KR20230122534A

KR20230122534A - 줄기세포 유래 나노베지클을 포함하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230122534A
Application number: KR1020220184363A
Authority: KR
Inventors: 김창수; 노용권; 김영재; 박예진
Original assignee: 주식회사 뉴메이스
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-08-22

Abstract

본 발명은 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 나노베지클은 피부에 대한 부작용을 최소화하면서 피부염 개선에 현저한 효과를 가지고 있어, 피부염의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 나노베지클을 포함하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, alleviating or treating atopic dermatitis comprising stem cell-derived nanovesicles}

본 발명은 줄기세포 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 가장 외부에 존재하는 기관으로 체내 수분을 보호하고 외부 인자(항원, 감염원 등)의 침입을 보호하는 필수적인 장벽기능을 수행한다. 그 중 표피는 약 80%의 수분으로 구성되어 있으며, 인체에서 가장 역동적인 조직인 표피세포의 형성, 분화 및 탈각과정이 끊임없이 반복되면서 표피의 항상성(epidermal homeostasis)을 유지한다. 표피의 주요 구성세포는 각질형성세포(keratinocyte)이며, 각질화(keratinization) 과정은 기저세포의 분열과정 → 유극세포의 합성 및 정비과정 → 과립세포의 자기 분해과정 → 각질세포의 재구축(remodeling)과정을 거쳐 최종적으로 일어난다.

이러한 각질형성세포의 분화가 비정상적으로 일어나게 되면 피부장벽 기능에 결함이 생기게 되며, 이는 피부건조를 유발시켜 아토피 피부염 등과 같은 만성적이고 재발성의 염증성 피부질환을 발생시킨다. 이러한 피부장벽 기능의 손상과 이와 관련된 면역반응은 아토피 피부염의 주요 원인이고, 아토피 피부염의 가려움증은 외부 자극원이 손상된 피부장벽을 투과하여 염증반응을 일으키고, 이에 의해 생성된 히스타민을 비롯한 여러 가려움증 매개체들에 의해 발생한다. 현재 치료법으로는 보습치료, 국소 스테로이드 및 면역조절제, 항히스타민제, 부신피질호르몬제 또는 국소 calcineurin 억제제 연고제 처방 등이 주를 이루고 있으나, 이들 치료법은 증상의 완화 개선을 목적으로 하며, 흔히 부작용을 동반하고 근본적인 완치는 어려운 실정이다. 또한, 최근 들어서는 항염증, 항노화, 주름개선, 미백 등의 피부 생리활성기능 증진을 위해 활용 가능한 소재로 생명공학 기술을 활용해 개발되고 있고, 여러 가지 원료를 이용하여 아토피 피부염 치료 및 완화를 위한 기능성 화장품, 의약품 등이 출시되고 있지만, 대개의 경우 보습 등의 일반적인 기능만이 알려져 있는 경우가 대부분이다. 사노피의 듀피젠트(성분명: 두필루맙), 릴리의 올루미언트(성분명: 바리시티닙), 애브비의 린버크(성분명: 유파다시티닙) 등의 생물학적 제제나 JAK(Janus Kinase) 억제제도 아토피 피부염 치료제로서 출시되어 어느 정도 효능이 입증되었지만, 높은 약제비나 안면홍조, 심혈관질환 유발 등의 문제점이 있다.

또한, 근래에 줄기세포에서 분비된 엑소좀(exosome)을 배양액으로부터 분리 추출하여 기능 증진의 원재료로 이용하기 위한 기술이 개발되고 있지만, 현재 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀 추출법으로는 엑소좀을 포함한 세포 분비물을 추출하는 단계에서 배지나 소혈청 유래의 엑소좀 및 단백질에 의한 간섭으로 인해 완전한 정제가 어렵다는 문제점이 있고, 배양액에 함유되어 있는 엑소좀은 0.1-0.5% 함량으로 매우 낮으므로 배양공정 효율, 생산성 및 상업성 측면에서 한계를 지니고 있다.

이에 본 발명자들은 줄기세포를 물리적으로 파쇄하여 자가조립(self-assembly) 기작에 의해 제조된 줄기세포 유래 나노베지클(nanovesicle)이 아토피 피부염에 대한 항염증 효과가 뛰어난 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2019-0003383호

본 발명의 목적은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 피부에 대한 부작용을 최소화하면서 피부염 개선에 현저한 효과를 가지고 있어, 피부염에 대한 화장품, 의약품 또는 의약외품으로 유용하게 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 유효성분은 (i) 인간 줄기세포 유래의 물질로서 생체적합성이 뛰어나고, (ii) 세포배양액의 제거 후 줄기세포만을 회수하여 분리공정함으로써, 배양액 내 불순물 함유에 따른 우려를 최소화하여 생체안정성이 뛰어나며, (iii) 줄기세포를 파쇄하여 제조함으로써, 기존 엑소좀에 비해 단위 세포당 생산 수율을 극대화할 수 있어 화장품 원천소재, 의약품 및 의약외품 조성물의 대량생산화가 가능하다는 효과가 있다.

도 1은 제조된 나노베지클의 성상, 크기(a) 및 분포도(b)를 초저온 투과전자현미경(Cryogenic-Transmission Electron Microscope, Cryo-TEM) 및 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 이용하여 확인한 결과이다.
도 2는 HaCaT(Human Epidermal Keratinocyte) 세포를 이용하여 나노베지클의 처리 농도에 따른 세포독성을 CCK(Cell Counting Kit) 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3a는 Poly I:C(Polyinosinic: Polycytidylic Acid) + IL-4, IL-13가 처리된 Keratinocyte(NHEK)세포에 나노베지클 또는 덱사메타손(양성 대조군)을 처리한 후, qRT-PCR을 통해 염증 마커인 IL-6 및 IL-1β의 mRNA 변화량과 HMC CM(Human mast cell conditioned media)을 이용하여 염증을 유발한 NHEK 세포의 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) ELISA를 측정한 결과이다.
도 3b는 PMACI(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate + Calcium Ionophore)가 처리된 Human mast cell(HMC)세포에 나노베지클 또는 덱사메타손(양성대조군)을 처리한 후, qRT-PCR을 통해 염증 마커인 TNF-α및 IL-13의 mRNA 변화량과 ELISA를 이용하여 Histamine의 변화량을 나타낸 결과이다.
도 4a는 염증이 유발된 마우스에 나노베지클 또는 덱사메타손(양성 대조군)을 처리한 후, 0일째 및 35일 째에 관찰된 마우스의 피부 조직 및 이로부터 산출된 임상스코어 결과이다.
도 4b는 염증이 유발된 마우스에 나노베지클 또는 덱사메타손(양성 대조군)을 처리한 후, 0일째 및 35일 째에 조직병리를 이용하여 H&E, Toluidine Blue염색으로 hyperkeratosis, inflammatory cell infiltration의 정도를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 치료용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "나노베지클(nanovesicle)"은 내부에 cargo를 지닌 nm 사이즈의 이중 지질막 구조의 입자로서, 줄기세포의 물리적 파쇄를 통해 제조된 세포 유래 소포체를 의미한다. 본 발명의 나노베지클은 이중 지질막 구조를 가진 엑소좀과 유사한 형태를 가지고 있으나, 엑소좀은 세포에서 자연적으로 세포외로 분비되어 분리 정제를 통해 수득되는 소포체라는 점에서 차이가 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 줄기세포를 압출 또는 파쇄하여 제조된 것일 수 있고, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "줄기세포(Stem Cell)"는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로 특정 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 말하며, "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)"는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(Stromal) 등에 존재하는 줄기세포를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 줄기세포를 압출 또는 파쇄하여 제조된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 중간엽 줄기세포를 3 내지 7 계대 (passage)까지 증식시킨 후 세포를 파쇄하여 제조된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 인간 지방유래줄기세포를 3 내지 7 계대 (passage)까지 증식시킨 후 세포 펠릿을 파쇄하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

더욱 바람직하게는, 상기 나노베지클은 (a) 중간엽 줄기세포를 증식시킨 후 세포 펠릿을 수득하는 단계; (b) 버퍼로 재부유된 세포를 압력을 가하여 파쇄하고 세포막을 재조립하는 단계; 및 (c) 재조립된 나노베지클 나노입자를 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 10~15% 인간 혈소판 용해물(human platelet lysate, HPL) 및 1~10 ng/ml 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)가 첨가된 배양액에서 증식될 수 있다. 상기 줄기세포는 4~5일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 배양한 후에 0.05% 트립신(Trypsin)을 넣고 4분간 반응시킨 후 900g 조건에서 10분동안 원심 분리하여 펠릿 다운하여 얻을 수 있다. 또한, 수득된 세포 펠릿은 PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼로 재부유시키고, PBS 버퍼로 재부유된 세포를 i) 5 μm 및 0.4 μm PCTE (Polycarbonate Track Etch) 멤브레인을 통해 파쇄하거나, ii) 30 내지 200 μm 구경의 채널을 통과시켜 세포를 파쇄하는 단계를 수행할 수 있다. 세포 파쇄 후에는 TFF (Tangential Flow Filtration) 방법을 이용하여 분리 정제, 농축 과정을 통하여 나노베지클을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 피부염은 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis) 및 알러지성 접촉피부염(allergic contact dermatitis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이제 한정되는 것은 아니다.

상기 용어, "아토피 피부염"은 원인이 분명하지 않은 자가면역질환 일종의 피부염으로 일반적으로 급성기에는 Th2 (T Helper 2 Cell) 편재 면역반응을 보이고, 만성기에는 Th2 에서 Th1 (T Helper 1 Cell)로 변화하는 양상을 보이며, 알레르겐, 피부건조, 긁는 행위 등으로 인하여 피부장벽손상을 일으키는 질병을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 Poly I:C(Polyinosinic: Polycytidylic Acid)에 의해 유도되는 아토피 피부염을 완화 또는 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 및 히스타민(Histamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상의 활성을 저해하는 것일 수 있다. TSLP는 Th2 cytokine을 과잉 생산하도록 하여 피부장벽을 손상시키고 피부염을 유발, 악화시킨다고 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 나노베지클은 1x10⁸particles/ml 내지 1x10¹²particles/ml의 양으로 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1x10⁹particles/ml 내지 1x10¹²particles/ml의 양으로 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1x10¹⁰particles/ml 내지 1x10¹²particles/ml의 양으로 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1x10¹⁰particles/ml 내지 5x10¹¹particles/ml의 양으로 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1x10¹¹particles/ml 내지 5x10¹¹particles/ml의 양으로 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1x10¹¹particles/ml 내지 2x10¹¹particles/ml의 양으로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 유효성분은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 30 중량%, 0.001 내지 20 중량%, 0.01 내지 20 중량%, 0.1 내지 20 중량%로 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 사용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다. 또한, 기능성 첨가물이 추가로 포함될 수 있으며, 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 배합 성분으로 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지 크림, 영양 크림, 모이스처 크림, 아이 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 스프레이, 파우더, 바디로션 또는 바디클린저의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 용어, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강 상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명은 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면, 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.

본 발명의 의약외품 조성물은 피부염의 예방 또는 개선을 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제조할 수 있다.

또한, 각 제형에 있어서 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(억제 또는 완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

또한, 각 제형의 의약외품 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 비경구 투여용인 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 나노베지클의 특성 분석

본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 파쇄하여 나노베지클을 제조하였고, TFF(tangential flow filtration)를 통해 분리 정제하였다. 제조된 나노베지클의 구조 및 분포도는 초저온투과전자현미경(Cryogenic-Transmission Electron Microscope, Cryo-TEM) 및 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)를 사용하여 확인하였다.

그 결과, 제조된 나노베지클은 단층(unilamellar)의 이중지질막 구조를 입자 외부에 형성하고 있음을 확인하였다(도 1a). 또한, 나노베지클의 크기는 평균 110 nm이고, 다분산지수(Poly Dispersity Index, PDI)는 0.15 내외임을 확인하였다 (도 1b).

실시예 2. 나노베지클의 독성 분석

중간엽 줄기세포를 파쇄하고 분리 정제하여 수득된 나노베지클의 독성을 평가하기 위해, 세포에 농도별로 나노베지클을 처리하고 세포 증식률을 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, HaCaT(Human Epidermal Keratinocyte) 세포를 10% 소혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 현탁시킨 후, 90% 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고, 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후, 기존 DMEM을 제거하고 새로운 DMEM과 함께 1x10¹¹particles/ml 또는 2x10¹¹particles/ml의 나노베지클을 처리하고, 48시간 동안 배양한 후 세포 생존율을 평가하였다(n=3). 세포 생존율은 CCK-8(Cell Counting Kit 8) 시약을 이용하였고, Microplate Reader를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 1x10¹¹ particles/ml 과 2x10¹¹ particles/ml의 처리군들에서 세포 생존율은 각각 102.6% 와 91.0% 로서 나노베지클은 HaCaT 세포에 대한 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 2).

실시예 3. 아토피 피부염 in vitro 항염증 지표 확인

Keratinocyte(NHEK) 세포를 Keratinocyte Growth Medium 배지에 현탁시킨 후, 이를 6-well plate에 5,000 cells/cm²로 분주하고 배양하였다. 48시간 이후, NHEK 세포에 아토피 피부염을 유발하는 Poly I:C(Polyinosinic: Polycytidylic Acid)와 100ng/ml IL-4, IL-13을 동시에 처리한 후, 1x10¹¹particles/ml의 나노베지클 또는 1 μM의 덱사메타손(Dexamethasone, 양성 대조군) 스테로이드를 처리하였다. 이후, 24시간 배양 후에 샘플을 채취하였고, NHEK 세포에서의 염증 반응을 평가하기 위하여 qRT-PCR(Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)을 통해 염증 마커인 IL-6, IL-8의 mRNA 변화량을 측정하였다. 그리고 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) KIT를 이용하여 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 변화량을 확인하였다. 앞서 제시한 동일한 방법으로 배양을 진행하였으나 아토피 피부염을 Human mast cell conditioned media(HMC CM)을 이용하여 유발시킨 후, 추출하여 ELISA 분석을 진행하였다.

그 결과, NHEK 세포에서 Poly I:C + IL-4, LI-13으로 염증이 유발된 그룹에서는 대조군(control)에 비해 IL-6, IL-1β의 mRNA 발현량이 증가하였으나, 나노베지클이 처리된 그룹에서는 IL-6, IL-1β의 mRNA 발현량이 현저히 감소된 것을 확인하였다(도3a). 특히, 나노베지클이 처리된 그룹에서는 덱사메타손이 처리된 그룹과 비교할 만한 항염증 효과가 있음을 확인하였다. ELISA 결과에서는 HMC CM으로 염증이 유발된 그룹에서 대조군에 비해 TSLP 발현량이 증가하였으며, 나노베지클이 처리된 그룹에서 TSLP의 발현량이 29.3% 통계적으로 유의미하게 감소하였다(표 1, 도3a).

TSLP ELISA (pg/ml)
N	Control	HMC CM	Nanovesicles
#1	0.9	29.4	18.1
#2	1.2	27.1	20.6
#3	1.1	26.6	20.9
Average	1.1	27.7	19.9 (HMC CM대비 29.3% 감소)
STEDV	0.1	1.5	1.4

Human Mast cell(HMC) 세포를 10% 소혈청이 포함된 IMDM 배지에 현탁시킨 후, 이를 6-well plate에 20,000 cells/cm²로 분주하고 배양하였다. 72시간 이후, HMC 세포에 아토피 피부염을 유발하는 PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) 40nM과 CI(Calcium Ionophore) 1uM(PMACI)를 처리한 후, 1x10¹¹ particles/ml의 나노베지클 또는 1 μM의 덱사메타손(Dexamethasone, 양성 대조군)을 처리하였다. 6 시간 배양 후에 샘플을 채취하였고, HMC 세포에서의 염증 반응을 평가하기 위하여 qRT-PCR을 통해 염증 마커인 TNF-α, IL-13의 mRNA 변화량을 측정하였다. 이후 ELISA KIT를 이용하여 Histamine 변화량을 확인하였다.

그 결과, HMC 세포에서 PMACI로 염증이 유발된 그룹에서 대조군에 비해 TNF-α, IL-13의 mRNA 발현량이 증가하였으나, 나노베지클이 처리된 그룹에서는 TNF-α, IL-13의 mRNA 발현량이 양성 대조군만큼 현저하게 감소된 것을 확인하였다(도 3b). 하기 [표 2]에 기재된 바와 같이, ELISA 결과에서는 PMACI로 염증 유발된 그룹이 대조군에 비해 Histamine 발현량이 37.6% 증가하였으며, 덱사메타손 및 나노베지클이 처리된 그룹에서는 vehicle control(PMACI 처리군) 대비 Histamine 발현량이 각각 34.9% 및 86.8%로 유의미하게 감소하였다(표 2, 도3b).

Histamine ELISA (ng/ml)
N	Control	PMACI	Dexamethasone	Nanovesicles
#1	367.5	518.9	445.6	392.1
#2	403	465	424.8	404.2
#3	342.2	547.8	515.2	371.8
Average	370.9	510.5 (control 대비 37.6% 증가)	461.8 (PMACI 대비 34.9% 감소)	389.3 (PMACI 대비 86.8% 감소)
STEDV	30.5	42.0	47.3	16.3

실시예 4. 아토피 피부염 유발 동물모델 실험

6주령의 수컷 NC/Nga 마우스(중앙실험동물, n=5)는 7일 동안 적응기를 거친 후 실험을 수행하였다. 마우스는 마우스는 귀 및 목 뒷부분을 면도기로 제모한 후 아토피 피부염 유발시약인 비오스타(Biostir) AD 크림 100 mg을 균일하게 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 후, 다음과 같이 4군으로 나누어 실험을 수행하였다: G1, 정상군; G2, 아토피 피부염이 유발된 대조군: G3, 아토피 피부염의 유발과 동시에 0.03% 덱사메타손(Dexamethasone)이 처리된 양성 대조군; 및 G4, 아토피 피부염의 유발과 동시에 나노베지클 처리군.

G3 및 G4 군에는 7일에 한 번씩 총 5번 아토피 피부염이 유발된 부위에 덱사메타손 또는 나노베지클을 피하 투여(Subcutaneous Injection, SC)로 진행하였다. 이후, 투여 후 35일 째에 마우스의 피부 조직을 관찰하고, 이로부터 임상스코어를 산출하였다. 임상스코어는 홍반/출혈, 부종, 찰과상/침식 및 인설/건조 증상을 포함한 종합적인 지표로 산출하였으며, 임상스코어가 높을수록 염증반응이 높은 것을 의미한다. 실험을 진행한 샘플을 부검하기 위해 해당 동물을 안락사시킨 뒤, 유발부위 (귀 및 목뒤 부분)를 적출하였다. 적출된 조직은 조직병리학적 검사를 위하여 10 % 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였다. 고정된 조직은 삭정, 탈수, 파라핀 포매, 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 조직병리학적 검사를 위한 검체를 제작한 뒤, Hematoxylin & Eosin (H&E) 및 Toluidine blue 염색을 실시하였고, 광학 현미경을 이용하여 조직병리학적 변화를 관찰하였다.

H&E 염색 슬라이드를 이용한 조직병리학적 평가는 가장 심한 병변 부위를 선정한 다음, 표피층(epidermis)에서 Hyperkeratosis를 진피(dermis)에서 Infiltration by inflammatory cells을 Score: 0(no symptoms), 1(mild), 2(moderate), 3(severe) 기준으로 평가하였다.

그 결과, 하기 [표 3]에 기재된 바와 같이, 35일 후, 대조군(G2, vehicle control), 양성 대조군(G3, positive control) 및 나노베지클 처리군(G4, test article)의 임상스코어는 각각 8.2, 5.2 및 6.0 으로서, 나노베지클 처리군(G4)에서는 대조군(G2)에 비해 아토피 피부염의 증상을 감소 또는 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다. 하기 [표 3]은 동물 실험 Gross Examination 0일째 및 35일째 정량 결과를 나타낸다.

GROSS EXAMINATION (UNIT: score)
DAY	GROUPS, AVG±STDEV
DAY	G1	G2	G3	G4
0	0.0±0.0	2.8±0.8	2.8±0.8	2.8±0.8
35	0.0±0.0	8.2±1.8	5.2±1.3	6.0±2.3

또한, 조직병리학적 평가 결과, 하기 [표 4]에 나타나나 바와 같이, 나노베지클 처리군(G4)에서 표피의 과각화 -42.9%, 진피 내 염증세포의 침윤 수준-21.4% 은 대조군(G2)에 비하여 낮은 경향 %를 나타냈다. Toluidine blue를 이용하여 G1과 유사한 형태의 표피와 진피를 G4 그룹에서 확인할 수 있었다(도 4). 하기 [표 4]는 조직 병리 H&E 분석 hyperkeratosis, inflammatory cell infiltration 정량 결과를 나타낸다.

HISTOPATHOLOGICAL EXAMINATION (UNIT: score)
TEST	GROUPS, AVG±STDEV
TEST	G1	G2	G3	G4
Hyperkeratosis	0.0±0.0	1.4±0.5	1.0±0.0	0.8±0.4
Inflammatory cell infiltration (dermis)	0.0±0.0	2.8±0.4	2.2±1.1	2.2±1.1

특히, 나노베지클 처리군(G4)는 스테로이드제인 덱사메타손이 처리된 양성 대조군과 비교할 만한 아토피 피부염의 증상 완화 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 나노베지클은 줄기세포를 파쇄하여 제조된 것인, 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 연골, 골조직, 지방조직, 골수, 제대혈, 양수, 태반 및 말초혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 조직으로부터 분리된 것인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 피부염은 아토피 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis) 및 알러지성 접촉피부염(allergic contact dermatitis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) 및 히스타민(Histamine)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상의 활성을 저해하는 것인, 조성물.
나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 약학 조성물.
나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 피부염(dermatitis)의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.