KR101905853B1 - Dna 단편 혼합물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Dna 단편 혼합물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 정류의 정소 또는 정액에서 분리한 특정 크기의 분자량을 가지는 DNA 단편 혼합물이 농도 의존적으로 아토피 피부염 병변을 완화시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 이용한 우수한 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물의 개발이 기대된다.
Description
본 발명은 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 주로 유아기 혹은 소아기에 시작되는 만성적이고 재발성의 염증성 피부 질환으로, 가려움증과 피부 건조증, 특징적인 습진을 동반하고, 피부 증상의 진행 상태에 따라 급성, 아급성 혹은 만성 피부 병변으로 나타난다. 일반적으로 소아기 때 호전되며, 사춘기 때 다소 악화되었다가 대부분 30세경에 자연 치유된다. 그러나 증상이 심각해질 경우에는 백내장, 초자체 혼탁, 망막 박리증 등의 심각한 눈의 합병증이 동반 될 수 있으며, 정신적 장애가 발생하는 경우도 보고되고 있다.
아토피 피부염의 발병 원인은 아직까지 확실하게 알려져 있지 않으나, 환경적인 요인과 유전적인 요인이 주요 원인으로 여겨지고 있다. 환경적인 요인으로는 대기 오염, 핵가족화, 모유 수유의 감소, 수입과 교육수준의 증가, 항생제 사용의 증가로 인한 알레르기를 일으키는 원인 물질(알레르겐, allergen)에 대한 노출의 증가, 주거환경 변화, 공업 발달로 인한 새로운 알레르겐의 등장 등이 있다. 아토피 피부염에서 유전적 요인이 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있는데, 원인 유전자에 대해서는 IL-4 프로모터(promoter) 혹은 IL-4 수용체(receptor)의 변이 등이 제시되었으나, 유전 양식과 원인 유전자는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다.
최근 연구에 따르면, 아토피 피부염은 크게 두 가지 기능장애(dysfunction)에 의해 발생하는데, 피부 장벽 기능 및 면역반응 기능 손실이 이에 해당한다.
피부 표피의 기저층(stratum basal)을 주로 이루고 있는 각질형성세포(keratinocytes)의 주요 기능은 피부 외부로부터 오는 손상을 막아주는 장벽을 형성하는 것이다. 정상 피부에서 각질형성세포는 분화과정을 통해 각질(keratin) 또는 필라그린(filaggrin)과 같은 피부 장벽 기능을 유지하는데 중요한 구조 단백질을 발현시켜 수분 손실 및 여러 환경적 침해로부터 피부를 보호한다. 각질형성세포의 분화과정은 피부 표피에 존재하는 단백질 분해효소(protease)와 단백질분해효소 억제제(protease inhibitor)에 의해서 진행된다.
필라그린(filaggrin)은 피부의 정상적인 분화과정을 통해 표피 과립층(granular layer)에서 프로필라그린(profilaggrin)이 합성되고, 합성된 프로필라그린에 단백질 분해효소들이 작용해 필라그린을 생성한다. 필라그린은 다시 자유아미노산(free amino acids)으로 분해되고, 이렇게 분해된 자유아미노산은 천연수분인자(natural moisturizing factor) 성분으로 중요한 피롤리돈 카르복실산(pyrolidone carboxylic acid)으로 변환되어 각질층에 수분을 유지시켜주는 기능을 한다(Presland R.B., 2009).
그러나 외부 물질인 알레르겐 또는 미생물에 의해 표피가 손상되면 각질층의 pH가 올라가면서 단백질분해효소와 단백질분해효소 억제제들의 활성 균형이 깨져 피부 장벽 항상성이 깨져 각질층에서 심한 탈락(desquamation)이 일어나거나, 각질세포가 탈락되지 못하여 피부장벽층이 두꺼워지는 증상이 나타난다(김현정, et al., 2013).
무너진 피부 장벽을 통해, 알레르겐이나 미생물 등이 체내에 유입되면, 면역체계에서 중요한 역할을 하는 보조 T 세포(helper T cell, Th)들의 활동 균형이 깨져 결국에는 면역 기능 장애를 일으킨다. 이때, 보조 T2 세포(Th2)들이 과활성화(overactivation)가 되어 IL-4(interleukin-4), IL-13 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 같은 염증 인자들이 생성된다. 이런 염증인자들은 B 세포를 자극하여 IgE(immunoglobulin E) 합성을 유도하고 비만세포(mast cell)의 탈과립(degranulation)을 통해 IL-4의 생성을 더욱 높여 급성 아토피 피부염을 일으킨다(Akdis C.A., et al., 1999; Jeong C.W., et al., 2003).
외부로부터 오는 자극이 심해지면 피부의 표피(epidermis)를 구성하고 있는 각질형성세포가 손상되면서 TSLP(thymic stromal lymphopoietin)를 배출하여 Th2 세포의 활성 반응을 촉진한다. 또한 손상된 각질형성세포에 의해 염증세포들의 침입(infiltration)이 높아지고 보조 T1 세포(Th1)들의 활동이 시작되면서 IFN-γ(interferon-γ)와 같은 높은 염증인자 발현으로 인해 만성 아토피 피부염으로 악화된다(Leung D.Y., et al., 2004).
과거에는 Th1의 활동을 증가시키고, Th2의 활동을 감소시키기 위하여, IFN-γ를 아토피 피부염을 치료하는 메카니즘의 하나로 사용해 왔으나, 최근의 연구 결과에서 IFN-γ는 급성 단계에서는 감소하지만, 만성단계에서는 증가하는 것으로 나타나, 이를 적절히 조절하는 것이 아토피의 근본적인 치료 수단이 될 수 있음이 보고되고 있다(Leung D.Y., et al., 2004).
아토피 피부염은 유전적 요인, 정신적 요인, 환경적 요인, 피부 감염 등 여러 요인에 의해 영향을 받기 때문에, 이에 대한 효과적인 치료법도 아직까지 확실하게 정립되지 않은 상태이다. 또한, 알레르기 질환의 특성상 원인이 확실히 밝혀지지 않았으며, 완치율이 낮고, 재발률이 높아 장기간의 치료가 요구된다.
현재 사용 중인 아토피 피부염 치료제는 알레르기 반응의 최종 산물인 히스타민(histamine) 분비를 억제하거나 알레르기 증상의 하나인 염증 반응을 억제하는 효과를 가진 스테로이드제 및 항히스타민제에 치중되어 있고, 일부 면역조절제와 광선 치료법이 사용되고 있다. 그러나 이러한 치료제의 경우 알레르기 증상 완화에 효과가 있으나, 근본적인 치료 방법이 아니며, 장기간의 사용시 약물의 효능 감소 및 다양한 부작용 발생의 위험이 있다. 따라서, 아토피 피부염의 단순한 증상 완화가 아닌 근본적인 치료가 가능한 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 DNA 단편 혼합물을 이용한 알레르기 치료를 연구하는 과정에서, DNA 단편 혼합물이 아토피 피부염에 의해 나타나는 피부 장벽 기능 손실 및 면역 반응 기능 손실을 개선하는 효과가 있으며, 이러한 개선 효과가 급성 아토피 피부염 및 만성 아토피 피부염 모두에서 나타나는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 일본공개특허 제1999-035468호에는 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 핵산, 그 구성 성분인 염기에서 선택되는 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 억제 조성물이 기재되어 있어, 본 발명의 구성과 유사하나, 본 발명의 50kDa 내지 3,500kDa 분자량의 DNA 단편 혼합물은 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 차이가 있다. 또한, 미국공개특허 제5955059호에는 1.3kDa~130kDa(2~200bp) 분자량의 DNA 단편을 이용한 피부질환 치료 효과가 기재되어 있고, 피부 질환으로 아토피 피부염이 기재되어 있으나, DNA 단편이 모노머 또는 다이머에 국한된 치료 효과를 기재하고 있고, 본 발명의 50kDa 내지 3,500kDa 분자량의 DNA 단편의 아토피 피부염 치료 효과를 직접적으로 확인한 결과는 기재되어 있지 않다.
김현정, 아토피피부염과 피부장벽 이상, Allergy Asthma Respir. Dis., 1(1), 20-28, 2013.
Akdis C.A., et al., Regulation of allergic inflammation by skin-homing T cells in allergic eczema, Int. Arch. Allergy Immunol., 118(2-4), 140-144, 1999.
Jeong C.W., et al., Differential in vivo cytokine mRNA expression in lesional skin of intrinsic vs. extrinsic atopic dermatitis patients using semiquantative RT-PCR, Clin. Exp. Allergy, 33(12), 1717-1724, 2003.
Leung D.Y., et al., New insights into atopic dermatitis, J. Clin. Invest., 113(5), 651-657, 2004.
Presland R.B., Function of filaggrin and caspase-14 in formation and maintenance of the epithelial barrier, Dermatol. Sinica, 27(1), 1-14, 2009.
본 발명의 목적은 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 50kDa 내지 3,500kDa의 분자량으로 이루어진 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 50kDa 내지 3,500kDa의 분자량으로 이루어진 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액에서 분리한 것일 수 있다.
상기 어류는 연어과일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 IL-4(interleukin-4), IL-13 및 IFN-γ(interferon-γ)를 감소시킬 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 50kDa 내지 3,500kDa의 분자량으로 이루어진 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 DNA 단편 혼합물의 분자량이 50kDa 미만일 경우에는 DNA 단편의 길이가 짧아 치료 효과를 발휘하기 전에 분해되어 치료 효과를 얻기 어려우며, 3,500kDa 초과일 경우에는 DNA 단편의 피부 투과율이 낮아져 충분한 치료 효과를 발휘하기 어렵다.
상기 DNA 단편 혼합물은 어류의 정소 또는 정액으로부터 분리한 것일 수 있다.
상기 어류는 연어과일 수 있고, 바람직하게는 연어 또는 송어일 수 있고, 가장 바람직하게는 연어일 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물이란, 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스(deoxyribose)로 이루어진 생체 고분자에 해당하는 DNA로, 분자량이 저감된 단편 형태로 혼합되어 존재하는 것을 지칭한다.
상기 DNA 단편 혼합물은 피부의 외부 적용 및 내부 주입에 의해 약리학적 효과를 나타내는 치료제 또는 고분자 지지체 역할을 할 수 있으며, 이는 DNA 단편 혼합물의 분자량에 따라 달라질 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 폴리데옥시리보뉴클레오티드(polydeoxyribonucleotide) 또는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 DNA 중합체로, 생체 구성 성분이기 때문에 알레르기 반응이나 체내 거부반응이 없으며, 주성분이 음전하를 가지는 DNA로 이루어져 있어 친수성을 띠고 있어 산업적 적용이 매우 용이하여 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 사용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 중합체의 생체 구성 성분이면서 지지체 구조를 가지고 있어 세포 재생 환경을 구성하는 역할을 할 수 있다.
상기 DNA 단편 혼합물은 아토피 피부염에 의해 발현이 증가된 IL-4, IL-13 및 IFN-γ의 양을 감소시킬 수 있다. 상기 IL-4 및 IL-13은 급성 아토피 피부염에서 Th2 세포들이 과활성화 되어 발현이 증가하고, 상기 IFN-γ는 만성 아토피 피부염에서 Th1 세포가 활성화 되어 발현이 증가한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 단편 혼합물 및 약제학적 부형제를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 DNA 단편 혼합물은 전체 조성물 총 중량을 기준으로 0.5중량% 내지 5중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.5중량% 내지 1중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명의 치료용 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 질환의 병리 상태, 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다.
상기 DNA 단편 혼합물은 2㎎/㎏ 내지 25㎎/㎏을 투여할 수 있다. 바람직하게는 2㎎/㎏ 내지 16㎎/㎏의 농도로 투여할 수 있다. 투여 농도가 2㎎/㎏ 미만일 경우에는 치료 효과를 얻기 어렵고, 25㎎/㎏를 초과할 경우에는 투여량 대비 치료 효과의 상승 정도가 크지 않다.
상기 DNA 단편 혼합물은 1일 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물은 아토피 피부염 예방 또는 치료를 위하여 쥐, 가축 및 인간과 같은 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사, 국소 적용에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 단편 혼합물 및 통상의 화장료에 배합되는 부형제를 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 DNA 단편 혼합물은 전체 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.5중량% 내지 5중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.5중량% 내지 1중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 바람직하게는 피부 외용제인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제는 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물 이외의 다른 성분들을 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 선택할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용 가능한 보조제를 함유할 수 있다.
상기 화장품학적으로 허용 가능한 보조제는 유기용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발표제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분들일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 DNA 단편 혼합물이 아토피 피부염 마우스에서 경피수분 손실 감소, 수분함유량 증가, SPINK5 단백질 및 필라그린 단백질 발현 증가를 통한 천연보습인자 증가로 표피의 과각화를 감소시켜 피부 장벽 기능을 강화시키는 것을 확인하였다. 또한, 비만세포침입 감소, IgE, IL-4, IL-13 및 IFN-γ와 같은 염증 인자를 감소시켜 면역기능 장애를 완화시키는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 이용하여 우수한 아토피 피부염 치료제 또는 완화용 화장료 조성물로 개발함으로써 아토피 피부염 치료 및 개선에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델(A) 및 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델(B, C)에서의 DNA 단편 혼합물의 처리에 따른 아토피 피부염의 치료 효과를 보여주고 있다. DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서는 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 피부의 과각화 및 각질 생성 정도를 확인하였고(A), 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서는 아토피 피부염이 유도된 귀 부위의 혈관 확장, 홍반 및 발적을 육안으로 관찰하였고(B), 귀의 두께 변화를 확인하였다(C).
도 2는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 경피수분손실량(A) 및 피부수분함유량(B)의 변화를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3에서 3(A) 및 3(B)는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직의 H&E 염색 결과 사진(A) 및 표피 두께 변화(B)를 확인한 결과를 보여주고 있으며, 3(C) 및 3(D)는 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 귀 조직의 H&E 염색 결과 사진(C) 및 표피 두께 변화(D)를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직의 톨루이딘 블루 염색 결과 사진(A) 및 비만세포의 수를 측정한 결과(B)를 보여주고 있다.
도 5는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직에서의 필라그린 발현을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직에서의 SPINK5 단백질 발현량을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 7은 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델(A, B) 및 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델의(C, D)의 혈액 내 IgE(A, C) 및 IL-4(B, D)의 발현량을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 8은 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 귀 조직에서의 IL-13(A) 및 IFN-γ(B)의 mRNA 발현량을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 경피수분손실량(A) 및 피부수분함유량(B)의 변화를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3에서 3(A) 및 3(B)는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직의 H&E 염색 결과 사진(A) 및 표피 두께 변화(B)를 확인한 결과를 보여주고 있으며, 3(C) 및 3(D)는 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 귀 조직의 H&E 염색 결과 사진(C) 및 표피 두께 변화(D)를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직의 톨루이딘 블루 염색 결과 사진(A) 및 비만세포의 수를 측정한 결과(B)를 보여주고 있다.
도 5는 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직에서의 필라그린 발현을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 등 피부 조직에서의 SPINK5 단백질 발현량을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 7은 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델(A, B) 및 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델의(C, D)의 혈액 내 IgE(A, C) 및 IL-4(B, D)의 발현량을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 8은 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델의 귀 조직에서의 IL-13(A) 및 IFN-γ(B)의 mRNA 발현량을 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
이하의 실시예에서 시행된 동물실험은 2016년 8월부터 10월까지, 약 두 달에 걸쳐 진행되었다.
<실시예 1. 아토피 피부염 마우스 모델 제작 및 시료 처리>
실시예 1-1. DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델 제작 및 시료 처리
아토피 피부염 마우스 모델을 제작하기 위해 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzen)를 처리하였다. DNCB를 피부에 도포하여 자극을 주면 자극된 국소 부위에 지연형 알레르기 반응이 유도되고 비정상적인 면역기능을 일으키면서 피부 장벽이 망가져, 아토피 피부염 모델을 제작할 수 있다.
DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델을 제작하기 위해 6주령의 암컷 무모 마우스(hairless mouse)를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 하기 표 1의 4개 그룹(정상군, 대조군, 실험군 1 및 실험군 2)으로 무작위적으로 나누었다. 4개의 그룹 중 정상군을 제외한 나머지 그룹의 마우스에 DNCB를 도포하여 아토피 피부염을 유발하였다.
아토피 피부염 유발을 위해 1% DNCB(99% 아세톤과 올리브 오일을 3:1[v/v] 비율로 혼합한 용매에 녹임) 200㎕를 7일 동안 매일 마우스의 등에 도포하였다. 7일 후에는 다시 0.1% DNCB 200㎕를 2일 간격으로 총 7회에 걸쳐 마우스의 등에 도포하였다. 0.1% DNCB를 처리하는 14일 동안에 대조군은 DNA 단편 혼합물이 포함되어 있지 않은 용매(부틸렌 글리콜(Butylene glycol):에탄올:물을 3:2:5[v:v:v]의 비율로 혼합)를, 실험군 1 및 실험군 2는 DNA 단편 혼합물이 각각 0.5중량% 및 1중량%가 혼합되어 있는 용매를 하루에 2번씩 매일 200㎕씩 도포하였다. 이때, 본 발명의 DNA 단편 혼합물은 ㈜파마리서치프로덕트(대한민국)에서 생산한 DNA 단편 혼합물을 사용하였다.
아토피 피부염의 치료 효과를 확인하기 위해, 아토피 피부염을 유도하기 전(0일)과 아토피 피부염 유도 7일 후(7일)(1% DNCB을 7일간 처리 후, 7일), 유도 14일 후(14일)(0.1% DNCB를 처리한지 7일째) 및 유도 21일 후(0.1% DNCB를 처리한지 14일째)의 마우스를 이용하였다.
실시예 1-2. 옥사졸론(oxazolone) 유도 아토피 피부염 마우스 모델 제작 및 시료 처리
옥사졸론(4-ethoxymethylene-2-phenyloxazolone)을 귀 부분에 도포하면 아토피 피부염과 비슷한 병변이 나타나며, 이때 병변이 유도된 귀는 발적을 일으키면서 비정상적인 면역반응이 일어나 귀의 두께가 두꺼워진다.
옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델을 제작하기 위해 6주령의 암컷 Balb/c 마우스를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 하기 표 1의 6개 그룹으로 무작위적으로 나누었다. 6개의 그룹 중 정상군을 제외한 나머지 그룹의 마우스의 귀에 옥사졸론을 도포하여 아토피 피부염을 유발하였다.
아토피 피부염 유발을 위해 1% 옥사졸론(99% 아세톤에 녹임) 20㎕를 7일 동안 매일 마우스의 양쪽 귀에 도포하였다. 7일 후에는 다시 0.1% 옥사졸론 20㎕를 2일 간격으로 총 11회에 걸쳐 마우스의 양쪽 귀에 도포하였다. 0.1% 옥사졸론을 처리하는 동안에 대조군은 DNA 단편 혼합물이 포함되어 있지 않은 용매(부틸렌 글리콜:에탄올:물을 3:2:5[v:v:v]의 비율로 혼합)를, 비교군 1 및 비교군 2는 본 발명의 DNA 단편 혼합물의 분자량을 벗어난 DNA 단편 혼합물 1중량%가 혼합되어 있는 용매를, 실험군 1 및 실험군 2는 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 각각 0.5중량% 및 1중량%가 혼합되어 있는 용매를 하루에 2번씩 매일 20㎕씩 도포하였다. 이때, 본 발명의 DNA 단편 혼합물은 ㈜파마리서치프로덕트(대한민국)에서 생산한 DNA 단편 혼합물을 사용하였다.
아토피 피부염의 치료 효과는 아토피 피부염을 유도하기 전(0일)과 아토피 피부염 유도 후 7일 간격(7일, 14일, 21일, 28일)으로 확인하였다.
| 구성 | 처리 조건 | |
| 아토피 유도 | 시료 처리 | |
| 정상군 | × | - |
| 대조군 | ○ | 용매* |
| 비교군 1 | ○ | 용매+ 분자량이 50kDa 미만인 DNA 단편 혼합물 1중량% |
| 비교군 2 | ○ | 용매+ 분자량이 3500kDa 초과인 DNA 단편 혼합물 1중량% |
| 실험군 1 | ○ | 용매+ 본 발명의 DNA 단편 혼합물 0.5중량% |
| 실험군 2 | ○ | 용매+ 본 발명의DNA 단편 혼합물 1중량% |
| 용매 : 부틸렌 글리콜(Butylene glycol):에탄올:물을 3:2:5[v:v:v]의 비율로 혼합 | ||
<
실시예
2. 육안 검사를 통한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
실시예 2-1. DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 효과 확인
상기 실시예 1-1의 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델을 이용하여, 본 발명의 DNA 단편 혼합물 처리 시간에 따른 피부의 변화를 육안으로 관찰하고, 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다.
도 1(A)에서 보여주듯이, DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서, 1% DNCB를 도포하고 3일 후부터는 대조군, 실험군 1 및 실험군 2의 마우스의 등 피부가 벗겨지고 각질이 일어나기 시작하여, 7일차에는 피부가 벗겨져 각질이 딱딱해지는 과각화증이 일어나는 것이 관찰되었다. 그러나, 0.1% DNCB 또는 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 도포한 후에는 대조군, 실험군 1 및 실험군 2의 마우스의 각화증 및 각질이 감소하는 것으로 나타났다. 특히, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2는 대조군에 비해 각화증 감소 효과가 빠르게 나타났으며, 실험군 1은 21일차에, 실험군 2는 14일차에 마우스의 등 피부가 정상군과 비슷해졌으나, 대조군은 21일차 후에도 약간의 각질이 존재하는 것을 확인하였다.
실시예 2-2. 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 효과 확인
상기 실시예 1-2의 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델을 이용하여, 본 발명의 DNA 단편 혼합물 처리 시간에 따른 귀 조직의 변화를 육안으로 관찰하고, 귀의 두께를 측정하여 그 결과를 도 1(B) 및 도 1(C)에 나타내었다.
도 1(B) 및 도 1(C)에서 보여주듯이, 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서, 대조군 마우스의 귀 상태는 혈관이 확장되었고, 홍반과 발적이 나타났으나, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2는 혈관의 확장이나, 홍반 및 발적이 호전된 것을 확인하였다(B). 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물의 분자량을 벗어난 DNA 단편 혼합물을 처리한 비교군 1 및 비교군 2는 대조군과 비슷하게 혈관이 확장되어 있고, 홍반 및 발적이 나타났다. 또한, 마우스 귀 두께 변화를 관찰한 경우(C)에는 정상군의 귀 두께는 시간에 따른 변화가 없는 반면에, 대조군의 경우에는 시간 의존적으로 귀 두께가 증가하다가 14일차부터 정상군의 약 2배로 증가하고, 28일차까지 유지되는 것을 확인하였다. 비교군 1 및 비교군 2의 경우에는 대조군의 귀 두께와 큰 차이가 없는 반면에, 실험군 1 및 실험군 2의 경우에는 DNA 단편 혼합물을 처리함에 따라 마우스 귀 두께가 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였고, 28일차의 경우에는 귀 두께가 0.25~0.27㎜로 대조군의 증가폭과 비교하여 약 30% 이상의 귀 두께가 감소한 것을 확인하였다.
상기 실시예 2-1 및 실시예 2-2의 결과를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 아토피 피부염에 의한 피부 각화, 각질 증가, 혼반, 발적 및 피부 두께의 두꺼워짐 등과 같은 증상들을 완화시킴으로써 아토피 피부염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3. 경피수분손실량 및 피부수분함유량 확인>
일반적으로 아토피 피부염은 피부 장벽이 무너져 보습이 잘 되지 않고, 수분이 손실되는 특징을 가진다. 따라서, 피부의 수분 보습에 대한 개선 정도는 화장료 조성물 용도로 사용함에 있어 중요한 판단 기준이 된다. 이에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 피부의 수분 손실 정도를 측정함으로써 아토피 피부염 치료 효과를 확인하였다.
상기 실시예 1-1의 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스로부터 경피수분손실량(trans epidermal water loss, TEWL) 및 피부수분함유량(hydration)을 측정하였다. 이때, 경피수분손실량은 AquaFlux(Biox, London, UK)를, 피부수분함유량은 Skin-O-Mat(COSMED, Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보여주듯이, 경피수분손실량(A)의 경우, 대조군, 실험군 1 및 실험군 2에서 아토피 피부염 유도 7일차에 경피수분손실량이 100g/㎡/h 이상으로 증가하였고, 7일 이후에 DNCB의 농도를 낮추어 도포한 경우에는 경피수분손실량이 감소하였고, 특히나, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2는 대조군과 대비하여 경피수분손실량이 더 많이 감소하여, 아토피 피부염 유도 14일차의 경우 대조군 대비 30~40% 정도가 감소하였고, 1중량%의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 2의 21일차 마우스의 경우 경피수분손실량이 40g/㎡/h 정도로 현저히 감소하였다.
수분함유량의 경우(B), 아토피 피부염 유발 7일차에는 정상군 대비 대조군, 실험군 1 및 실험군 2의 수분함유량이 50% 이상 감소하였으나, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 후부터는 처리 시간에 의존적으로 수분함유량이 증가하였다. 특히나, 21일 차에는 대조군의 수분함유량이 정상군의 50% 정도인 반면에, 실험군 1 및 실험군 2의 수분함유량은 정상군과 비슷한 수준이 되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 아토피 피부염에 의해 손실된 피부의 장벽 기능을 회복 및 강화시켜 피부의 수분 보습을 개선함으로써 아토피 피부염 치료 효과를 높일 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4. H&E 염색을 통한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
실시예 4-1. DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 효과 확인
아토피 피부염에 의해 표피가 손상되면 각질세포가 탈락되지 못하여 피부장벽층이 두꺼워진다. 따라서, 본 발명의 DNA 단편 혼합물 처리에 의한 피부장벽층의 두께 변화를 관찰하기 위해 피부 조직을 H&E(hematoxylin and eosin)로 염색시켰다. 헤마톡실린(hematoxylin)은 세포의 핵과 같은 산성과 만나서 청색으로 염색시키고, 에오신(eosin)은 염기성과 만나서 다른 세포질 성분 및 콜라겐을 붉은 색으로 염색시킨다.
상기 실시예 1-1의 21일차의 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스의 등 피부 조직을 채취한 후, 4% 포르말린(formalin)으로 고정한 후, H&E(hematoxylin and eosin)로 염색하였다. 염색된 조직 및 Image J 프로그램을 이용하여 표피의 두께를 측정하였고, 이때 두께 측정은 마우스 마리당 2번씩 촬영한 조직 사진을 이용해 임의로 3군데를 지정하여 두께를 측정하고 평균값을 구하였고, 그 결과를 도 3(A) 및 도 3(B)에 나타내었다.
도 3(A)의 조직 사진 및 도 3(B)의 등 피부의 표피 두께를 측정한 결과에서 보여주듯이, 대조군의 표피 두께는 80㎛ 이상으로, 정상군의 표피 두께와 대비하여 현저히 증가하였다. 그러나 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2의 경우에는 대조군에 비해 표피 두께가 DNA 단편 혼합물 처리 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 3(A)의 조직 사진에서, 대조군의 경우, 표피 최상위 층의 세포 수가 증가하였고, 이는 표피의 과각화가 일어나는 것으로 추측할 수 있었으며, 진피(dermis) 위층에 세포핵이 많이 관찰되는 것을 통해 면역세포가 진피의 위층으로 이동하여 면역반응이 활발히 일어나는 것으로 예상되었다. 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2는 대조군에 비해 면역세포가 덜 침투하여 21일차에는 이미 병변이 많이 줄어들었다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4-2. 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 효과 확인
상기 실시예 1-2의 29일차의 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스의 귀 조직을 채취하여, 상시 실시예 4-1과 같이 H&E로 염색한 후, 표피의 두께를 측정하여, 그 결과를 도 3(C) 및 도 3(D)에 나타내었다.
도 3(C)의 조직 사진 및 도 3(D)의 귀 조직의 표피 두께를 측정한 결과에서 보여주듯이, 대조군의 표피 두께가 정상군에 비해 3배 정도 증가하였으나, 실험군 1 및 실험군 2의 표피 두께는 정상군과 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 3(C)의 조직 사진에서, 대조군의 경우, 정상군에 비해 세포의 수가 증가되었고, 이는 면역세포가 진피로 이동하여 면역반응이 활발히 일어나는 것으로 예상된다. 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2의 경우에는 대조군에 비해 세포수가 감소되었고, 이는 아토피 피부염이 DNA 단편 혼합물에 의해 호전되었다는 것을 의미한다.
상기 실시예 4-1 및 실시예 4-2의 결과를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 피부 장벽의 기능 손실 및 면역 기능 장애를 완화시킴으로써 아토피 피부염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5. 비만세포를 이용한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
비만세포(mast cell)는 즉시형 알레르기 반응을 유발하는 세포로 히스타민, 키나아제(kinase) 등의 단백질분해효소, 헤파린 등과 같은 알레르기 반응과 관련된 다양한 물질들을 방출하여 알레르기 증상을 일으킨다. 따라서, 본 발명의 DNA 단편 혼합물 처리에 따른 비만세포의 수의 변화를 관찰함으로써, 아토피 피부염 치료 효과를 확인하였다.
상기 실시예 1-1의 21일차의 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스의 등 피부 조직을 채취하여 파라핀(paraffin)으로 고정시킨 조직 절편을 탈파라핀(deparaffinization)시킨 후, 0.1% 톨루이딘 블루(toluidine blue) 용액(1% NaCl, pH 2.3, 70% 에탄올, 0.1% 톨루이딘 블루)에 넣고 2~3분간 염색하였다. 염색이 끝난 조직 절편을 증류수로 5분씩 3회 세척한 뒤, 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 자일렌(xylene) 용액으로 각 1회(회당 5분)씩 세척하여 탈수소화(dehydration)시켰다. 염색이 완료된 조직을 현미경으로 관찰 한 후 사진을 찍고, 사진을 Image J 프로그램을 이용하여 진피층에 존재하는 비만세포의 수를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 조직 사진(A) 및 비만세포의 수를 측정한 결과(B)에서 보여주듯이, 대조군의 경우, 정상군에 비해 진피층에 존재하는 비만세포의 수가 현저히 증가하였고, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2의 비만세포의 수는 DNA 단편 혼합물 처리 농도에 따라 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명이 DNA 단편 혼합물은 진피층의 비만세포의 수가 증가하는 것을 억제함으로써 아토피 피부염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6. 필라그린 발현 관찰을 통한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
필라그린(filaggrin)은 프로필라그린으로부터 만들어지는 단백질로 피부의 과립층(granular layer) 위쪽에서만 발현된다. 필라그린은 각질세포 분화와도 밀접한 관계가 있으며, 필라그린 복합체는 단량체로 분해되고, 단량체의 필라그린은 천연수분인자로 변환되어 피부 장벽기능의 발현을 확인할 수 있는 물질이다. 따라서, 본 발명의 DNA 단편 혼합물의 처리에 따른 필라그린의 발현 변화를 관찰함으로써 아토피 피부염에 대한 치료 효과를 관찰하였다.
상기 실시예 5의 탈파라핀화 시킨 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스의 등 피부 조직 절편을 5% BSA(bovine serum albumin)로 1시간 동안 블로킹(blocking) 시킨 후, 필라그린 1차 항체를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나며 조직 절편을 PBS(phosphate buffer saline)로 5분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광이 표지된 2차 항체를 1시간 동안 처리하였다. 2차 항체 처리가 끝나면 다시 PBS로 세척하고, 퍼마운트(Permount, SP15, Fisher scientific)로 봉입(mounting)하고 형광현미경을 이용하여 필라그린의 발현을 관찰하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, DAPI(4',6'-diamidino-2'-phenylindole)를 이용하여 피부 세포를 함께 염색하였다.
도 5에서 보여주듯이, 정상군에서는 각질층 윗부분에서 필라그린이 발현되나 대조군에서는 필라그린 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2에서는 필라그린의 발현이 대조군에 비해 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 필라그린의 발현 양을 증가시킴으로써 피부 장벽 기능을 향상시킨다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 7. SPINK5 단백질 발현 확인을 통한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
SPINK5(Serin protease inhibitor KazaL-type 5)는 아토피 피부염에서 피부 박리를 조절하는 단백질 분해효소를 억제하여 피부 장벽을 강화하도록 하는 중요한 인자이다. 따라서, SPINK5의 단백질 발현을 확인함으로써 본 발명의 DNA 단편 혼합물의 아토피 피부염 치료 효과를 확인하였다.
상기 실시예 1-1의 21일차의 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스의 등 조직을 채취하여 균질화(homogenization) 시킨 후, 단백질을 추출하고 동일량의 단백질을 SDS-PAGE 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 통해 크기별로 분리하였다. 크기별로 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인(polyvinylidene fluoride membrane)으로 이동(transfer)시켰다. 멤브레인을 상온에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹 시킨 다음 상온에서 2시간 동안 SPINK5 항체와 반응 시켰다. 이때, 로딩 대조군으로 튜불린(tubulin)을 확인하기 위해 튜불린 항체를 이용하였다. 이후 1차 항체를 세척하고 해당 2차 항체를 반응 시킨 후 ECL(enhanced chemiluminescence system)을 이용하여 SPINK5 단백질 밴드를 확인하였고, 밴드의 밀도를 측정하여 로딩 대조군인 튜불린 대비 SPINK5 단백질의 양(SPINK5/튜불린)을 계산하여 도 6에 그래프로 나타내었다.
도 6에서 보여주듯이, 대조군의 경우 정상군에 비해 SPINK5 단백질의 발현이 현저히 감소하는 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2의 경우에는 DNA 단편 혼합물 처리 농도 의존적으로 SPINK5 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 아토피 피부염에서 SPINK5 단백질의 발현을 증가시켜 단백질분해효소의 활성을 억제함으로써 피부 장벽 기능을 향상시킨다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 8. 혈액 내 IgE 및 IL-4 단백질 발현 확인을 통한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
실시예 8-1. DNCB 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 발현 확인
아토피 피부염의 마커로 사용되는 IgE와 급성 아토피 피부염에서 면역 기능 장애로 인한 보조 T2 세포(Th2)의 과활성화로 인해 생성되는 사이토카인 중 하나인 IL-4의 혈액 내 발현량을 ELISA 키트(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 측정하였다.
상기 실시예 1-1의 21일차의 DNCB 유도 아토피 피부염 마우스로부터 혈액을 채취하고, 채취한 혈액을 8,000rpm으로 15분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하였다. 분리한 혈장을 IL-4와 IgE ELISA 키트(eBioscience 사)에 적용하여 혈액 내 IgE 및 IL-4 단백질 발현량을 측정하고, 그 결과를 도 7(A) 및 도 7(B)에 나타내었다. 이때, 실험방법은 ELISA 키트 제조사에서 제공하는 방법대로 실험을 진행하였다.
도 7(A)의 IgE의 발현량의 경우, 정상군에 비해 대조군에서 크게 증가하는 것을 확인하였고, 본 발명이 DNA 단편 혼합물을 처리한 경우, 농도 의존적으로 IgE의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 7(B)의 IL-4의 발현량의 경우, 정상군에 비해 대조군에서 크게 증가하였고, 실험군 1 및 실험군 2와 같이 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 경우에는 IL-4의 발현량이 감소하였다.
실시예 8-2. 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스 모델에서의 발현 확인
상기 실시예 1-2의 29일차의 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스로부터 채취한 혈액을 이용하였고, 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 7(C) 및 도 7(D)에 나타내었다.
도 7(C)의 IgE의 발현량의 경우, 정상군에 비해 대조군에서 크게 증가하였고, 비교군 1 및 비교군 2에서는 대조군과 비슷한 수준으로 유지되는 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2의 경우에는 대조군에 비해 IgE의 양이 감소하였고, 이러한 감소는 본 발명의 DNA 단편 혼합물 처리 농도 의존적으로 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 도 7(D)의 IL-4의 발현량의 경우, IgE와 마찬가지로, 정상군에 비해 대조군, 비교군 1 및 비교군 2에서 크게 증가한 반면에, 실험군 1 및 실험군 2와 같이 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 경우에는 IL-4의 발현량이 정상군과 비슷한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
상기 실시예 8-1 및 실시예 8-2의 결과를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 급성 아토피 피부염에 관련되어 있는 보조 T2 세포(Th2)의 과활성화로 인한 사이토카인의 생성을 억제함으로써 아토피 피부염에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 9. 아토피 피부염 관련 사이토카인의 mRNA 발현 확인을 통한 아토피 피부염 치료 효과 확인>
아토피 피부염의 진행 정도와 관련되어 있는 사이토카인 중 IL-13(급성 아토피 피부염에서 발현 증가) 및 IFN-γ(만성 아토피 피부염에서 발현 증가)의 mRNA 발현량을 확인하였다.
상기 실시예 1-2의 29일차의 옥사졸론 유도 아토피 피부염 마우스의 귀 조직을 균질화한 후, 조직으로부터 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)을 수행하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| IL-13(F) | AGC TGA GCA ACA TCA CAC AAG AC |
| IL-13(R) | GGC CAG GTC CAC ACT CCA T |
| IFN-γ(F) | CAA CAG CAA GGC GAA AAA GG |
| IFN-γ(R) | CCT CAG CAA GGC GAA AAA GG |
도 8에서 보여주듯이, IL-13(A) 및 IFN-γ(B) mRNA 발현량이 정상군에 비해 대조군에서 증가하였고, 본 발명의 DNA 단편 혼합물의 분자량을 벗어난 DNA 단편 혼합물을 처리한 비교군 1과 비교군 2는 IL-13 및 IFN-γ의 발현율이 대조군과 비슷한 수준인 반면에, 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 처리한 실험군 1 및 실험군 2의 경우에는 DNA 단편 혼합물 처리 농도 의존적으로 IL-13(A) 및 IFN-γ(B) mRNA 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 DNA 단편 혼합물이 급성 및 만성 아토피 피부염 모두에 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
<제조예 1. 약학적 제제>
제조예 1-1. 연고 제형 약학적 제제
조제용기에 백색 바셀린 15중량%, 세토스테아릴알콜 10중량%, 경질유동파라핀 7중량% 및 세토마크로골 1.5중량%를 약 65℃로 가온하여 용융시킨 다음 용융된 액을 100 메쉬체로 여과하였다. 별도의 용기에 정제수를 붓고 본 발명의 DNA 단편 혼합물 1중량%를 넣어 교반하고 용해시킨 다음 조제용기에 투입하였다. 또 다른 별도의 용기에 95℃의 열탕 정제수에 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.12중량%, 파라옥시안식향산프로필에스테르 0.08중량%를 용해시켜 조제용기에 투입한 다음 약 20분 동안 교반 시킨 후 호모게나이저로 약 20분 동안 2500rpm의 속도로 유화시킨 다음 유화가 완료되면 천천히 교반하면서 냉각하였다.
제조예 1-2. 정제의 제조
본 발명의 DNA 단편 혼합물 100g을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활성 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제조예 2. 화장료 조성물의 제조>
제조예 2-1. 영양 로션의 제조
프로필렌글리콜 3중량부, 크로복시폴리머 0.1중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80℃ 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 10중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5중량부, 유동 파라민 10중량부, 솔비탄 스테아레이트 1중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5중량부, 스테아린산 1.5중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1중량부, 트리에탄올아민 0.2중량부, 키토산 1중량부를 80℃ 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
제조예 2-1. 영양 크림의 제조
카르복시폴리머 0.3중량부, 부틸렌글리콜 5중량부, 글리세린 3중량부 및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80℃ 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2중량부, 세틸알콜 2중량부, 글리세릴모노스테아레이트 2중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1중량부, 왁스 1중량부, 유동파라핀 4중량부, 스쿠알란 4중량부, 카프릴릭/키프릭트리글리세라이드 4중량부, 키토산 1중량부를 80℃ 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 본 발명의 DNA 단편 혼합물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
Claims (8)
- 어류의 정소 또는 정액에서 분리한 50~3,500kDa의 분자량으로 저감된 단편이 혼합되어 있는 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 급성 및 만성 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 어류는 연어과인 것을 특징으로 하는 급성 및 만성 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 DNA 단편 혼합물은 IL-4(interleukin-4), IL-13 및 IFN-γ(interferon-γ)를 감소시키는 것을 특징으로 하는 급성 및 만성 아토피 피부염 예방 또는 치료용 조성물. - 어류의 정소 또는 정액에서 분리한 50~3,500kDa의 분자량으로 저감된 단편이 혼합되어 있는 DNA 단편 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 급성 및 만성 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 어류는 연어과인 것을 특징으로 하는 급성 및 만성 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 DNA 단편 혼합물은 IL-4, IL-13 및 IFN-γ를 감소시키는 것을 특징으로 하는 급성 및 만성 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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