TWI418627B - 促進液態培養雲芝胞外多醣肽與胞內多醣肽之培養基組合及其生產方法 - Google Patents
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本發明所屬之技術領域為藥用菌類多醣肽，更特定而言，係關於雲芝胞外多醣肽(EPS)及胞內多醣肽(IPS)促進其產量之培養基組合物及生產之方法。
雲芝學名為Trametes versicolor(syn.Coriolus versicolor)，寄生於腐木，為白色菌絲體，生長分佈於全世界，是一種廣泛使用之藥用真菌(Wasser,& Weis,1999)。雲芝子實體生長緩慢，且價格昂貴。以液態培養方式所生產之雲芝多醣肽已知具有免疫調節與抗腫瘤之生物活性(Cui,& Chisti,2003)。雲芝多醣肽可從不同雲芝品系如CM-101(ATCC 20547)或Cov-1分離(Kobayashi,Matsunaga,& Fujii,1993；Cui,& Chisti,2003；Moradali,Mostafavi,Ghods,& Hediaroude,2007)。多醣肽中之多醣體以α(1→4)及β(1→3)之鍵結，於體外、體內及臨床實驗上已證實其具免疫調節活性(Hsieh,Wu,Park,& Wu,2006)。從雲芝菌株Cov-1品系製備所得之多醣肽可增加免疫細胞介白素IL-1β及IL-6之分泌量，且誘發人類HL-60淋巴癌細胞之細胞凋亡(apoptosis)(Hsieh,Kunicki,Darzynkiewicz,& Wu,2002)。
動物體內實驗中，從餵食多醣肽之老鼠分離出之巨噬細
胞，含有活性氮中間體(reactive nitrogen intermediates，RNI)、超氧化物陰離子(superoxide anions)及腫瘤壞死因子-γ(Tumor Necrosis Factor-γ，TNF-γ)(Liu,Ng,Sze,& Tsui,1993)。雲芝的多醣肽可以活化巨噬細胞、刺激分泌細胞激素TNF-γ、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)及介白素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)，這些細胞激素係用以對抗細胞增生及引起細胞凋亡及分化。雲芝多醣肽可引起免疫系統非專一性防禦及透過服用者本身免疫系統進而產生抗腫瘤作用(Ng,1998)。
一般真菌深層發酵槽培養，其菌絲體生長及胞外多醣肽生產受培養條件環境及培養基組成影響。以牛肝菌(Boletus spp)為例，進行培養所產生之菌絲體及胞外多醣肽受如溫度、攪拌速度及起始pH值等因子影響(Wang,& Lu,2005)。不同雲芝菌株品系Wr-74和ATCC-20545，利用乳清添加於培養基中可影響其菌絲體及胞外多醣肽之產量(Cui,Goh,Archer,& Singh,2007)，培養其間亦可影響雲芝多醣肽之抗腫瘤活性(Lee et al.,2006)。過去雲芝液態培養過程中，其胞內多醣肽或胞外多醣肽之產量不高，亦未有在相同培養條件下，同時生產其胞內多醣肽與胞外多醣肽。
本案發明人自台灣南投山區採集不同雲芝子實體，經分
離培養後發現其中一雲芝菌株品系LH1，生長快速且菌絲體產量高，經食品工業發展研究所生物資源保存中心鑑定其學名為Trametes versicolor(L.)Lloyd【菌種鑑定報告如附送書件】，研究發現能產生新穎胞外多醣肽(簡稱ePSP-Cv)，且在所採用之培養基條件下具有較高之產物比生成率與促進細胞激素分泌之免疫調節活性(Lin et al.,2008)。為進一步提高其產量與同步開發其菌絲體中之胞內多醣肽，本發明將培養基中碳源與氮源種類與濃度組合最適化，經由5公升發酵槽產程證實，胞外多醣肽產量較原始基礎培養基配方提高26.39%，胞內多醣肽產量較原始基礎培養基配方提高23.45%。
目前寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存中心，寄存編號為BCRC930112。
刮取上述保存之雲芝菌種，將其接種於培養基，在25℃溫度下，於恆溫震盪培養箱中以振盪速率150rpm振盪培養5天做為種菌。
其中該培養基之一實施配方如下：
將上述培養基以10%種菌接種量，於500mL錐形燒瓶中進行培養(溫度25℃；攪拌速率150rpm；培養基量100mL)。將培養7天後之醱酵培養液，以6000rpm離心30分鐘，可得菌絲體及上清液。將上清液經四倍量的95%酒精，澱析24小時後再經離心，沉澱物依據Dubois等人(1956)「酚硫酸法(phenol-sulphuric acid method)」及AOAC方法(1995)分析其中含多醣及蛋白質組成，沉澱之多醣肽即為胞外多醣肽(extracellular polysaccharopeptides，EPS)。
將發酵液以離心機6000rpm離心10min，所得菌絲體以無菌水沖洗三次，再次離心所得之菌絲體冷凍乾燥，取0.1g菌絲體加入10mL蒸餾水中，置於滅菌釜熱萃30分鐘(121℃)，重複上述步驟，再經抽氣過濾，收集濾液，取此菌絲體熱水萃取液，取1mL加入4mL的95%乙醇，於4℃靜置24小時後，以7000rpm離心10min，去除上清液，加入1mL R.O水，置於-18℃冷凍櫃下冷凍後進行冷凍乾燥，沉澱之多醣肽即為胞內多醣肽(intracellular polysaccharopeptides，IPS)。
將醱酵培養液以6000rpm離心30分鐘，可得菌絲體及上清液。將菌絲體加入10ml去離子水懸浮清洗，以6000rpm離心30分鐘，重複三次。所得菌絲體冷凍乾燥後秤重，即為菌絲體生質量。
本發明中之實驗數據以Statistical Analysis System 6.0軟體進行分析，以ANOVA作變異分析，並以Duncan’s multiple range test做平均值顯著性差異之比較(p<0.05)。
將基礎培養基中葡萄糖碳源分別以果糖、蔗糖與乳糖替代，分析其對於雲芝胞外多醣肽(EPS)、胞內多醣肽(ISP)及菌絲體生質之影響，結果如表一所示。
在四種培養基碳源中，以蔗糖所產生之胞外多醣肽產量
4.03±0.21mg/L最高，以葡萄糖所產生之胞內多醣肽產量4.03±0.21mg/L最高。
過去文獻中，雲芝菌株品系INETI培養於酵母麥芽培養基中只能產生0.70g/L胞外多醣肽(Tavares,Coelho,Agapito,Coutinho & Xavier,2005)；雲芝菌株品系Wr-74及ATCC-20545，培養於添加乳清之培養基中能產生1.15和1.32g/L胞外多醣肽(Cui,Goh,Archer,& Singh,2007)，但產量均較本發明之胞外多醣肽產量4.03g/L為低。
依據實施例一之結果，選擇較有利於雲芝胞外多醣肽生成之蔗糖為碳源，進一步探討最適合之碳源濃度對雲芝胞外多醣肽(EPS)、胞內多醣肽(ISP)及菌絲體生質之影響，結果如表二所示。原始基礎培養基中之碳源濃度為4%，於本發明中亦顯示4%碳源濃度較有利於雲芝胞外多醣肽生成，其產量為4.11±0.25mg/L。4%碳源濃度時雲芝胞內多醣肽與菌絲體生質之產量則分別為75.19±3.41mg/g與12.35±0.79g/L。
將基礎培養基中氮白胨氮源分別以酵母萃出物、玉米漿(corn steep liquor)與硫酸銨替代，分析其對於雲芝胞外多醣肽(EPS)、胞內多醣肽(ISP)及菌絲體生質之影響，結果如表三所示。
在四種培養基氮源中，以蛋白胨所產生之胞外多醣肽產量4.13±0.23mg/L最高，其亦最有利於雲芝胞內多醣肽與菌絲體生質生成，其產量分別為75.26±3.47mg/L與12.37±0.49g/L。
依據實施例三之結果，選擇較有利於雲芝胞外多醣肽生成之蛋白胨為氮源，進一步探討最適合之氮源濃度對雲芝胞外多醣肽(EPS)、胞內多醣肽(ISP)及菌絲體生質之影響，結果如表四所示。原始基礎培養基中之氮源濃度為0.3%，於本發明中亦顯示0.4%氮源濃度較有利於雲芝胞外多醣肽生
成，其產量為4.18±0.57mg/L。對雲芝胞內多醣肽與菌絲體生質較適合之氮源濃度則為0.8%，其產量則分別為83.14±4.98mg/g與12.79±0.52g/L。
將培養基中之碳源蔗糖濃度4%固定，以蛋白胨為氮源，分別以15：1、20：1、25：1及30：1四種比例探討最適合之碳氮比對雲芝胞外多醣肽(EPS)、胞內多醣肽(ISP)及菌絲體生質之影響，結果如表五所示。
結果顯示培養基碳氮比為25：1時，雲芝胞外多醣肽與胞內多醣肽之產量皆為最高，分別為4.26±0.31mg/L與
82.68±4.89mg/g。
依據實施例五所得之實驗結果，進一步以5公升發酵槽進行產程發酵，於五公升發酵槽中加入三公升之最適化培養基組合，接入10%種菌，溫度控制於25℃，通氣量為1vvm，攪拌轉速100rpm，培養12天，結果如圖一所示。
結果顯示雲芝胞外多醣肽於培養第四天至第六天期間產量顯著增加，至第十天有最高之產量4.31mg/L，此一產量與原始基礎培養基產量3.41±0.14mg/L比較，增加26.39%；
雲芝胞內多醣肽於培養第二天開始其產量及逐漸增加，亦於第十天有最高之產量92.19mg/g，此一產量與原始基礎培養基產量74.68±3.79mg/g比較，增加23.45%。
1. Cui, J. and Chisti, Y. (2003) Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses and production. Biotechnology Advances, 21(2), 109-122.
2. Cui, J., Goh, K. K., Archer, R. and Singh, H. (2007) Characterisation and bioactivity of protein-bound polysaccharides from submerged-culture fermentation of Coriolus versicolor Wr-74 and ATCC-20545 strains. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 34(5), 393-402.
3. Hsieh, T. C., Kunicki, J., Darzynkiewicz, Z. and Wu, J. M. (2002) Effects of extracts of Coriolus versicolor (I'm-Yunity) on cell-cycle progression and expression of interleukins-1 beta-6, and -8 in promyelocytic HL-60 leukemic cells and mitogenically stimulated and nonstimulated human lymphocytes. Journal of Alternative and Complementary Medicine, 8(5), 591-602.
4. Hsieh, T. C., Wu, P., Park, S. and Wu, J. M. (2006) Induction of cell cycle changes and modulation of apoptogenic/anti-apoptotic and extracellular signaling regulatory protein expression by water extracts of I'm-YunityTM (PSP). BMC Complementary and Alternative Medicine, 6, 30.
5. Kobayashi, H., Matsunaga, K. and Fujii, M. (1993) PSK as a chemopreventive agent. Cancer Epidemiology, Biomarkers Prevention, 2(3), 271-276.
6. Lee, C. L., Yang, X. and Wan, M. F. (2006) The culture duration affects the immunomodulatory and anticancer effect of polysaccharopeptide derived from Coriolus versicolor. Enzyme and Microbial Technology, 38(1-2), 14-21.
7. Lin, F. Y., Lai, Y. K., Yu, H. C., Chen, N. Y., Chang, C. Y., Lo, H. C. and Hsu,
T. H. (2008) Effects of Lycium barbarum extract on production and immunomodulatory activity of the extracellular polysaccharopeptides from submerged fermentation culture of Coriolus versicolor. Food Chemistry. 110(2), 446-453.
8. Liu, W. K., Ng, T. B., Sze, S. F. and Tsui, K. W. (1993) Activation of peritoneal macrophages by polysaccharopeptide from the mushroom, Coriolus versicolor. Immunopharmacology, 26(2), 139-146.
9. Moradali, M. F., Mostafavi, H., Ghods, S. and Hedjaroude, G. A. (2007) Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi (macrofungi). International Immunopharmacology, 7 (6), 701-724.
10. Ng, T. B. (1998) A review of research on the protein-bound polysaccharide (polysaccharopeptide, PSP) from the mushroom Coriolus versicolor (Basidiomycetes: Polyporaceae). General Pharmacology, 30(1), 1-4.
11. Wang, Y. X. and Lu, Z. X. (2005) Optimization of processing parameters for the mycelial growth and extracellular polysaccharide production by Boletus spp.ACCC 50328. Process Biochemistry, 40(3-4), 1043-1051.
12. Wasser, S. P. and Weis, A. L. (1999) Therapeutic effects of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective. Critical Reviews in Immunology, 19(1), 65-96.
EPS‧‧‧胞外多醣肽
IPS‧‧‧胞內多醣肽
圖一：5公升發酵槽中雲芝胞外多醣肽(ESP)、胞內多醣肽(ISP)及菌絲體生質於最適化培養基組合中產程變化
EPS‧‧‧胞外多醣肽
IPS‧‧‧胞內多醣肽
Claims (7)
- 一種同步生產高產量雲芝(Trametes versicolor)菌種品系LH1胞外多醣肽與胞內多醣肽液態培養之培養基組合物，該培養基組合物組成為4%葡萄糖(glucose)、0.3%蛋白腖(peptone)、0.15%磷酸二氫鉀(KH2PO4)及0.15%硫酸鎂(MgSO4 7H2O)。
- 如申請專利範圍第1項所述之培養基組合物，其中之雲芝菌種品系LH1寄存於食品工業發展研究所生物資源保存中心，登錄號碼為BCRC 930112。
- 一種如申請專利範圍第2項所述雲芝菌種品系所產生之多醣肽，係將雲芝菌種品系LH1經如申請專利範圍第1項培養基組合物進行液態培養後，分離自菌絲體或發酵培養液之產物者。
- 一種雲芝(Trametes versicolor)菌種品系LH1多醣肽生產方法，包含：i.配製液態培養基：如申請專利範圍第1項所述之培養基組合物；ii.接種10%雲芝菌種品系LH1於該液態培養基中；iii.於溫度25℃及攪拌速率150rpm條件下進行液態培養；以及iv.分離經液態培養後之產物者。
- 如申請專利範圍第4項所述之雲芝菌種品系LH1多醣肽 生產方法，該雲芝菌種品系寄存於食品工業發展研究所生物資源保存中心，登錄號碼為BCRC 930112。
- 一種雲芝胞外多醣肽組合物，其包含如申請專利範圍第3項所述之多醣肽，及稀釋劑、賦型劑或載體。
- 一種雲芝胞外多醣肽組合物，其包含如申請專利範圍第4項所述之生產方法所得之多醣肽，及稀釋劑、賦型劑或載體。
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| Lin et al., "Effects of Lycium barbarum extract on production and immunomodulatory activity of the extracellular polysaccharopeptides from submerged fermentation culture of Coriolus versicolor." Food Chemistry 110 (2008) 446-453. * |
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