TWI725580B

TWI725580B - 重組微生物、其代謝物、及其用於治療或/及預防脂肪肝及心血管疾病之用途

Info

Publication number: TWI725580B
Application number: TW108137675A
Authority: TW
Inventors: 李美芳; 林維文; 宋沛澎; 劉星君
Original assignee: 臺中榮民總醫院
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-04-21
Also published as: CN112680390A; TW202117001A; CN112680390B

Abstract

本發明之主要目的係在於提供一種新穎重組微生物，其係具有高安全性而被用以作為醫藥組合物之有效成分，或是作為表現外源基因之平台，舉例來說，該新穎重組微生物具有核苷酸序列編碼為SEQ ID No.：1之外源基因，而能夠表現胺基酸序列係編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質。

Description

重組微生物、其代謝物、及其用於治療或/及預防脂肪肝及心血管疾病之用途

本發明係有關於重組微生物及其用途，特別係指一種重組微生物、其代謝物、及其用於治療或/及預防脂肪肝及心血管疾病之用途。

按，粥狀動脈硬化係為膽固醇沈積於血管內皮細胞下層，氧化造成之發炎性疾病；脂肪肝則是體內脂肪儲存於肝細胞所造成之發炎性疾病。目前臨上對於粥狀動脈硬化之治療方法係多以投予他汀類藥物作為降脂療法（Lipid-lowering therapy），意即透過投予藥物降低低密度膽固醇或是提昇高密度膽固醇，但是實際治療效果都不彰；而目前臨床上未有直接治療脂肪肝之藥物，僅能針對脂肪肝所造成之病徵進行症狀改善或控制；換言之，目前臨床上對於粥狀動脈硬化或脂肪肝僅有提供改善症狀之治療方法。

更進一步來說，為能使該外源基因能夠於乳酸菌表現系統產製出胺基酸序列係編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質，該外源基因係經過人工設計並進行人工合成而得到。

本發明之另一目的係在於提供該新穎重組微生物或其代謝物之用途，其係能夠抑制脂肪堆積於血管壁或肝臟細胞，用以有效地達到改善或治療脂肪肝、粥狀動脈硬化之功效。

換言之，本發明所揭新穎重組微生物或其代謝物係具有抑制發炎因子表現、抑制脂肪細胞生成、保護肝臟及血管組織等功效，故得應用於治療或預防與脂肪代謝相關之疾病的醫藥組合物。

為能達成上述目的，於本發明之一實施例中，本發明係揭露一種重組微生物，其係具有一外源基因之乳酸菌，而能表現如胺基酸序列係編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質，其中，該外源基因之核苷酸序列編碼為SEQ ID No.：1。

於本發明之一實施例中，該重組微生物係為一符合食品等級標準之乳酸菌所製備而成。

於本發明之另一實施例中，該重組微生物係以下列步驟所製備而成：

步驟a：取得該外源基因；

步驟b：構築一重組載體，其包含有該外源基因；

步驟c：將該重組載體導入一乳酸球菌內，使該乳酸球菌能夠表現該外源基因。

為能使本發明所揭重組微生物或其代謝物能夠供個體所利用，於本發明之實施例中係提供一種醫藥組合物，其包含有一有效量之該重組微生物或其代謝物，及至少一藥學上可接受之載體，其中，該代謝物中係包含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2之蛋白質。

更進一步來說，於本發明之一實施例中係揭露該重組微生物或其代謝物之用途，其係能夠用於治療或預防脂肪肝或是粥狀動脈硬化，其中，該代謝物中係包含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2之蛋白質。

本發明所揭重組微生物係為將能夠含有SEQ ID No.1所示外源基因之重組乳酸菌，如重組乳酸球菌（Lactococcus lactis），而為能使該外源基因能夠順利地於乳酸菌中表現，該外源基因係經人為設計合成而得，並且透過該重組微生物表現該外源基因，可使該重組微生物之代謝物中含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2之蛋白質。

更進一步來說，由於該重組微生物能夠表現該外源基因，或該重組微生物之代謝物中含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2之蛋白質，係能夠抑制肝細胞之IL-1β表現、減少脂肪堆積於肝細胞、降低發炎細胞浸潤，並且能夠使動脈內壁厚度下降、減少血管內皮細胞下層之泡沫細胞（foam cells）之數量，因而能夠達到治療或/及預防該生物體粥狀動脈硬化、脂肪肝、心血管相關疾病之功效。換言之，該重組微生物或其代謝物係能夠被開發作為一醫藥組合物，如疫苗等，亦能夠被開發成為一營養補充品。

所謂「重組微生物」，係指將一外源基因導入一微生物之基因組中，並使該重組微生物能夠表現該外源基因，一般來說，導入該外源基因之人為手段包含有基因工程（或稱遺傳工程）技術，例如利用載體攜帶該外源基因進入一微生物，而載體得為一分子量小之DNA片段，如質體、病毒DNA等；而該微生物係得為乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌等細菌。

所謂「醫藥組合物」，係指包含一有效量之欲產生特定效果之所需化合物或活性成份，以及至少一藥學上能接受之載體。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，醫藥組合物之型態得隨著欲引起特定效果之投予方式有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著醫藥組合物之型態而得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。

所謂「有效量」，係指欲產生所求特定效果所需化合物或活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。依據本發明所屬技術領域之通常知識，該有效量會因為欲引起特定效果之投予方式而有所不同，舉例來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%

所謂「人工合成方式」乙詞係為以本發明所屬技術領域且具通常知識者之周知技術，透過人工方式將胺基酸依序連接而成為一多胜肽，其中，人工合成方式包含化學合成法以及胜肽合成儀。

以下，為能更為詳細說明本發明之技術特徵及其功效，將茲舉若干實例並搭配圖表作更進一步說明如后。

於下列實例中所使用之乳酸球菌NZ3900及質體pNZ8149係自MoBiTec（Goettingen, Germany）購入，其中，乳酸球菌NZ3900為食品等級之標準菌株；質體pNZ8149包含有lacF gene，其於乳糖上生長能用於作為食品等級篩選用，以及nisA啟動子，用以表現nisin誘導基因。

以下實例中之動物試驗係經過台中榮民總醫院（台灣）動物照護及使用委員會審查並通過（La-1071566）。

實例一：製備重組乳酸球菌

以修飾序列之方式合成Ganoderma lucidum之LZ8蛋白之編碼基因（encoding gene），而其修飾方式係以乳酸球菌之最優化密碼子利用（optimized codon usage）為基礎，以人工合成方式合成一基因編碼為SEQ ID No.：1之LZ8蛋白片段，長度為335bp，而能夠轉譯出之LZ8蛋白片段之胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:2。

將LZ8蛋白片段之編碼基因克隆至pNZ8149載體之NcoI/XbaI 位點，並以DNA分析儀（ABI Prism 3700）確認後，得到一構築好之重組質體pNZ81490。將該重組質體pNZ81490以電穿孔法轉形至乳酸球菌NZ3900，將經電穿孔之混合物置於Eliker培養盤上，於30℃下培養48小時，觀察到呈現黃色之乳糖陽性菌落，確認得到一LZ8重組乳酸球菌NZ3900。

實例二：蛋白質表現試驗

將LZ8重組乳酸球菌NZ3900培養於30℃下，培養基為M17培養基，其內含有0.5%乳糖，LZ8重組乳酸球菌NZ3900生長至OD600為0.5為止，並用不同濃度的乳酸鏈球菌素(Nisin)：0~50ng/ml(Sigma，密蘇里州，美國)誘導1~20小時。而以於上述相同方式處理帶有空白質體(empty plasmid)之乳酸球菌NZ3900，作為控制組。

將經上述處理之細胞透過兔抗LZ8多株抗體進行免疫檢測，用以檢測各細胞之蛋白表現，並利用純化之大腸桿菌來源的LZ8蛋白片段(胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2)作為蛋白值檢測之定量標準，結果如圖1所示。

更進一步者，為後續之口服疫苗接種定量，將經上述處理之細胞沉澱以磷酸鹽緩衝液清洗，由免疫墨點法(immunoblotting)檢測LZ8重組乳酸球菌NZ3900於乳酸鏈球菌素誘導不同時間下之LZ8蛋白片段表現量，結果如圖2所示。

由圖1之結果可知，胺基酸序列編碼為SEQ ID No.2之LZ8蛋白片段的大小約為15kDa，於野生乳酸球菌NZ3900中並未檢測到任何電泳帶(band)，而LZ8重組乳酸球菌NZ3900則於約15kDa處出現電泳帶(band)。

由圖2之結果可知，LZ8重組乳酸球菌NZ3900經乳酸鏈球菌素誘導之LZ8蛋白片段最佳表現量為1μg/2 x 10¹⁰菌落單位，並可持續4小時。進而由動物與人體換算有效劑量之公式，可知LZ8重組乳酸球菌NZ3900用於人體之有效菌量至少為1.2x10¹¹。

實例三：動物試驗

取12隻雄性紐西蘭白兔，各白兔之體重約2.45±0.30公斤，隨機分為3組，試驗期間為35天(共5週)。於試驗期間，各組白兔皆以添加2%膽固醇、1%膽酸和0.5%硫尿嘧啶之市售飼料餵食，並於口服疫苗前4小時須進食，每週須投予5次，而投予至各組白兔之口服疫苗的內容物說明分別如下：

空白組：15％蔗糖糖漿；

控制組：含有15％蔗糖糖漿之2x10 ¹⁰乳酸球菌NZ3900懸浮液；

LZ8組：含有15％蔗糖糖漿之2x10 ¹⁰LZ8重組乳酸球菌NZ3900懸浮液。

於試驗期間定期測量各組白兔體重，並自各組白兔耳緣靜脈收集血液，分離出血清，進行血液生化值檢測；於試驗期間後，犧牲各組白兔，分別取其主動脈、主動脈弓至胸主動脈、肝臟等，以進行後續分析。

各組白兔於試驗期間之體重、血液生化值如下表一所示；各組白兔的肝臟組織以H&E染色法進行染色，結果如圖3所示。

由表一之結果可知，於投予含有2％膽固醇飼料3週後，各組白兔之總膽固醇及低密度膽固醇都明顯升高，但是高密度膽固醇與三酸甘油脂未有顯著之增加；而就肝臟功能來說，於投予含有2％膽固醇飼料3週後，空白組與控制組之白兔血清內AST與ALT之含量都明顯增加，但是LZ8組之白兔卻沒有增加，換言之，於高脂飲食下，投予本發明所揭LZ8重組乳酸球菌NZ3900係對於AST與ALT之活性沒有不良影響

再者，由圖3之結果可知，於投予含有2％膽固醇飼料5週後，空白組或控制組白兔之肝臟細胞切片染色圖中有明顯之脂肪堆積，而於LZ8組白兔之肝臟細胞切片染色圖中則幾乎觀察不到脂肪堆積之現象。

根據表1及圖3之結果，顯示本發明所揭LZ8重組乳酸球菌NZ3900或其表現之LZ8蛋白片段係能夠保護肝臟細胞免於受到高脂飲食影響而受到破壞、避免脂肪堆積於肝臟，並維持肝臟功能正常，而能夠達到治療或預防如脂肪肝等之肝臟相關疾病之功效。

表一：各組白兔於試驗期間之體重與血液生化值之檢測結果

	空白組	控制組	LZ8組
	第0週	第3週	第5週	第0週	第3週	第5週	第0週	第3週	第5週
體重（公斤）	2.62± 0.32	2.75± 0.25	2.79± 0.26	2.38± 0.30	2.51± 0.23	2.61± 0.38	2.58± 0.25	2.72± 0.29	2.83± 0.23
膽固醇（mg/dL）	38± 8.6	1264± 214	1487± 552	41.5± 22.9	831.3± 511.3	1342 ±258	39.3± 8.1	1390 ±602	1980 ±394.7
高密度膽固醇（mg/dL）	19± 5.8	30± 7.9	31.5± 11.2	14.2± 4.9	39.2± 11.9	26.5± 11.7	20.5± 4.7	29.58 ±8.7	21.8± 5.6
低密度膽固醇（mg/dL）	8.5± 3.6	527.9± 80.9	540.8± 237.5	9.85± 7.9	291.3± 198.8	520.5± 6.1	7.05± 2.2	558.1± 262.3	773.2± 121.9
三酸甘油脂（高密度膽固醇（mg/dL））	56.5± 14.5	89.5± 68.3	111.5± 52.8	44± 14.6	79.8± 58.5	71.3± 28.7	45.8± 5.3	79± 44.0	110.8± 64.9
AST（U/L）	24.2± 9.1	348.5± 156.9	107.5± 57.1	18± 5.6	179.5± 40.9	52± 25.5	36± 18.9	83.3± 73.8	73.2± 29.2
ALT（U/L）	44.3± 22.6	304± 94.2	134± 59.7	33.5± 5.8	183.7± 58.7	78.5± 25.8	54± 22.8	84.3± 47.9	98.3± 57.5

實例四：組織染色試驗

將自實例三之各組白兔取得之主動脈、主動脈弓至胸主動脈分別進行清洗並移除週邊組織，將該些組織分別以蘇丹紅（Sudan IV）及H&E染色法進行染色，完成染色後，將各主動脈縱向切開，並進行拍照，結果如圖4所示。

由圖4A可知，空白組之主動脈內表面出現明顯脂肪沈積，並且脂肪小斑塊主要發生於主動脈弓上；而由控制組與LZ8組之蘇丹紅染色結果顯示於主動脈弓之斑塊面積明顯減少。由圖4B之結果可知，於空白組及控制組白兔之動脈內膜明顯增厚，為粥狀動脈硬化之主要特徵；而LZ8組白兔動脈內膜厚度則較空白組及控制組減少許多。

由上述結果顯示高脂飲食確實會使個體動脈內膜上累積過量脂肪，並引發粥狀動脈硬化或心血管疾病，而藉由投予本發明所揭LZ8重組乳酸球菌NZ3900或其表現之LZ8蛋白片段係不僅能夠避免脂肪累積於血管內膜上，亦能有效地清除血管壁內之脂肪累積，達到預防或治療粥狀動脈硬化或心血管疾病之功效。

實例五：檢測LZ8蛋白片段對於發炎因子表現之影響

以TRIzol試劑自實例三中各組白兔升主動脈(ascending aortas)中萃取出總RNA，並以SuperScript III kit套組自萃取出之總RNA中產出cDNA，而後再進行逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction)，將獲得之PCR產品以電泳法進行分析，結果如圖5所示，其中，所使用之引子對如下表二所示；逆轉錄聚合酶鏈反應條件如下：DNA變性(denaturation)，94℃、1分鐘，黏和，55℃、1分鐘，引子延長(extension)、72℃、1分鐘。

由圖5A及圖5B之結果可知，相較於空白組及控制組來說，LZ8組白兔升主動脈內IL-1β之表現量係大幅降低，顯示投予本發明所揭LZ8重組乳酸球菌NZ3900係能夠有效降低促發炎細胞激素，如IL-1β之表現，以能夠達到治療如粥狀動脈硬化或發炎性相關疾病之功效；換言之，本發明所揭LZ8重組乳酸球菌NZ3900或其表現之LZ8蛋白片段係能夠用於治療或預防粥狀動脈硬化或發炎性相關疾病。

無

圖1係為檢測LZ8重組乳酸球菌NZ3900之蛋白質表現之電泳圖。圖2係為LZ8重組乳酸球菌NZ3900經乳酸鏈球菌素誘導不同時間之LZ8蛋白片段之表現量。圖3係為各組白兔的肝臟組織以H&E染色法進行染色之結果，其中，比例尺為100μm，放大倍數為×400。圖4A係為係為各組白兔的主動脈內表面以蘇丹紅進行染色之結果。圖4B係為係為各組白兔的主動脈內表面以H&E染色法進行染色之結果，其中，比例尺為100μm。圖5A係為檢測各組白兔升主動脈內IL-1β表現量之結果。圖5B係為量化圖5A之結果。

<110> 台中榮民總醫院

<120> 重組微生物、其代謝物、及其用於治療或/及預防脂肪肝及心血管疾病之用途

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成

<400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成

<400> 6

Claims

一種重組微生物，其係為具有一外源基因之乳酸菌而能夠表現如胺基酸序列係編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質，其中：該外源基因之核苷酸序列編碼為SEQ ID No.：1。
如請求項1所述重組微生物，其係以下列步驟製備而成：步驟a：取得該外源基因；步驟b：構築一重組載體，其包含有該外源基因；步驟c：將該重組載體導入一乳酸球菌內，使該乳酸球菌能夠表現該外源基因。
一種醫藥組合物，其係包含一有效量之如請求項1所述重組微生物或其代謝物，及至少一藥學上可接受之載體。
如請求項3所述醫藥組合物，其中，該重組微生物之代謝物包含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質。
將如請求項1所述重組微生物或其代謝物用於製備治療或預防脂肪肝之醫藥組合物之用途，其中，該重組微生物之代謝物包含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質。
將如請求項1所述重組微生物或其代謝物用於製備治療或預防粥狀動脈硬化之醫藥組合物之用途，其中，該重組微生物之代謝物包含有胺基酸序列編碼為SEQ ID No.:2之蛋白質。