CN112680390B

CN112680390B - 重组微生物、其代谢物、及其用于治疗或/及预防脂肪肝及心血管疾病的用途

Info

Publication number: CN112680390B
Application number: CN202010234998.7A
Authority: CN
Inventors: 李美芳; 林维文; 宋沛澎; 刘星君
Original assignee: Taichung Veterans General Hospital
Current assignee: Taichung Veterans General Hospital
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: TWI725580B; CN112680390A; TW202117001A

Abstract

本发明的主要目的在于提供一种新颖重组微生物，其具有高安全性而被用以作为医药组合物的有效成分，或是作为表达外源基因的平台，举例来说，该新颖重组微生物具有核苷酸序列编码为SEQ ID No.1的外源基因，而能够表达氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质。

Description

重组微生物、其代谢物、及其用于治疗或/及预防脂肪肝及心血管疾病的用途

技术领域

本发明有关于重组微生物及其用途，特别指一种重组微生物、其代谢物、及其用于治疗或/及预防脂肪肝及心血管疾病的用途。

背景技术

粥状动脉硬化为胆固醇沉积于血管内皮细胞下层，氧化造成的发炎性疾病；脂肪肝则是体内脂肪储存于肝细胞所造成的发炎性疾病。目前临上对于粥状动脉硬化的治疗方法多以投予他汀类药物作为降脂疗法(Lipid-lowering therapy)，意即通过投予药物降低低密度胆固醇或是提升高密度胆固醇，但是实际治疗效果都不彰；而目前临床上未有直接治疗脂肪肝的药物，仅能针对脂肪肝所造成的病征进行症状改善或控制；换言之，目前临床上对于粥状动脉硬化或脂肪肝仅有提供改善症状的治疗方法。

发明内容

更进一步来说，为能使该外源基因能够在乳酸菌表达为统产制出氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质，该外源基因经过人工设计并进行人工合成而得到。

本发明的另一目的在于提供该新颖重组微生物或其代谢物的用途，其能够抑制脂肪堆积于血管壁或肝脏细胞，用以有效地达到改善或治疗脂肪肝、粥状动脉硬化的功效。

换言之，本发明所揭新颖重组微生物或其代谢物具有抑制发炎因子表达、抑制脂肪细胞生成、保护肝脏及血管组织等功效，故可应用于治疗或预防与脂肪代谢相关的疾病的医药组合物。

为能达成上述目的，在本发明的一实施例中，本发明揭露一种重组微生物，其具有一外源基因的乳酸菌，而能表达如氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质，其中，该外源基因的核苷酸序列编码为SEQ ID No.1。

在本发明的一实施例中，该重组微生物为一符合食品等级标准的乳酸菌所制备而成。

在本发明的另一实施例中，该重组微生物以下列步骤所制备而成：

步骤a：取得该外源基因；

步骤b：构筑一重组载体，其包含有该外源基因；

步骤c：将该重组载体导入一乳酸球菌内，使该乳酸球菌能够表达该外源基因。

为能使本发明所揭重组微生物或其代谢物能够供个体所利用，在本发明的实施例中提供一种医药组合物，其包含有一有效量的该重组微生物或其代谢物，及至少一药学上可接受的载体，其中，该代谢物中包含有氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质。

更进一步来说，在本发明的一实施例中揭露该重组微生物或其代谢物的用途，其能够用于治疗或预防脂肪肝或是粥状动脉硬化，其中，该代谢物中包含有氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种重组微生物其具有高安全性而被用以作为医药组合物的有效成分，或是作为表达外源基因的平台，举例来说，该新颖重组微生物具有核苷酸序列编码为SEQ ID No.1的外源基因，而能够表达氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质。

附图说明

图1为检测LZ8重组乳酸球菌NZ3900的蛋白质表达的电泳图。

图2为LZ8重组乳酸球菌NZ3900经乳酸链球菌素诱导不同时间的LZ8蛋白片段的表达量。

图3为各组白兔的肝脏组织以H&E染色法进行染色的结果，其中，比例尺为100μm，放大倍数为×400。

图4A为各组白兔的主动脉内表面以苏丹红进行染色的结果。

图4B为各组白兔的主动脉内表面以H&E染色法进行染色的结果，其中，比例尺为100μm。

图5A为检测各组白兔升主动脉内IL-1β表达量的结果。

图5B为量化图5A的结果。

具体实施方式

本发明所揭重组微生物为将能够含有SEQ ID No.1所示外源基因的重组乳酸菌，如重组乳酸球菌(Lactococcus lactis)，而为能使该外源基因能够顺利地在乳酸菌中表达，该外源基因经人为设计合成而得，并且通过该重组微生物表达该外源基因，可使该重组微生物的代谢物中含有氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质。

更进一步来说，由于该重组微生物能够表达该外源基因，或该重组微生物的代谢物中含有氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质，能够抑制肝细胞的IL-1β表达、减少脂肪堆积于肝细胞、降低发炎细胞浸润，并且能够使动脉内壁厚度下降、减少血管内皮细胞下层的泡沫细胞(foam cells)的数量，因而能够达到治疗或/及预防该生物体粥状动脉硬化、脂肪肝、心血管相关疾病的功效。换言之，该重组微生物或其代谢物能够被开发作为一医药组合物，如疫苗等，亦能够被开发成为一营养补充品。

所谓“重组微生物”，指将一外源基因导入一微生物的基因组中，并使该重组微生物能够表达该外源基因，一般来说，导入该外源基因的人为手段包含有基因工程(或称遗传工程)技术，例如利用载体携带该外源基因进入一微生物，而载体可为一分子量小的DNA片段，如质粒、病毒DNA等；而该微生物可为乳酸菌、酵母菌、大肠杆菌等细菌。

所谓“医药组合物”，指包含一有效量的要产生特定效果的所需化合物或活性成份，以及至少一药学上能接受的载体。如同本发明所属技术领域中技术人员所了解者，医药组合物的型态可随着要引起特定效果的投予方式有所不同，如锭剂、粉剂、针剂等，并且，该载体也随着医药组合物的型态而可为固态、半固态或液态。举例来说，载体包含，但不限于，明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。

所谓“有效量”，指要产生所求特定效果所需化合物或活性成份的量，可以其在组合物中所占重量百分比表示。依据本发明所属技术领域的公知常识，该有效量会因为要引起特定效果的投予方式而有所不同，举例来说，活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合物重量的约1％至约100％，较佳者为约30％至约100％

所谓“人工合成方式”一词为以本发明所属技术领域技术人员的公知技术，通过人工方式将氨基酸依序连接而成为一多肽，其中，人工合成方式包含化学合成法以及多肽合成仪。

以下，为能更为详细说明本发明的技术特征及其功效，将兹举若干实施例并搭配图表作更进一步说明如后。

在下列实施例中所使用的乳酸球菌NZ3900及质粒pNZ8149自MoBiTec(Goettingen,Germany)购入，其中，乳酸球菌NZ3900为食品等级的标准菌株；质粒pNZ8149包含有lacF gene，其在乳糖上生长能用于作为食品等级筛选用，以及nisA启动子，用以表达nisin诱导基因。

以下实施例中的动物试验经过台中荣民总医院(中国台湾)动物照护及使用委员会审查并通过(La-1071566)。

实施例1：制备重组乳酸球菌

以修饰序列的方式合成Ganoderma lucidum的LZ8蛋白的编码基因(encodinggene)，而其修饰方式以乳酸球菌的最优化密码子利用(optimized codon usage)为基础，以人工合成方式合成一基因编码为SEQ ID No.1的LZ8蛋白片段，长度为335bp，而能够转译出的LZ8蛋白片段的氨基酸序列编码为SEQ ID No.2。

将LZ8蛋白片段的编码基因克隆至pNZ8149载体的NcoI/XbaI位点，并以DNA分析仪(ABI Prism 3700)确认后，得到一构筑好的重组质粒pNZ81490。将该重组质粒pNZ81490以电穿孔法转形至乳酸球菌NZ3900，将经电穿孔的混合物置于Eliker培养盘上，在30℃下培养48小时，观察到呈现黄色的乳糖阳性菌落，确认得到一LZ8重组乳酸球菌NZ3900。

实施例2：蛋白质表达试验

将LZ8重组乳酸球菌NZ3900培养于30℃下，培养基为M17培养基，其内含有0.5％乳糖，LZ8重组乳酸球菌NZ3900生长至OD600为0.5为止，并用不同浓度的乳酸链球菌素(Nisin)：0～50ng/ml(Sigma，密苏里州，美国)诱导1～20小时。而以在上述相同方式处理带有空白质粒(empty plasmid)的乳酸球菌NZ3900，作为控制组。

将经上述处理的细胞通过兔抗LZ8多株抗体进行免疫检测，用以检测各细胞的蛋白表达，并利用纯化的大肠杆菌来源的LZ8蛋白片段(氨基酸序列编码为SEQ ID No.2)作为蛋白值检测的定量标准，结果如图1所示。

更进一步地，为后续的口服疫苗接种定量，将经上述处理的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液清洗，由免疫墨点法(immunoblotting)检测LZ8重组乳酸球菌NZ3900在乳酸链球菌素诱导不同时间下的LZ8蛋白片段表达量，结果如图2所示。

由图1的结果可知，氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的LZ8蛋白片段的大小约为15kDa，在野生乳酸球菌NZ3900中并未检测到任何电泳带(band)，而LZ8重组乳酸球菌NZ3900则在约15kDa处出现电泳带(band)。

由图2的结果可知，LZ8重组乳酸球菌NZ3900经乳酸链球菌素诱导的LZ8蛋白片段最佳表达量为1μg/2x 10¹⁰菌落单位，并可持续4小时。进而由动物与人体换算有效剂量的公式，可知LZ8重组乳酸球菌NZ3900用于人体的有效菌量至少为1.2x 10¹¹。

实施例3：动物试验

取12只雄性纽西兰白兔，各白兔的体重约2.45±0.30公斤，随机分为3组，试验期间为35天(共5周)。在试验期间，各组白兔皆以添加2％胆固醇、1％胆酸和0.5％硫尿嘧啶的市售饲料喂食，并在口服疫苗前4小时须进食，每周须投予5次，而投予至各组白兔的口服疫苗的内容物说明分别如下：

空白组：15％蔗糖糖浆；

控制组：含有15％蔗糖糖浆的2x10¹⁰乳酸球菌NZ3900悬浮液；

LZ8组：含有15％蔗糖糖浆的2x10¹⁰ LZ8重组乳酸球菌NZ3900悬浮液。

在试验期间定期测量各组白兔体重，并自各组白兔耳缘静脉收集血液，分离出血清，进行血液生化值检测；在试验期间后，牺牲各组白兔，分别取其主动脉、主动脉弓至胸主动脉、肝脏等，以进行后续分析。

各组白兔在试验期间的体重、血液生化值如下表一所示；各组白兔的肝脏组织以H&E染色法进行染色，结果如图3所示。

由表一的结果可知，在投予含有2％胆固醇饲料3周后，各组白兔的总胆固醇及低密度胆固醇都明显升高，但是高密度胆固醇与三酸甘油脂未有显著的增加；而就肝脏功能来说，在投予含有2％胆固醇饲料3周后，空白组与控制组的白兔血清内AST与ALT的含量都明显增加，但是LZ8组的白兔却没有增加，换言之，在高脂饮食下，投予本发明所揭LZ8重组乳酸球菌NZ3900对于AST与ALT的活性没有不良影响

再者，由图3的结果可知，在投予含有2％胆固醇饲料5周后，空白组或控制组白兔的肝脏细胞切片染色图中有明显的脂肪堆积，而在LZ8组白兔的肝脏细胞切片染色图中则几乎观察不到脂肪堆积的现象。

根据表1及图3的结果，显示本发明所揭LZ8重组乳酸球菌NZ3900或其表达的LZ8蛋白片段能够保护肝脏细胞免于受到高脂饮食影响而受到破坏、避免脂肪堆积于肝脏，并维持肝脏功能正常，而能够达到治疗或预防如脂肪肝等的肝脏相关疾病的功效。

表一：各组白兔在试验期间的体重与血液生化值的检测结果

实施例4：组织染色试验

将自实施例3的各组白兔取得的主动脉、主动脉弓至胸主动脉分别进行清洗并移除周边组织，将该些组织分别以苏丹红(Sudan IV)及H&E染色法进行染色，完成染色后，将各主动脉纵向切开，并进行拍照，结果如图4所示。

由图4A可知，空白组的主动脉内表面出现明显脂肪沉积，并且脂肪小斑块主要发生于主动脉弓上；而由控制组与LZ8组的苏丹红染色结果显示在主动脉弓的斑块面积明显减少。由图4B的结果可知，在空白组及控制组白兔的动脉内膜明显增厚，为粥状动脉硬化的主要特征；而LZ8组白兔动脉内膜厚度则较空白组及控制组减少许多。

由上述结果显示高脂饮食确实会使个体动脉内膜上累积过量脂肪，并引发粥状动脉硬化或心血管疾病，而通过投予本发明所揭LZ8重组乳酸球菌NZ3900或其表达的LZ8蛋白片段不仅能够避免脂肪累积于血管内膜上，亦能有效地清除血管壁内的脂肪累积，达到预防或治疗粥状动脉硬化或心血管疾病的功效。

实施例5：检测LZ8蛋白片段对于发炎因子表达的影响

以TRIzol试剂自实施例3中各组白兔升主动脉(ascending aortas)中萃取出总RNA，并以SuperScript III kit套组自萃取出的总RNA中产出cDNA，而后再进行逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction)，将获得的PCR产品以电泳法进行分析，结果如图5所示，其中，所使用的引物对如下表二所示；逆转录聚合酶链反应条件如下：DNA变性(denaturation)，94℃、1分钟，粘和，55℃、1分钟，引物延长(extension)、72℃、1分钟。

由图5A及图5B的结果可知，相较于空白组及控制组来说，LZ8组白兔升主动脉内IL-1β的表达量大幅降低，显示投予本发明所揭LZ8重组乳酸球菌NZ3900能够有效降低促发炎细胞激素，如IL-1β的表达，以能够达到治疗如粥状动脉硬化或发炎性相关疾病的功效；换言之，本发明所揭LZ8重组乳酸球菌NZ3900或其表达的LZ8蛋白片段能够用于治疗或预防粥状动脉硬化或发炎性相关疾病。

表二：引物对

引物	编码
		IL-1β正向引物(SEQ ID No.3)	5’-TCCAGCTGCGCATCTCCTGC-3’
IL-1β反向引物(SEQ ID No.4)	5’-CTTCTCCTTGCACAAAACTC-3’
		β肌动蛋白正向引物(SEQ ID No.5)	5’-CGAGACCACCTTCAACTCGATC-3’
β肌动蛋白反向引物(SEQ ID No.6)	5’-CTTCTGCATGCGGTCGG-3’

SEQUENCE LISTING

<110> 台中荣民总医院

<120> 重组微生物、其代谢物、及其用于治疗或/及预防脂肪肝及心血管疾病的用

途

<130> none

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 335

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctagcgatac tgctttgatt ttcagattgg cttgggatgt taagaagttg agcttcgatt 60

acactccaaa ttggggaaga ggaaatccaa ataatttcat tgatactgtt actttcccaa 120

aggttttgac tgataaggct tacacttaca gagttgctgt tagcggaaga aatttgggag 180

ttaagccaag ctacgctgtt gagagcgatg gaagccaaaa ggttaatttt ttggagtaca 240

atagcggata cggaattgct gatactaata ctattcaagt tttcgttgtt gatccagata 300

ctaataatga tttcattatt gctcaatgga attag 335

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Asp Thr Ala Leu Ile Phe Arg Leu Ala Trp Asp Val Lys Lys

1 5 10 15

Leu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Gly Arg Gly Asn Pro Asn Asn

20 25 30

Phe Ile Asp Thr Val Thr Phe Pro Lys Val Leu Thr Asp Lys Ala Tyr

35 40 45

Thr Tyr Arg Val Ala Val Ser Gly Arg Asn Leu Gly Val Lys Pro Ser

50 55 60

Tyr Ala Val Glu Ser Asp Gly Ser Gln Lys Val Asn Phe Leu Glu Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Gly Tyr Gly Ile Ala Asp Thr Asn Thr Ile Gln Val Phe Val

85 90 95

Val Asp Pro Asp Thr Asn Asn Asp Phe Ile Ile Ala Gln Trp Asn

100 105 110

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccagctgcg catctcctgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttctccttg cacaaaactc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgagaccacc ttcaactcga tc 22

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cttctgcatg cggtcgg 17

Claims

1. 一种重组微生物用于制备治疗脂肪肝的医药组合物的用途，其特征在于，该重组微生物为具有一外源基因的乳酸菌而能够表达如氨基酸序列编码为SEQ ID No.2的蛋白质，该外源基因的核苷酸序列编码为SEQ ID No.1。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该重组微生物以下列步骤制备而成：

步骤a：取得该外源基因；

步骤b：构筑一重组载体，其包含有该外源基因；