JP2010517537A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が酵母培養期間の少なくとも50%にわたって5.5〜8の間のpHレベルで維持される方法を提供する。本発明はまた、培地で酵母を培養することにより酵母を増殖させるための方法であって、培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持され、酵母密度が少なくとも0.5酵母単位/mLである方法も提供する。
本発明はまた、抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより個体におけるTh1型応答を誘導する方法であって、酵母が、5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地で培養されている方法も提供する。1つの態様では、組成物は、中性pHで培養、維持または回収された酵母を添加した樹状細胞を含む。別の態様では、酵母はSaccharomyces cerevisiaeである。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。本発明の他の態様では、酵母は免疫応答を誘発する。本発明の他の態様では、酵母は抗原を発現し、いくつかの場合では抗原は異種抗原である。いくつかの場合では、異種抗原は酵母表面で発現される。1つの態様では、Th1型応答はインターフェロン−ガンマ産生である。別の態様では、Th1型応答はIL−12産生である。
本発明はまた、pHが少なくとも5.5である培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキットも提供する。本発明はまた、pHが5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地、および酵母を培養するための培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキットも提供する。他の態様では、培地はコハク酸塩もしくはコハク酸で緩衝されるか、または培地はさらにソイトンを含有することができる。1つの態様では、キットはさらに酵母を含む。いくつかの場合では、酵母は凍結または凍結乾燥されている。いくつかの場合では、酵母は、pHが少なくともpH5.5の培地で培養されるか、または5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地で培養されている。他の場合では、酵母は複製可能である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下を提供する:
(項目1)
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、該培地が、該酵母が培養中にある時間の少なくとも50%にわたって5.5〜8の間のpHレベルで維持される、方法。
(項目2)
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、前記培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持され、該酵母の密度が少なくとも0.5酵母単位/mLである、方法。
(項目3)
酵母が培養中にある時間の少なくとも50%にわたって、少なくとも5.5のpHレベルを有する培地で該酵母を培養することによる、酵母を増殖させるための方法。
(項目4)
前記培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持される、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、項目3に記載の方法。
(項目6)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目3に記載の方法。
(項目7)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目6に記載の方法。
(項目8)
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目3に記載の方法。
(項目9)
前記酵母が異種抗原を発現する、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目9に記載の方法。
(項目11)
項目1、2、または3に記載の方法のいずれか1つにより培養された酵母を含む組成物。
(項目12)
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地のpHが少なくとも5.5である、方法。
(項目13)
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持される、方法。
(項目14)
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、項目12または13に記載の方法。
(項目15)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目15に記載の方法。
(項目17)
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目12または13に記載の方法。
(項目18)
前記酵母が異種抗原を発現する、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記酵母が5.5未満のpHで増殖する場合より容易に前記異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である、項目18に記載の方法。
(項目21)
項目12または13に記載の方法のいずれか1つにより培養された酵母を含む組成物。
(項目22)
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるTh1型応答を誘導する方法であって、該酵母が、少なくとも5.5のpHレベルを有する培地で培養されている、方法。
(項目23)
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるTh1型応答を誘導する方法であって、該酵母が、5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地で培養されている、方法。
(項目24)
前記組成物が、中性pHで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目26に記載の方法。
(項目28)
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目23に記載の方法。
(項目29)
前記酵母が異種抗原を発現する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記Th1型応答がインターフェロン−ガンマ産生である、項目23に記載の方法。
(項目32)
前記Th1型応答がIL−12産生である、項目23に記載の方法。
(項目33)
pHが少なくとも5.5である培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
(項目34)
5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
(項目35)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目34に記載のキット。
(項目36)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目34に記載のキット。
(項目37)
さらに酵母を含む、項目34に記載のキット。
(項目38)
前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、項目37に記載のキット。
(項目39)
前記酵母が、少なくともpH5.5の培地で培養されるか、または5.5〜8の間のp
Hレベルで維持される培地で培養されている、項目37に記載のキット。
(項目40)
前記酵母が複製可能である、項目37に記載のキット。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下を提供する:
(項目1)
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、該培地が、該酵母が培養中にある時間の少なくとも50%にわたって5.5〜8の間のpHレベルで維持される、方法。
(項目2)
酵母を増殖させるための方法であって、培地で該酵母を培養することを含み、前記培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持され、該酵母の密度が少なくとも0.5酵母単位/mLである、方法。
(項目3)
酵母が培養中にある時間の少なくとも50%にわたって、少なくとも5.5のpHレベルを有する培地で該酵母を培養することによる、酵母を増殖させるための方法。
(項目4)
前記培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持される、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、項目3に記載の方法。
(項目6)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目3に記載の方法。
(項目7)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目6に記載の方法。
(項目8)
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目3に記載の方法。
(項目9)
前記酵母が異種抗原を発現する、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目9に記載の方法。
(項目11)
項目1、2、または3に記載の方法のいずれか1つにより培養された酵母を含む組成物。
(項目12)
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培地で培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地のpHが少なくとも5.5である、方法。
(項目13)
抗原を発現する発現系を含有する酵母を培養することにより抗原発現酵母を産生するための方法であって、該培地が5.5〜8の間のpHレベルで維持される、方法。
(項目14)
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、項目12または13に記載の方法。
(項目15)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目15に記載の方法。
(項目17)
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目12または13に記載の方法。
(項目18)
前記酵母が異種抗原を発現する、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記酵母が5.5未満のpHで増殖する場合より容易に前記異種抗原が他の細胞または作用物質との相互作用に到達可能である、項目18に記載の方法。
(項目21)
項目12または13に記載の方法のいずれか1つにより培養された酵母を含む組成物。
(項目22)
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるTh1型応答を誘導する方法であって、該酵母が、少なくとも5.5のpHレベルを有する培地で培養されている、方法。
(項目23)
抗原発現酵母を含む組成物を個体に投与することにより該個体におけるTh1型応答を誘導する方法であって、該酵母が、5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地で培養されている、方法。
(項目24)
前記組成物が、中性pHで培養、維持または回収された酵母で負荷された樹状細胞を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、項目23に記載の方法。
(項目26)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目23に記載の方法。
(項目27)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目26に記載の方法。
(項目28)
個体に投与された場合に前記酵母が免疫応答を誘発する、項目23に記載の方法。
(項目29)
前記酵母が異種抗原を発現する、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記異種抗原が前記酵母の表面で発現される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記Th1型応答がインターフェロン−ガンマ産生である、項目23に記載の方法。
(項目32)
前記Th1型応答がIL−12産生である、項目23に記載の方法。
(項目33)
pHが少なくとも5.5である培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
(項目34)
5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
(項目35)
前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、項目34に記載のキット。
(項目36)
前記培地がさらにソイトンを含有する、項目34に記載のキット。
(項目37)
さらに酵母を含む、項目34に記載のキット。
(項目38)
前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、項目37に記載のキット。
(項目39)
前記酵母が、少なくともpH5.5の培地で培養されるか、または5.5〜8の間のp
Hレベルで維持される培地で培養されている、項目37に記載のキット。
(項目40)
前記酵母が複製可能である、項目37に記載のキット。
本明細書に開示された本発明は、中性pH、少なくともpH5.5、またはpH5.5〜8の間、またはpH6〜8の間で酵母を増殖することが、より望ましい生物学的特徴を有する酵母をもたらすという発見に基づく。以下に詳述されるこれらの望ましい特徴のいくつかは、酵母細胞壁を柔軟に、および細胞壁消化酵素による消化に対し感受性に保ちながら、増加した細胞密度で十分に増殖する能力、ならびに他の細胞および/または作用物質に抗原をより接近できるようにする方法での抗原の提示を含むが、これらに限定されない。
本明細書では、「抗原」の一般的使用は、適応免疫系により認識され得る任意の分子を指す。1つの態様では、抗原は抗体に特異的に結合する分子である。分子は、タンパク質が自然発生もしくは合成的に得られたタンパク質のいずれかの部分(ペプチド、部分タンパク質、完全長タンパク質)、または細胞組成物の一部(細胞全体、細胞溶解物または破壊細胞)、生物の一部(生物全体、溶解物または破壊細胞)、または糖質もしくはこの部分であり得る。抗原は、単独でまたは(破砕した酵母細胞のような)アジュバントなど別の化合物の使用により、抗原特異的体液性免疫応答を誘発することができる。別の態様では、抗原は、主要組織適合複合体(MHC)との関連においてTリンパ球(すなわちT細胞)により認識される。別の態様では、抗原は、抗原を投与した動物の細胞および組織内で遭遇する同一または類似の抗原に対し、寛容原(toleragen)として作用することができる。
これらの方法は、すべての酵母に対し幅広く適用できる。酵母は、3つのクラス、すなわち、Ascomycetes、BasidiomycetesおよびFungi Imperfectiの1つに属する単細胞微生物である。病原性酵母株、またはその非病原性変異体を本発明により使用することができるが、1つの態様では、非病原性酵母株が使用される。非病原性酵母株の例には、Saccharomyces、Candida、Cryptococcus、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Rhodotorula、SchizosaccharomycesおよびYarrowiaが含まれる。1つの態様では、Saccharomyces、Candida、Hansenula、PichiaおよびSchizosaccharomycesが使用される。さらに他の態様では、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces carlsbergensis、Candida albicans、Candida kefyr、Candida tropicalis、Cryptococcus laurentii、Cryptococcus neoformans、Hansenula anomala、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus var. lactis、Pichia pastoris、Rhodotorula rubra、Schizosaccharomyces pombe、および、Yarrowia lipolyticaが使用される。本発明は上記の種リストに限定されず、当業者は本明細書の教示をいずれのタイプの酵母にも適用できることが理解される。別の態様では、Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae)が本発明の方法を実施するのに使用される。S. cerevisiaeは、分子操作の容易さ、および食品添加物としての使用に「一般に安全と認められる」すなわち「GRAS」である(GRAS、FDA提案規則62FR18938、1997年、4月17日)ため好ましい。
pHレベルは、酵母の培養に重要である。当業者は、培養工程には、酵母培養の開始だけでなく、同様に培養の維持も含まれることを理解するであろう。酵母培養は、いずれのpHレベルでも開始することができるが、酵母培養の培地は、時間とともにより酸性(すなわち、pH低下)になる傾向があるため、培養工程中はpHレベルをモニターすることを注意しなければならない。
他の添加剤は、異種遺伝子の発現誘導など、他の目的で酵母培養に添加することができる。いくつかの態様では、血球凝集素発現の発現を誘導するのに銅が使用される。しかし、銅の使用は、中性pHでは理想的ではなく、そのため、中性pHで増殖される酵母で発現される誘導性遺伝子の調節には、銅以外の添加剤が推奨される。
酵母培養に対する中性pHの効果
酵母の培養における中性pHの使用は、免疫調節および/または免疫応答誘発のためのビヒクルとして酵母を使用するのに望ましい特徴である、いくつかの生物学的効果を促進する。1つの態様では、中性pHでの酵母の培養は、倍加時間に何らのマイナス効果を与えることなく(例えば、倍加時間の減速)を与えることなく、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、細胞壁の柔軟性を失うことなく高密度まで増殖し続けることができる。
酵母の培養における中性pHの使用は、免疫調節および/または免疫応答誘発のためのビヒクルとして酵母を使用するのに望ましい特徴である、いくつかの生物学的効果を促進する。1つの態様では、中性pHでの酵母の培養は、倍加時間に何らのマイナス効果を与えることなく(例えば、倍加時間の減速)を与えることなく、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、細胞壁の柔軟性を失うことなく高密度まで増殖し続けることができる。
別の態様では、少なくとも5.5のpH、またはpH5.5〜8の間などの中性pHの使用は、すべての回収密度で柔軟な細胞壁を有する酵母および/または細胞壁消化酵素(例えば、グルカナーゼ)に感受性を有する酵母の産生を可能にする。このため、本発明は、従来のアッセイで測定した細胞壁の柔軟性(例えば、グルカナーゼに対する感受性)を有する酵母の方法および組成物を提供する。事前実験は、酵母が、0.5YU(酵母単位)/mlの回収密度で、細胞壁消化酵素による消化に対する感受性を喪失することを立証した。このため、1つの利点は、0.5YU/mlでの標準的な増殖培地で培養された酵母により行われる比較を、任意の密度での中性pH増殖との比較に使用できることである。柔軟な細胞壁を有する酵母は、酵母を宿す細胞におけるサイトカイン(例えば、INF−ガンマ)分泌を促進するなど、独特の免疫応答を示すことができるため、この特性は望ましい。当業者が中性pHの方法を使用すると考えられる別の理由は、細胞壁に位置する抗原への到達性を高められる点である。これは、発現タンパク質の免疫原性の増大、およびフローサイトメトリーなどの標準技術で測定した、抗体検出に有用である。
中性pHで培養された酵母で観察されるさらに別の望ましい特徴は、免疫調節の目的で有益な方法での抗原発現である。1つの態様では、酵母は抗原発現のためのビヒクルとして使用される(例えば、米国特許第5,830,463号および第7,083,787号を参照されたい)。抗原は、酵母にとって天然の抗原、あるいは酵母により発現される異種抗原であってよい。いくつかの態様では、抗原発現のための酵母の使用は、様々な疾患および病気(例えば、感染症または癌)と闘うワクチン、予防薬、および治療薬の開発に役立つ。中性pHの方法を用いて、当業者は、抗原が他の細胞(例えば、免疫共刺激性機能または免疫制御のため)または他の作用物質(例えば、検出用抗体)により到達可能な抗原提示酵母を産生することができる。さらに、インフルエンザHA抗原などのいくつかの抗原に中性pHを使用することは、ジチオスレイトール(DTT)による処理により、ジスルフィド結合したHAの遊離を可能にする。これは、HA発現酵母が、pHがpH5より下に低下する培地で培養される場合には不可能なことである。いくつかの場合では、これは、わずかな時間でもpHがpH5より下に低下する場合に生じる。他の場合では、これは、1もしくは数分または1もしくはより長い時間、pHがpH5より下に低下する場合に生じる。
中性pHの方法に従い培養された酵母が示す別の望ましい特徴は、酵母に曝露した細胞からのTh1型サイトカインの分泌である。Th1型サイトカインの例には、インターフェロン−ガンマ、IL−12、およびIL−2が含まれるが、これらに限定されない。実施例にさらに詳述されている通り、中性pHプロトコルに従い増殖された酵母が添加された樹状細胞は、低い(酸性)pH培地で増殖された酵母に比べて、インターフェロン−ガンマ分泌および発現レベルの上昇を示す。中性pH培養方法を用いる場合、IL−12分泌レベルの低下はなかった。このため、当業者は、免疫調節の目的、例えば、増大したTh1型応答から恩恵を受けると考えられる、疾患または障害に苦しんでいる個体においてTh1型応答を誘導するために、本明細書に開示された中性pHの方法を使用することができる。
中性pHの方法を用いて増殖された酵母の組成物
本発明はまた、本明細書に開示された中性pHの方法を用いて増殖された酵母を含む組成物も企図する。1つの態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で天然抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、アジュバントとしての投与など、様々な目的に有用であり得る。別の態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で異種抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、免疫調節を必要としている個体における免疫調節およびワクチン開発など、様々な目的に有用であり得る。
本発明はまた、本明細書に開示された中性pHの方法を用いて増殖された酵母を含む組成物も企図する。1つの態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で天然抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、アジュバントとしての投与など、様々な目的に有用であり得る。別の態様では、組成物は、この表面もしくは内部のいずれか、または両方で異種抗原を発現する酵母を含む。この組成物は、免疫調節を必要としている個体における免疫調節およびワクチン開発など、様々な目的に有用であり得る。
これらの組成物はまた、医薬的に許容可能な賦形剤および/または担体を含むこともできる。医薬的に許容可能な担体には、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれ得る。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性/水性溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補液、電解質補液(リンゲルデキストロースを基にしたものなど)などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加剤も存在することができる。医薬的に許容可能な賦形剤を有する、中性pH条件下で増殖された酵母を含む組成物製剤は、一般に当業者には日常的である。
(実施例1)
酵母培地処方
様々なタイプの培地を、酵母を培養するのに使用およびpHレベルが中性になるように調整することができる。使用することができる培地のいくつかの例を以下に提供するが、本発明は、これらの培地成分または培地プロトコルの使用に限定されないことを理解されたい。
酵母培地処方
様々なタイプの培地を、酵母を培養するのに使用およびpHレベルが中性になるように調整することができる。使用することができる培地のいくつかの例を以下に提供するが、本発明は、これらの培地成分または培地プロトコルの使用に限定されないことを理解されたい。
細胞増殖および培養pHに対する培地pHの効果
図1に示した通り、細胞増殖および培養pHに対する培地pHの効果を試験した。細胞は、Bis−Tris緩衝液、pH7.2またはリン酸緩衝液、pH7.2を補充したU2培地で増殖させた。対照培養物は、培地に緩衝液を添加せずにU2培地で増殖させた。対照として特筆される条件(培地pH5.5と同じ)または培地pH7.2としては、これらの対照物の増殖培地は、酵母を接種する前に塩基(NaOH)によりpH5.5またはpH7.2のいずれかに調整した。培養物を30℃でインキュベートし、細胞数および培養pHを最大16時間モニターした。結果は、様々なpHレベルでの緩衝液が、酵母の増殖速度に影響したことを示す。図1に示した通り、倍加時間は2.8〜4.5時間の範囲であった。非緩衝pH7培地におけるpHは、2.0YU/mLで約5.5であった。これは、pHを中性レベルに保つためにいくつかの形態の緩衝剤が必要であることを示すものである。
(実施例3)
細胞壁厚に対する培地pHの効果
培地pHの効果を試験して、細胞壁厚に何らかの効果を有するかどうかを判定した。増殖培地および条件は実施例1と同じであった。培養物は、0.5〜2.0YU/mLの範囲の密度で回収した。図2の凡例では、培養物を回収した密度がダッシュマークの後ろの数字で記されている。例えば、対照−0.6とは、細胞をpH5.5で非緩衝培地で増殖し、次いで、細胞が0.6YU/mL密度に達したときに回収したことを意味する。フラスコ1〜3の条件(例えば1〜0.5、2〜2.0または3〜1.0)は、図の下に記載されており、回収時の細胞密度は凡例に記されている。使用した溶解アッセイプロトコルは以下の通りであった:(1)洗浄した細胞10YUを1mLのTris−BMEで再懸濁する;(2)「時間0」の試料を採取し、600nmでODを測定する;(3)グルカナーゼ20Uを添加する;(4)30℃で回転させる;(5)10分ごとに、試料を採取しODを測定する。
細胞壁厚に対する培地pHの効果
培地pHの効果を試験して、細胞壁厚に何らかの効果を有するかどうかを判定した。増殖培地および条件は実施例1と同じであった。培養物は、0.5〜2.0YU/mLの範囲の密度で回収した。図2の凡例では、培養物を回収した密度がダッシュマークの後ろの数字で記されている。例えば、対照−0.6とは、細胞をpH5.5で非緩衝培地で増殖し、次いで、細胞が0.6YU/mL密度に達したときに回収したことを意味する。フラスコ1〜3の条件(例えば1〜0.5、2〜2.0または3〜1.0)は、図の下に記載されており、回収時の細胞密度は凡例に記されている。使用した溶解アッセイプロトコルは以下の通りであった:(1)洗浄した細胞10YUを1mLのTris−BMEで再懸濁する;(2)「時間0」の試料を採取し、600nmでODを測定する;(3)グルカナーゼ20Uを添加する;(4)30℃で回転させる;(5)10分ごとに、試料を採取しODを測定する。
(実施例4)
75−15細胞の構築
TK75−15で表される融合タンパク質は、TEF2プロモーターに誘導されるAga2配列を用いて細胞壁にインフルエンザHAタンパク質を発現するように設計した。このコンストラクトでは、Aga2配列のC末端にHA配列を有するタンパク質を構築した。このタンパク質は、Aga1p(この場合では、CUP1プロモーターによって駆動される)も発現する細胞で発現した場合、酵母細胞の外側の細胞壁、およびサイトゾルに局在する。インフルエンザHA抗原を含む融合タンパク質は、N末端からC末端へとインフレームで融合される以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである(融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号1で表される):1)天然の18アミノ酸ER標的シグナル配列(配列番号1の位置1〜18)を含む、完全長のS. cerevisiae Aga2タンパク質配列(配列番号1の位置1〜87);2)HA本体からAga2を隔てるスペーサー(位置88および89);3)シグナル配列(配列番号1の位置90〜600)を欠く、およびHAの36個のC末端残基を欠き、それによってC末端膜アンカーおよび細胞質尾部が排除された、インフルエンザHAタンパク質;4)ヒスチジンタグからHAタンパク質本体を隔てるトリグリシンスペーサー(配列番号1の位置601〜603);および5)C末端ヘキサヒスチジンタグ(配列番号1の位置604〜609)。配列番号1の融合タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に配列番号2で表される。この融合タンパク質およびこれを発現するタルモゲン(Tarmogen)は、75−15と呼ぶことができる。
75−15細胞の構築
TK75−15で表される融合タンパク質は、TEF2プロモーターに誘導されるAga2配列を用いて細胞壁にインフルエンザHAタンパク質を発現するように設計した。このコンストラクトでは、Aga2配列のC末端にHA配列を有するタンパク質を構築した。このタンパク質は、Aga1p(この場合では、CUP1プロモーターによって駆動される)も発現する細胞で発現した場合、酵母細胞の外側の細胞壁、およびサイトゾルに局在する。インフルエンザHA抗原を含む融合タンパク質は、N末端からC末端へとインフレームで融合される以下の配列要素を有する単一のポリペプチドである(融合タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号1で表される):1)天然の18アミノ酸ER標的シグナル配列(配列番号1の位置1〜18)を含む、完全長のS. cerevisiae Aga2タンパク質配列(配列番号1の位置1〜87);2)HA本体からAga2を隔てるスペーサー(位置88および89);3)シグナル配列(配列番号1の位置90〜600)を欠く、およびHAの36個のC末端残基を欠き、それによってC末端膜アンカーおよび細胞質尾部が排除された、インフルエンザHAタンパク質;4)ヒスチジンタグからHAタンパク質本体を隔てるトリグリシンスペーサー(配列番号1の位置601〜603);および5)C末端ヘキサヒスチジンタグ(配列番号1の位置604〜609)。配列番号1の融合タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に配列番号2で表される。この融合タンパク質およびこれを発現するタルモゲン(Tarmogen)は、75−15と呼ぶことができる。
75−15細胞増殖および培養pHに対する異なる緩衝剤(pH6.5培地)の効果
細胞増殖に対する効果および培養pHに対する効果を判定するため、異なる緩衝剤を75−15細胞で試験した。これらの緩衝剤を図3に示す。これらの緩衝剤には、コハク酸塩、クエン酸塩、および炭酸塩が含まれる。いずれの緩衝剤も沈殿形成をもたらすことはなかった。使用した緩衝剤のすべてが、標準的な増殖培地に十分に溶解した。すべての試験培養物のpHを、酵母の接種前にpH6.5に調整した。培養物を、次いで、振盪フラスコで30℃で最大15時間増殖させた。細胞を炭酸塩緩衝剤で増殖させた場合には、最少の増殖が見られた、または増殖は見られなかった。図3に見られる通り、異なる緩衝剤の使用は、増殖速度に影響した。増殖は、中性pH(少なくともpH5.5)で速かった。特に、コハク酸塩緩衝剤を有する培地は、倍加時間に関して最良であった(約2.5時間の倍加時間)。反対に、酵母細胞をpH5.5未満(より酸性条件)で増殖させた場合、倍加時間は約3.5時間で減速した。クエン酸塩は同様の倍加時間であった(約3.5時間)。0.05Mでのクエン酸塩は、0.02Mでのコハク酸塩より緩衝能力が増大した。これらの実験では、発現誘導のため培養物すべてに0.35mMの銅を入れた。
(実施例7)
培地処方試験
酵母培地に添加される他の剤の寄与を試験し、結果を図5に示す。U2またはU4は、基本的な培地組成物を指す。タンパク質発現は、銅誘導性CUP1プロモーターの調節下にあるため、HAタンパク質を発現するのに誘導される酵母細胞用の培地に、0.35mMの銅を添加する。ソイトン(図5のSoy)は、大豆のペプシン消化により得られる栄養素の市販の複合体混合物である。ソイトンの添加は、最速の増殖および最高収量(30YU/mL)をもたらした。0.08Mのコハク酸の使用は、より良好な緩衝能力を示した。細胞は、30℃で、x軸に示した時間の間増殖させた。
培地処方試験
酵母培地に添加される他の剤の寄与を試験し、結果を図5に示す。U2またはU4は、基本的な培地組成物を指す。タンパク質発現は、銅誘導性CUP1プロモーターの調節下にあるため、HAタンパク質を発現するのに誘導される酵母細胞用の培地に、0.35mMの銅を添加する。ソイトン(図5のSoy)は、大豆のペプシン消化により得られる栄養素の市販の複合体混合物である。ソイトンの添加は、最速の増殖および最高収量(30YU/mL)をもたらした。0.08Mのコハク酸の使用は、より良好な緩衝能力を示した。細胞は、30℃で、x軸に示した時間の間増殖させた。
(実施例9)
サイトカイン産生に対する中性pHの効果
pHが、pH5.5より上に維持されたか、またはpH5.5より上に維持されなかった培地で増殖させたYVEC酵母(異種抗原を発現していない)を添加した、樹状細胞(DC)を用いて、中性pHで酵母を培養することがサイトカイン産生に与える効果を実験した。マウス骨髄由来樹状細胞に、DCあたり10酵母を、RPM1培地で48時間、37℃で一緒にインキュベートして添加した。次いで、上清を、分泌されたサイトカインについて分析した。図9はこれらの実験結果を示す。下のパネルは、中性pH(すなわち、少なくとも5.5以上)で増殖される酵母が添加された樹状細胞からのIFN−ガンマ分泌は著しく増加すること、酵母がpHを5.5未満に低下させた培地で培養される場合には、著しい増加は見られないことを示す。
サイトカイン産生に対する中性pHの効果
pHが、pH5.5より上に維持されたか、またはpH5.5より上に維持されなかった培地で増殖させたYVEC酵母(異種抗原を発現していない)を添加した、樹状細胞(DC)を用いて、中性pHで酵母を培養することがサイトカイン産生に与える効果を実験した。マウス骨髄由来樹状細胞に、DCあたり10酵母を、RPM1培地で48時間、37℃で一緒にインキュベートして添加した。次いで、上清を、分泌されたサイトカインについて分析した。図9はこれらの実験結果を示す。下のパネルは、中性pH(すなわち、少なくとも5.5以上)で増殖される酵母が添加された樹状細胞からのIFN−ガンマ分泌は著しく増加すること、酵母がpHを5.5未満に低下させた培地で培養される場合には、著しい増加は見られないことを示す。
Claims (20)
- 個体における免疫応答を誘発する方法において使用するための、Saccharomycesからの酵母を含む組成物であって、該酵母は、5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地において培養された、組成物。
- 増大したTh1型免疫応答から恩恵を受ける疾患または障害に苦しんでいる個体においてTh1型免疫応答を誘発する際に使用するための、請求項1に記載の組成物。
- 前記Th1型免疫応答がインターフェロン−ガンマ産生によって特徴付けられる、請求項2に記載の組成物。
- 前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記培地が6〜8の間のpHレベルで維持される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記酵母が異種抗原を発現する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物であって、
a)前記酵母が培養中にある時間の少なくとも(1)80%または(ii)90%にわたって、該酵母が中性pHにおいて培養される;
b)該酵母は、該培地のpHがpH5.5未満に低下しないように培養される;または
c)該酵母は、該培地のpHが(i)5分間、(ii)10分間、(iii)20分間、(iv)30分間、(v)40分間、(vi)50分間、または(vii)60分間を超えてpH5.5未満に低下することがないように培養される、
組成物。 - 酵母を増殖させる方法であって、
a)5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地で該酵母を培養すること;および
b)該酵母ならびに医薬的に許容可能な賦形剤および/または担体を含む組成物を処方すること
を含む、方法。 - 前記培地が6〜8の間のpHレベルで維持される、請求項9に記載の方法。
- 前記酵母が異種抗原を発現する、請求項9または10に記載の方法。
- 前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 個体において免疫応答を誘発する際に使用するための、抗原発現酵母を含む組成物であって、該抗原発現酵母は、少なくとも5.5のpHレベルで維持された培地において培養された、組成物。
- Th1型免疫応答の強化によって利益を受ける疾患または障害に罹患した個体においてTh1型免疫応答を誘発する際に使用するための、請求項13に記載の組成物。
- 前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項13または14に記載の組成物。
- 培地のpHが5.5〜8の間のpHレベルで維持される培地、および酵母を培養するための該培地の使用に関する指示書を含む、酵母を培養するためのキット。
- 前記培地がコハク酸塩またはコハク酸で緩衝される、請求項16に記載のキット。
- 前記培地がさらにソイトンを含有する、請求項16または17に記載のキット。
- さらに酵母を含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載のキット。
- 前記酵母が凍結または凍結乾燥されている、請求項19に記載のキット。
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