WO2017209274A1 - アジュバント組成物とその利用 - Google Patents

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antigen
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immunogenic substance
protein
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眞一郎 藤井
佳奈子 清水
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国立研究開発法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant capable of causing immunostimulation, particularly T cell immunization.
  • the present invention relates to an adjuvant that can cause antigen-specific immunostimulation, in particular T cell immunization.
  • Adjuvant is a term derived from “adjuvare”, which means Latin assistance, and refers to something that modifies the endogenous immunogenicity of an antigen in a vaccine.
  • aluminum salts such as aluminum chloride, aluminum hydroxide and aluminum phosphate have been used as adjuvants
  • incomplete Freund's adjuvant IFA
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • Granzyme A is a protein having serine protease activity and was found in cytotoxic T lymphocytes (Non-patent Document 2). As a function of granzyme A, induction of apoptosis has been reported (Non-patent Document 3).
  • the present invention provides an adjuvant capable of causing immune activation, particularly T cell immune activation.
  • the present invention provides adjuvants that can cause antigen-specific immunostimulation, particularly T cell activation.
  • the present invention provides an adjuvant capable of causing immune activation, particularly T cell immune activation.
  • the present invention provides adjuvants that can cause antigen-specific immunostimulation, particularly T cell activation.
  • the present inventors have revealed that granzyme A immunostimulates independently of serine protease activity.
  • the present inventors have also clarified that antigen-specific immune activation occurs in this immune activation.
  • the inventors further show that granzyme A induces antigen-specific T cell induction, dendritic cell maturation (eg, CD8 positive and / or CD8 negative dendritic cell maturation), production of interferon gamma. Also revealed that it causes.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • An adjuvant composition comprising granzyme A or a protein having an amino acid sequence having 80% or more homology with granzyme A.
  • Granzyme A in which serine protease activity is lower than that of the wild type is Granzyme A in which the amino acid corresponding to the 184th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is substituted with serine to alanine
  • Adjuvant composition Adjuvant composition.
  • composition for antigen-specific immune activation according to the above (6) or (7), wherein the immunogenic substance is a polypeptide, and an effective amount of granzyme A or granzyme A as an adjuvant and 80
  • a composition for antigen-specific immune activation comprising a protein having an amino acid homology of at least% in the form of a fusion protein with the immunogenic substance.
  • a composition for use in stimulating immunity comprising granzyme A or a vector comprising a nucleic acid encoding a protein having 80% or more amino acid homology with granzyme A.
  • a composition for use in stimulating immunity to the peptidic immunogenic substance which is contained in one vector or two or more vectors separately contained in the combination described in (12) above .
  • An animal cell that is transformed with the composition according to (13) and expresses granzyme A and the immunogenic substance.
  • a fusion protein comprising a peptide-like immunogenic substance and granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with granzyme A, and having immunogenicity.
  • a composition for antigen-specific immune activation comprising the cell according to (14) or (16) as an active ingredient.
  • a composition for antigen-specific immune activation comprising the combination according to (18) above.
  • Composition comprising a peptide-like immunogenic substance and granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with granzyme A, and having immunogenicity.
  • FIG. 1 is a diagram showing that cells expressing an antigen and granzyme A induce antigen-specific T cells.
  • the antigen is ovalbumin.
  • granzyme A is sometimes abbreviated as grmA, and the same applies to the following figures.
  • FIG. 2 shows that antigen-specific T cell induction is caused more strongly by granzyme A than other granzymes (see FIG. 2A).
  • FIG. 2 is also a diagram showing that granzyme A hardly induces serine protease activity of granzyme in antigen-specific T cell induction (see FIG. 2B).
  • S184A gzmA in the figure is a mutant that substantially lost serine protease activity of granzyme A.
  • FIG. 3 is a diagram showing that granzyme A has an action to mature dendritic cells equivalent to or stronger than lipopolysaccharide (hereinafter also referred to as “LPS”).
  • DC means a dendritic cell.
  • CD86 in the figure is a marker of mature dendritic cells.
  • FIG. 4 shows that granzyme A matures CD8 positive dendritic cells and CD8 negative dendritic cells equal to or stronger than lipopolysaccharide (hereinafter also referred to as “LPS”).
  • FIG. 5 shows that antigen-specific T cells are induced when an antigen and granzyme A are administered to mice (see FIG. 5A).
  • FIG. 5A shows that antigen-specific T cells are induced when an antigen and granzyme A are administered to mice (see FIG. 5A).
  • FIG. 5 is also a diagram showing that interferon ⁇ is produced when an antigen and granzyme A are administered to mice (see FIG. 5B).
  • “Pep” in the figure means OVA.
  • FIG. 6 shows that granzyme A can suppress cancer in an antigen-specific manner in mice.
  • FIG. 7 shows that the production amount of antigen-specific IgG2 antibody increased in mice administered with antigen and granzyme A, and the production amount of antigen-specific IgG1 antibody in mice administered with antigen and aluminum hydroxide (Alum). It is a figure which shows that increases.
  • adjuvant composition means a composition used as an adjuvant.
  • an adjuvant composition may be referred to as an immunostimulant, an immunopotentiator, or a composition for use in immunostimulating.
  • an adjuvant composition is used for inducing antigen-specific T cells, in particular for inducing antigen-specific CD8 single positive cells, so that dendritic cells (eg, CD8-positive trees) are used. For use in maturation of dendritic cells and CD8 negative dendritic cells).
  • the CD8 single positive cell means a T cell that is positive for CD8 and negative for CD4, and includes, for example, cytotoxic T lymphocyte (CTL).
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • immunogenic substance means a substance having immunogenicity in general.
  • immunogenic substances substances that are exogenous antigens in the administration target (for example, toxoids such as bacterial toxoids, viruses, virus-like particles (VLPs), protein complexes, proteins, polypeptides, liposomes, and antigens are expressed.
  • toxoids such as bacterial toxoids, viruses, virus-like particles (VLPs), protein complexes, proteins, polypeptides, liposomes, and antigens are expressed.
  • the “peptidic immunogenic substance” means a peptide having a modification such as a post-translational modification or a peptide not having a modification such as a post-translational modification and having an immunogenicity. .
  • nucleic acid means a biopolymer in which nucleotides are linked. Nucleic acids include deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • animal means an animal with an immune system, particularly acquired immunity, and includes vertebrates, eg, birds or mammals, eg, mammals, eg, primates, especially humans. It is done.
  • the term “animal” is used to include humans as described above, and is described as a non-human animal when humans are excluded.
  • administered in combination with A and B or similar analogs, as long as A and B are administered in combination, A and B may be administered in combination, or A And B may be administered separately or simultaneously or sequentially.
  • Gramzyme A is a serine protease produced by cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer cells (NK cells), and cytotoxic T lymphocyte-related serine esterase 3 (CTLA3). ), Also referred to as cytotoxic T lymphocyte and NK cell specific trypsin-like serine protease, or HANUKAH factor serine protease (HFSP).
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • NK cells natural killer cells
  • HFSP cytotoxic T lymphocyte-related serine esterase 3
  • human granzyme A include a protein encoded by mRNA registered by NM_006144.3.
  • the protein encoded by the mRNA registered by NM_006144.3 (having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2) is produced as a granzyme A precursor having a 26 amino acid signal peptide at the N-terminus. 254th is mature granzyme A.
  • the amino acid sequence of mature human granzyme A can be, for example, SEQ ID NO: 3.
  • an immunostimulatory agent or a composition for use in immunostimulation comprising granzyme A.
  • Immunostimulation was antigen specific. Therefore, according to the present invention, there is provided an antigen-specific immunostimulating agent containing granzyme A or a composition for use in antigen-specific immunostimulation.
  • the composition for use in immunostimulating agent or immunostimulation of the present invention can be administered to a subject in combination with an immunogenic substance as an antigen or a composition containing the same.
  • the immunostimulatory promoter or composition for use in immunostimulation of the present invention is a composition administered to a subject in combination with an immunogenic substance as an antigen or a composition containing the same. It can be a thing.
  • granzyme A induced antigen-specific T cells.
  • granzyme A also induced antigen-specific T cells.
  • granzyme A caused dendritic cell maturation.
  • granzyme A matured both CD8-positive and CD8-negative dendritic cells.
  • these antigen-specific T cell induction, antigen-specific CD8 single positive cell induction, dendritic cell maturation, CD8 positive dendritic cell maturation, and CD8 negative dendritic cell maturation are induced in vivo. It was.
  • an antigen-specific T cell inducer comprising granzyme A, a composition for use in inducing antigen-specific T cells; antigen-specific CD8 comprising granzyme A A composition for use in inducing single positive cells; a composition for use in maturation of dendritic cells comprising granzyme A; a maturation of CD8 positive dendritic cells comprising granzyme A; and / or Alternatively, compositions for use in maturing CD8 negative dendritic cells can be provided, eg, they can be administered to a living body. Any of these inducers and compositions can be administered to a subject in combination with an immunogenic substance as an antigen or a composition containing the same.
  • an antigen-specific T cell inducer comprising granzyme A as described above, a composition for use in inducing antigen-specific T cells; an antigen-specific T cell comprising granzyme A A composition for use in inducing cells; a composition for use in maturation of dendritic cells, comprising granzyme A; and maturation of CD8 positive dendritic cells comprising granzyme A; and / or A composition for use in maturing CD8 negative dendritic cells can be an inducer or composition administered to a subject in combination with an immunogenic substance as an antigen or a composition comprising the same.
  • serine protease activity was not necessary for the adjuvant effect of granzyme A. Therefore, in one embodiment, instead of granzyme A, granzyme A in which serine protease activity is lower than that in the wild type, for example, granzyme A in which serine protease activity has been substantially lost, or granzyme A in which serine protease activity has been completely lost is used. Can be used. Examples of granzyme A having serine protease activity lower than that of the wild type include granzyme A in which serine corresponding to the 184th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is substituted with another amino acid (for example, alanine), It can be used in the invention.
  • granzyme A which is an active ingredient for the adjuvant effect, can be used in the form of a cell preparation supplied by cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A.
  • Cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A may be either allogeneic or allogeneic. From the viewpoint that granzyme A can be supplied without being rejected in the body of the administration subject, Homogeneous and homologous are preferred.
  • an immunostimulatory agent or a composition for use in immunostimulating comprising cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A.
  • an antigen-specific immunostimulator or a composition for use in antigen-specific immunostimulation comprising cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A.
  • an antigen-specific T cell inducer comprising a cell expressing granzyme A or a cell incorporating granzyme A, a composition for use in inducing an antigen-specific T cell A composition for use in inducing antigen-specific T cells, including cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A; comprising cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A; Compositions used to mature dendritic cells; mature CD8 positive dendritic cells and / or mature CD8 negative dendritic cells, including cells expressing granzyme A or cells incorporating granzyme A Compositions can be provided for use, eg, they can be administered to a living body.
  • the immunogenic substance may be incorporated into the cells together with clanzyme A, or may be expressed in the cells. It may be.
  • granzyme A can be administered to a subject in combination with an immunogenic substance as an antigen, a composition containing the same, or a cell having the composition.
  • the immunostimulatory agent or composition for use in immunostimulation of the present invention is a composition administered to a subject in combination with an immunogenic substance as an antigen or a composition containing the same. obtain.
  • the immunogenic substance can be administered separately with the cells.
  • the immunogenic substance may be administered in a form that exists in the cell or on the cell membrane.
  • an amino acid sequence having a sequence homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, or even more preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 instead of granzyme A.
  • Protein for example, granzyme A having an amino acid sequence having a sequence homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, or even more preferably 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. May be used).
  • Sequence homology can be determined with default parameters, for example, by the FASTA program of Pearson and Lipman, PNAS, 85: 2444-2448, 1988.
  • an immunogenic substance and an effective amount of granzyme A as an adjuvant or granzyme A having a serine protease activity decreased from that of the wild type or a protein having 80% or more amino acid homology with these are included.
  • a composition for antigen-specific immune activation is provided. When the composition of the present invention is administered to a living body, immunity specific to an immunogenic substance can be activated.
  • a conjugate of an immunogenic substance and granzyme A or granzyme A having serine protease activity lower than that of the wild type or a protein having 80% or more amino acid homology with these In the above conjugate, the immunogenic substance and granzyme A or granzyme A whose serine protease activity is lower than that of the wild type or a protein having 80% or more amino acid homology with these are bound via a linker. Also good.
  • Such a conjugate is permissible as long as it does not inhibit the adjuvant ability of granzyme A, and can exert an effect as a composition for antigen-specific immune activation by interacting intramolecularly or intermolecularly.
  • the antigen-specific immune activation composition of the present invention has an effective amount of granzyme A as an adjuvant or granzyme A having a serine protease activity decreased from that of the wild type or 80% or more amino acid homology with these.
  • the protein having can be included in the form of a conjugate with an immunogenic substance.
  • the immunogenic substance is conjugated to granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with granzyme A or serine protease activity reduced from the wild type via a linker. May be.
  • the immunogenic substance is a polypeptide, and an effective amount of granzyme A as an adjuvant or granzyme A having a serine protease activity reduced from that of the wild type or 80% or more amino acid homology with these. Proteins and fusion proteins with the immunogenic substances are provided.
  • the immunogenic substance may be conjugated to granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with granzyme A or serine protease activity reduced from the wild type via a linker. . As long as such a conjugate does not inhibit the adjuvant ability of granzyme A, it can interact intramolecularly or intermolecularly and exert an effect as a composition for antigen-specific immune activation.
  • nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention is provided.
  • the immunogenic substance in the composition for antigen-specific immune activation of the present invention, is a polypeptide, and the effective amount of granzyme A or serine protease activity as an adjuvant is lower than that of the wild type.
  • Granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with these may be included in the form of a fusion protein with the immunogenic substance.
  • the immunogenic substance is a polypeptide, there is an advantage in that it can be supplied as a fusion peptide with granzyme A. In this case, the fusion may be made via a peptidic linker.
  • the immunogenic substance may be a membrane protein, in which case it is presented on the cell surface or VLP. Or in the state of being taken up into cells.
  • the cells may have granzyme A and an immunogenic substance as a conjugate as described above, or have granzyme A and a peptidic immunogenic substance as a fusion protein as described above. It may be.
  • “the cell has X” means that the cell may contain X or may be presented on the cell surface.
  • the animal cell can be an autologous cell or a non-self cell for the administration subject, and the non-self cell can be, for example, an allogeneic animal cell.
  • the kind of cell is not specifically limited, For example, it can be set as a somatic cell, a dendritic cell, a blood cell, a lymphocyte, a spleen cell, etc.
  • Methods for expressing proteins such as granzyme in cells are well known to those skilled in the art.
  • a method using a viral vector, a method using an expression plasmid vector, a method for introducing mRNA, and the like can be used.
  • a method for incorporating a protein such as granzyme and an immunogenic substance into cells is well known to those skilled in the art and can be appropriately carried out by those skilled in the art.
  • spleen cells are used as cells, and after incubating under high osmotic pressure conditions in the presence of an immunogenic substance, apoptosis is induced under low osmotic pressure conditions, whereby the immunogenic substance is converted into cells.
  • the immunogenic substance can be a cancer antigen.
  • all adjuvant compositions and antigen-specific immune activation compositions of the invention are vertebrates, eg, birds or mammals, eg, mammals, eg, primates, especially humans. Can be administered.
  • the antigen-specific immune activation composition of the present invention may be used as a vaccine.
  • the composition for antigen-specific immune activation of the present invention can be used as a vaccine such as a cancer vaccine and an infectious disease vaccine for the purpose of treatment or prevention.
  • the composition for antigen-specific immune activation of the present invention is a subject in need thereof, for example, a subject suffering from cancer or an infectious disease, It is administered to the determined subject.
  • the antigen-specific immune activation composition of the present invention is a subject suspected of suffering from cancer or an infectious disease or a subject determined to be suspected Administered to a subject in which it is desirable or desirable to prevent recurrence of cancer, or to a subject in which it is desirable or desirable to prevent the onset of infection. Therefore, according to the present invention, granzyme A or granzyme A having serine protease activity decreased from the wild type or 80 for use as vaccines such as cancer vaccines and infectious disease vaccines.
  • a composition for antigen-specific immune activation comprising a protein having at least% amino acid homology.
  • the immunogenic substance can be a cancer antigen, and the cancer antigen is included in the immunogenic composition in various forms such as a form presented to cells and a form presented to VLPs. Can be made.
  • the immunogenic substance is preferably a vaccine used for the prevention of infectious diseases.
  • a nucleic acid encoding granzyme A or granzyme A having a serine protease activity reduced from that of the wild type, or a protein having 80% or more amino acid homology with these, and a nucleic acid encoding a peptidic immunogenic substance are: They may be provided on the same vector or supplied on separate vectors. And when provided on the same vector, they may be linked in frame and via or without a linker so as to be expressed as a fusion protein.
  • the nucleic acid can be incorporated into an expression vector so as to be operably linked to, for example, a promoter capable of driving expression in the cell and to allow expression of the protein from the nucleic acid in the cell.
  • expression vectors such as these can also be provided.
  • Nucleic acid encoding granzyme A or granzyme A in which serine protease activity is lower than that of the wild type or a protein having 80% or more amino acid homology with these and nucleic acid encoding peptidic immunogenic substance are expressed separately
  • the present invention provides a combination of these expression vectors.
  • nucleic acid that encodes granzyme A or granzyme A having a serine protease activity lower than that of the wild type or a protein having 80% or more amino acid homology with these a nucleic acid that encodes a peptidic immunogenic substance
  • Animal cells containing one or more vectors into which the combinations are expressed are provided. These cells may be allogeneic or allogeneic in the subject to be administered.
  • an animal cell comprising an antigenic peptide and granzyme A or granzyme A whose serine protease activity is lower than that of the wild type or a combination thereof with a protein having 80% or more amino acid homology.
  • the present invention also provides an antigen-specific immunity comprising an animal cell comprising an antigenic peptide and granzyme A or a combination of granzyme A having a serine protease activity reduced from that of the wild type or a protein having 80% or more amino acid homology with these.
  • An activation composition is provided.
  • the immunogenic substance may be incorporated into cells and administered.
  • granzyme A may be supplied into the same cell, may be supplied into another cell, or may be supplied in combination with a cell supplied as a peptide and incorporating an immunogenic substance.
  • the present invention includes granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with granzyme A or serine protease activity that is administered in combination with spleen cells that have taken up antigen peptide and has a reduced activity compared to wild type.
  • a composition for use in stimulating immunity to the antigenic peptide is provided.
  • a method for stimulating antigen-specific immunity in a subject, activating immunity by an antigen-specific T cell (eg, CD8SP cell) and / or maturating dendritic cells comprising granzyme A method comprising administering to a subject a combination of A or a serine protease activity-reduced granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with these and an immunogenic substance as an antigen Is done.
  • an antigen-specific T cell eg, CD8SP cell
  • maturating dendritic cells comprising granzyme A method comprising administering to a subject a combination of A or a serine protease activity-reduced granzyme A or a protein having 80% or more amino acid homology with these and an immunogenic substance as an antigen Is done.
  • the present invention provides the use of granzyme A in the manufacture of an immunostimulatory agent or a composition for use in immunostimulating.
  • use of granzyme A in the manufacture of an antigen-specific immunostimulating agent or a composition for use in antigen-specific immunostimulation in the present invention, an antigen-specific T cell inducer, a composition for use in inducing an antigen-specific T cell, a composition for use in inducing an antigen-specific T cell, dendritic Compositions for use in cell maturation, use of granzyme A in the manufacture of a composition for use in maturing CD8 positive dendritic cells and / or maturing CD8 negative dendritic cells are provided.
  • composition of the present invention may contain an excipient.
  • the composition of the present invention can be administered, for example, by parenteral administration (for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intratumoral administration, etc.). These can be prepared to be suitable for parenteral administration.
  • parenteral administration for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, intratumoral administration, etc.
  • composition of the present invention may contain an adjuvant other than granzyme A.
  • adjuvants include, but are not limited to, aluminum hydroxide and Freund's adjuvant. Even when adjuvants other than granzyme A are included, the effects of antigen-specific T cell induction and / or dendritic cell maturation can be brought about by granzyme A.
  • Proteins and peptides such as granzyme A and peptidic immunogenic substances can be prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • a protein such as granzyme A a protein synthesized in a cell by introducing a nucleic acid encoding a protein such as granzyme A into an insect cell, a mammalian cell or the like can be used.
  • a method such as introducing mRNA encoding the protein into the cell or introducing a vector expressing the protein into the cell.
  • Proteins such as granzyme A can also be synthesized, for example, using a cell-free protein synthesis system.
  • An expression vector that can express a protein in a selected host cell can be used.
  • the expression vector may be an episomal vector or a vector that is integrated into the host cell genome when introduced into the cell.
  • vectors such as plasmids and viral vectors can be used.
  • Such expression vectors can be designed and prepared by methods well known to those skilled in the art.
  • the target protein to be expressed is usually operably linked to a promoter.
  • the promoter a promoter capable of expressing a protein in a host cell can be appropriately used.
  • Expression vectors can be introduced into cells by methods well known to those skilled in the art.
  • Example 1 Induction of Antigen-Specific Immunity
  • gzmA granzyme A
  • OVA ovalbumin
  • NIH3T3 cells were treated with mRNA encoding OVA (Accession number: NM_205152). ) And mRNA encoding Granzyme A (Accession number: NM — 006144.3) were introduced by electroporation and intravenously administered to the pathogen-free C57BL / 6 mice via the tail vein. Seven days after administration, the spleen was excised from the mouse, strained using a cell strainer, red blood cells were hemolyzed with ACK lysing buffer and washed to obtain spleen-derived mononuclear cells.
  • OVA-tet Spleen-derived mononuclear cells and tetramer of OVA 257-264 peptide (OVA-tet; manufactured by MBL, product number: TS-5001-1C) and FITC-labeled anti-CD8 antibody (manufactured by Biolegend, manufacturing number: 100706 ). OVA-specific T cell responses were detected by flow cytometry. As a control, untreated NIH3T3 cells were used. The result was as shown in FIG.
  • OVA-specific immune activity in particular CD8 positive cells, was induced.
  • OVA mRNA alone was introduced into NIH3T3 cells and intravenously administered to the mouse tail vein as described above.
  • the number of CD8-positive cells obtained from mice after 7 days was 1, and granzyme A, granzyme B (Accession number: NM_013542), granzyme K (Accession number: NM_008196) or granzyme M (Accession number: The number of CD8 positive cells when the mRNA of (NM_008504) was introduced was compared by relative value. The result was as shown in FIG.
  • granzyme A is a serine protease
  • this enzyme activity is necessary for the above-described immunostimulatory activity of granzyme A.
  • a S184A mutant in which serine at position 184 in the amino acid sequence of granzyme A (amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) was replaced with alanine was prepared, and this mRNA was introduced into NIH3T3 cells together with OVA mRNA in the above experimental system. Thus, OVA-specific T cell induction was confirmed. The result was as shown in FIG.
  • granzyme A is considered to be expressed in NIH3T3 cells. Since granzyme A was not released from NIH3T3 cells, it was suggested that granzyme A exerts an adjuvant effect by being destroyed by immune cells in the mouse body and released as cell contents.
  • Granzyme A protein was synthesized using an insect cell (sf9 cell) -baculovirus expression system according to the manufacturer's manual.
  • Mouse bone marrow cells were obtained from the peripheral blood of C57BL / 6 mice free of pathogenic bacteria. Specifically, bone marrow cells were collected from mouse femur and tibia, and mouse FLT3L (Peprotech Co., Ltd. 250-31L) 200 ng / ml was added to induce dendritic cell culture.
  • Synthesized granzyme A (concentration: 1000 ng / mL) was added to the culture system of culture-induced CD11-positive dendritic cells, and after 24 hours, the cells were collected and washed, and anti-CD86 antibody (BD) was obtained by flow cytometry. And product number: 553690) and Streptavidin-PE (product number: 12-4317-87, manufactured by ebioscience) was used to examine the maturation of dendritic cells based on CD86 expression intensity.
  • LPS manufactured by Invivogen, product number: tlrl-eklps
  • negative controls no granzyme A or LPS was added, and an isotype antibody was used in place of the anti-CD86 antibody. The result was as shown in FIG.
  • mice were intravenously administered with 20 ⁇ g of synthesized granzyme A. Sixteen hours after the administration, the spleen was collected and subjected to enzyme treatment using collagenase D (Roche, product number: 11088882001) to obtain a sufficient amount of dendritic cells. Next, splenic dendritic cells were stained with anti-CD11c antibody (BD, product number 550261) and anti-CD8a antibody (Biolegend, product number: 100706) to obtain CD8-positive and CD8-negative dendritic cells. Divided into. For each, maturation was examined by CD86 expression intensity as described above. The result was as shown in FIG.
  • Example 3 Induction of immunity with granzyme A in vivo
  • cells expressing both granzyme A and antigen were administered to a living body.
  • granzyme A was administered to the living body as a protein.
  • mice were immunized with OVA antigen according to the method described in Fujii S. et al., Journal of Experimental Medicine, 198 (2): 267-279, 2003, and the presence or absence of antigen-specific T cells was examined. Specifically, spleen cells were collected from the ascites of C57BL / 6 mice free of pathogenic bacteria. The obtained splenocytes were incubated in hyperosmotic medium (Hyper0.5M sucrose, 10% wt / vol polyethylene glycol 1540, 10 mM Hepes containing RPMI) for 10 minutes at 37 ° C.
  • hyperosmotic medium Hyper0.5M sucrose, 10% wt / vol polyethylene glycol 1540, 10 mM Hepes containing RPMI
  • OVA antigen-incorporated splenocytes were prepared by incubating with a hypotonic solution (DDW plus RPMI medium) for 2 minutes to induce apoptosis and washing with PBS.
  • the obtained OVA antigen-incorporated spleen cells were administered to mice together with 20 ⁇ g of granzyme A synthesized by a cell-free protein synthesis system, and the spleen was collected to obtain spleen-derived mononuclear cells.
  • the obtained spleen mononuclear cells were reacted with a tetramer of OVA 257-264 peptide, and an OVA-specific T cell response was detected with a flow cytometer.
  • As a positive control 20 ⁇ g LPS and OVA antigen-incorporated spleen cells were used, and as a negative control, a buffer alone was used. The results were as described in FIG.
  • OVA-specific T cell induction was confirmed in the group administered with OVA antigen-incorporated spleen cells and granzyme A (FIG. 5A right).
  • OVA-specific T cell induction was not confirmed (middle of FIG. 5A).
  • the isolated mononuclear cells were cultured for 6 hours in the absence or presence of OVA peptide (concentration 1 ⁇ M), and the change in production of interferon ⁇ before and after the culture (T cell response) was examined. Interferon ⁇ was measured by intracellular staining. The result was as shown in FIG.
  • Example 4 Use as a cancer vaccine
  • granzyme A can be used as an adjuvant that can induce an antigen-specific immune response.
  • the suppressive effect of cancer cells by the induced immune response was examined.
  • OVA antigen-incorporated spleen cells were prepared. 2 ⁇ 10 7 OVA antigen-incorporated spleen cells were intravenously administered to mice together with 20 ⁇ g of granzyme A, and 7 days later, 1 ⁇ 10 5 MO4 cells were subcutaneously administered to increase the growth effect of MO4 cells in the body. confirmed.
  • the MO4 cell is known as a mouse melanoma cell line B16 cell in which OVA is forcibly expressed.
  • mice to which only MO4 cells were administered were used. The result was as shown in FIG.
  • the tumor size increased rapidly in the control group that did not pre-administer OVA antigen-incorporated spleen cells and granzyme A, whereas the pre-administered group increased tumor size.
  • the pre-administered group increased tumor size.
  • granzyme A has a strong adjuvant effect and is promising as a cancer vaccine.
  • Example 5 Analysis of immune response induced by granzyme A
  • the immune response induced by granzyme A was analyzed in more detail.
  • peripheral blood was collected from the mice.
  • a large amount of IgG1 groove and an amount of IgG2 antibody in the collected peripheral blood were measured using conventional methods. The result was as shown in FIG.
  • granzyme A is a biological protein, it is expected to reduce side effects.

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Abstract

本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントを提供する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こしうるアジュバントを提供する。

Description

アジュバント組成物とその利用
　本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントに関する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こしうるアジュバントに関する。
　免疫系を効率的に賦活化し，抗原特異的な記憶を成立させることは、感染症、癌などに対するワクチンの開発において重要な課題である。その為には至適条件の抗原とアジュバントを用いる必要がある。アジュバントは、ラテン語の補助を意味する“adjuvare”に由来した言葉で、ワクチンの際の抗原の内因性免疫原性を修飾するものを示す。
　臨床では、アジュバントとして塩化アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩(alum)が利用され、癌ワクチンには不完全フロイントアジュバント(IFA)が使用されてきたが、これらの効果は抗原特異的な免疫賦活化を誘導する上で、未だ十分といえない。また、これらの作用機序は不明であり、かつ、副作用の問題点が指摘され始めている（非特許文献１）。
　グランザイムＡは、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、細胞傷害性Ｔリンパ球から見つかった（非特許文献２）。グランザイムＡの機能としては、アポトーシスの誘導が報告されている（非特許文献３）。
Gherardi et al., Brain, 124: 1821-1831, 2001 Gershenfeld et al, Science, 232 (4752): 854-858, 1996 Martinvalet et al, Cell, 133 (4): 681-692, 2008
　本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントを提供する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞賦活化を引き起こしうるアジュバントを提供する。
　本発明は、免疫賦活化、特にＴ細胞免疫賦活化を引き起こし得るアジュバントを提供する。本発明は、特に抗原特異的な免疫賦活化、特にＴ細胞賦活化を引き起こしうるアジュバントを提供する。
　本発明者らは、グランザイムＡが、セリンプロテアーゼ活性に非依存的に免疫賦活化することを明らかにした。本発明者らはまた、この免疫賦活化において抗原特異的な免疫の賦活化が生じていることも明らかにした。本発明者らはさらに、グランザイムＡは、抗原特異的なＴ細胞の誘導、樹状細胞の成熟（例えば、ＣＤ８陽性樹状細胞および／またはＣＤ８陰性樹状細胞の成熟）、インターフェロンγの産生を引き起こすことも明らかにした。本発明は、このような知見に基づく発明である。
　すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、アジュバント組成物。
（２）グランザイムＡが、セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡである、上記（１）記載のアジュバント組成物。
（３）セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡが、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がセリンからアラニンに置換されたグランザイムＡである、上記（２）に記載のアジュバント組成物。
（４）Ｔ細胞性免疫またはＢ細胞性免疫を賦活化することに用いるための、上記（１）～（３）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
（５）樹状細胞を成熟化させることに用いるための、上記（１）～（４）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
（６）アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質と、免疫原性物質とを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（７）アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、免疫原性物質とのコンジュゲートの形態で含む、上記（６）に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
（８）上記（６）または（７）に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物であって、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質の形態で含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（９）免疫原性物質が、がん抗原である、上記（６）～（８）のいずれかに記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
（１０）ワクチンとして用いるための、上記（６）～（９）のいずれかに記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
（１１）グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む、免疫を賦活化することに用いるための組成物。
（１２）上記（１１）で定義された核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せであって、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
（１３）上記（１２）に記載の組合せが、１つのベクターまたは別々に含む２つ以上のベクターに含まれる、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組成物。
（１４）上記（１３）に記載の組成物で形質転換され、グランザイムＡと前記免疫原性物質とを発現する、動物細胞。
（１５）ペプチド性の免疫原性物質とグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との融合タンパク質であって、免疫原性を有する融合タンパク質。
（１６）上記（１５）に記載の融合タンパク質を有する動物細胞。
（１７）上記（１４）または（１６）に記載の細胞を有効成分として含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（１８）グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む動物細胞と免疫原性物質との組合せであって、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
（１９）上記（１８）に記載の組合せを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
（２０）免疫原性物質取込み脾臓細胞と組み合わせて投与される、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための上記（１）～（５）のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
図１は、抗原とグランザイムＡを発現する細胞が抗原特異的なＴ細胞を誘導することを示す図である。図１では、抗原は、オボアルブミンである。図中グランザイムＡは、ｇｒｍＡと略されていることがあり、以下の図でも同様である。 図２は、抗原特異的なＴ細胞誘導は、他のグランザイムよりもグランザイムＡにより強く引き起こされることを示す図である（図２Ａ参照）。図２はまた、グランザイムＡによる抗原特異的なＴ細胞誘導には、グランザイムのセリンプロテアーゼ活性がほとんど関与しないことを示す図である（図２Ｂ参照）。図中のＳ１８４Ａ　ｇｚｍＡは、グランザイムＡのセリンプロテアーゼ活性を実質的に喪失させた変異体である。 図３は、グランザイムＡが、リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」ともいう）と同等かそれよりも強く樹状細胞を成熟化させる作用を有することを示す図である。図中、ＤＣは樹状細胞を意味する。図中のＣＤ８６は、成熟した樹状細胞のマーカーである。 図４は、グランザイムＡが、リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」ともいう）と同等かそれよりも強くＣＤ８陽性樹状細胞およびＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることを示す図である。 図５は、マウスに抗原とグランザイムＡを投与すると抗原特異的なＴ細胞が誘導されることを示す図である（図５Ａ参照）。図５はまた、マウスに抗原とグランザイムＡを投与するとインターフェロンγが産生されることを示す図である（図５Ｂ参照）。図中の「ｐｅｐ」は、ＯＶＡを意味する。 図６は、マウスにおいてグランザイムＡが抗原特異的にがんを抑制できることを示す図である。 図７は、抗原とグランザイムＡを投与したマウスでは、抗原特異的なＩｇＧ２抗体の産生量が増加し、抗原と水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）を投与したマウスでは、抗原特異的なＩｇＧ１抗体の産生量が増加することを示す図である。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「アジュバント組成物」とは、アジュバントとして用いる組成物を意味する。アジュバント組成物は、例えば、免疫原性物質と組み合わせて同時にまたは別々に投与すると、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することができる。本明細書では、アジュバント組成物を、免疫賦活剤、免疫増強剤、または免疫賦活化することに用いるための組成物ということがある。本明細書では、アジュバント組成物は、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるため、特に抗原特異的なＣＤ８シングルポジティブ細胞を誘導することに用いるため、樹状細胞（例えば、ＣＤ８陽性樹状細胞およびＣＤ８陰性樹状細胞）を成熟化させることに用いるため、などの様々な目的に用いることができる。ＣＤ８シングルポジティブ細胞とは、ＣＤ８が陽性でありＣＤ４が陰性であるＴ細胞を意味し、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が挙げられる。
　本明細書では、「免疫原性物質」とは、免疫原性を有する物質一般を意味する。免疫原性物質としては、投与対象において外因性の抗原となる物質（例えば、細菌トキソイドなどのトキソイド、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、抗原を表出した細胞、目的抗原ペプチドを表出した細胞および免疫刺激複合体及びこれらの断片）、及び投与対象において内因性の抗原となる物質（例えば、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、Ｍａｇｅ－１、Ｍａｇｅ－３、ｇｐ１００、チロシナーゼ，ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ－１２５、ｅｒｂ－２、Ｍｕｃ－１、Ｍｕｃ－２、ＴＡＧ－７２、ＡＥＳ、ＦＢＰ、Ｃ－レクチン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇａｌｅｃｔｉｎ－４／ＮＹ－ＣＯ－２７、Ｐｅｃ６０、ＨＥＲ－２／ｅｒｂＢ－２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、Ｇ２５０、Ｈｓｐ１０５、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、癌胎児性抗原、proteinase 3、ＷＴ－１、ｈＴＥＲＴ、ＰＲＡＭＥ、ＰＭＬ／ＲＡＲ－ａ、ＤＥＫ／ＣＡＮ、シクロフィリンＢ、ＴＥＬ－ＭＡＬ１、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｓｐｅｒｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１７、ＳＰＡＮ－Ｘｂ、ＣＴ－２７、ＭＵＣ１などのがん抗原及びこれらの断片）が挙げられる。本明細書では、「ペプチド性の免疫原性物質」とは、翻訳後修飾等の修飾を有するペプチドまたは翻訳後修飾等の修飾を有しないペプチドであって、免疫原性を有するペプチドを意味する。
　本明細書では、「核酸」とは、ヌクレオチドが連結した生体高分子を意味する。核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
　本明細書では、「動物」とは、免疫系、特に獲得免疫が備わった動物を意味し、脊椎動物、例えば、鳥類または哺乳動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、特に、ヒトが挙げられる。本明細書では、動物は上述のようにヒトを含む意味で用いられ、ヒトを排除する場合には、非ヒト動物と記載する。
　本明細書では、「ＡとＢとを組み合わせて投与する」またはこの類似表現は、ＡとＢとを組み合わせて投与する限り、ＡとＢとを混合して投与してもよいし、またはＡとＢとを別体として同時に若しくは逐次的に投与してもよいことを意味する。
　本明細書では、「グランザイムＡ」とは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）により産生されるセリンプロテアーゼであり、細胞傷害性Ｔリンパ球関連セリンエステラーゼ３（ＣＴＬＡ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞特異的トリプシン様セリンプロテアーゼ、またはＨＡＮＵＫＡＨ因子セリンプロテアーゼ（ＨＦＳＰ）とも呼ばれている。ヒトグランザイムＡとしては、例えば、NM_006144.3により登録されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が挙げられる。NM_006144.3により登録されたｍＲＮＡによりコードされるタンパク質（配列番号２のアミノ酸配列を有する）は、２６アミノ酸のシグナルペプチドをＮ末端に有するグランザイムＡ前駆体として産生され、配列番号２においてアミノ酸番号２９～２５４番が成熟型グランザイムＡとなる。成熟型ヒトグランザイムＡのアミノ酸配列は、例えば、配列番号３であり得る。
　本発明では、グランザイムＡは、抗原特異的な免疫賦活化することが示された。従って、本発明によれば、グランザイムＡを含む、免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。免疫賦活化は、抗原特異的なものであった。従って、本発明によれば、グランザイムＡを含む、抗原特異的な免疫賦活化剤または抗原特異的な免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。本発明の免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与することができる。従って、ある態様では、本発明の免疫賦活化促進剤または免疫賦活化することに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与される組成物であり得る。
　本発明では、グランザイムＡは、抗原特異的なＴ細胞を誘導した。本発明ではまた、グランザイムＡは、抗原特異的なT細胞を誘導した。本発明ではさらに、グランザイムＡは、樹状細胞の成熟を引き起こした。特に本発明では、グランザイムＡは、ＣＤ８陽性樹状細胞も、ＣＤ８陰性樹状細胞も成熟化させた。特に、これらの抗原特異的なＴ細胞誘導、抗原特異的なＣＤ８シングルポジティブ細胞誘導、樹状細胞の成熟、ＣＤ８陽性樹状細胞の成熟、およびＣＤ８陰性樹状細胞の成熟は、インビボにおいて誘導された。従って、本発明によれば、グランザイムＡを含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、抗原特異的なＣＤ８シングルポジティブ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、樹状細胞を成熟化させることに用いる組成物；グランザイムＡを含む、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させること、および／または、ＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物が提供され得、例えば、これらは生体に投与され得る。これらの誘導剤および組成物はいずれも、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与することができる。従って、ある態様では、上記のグランザイムＡを含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、抗原特異的なＴ細胞を誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを含む、樹状細胞を成熟化させることに用いる組成物；グランザイムＡを含む、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させること、および／または、ＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与される誘導剤または組成物であり得る。
　本発明では、グランザイムＡのアジュバント効果には、セリンプロテアーゼ活性は必要ではなかった。従って、ある態様では、グランザイムＡに代えて、セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡ、例えば、セリンプロテアーゼ活性が実質的に喪失したグランザイムＡ、セリンプロテアーゼ活性を完全に喪失したグランザイムＡを用いることができる。セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡとしては、配列番号３のアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するセリンが他のアミノ酸（例えば、アラニン）に置換されたグランザイムＡが挙げられ、本発明で用いることができる。セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡを用いると、セリンプロテアーゼ活性に起因する副作用を低減できる点で有利であると考えられる。配列番号３のアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するセリンがアラニンに置換されたグランザイムＡは、セリンプロテアーゼ活性を実質的に有さず、本発明で好ましく用いられ得る。
　本発明では、アジュバント効果の有効成分となるグランザイムＡを、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞によって供給する細胞製剤の形態で用いられ得る。グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞は、同種同系、および同種異系のどちらであっても良いが、投与対象の体内で拒絶されずにグランザイムＡを供給できるという観点からは、同種同系が好ましい。
　言い換えれば、グランザイムＡの代わりに、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を用いることができる。
　従って、本発明によれば、本発明によれば、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。本発明によれば、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、抗原特異的な免疫賦活化剤または抗原特異的な免疫賦活化することに用いるための組成物が提供される。
　また、本発明によれば、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物；グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、樹状細胞を成熟化させることに用いる組成物；グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞を含む、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させることおよび／またはＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物が提供され得、例えば、これらは生体に投与され得る。
　グランザイムＡが、グランザイムＡを発現する細胞またはグランザイムＡを取り込んだ細胞の形態で投与される上記態様において、免疫原性物質はクランザイムＡと共に細胞に取り込まれていてもよいし、細胞に発現させられていてもよい。
　また、この態様では、グランザイムＡは、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物若しくはこれを有する細胞と組み合わせて対象に投与することができる。ある態様では、本発明の免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物は、抗原としての免疫原性物質またはこれを含む組成物と組み合わせて対象に投与される組成物であり得る。投与の際、免疫原性物質は、前記細胞と一緒に、別々に投与することができる。免疫原性物質は、細胞内または細胞膜上に存在する形態で投与してもよい。
　本発明では、グランザイムＡの代わりに、配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、またはさらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、またはさらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するグランザイムＡであってもよい）を用い得る。配列相同性は、例えば、Pearson and Lipman, PNAS, 85:2444-2448, 1988のＦＡＳＴＡプログラムにより、デフォルトパラメータで決定することができる。
　本発明のある面では、免疫原性物質と、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物が提供される。本発明の上記組成物を生体に投与すると、免疫原性物質に特異的な免疫が賦活化され得る。
　本発明のある面では、免疫原性物質とグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とのコンジュゲートが提供される。上記コンジュゲートにおいては、免疫原性物質とグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とは、リンカーを介して結合していてもよい。このようなコンジュゲートは、グランザイムＡのアジュバント能力を阻害しない限り許容され、分子内または分子間で相互作用して抗原特異的免疫活性化用組成物としての効果を発揮し得る。
　ある態様では、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、免疫原性物質とのコンジュゲートの形態で含み得る。本発明のある態様では、免疫原性物質は、リンカーを介してグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とコンジュゲートしていてもよい。
　本発明のある面では、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質が提供される。ある態様では、免疫原性物質は、リンカーを介してグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質とコンジュゲートしていてもよい。このようなコンジュゲートは、グランザイムＡのアジュバント能力を阻害しない限り、分子内または分子間で相互作用して抗原特異的免疫活性化用組成物としての効果を発揮し得る。
　本発明のある面では、本発明の上記融合タンパク質をコードする核酸が提供される。
　本発明のある態様では、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質の形態で含み得る。免疫原性物質がポリペプチドである場合には、グランザイムＡと融合ペプチドとして供給され得る点で利点がある。この場合、融合はペプチド性リンカーを介してなされてもよい。
　本発明によれば、グランザイムＡおよび免疫原性物質は、一緒に若しくは別々に、細胞内に発現させて（免疫原性物質は膜タンパク質であってもよく、この場合、細胞表面やＶＬＰに提示させて）、または細胞内に取り込ませた状態で、同時にまたは逐次的に投与することができる。細胞は、グランザイムＡおよび免疫原性物質を上記で説明したようにコンジュゲートとして有していてもよいし、グランザイムＡおよびペプチド性の免疫原性物質を上記で説明したように融合タンパク質として有していてもよい。ここで、「細胞がＸを有する」とは、細胞がＸを含んでいてもよいし、細胞表面に提示していてもよいことを意味する。
　この態様において、動物細胞は、投与対象に対して自己細胞または非自己細胞とすることができ、非自己細胞としては、例えば、同種異系の動物細胞とすることができる。細胞の種類は、特に限定されないが例えば、体細胞、樹状細胞、血球細胞、リンパ球、脾臓細胞などとすることができる。
　細胞内にグランザイム等のタンパク質を発現させる方法は、当業者に周知であり、例えば、ウイルスベクターを用いる方法、発現プラスミドベクターを用いる方法、ｍＲＮＡを導入する方法などを用いることができる。
　細胞内にグランザイム等のタンパク質および免疫原性物質を取り込ませる方法は、当業者に周知であり、当業者であれば適宜実施することができる。例えば、本発明では、細胞として脾臓細胞を用い、免疫原性物質の存在下で高浸透圧条件下でインキュベートした後に低浸透圧条件下でアポトーシスを誘導することにより、免疫原性物質を細胞に取り込ませることができる（例えば、Iyoda et al., J. Exp. Med., 195 (10): 1289-1302を参照）。
　本発明のある態様では、免疫原性物質は、がん抗原であり得る。
　本発明のある態様では、本発明の全てのアジュバント組成物および抗原特異的免疫活性化用組成物は、脊椎動物、例えば、鳥類または哺乳動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、特に、ヒトに投与され得る。
　本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、ワクチンとして用いてもよい。本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、治療または予防を目的として、例えば、がんワクチンおよび感染症ワクチンなどのワクチンとして用いることができる。治療を目的としたワクチンとして用いる場合、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、これを必要とする対象、例えば、がんまたは感染症に罹患している対象または罹患していると判定された対象に対して投与される。予防を目的としたワクチンとして用いる場合、これを必要とする対象、本発明の抗原特異的免疫活性化用組成物は、がん若しくは感染症の罹患が疑われる対象または疑われると判定された対象、がんの再発を防ぐことが望ましい対象または望ましいと判定された対象、または感染症の罹患を未然に防ぐことが望ましい対象または望ましいと判定された対象に投与される。従って、本発明によれば、ワクチンとして用いるための、例えば、がんワクチンおよび感染症ワクチンなどのワクチンとして用いるための、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む、抗原特異的免疫活性化用組成物が提供される。がんワクチンにおいては、免疫原性物質はがん抗原とすることができ、がん抗原は細胞に提示された形態、ＶＬＰに提示された形態など、様々な形態で免疫原性組成物に含ませることができる。また、感染症ワクチンにおいては、免疫原性物質は、感染症の予防に用いられるワクチンとすることが好ましい。
　本発明では、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せ（特に非天然の組合せ）が提供される。この態様において、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸とは、同一の核酸上に提供されてもよいし、別々の核酸として提供されてもよい。例えば、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸とは、同一のベクター上に提供されてもよいし、別々のベクター上に供給されてもよい。そして、同一のベクター上に提供される場合には、融合タンパク質として発現するようにインフレームで、リンカーを介してまたは介さずに連結されていてもよい。そして、上記核酸は、例えば、細胞内での発現を駆動することができるプロモーターに作動可能に連結され、細胞内で該核酸からのタンパク質の発現を可能とするように発現ベクターに組込まれ得る。本発明ではこれらのような発現ベクターも提供されうる。グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸とが別の発現ベクター上に提供される場合には、本発明では、これらの発現ベクターの組合せが提供される。
　本発明では、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せが発現可能に組込まれた１以上のベクターを含む動物細胞が提供される。これらの細胞は、投与する対象において同種同系または同種異系であってもよい。
　本発明によれば、抗原ペプチドとグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との組合せを含む、動物細胞が提供される。本発明ではまた、抗原ペプチドとグランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との組合せを含む動物細胞を含む、抗原特異的免疫活性化用組成物が提供される。
　本発明では、免疫原性物質は細胞に取り込ませて投与してもよい。この際、グランザイムＡは同一の細胞内に供給されてもよいし、別の細胞内に供給されてもよいし、あるいは、ペプチドとして供給され、免疫原性物質を取り込んだ細胞と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明では、抗原ペプチド取込み脾臓細胞と組み合わせて投与され、かつ、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む、前記抗原ペプチドに対する免疫を賦活化することに用いるための組成物が提供される。
　本発明では、対象において抗原特異的な免疫を賦活化する、抗原特異的なＴ細胞（例えばＣＤ８ＳＰ細胞）による免疫を賦活化する、および／または、樹状細胞を成熟させる方法であって、グランザイムＡ若しくはセリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡまたはこれらと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質と、抗原としての免疫原性物質を組み合わせて対象に投与することを含む、方法が提供される。
　本発明では、免疫賦活化剤または免疫賦活化することに用いるための組成物の製造におけるグランザイムＡの使用が提供される。本発明では、抗原特異的な免疫賦活化剤または抗原特異的な免疫賦活化することに用いるための組成物の製造におけるグランザイムＡの使用が提供される。本発明では、抗原特異的なＴ細胞の誘導剤、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物、抗原特異的なＴ細胞の誘導することに用いるための組成物、樹状細胞の成熟化に用いる組成物、ＣＤ８陽性樹状細胞を成熟化させること、および／または、ＣＤ８陰性樹状細胞を成熟化させることに用いるための組成物の製造におけるグランザイムＡの使用が提供される。
　本発明の組成物は、賦形剤を含んでいてもよい。本発明の組成物は、例えば、非経口投与（例えば、腹腔内投与、静脈投与、皮下投与、腫瘍内投与など）で投与されうる。これらの非経口投与に適するように、調製され得る。
　本発明の組成物は、グランザイムＡ以外のアジュバントを含んでいてもよい。そのようなアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウムおよびフロイントアジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。グランザイムＡ以外のアジュバントを含む場合においても、抗原特異的なＴ細胞の誘導および／または樹状細胞の成熟化の効果は、グランザイムＡによってもたらされ得る。
　グランザイムＡおよびペプチド性の免疫原性物質などのタンパク質およびペプチドは、当業者に周知の方法により調製することができる。例えば、グランザイムＡなどのタンパク質は、昆虫細胞、哺乳動物細胞などにグランザイムＡなどのタンパク質をコードする核酸を発現可能に導入することにより、細胞内で合成されたものを用いることができる。タンパク質を発現可能に細胞に導入するためには、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内に導入すること、または当該タンパク質を発現するベクターを細胞内に導入することなどの方法により達成することができる。グランザイムＡなどのタンパク質はまた、例えば、無細胞タンパク質合成系を用いて合成することもできる。
　発現ベクターは、選択された宿主細胞内でタンパク質を発現できるベクターを用いることができる。発現ベクターは、エピゾーマルベクターであってもよいし、細胞内に導入されると宿主細胞ゲノム内にインテグレートされるベクターであってもよい。発現ベクターとしては、プラスミドおよびウイルスベクターなどのベクターを用いることができる。このような発現ベクターは、当業者に周知の方法で設計され、かつ調製され得る。発現ベクター内では、発現させたい目的タンパク質は、通常、プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターとしては、宿主細胞内でタンパク質を発現させることができるプロモーターを適宜用いることができる。発現ベクターは、当業者に周知の方法により細胞内に導入することができる。
実施例１：抗原特異的な免疫の誘導
　本実施例では、グランザイムＡ（以下、「ｇｚｍＡ」と略す）がオボアルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）に対する特異的免疫を引き起こすことを明らかにした。
　ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＯＶＡをコードするｍＲＮＡ（Accession番号：NM_205152
）と、グランザイムＡをコードするｍＲＮＡ（Accession番号：NM_006144.3）をエレクトロポレーションで導入し、病原菌フリーのＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より静脈内投与した。投与７日後のマウスから脾臓を摘出し、セルストレイナーを用いて漉し、ACK lysing bufferで赤血球を溶血して洗浄し、脾臓由来単核球を得た。得られた脾臓由来単核球とＯＶＡ２５７-２６４ペプチドのテトラマー（ＯＶＡ－ｔｅｔ；MBL社製、製品番号：TS-5001-1C）およびFITC標識－抗ＣＤ８抗体（Biolegend社製、製造番号：100706）と反応させた。フローサイトメトリーでＯＶＡ特異的Ｔ細胞反応を検出した。対照としては、未処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。結果は、図１に示される通りであった。
　図１に示されるように、グランザイムＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＯＶＡ特異的な免疫活性、特にＣＤ８陽性細胞が誘導された。
　次に、上記においてグランザイムＡに代えて他のグランザイムファミリー（グランザイムＢ、ＫおよびＭ）のｍＲＮＡを用いて、他のグランザイムファミリーが同様の免疫誘導活性を有するかを調べた。
　ＯＶＡのｍＲＮＡを単独でＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入して、上記と同様にマウス尾静脈に静脈投与した。７日後のマウスから得られたＣＤ８陽性細胞数を１として、ＯＶＡのｍＲＮＡに加えて、グランザイムＡ、グランザイムＢ（Accession番号：NM_013542）、グランザイムＫ（Accession番号：NM_008196）またはグランザイムＭ（Accession番号：NM_008504）のｍＲＮＡを導入した場合のＣＤ８陽性細胞数を相対値により比較した。結果は、図２に示される通りであった。
　図２左に示されるように、グランザイムＡは、ＯＶＡ特異的なＴ細胞を誘導したが、グランザイムＫおよびＭでは、ＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導は確認されなかった。グランザイムＢでは、弱いＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導が確認された。
　さらに、グランザイムＡがセリンプロテアーゼであることから、グランザイムＡが有する上記の免疫賦活活性にこの酵素活性が必要か否かを調べた。このために、グランザイムＡのアミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）の１８４番目のセリンをアラニンに置き換えたＳ１８４Ａ変異体を作製し、上記の実験系において、このｍＲＮＡをＯＶＡ　ｍＲＮＡと共にＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入してＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導を確認した。結果は、図２に示される通りであった。
　図２右に示されるように、グランザイムＡによる免疫賦活活性には、セリンプロテアーゼ活性は不要であることが示された。このことから、グランザイムＡの酵素活性を不活化した変異体を用いることにより、例えば、グランザイムＡ導入細胞を生体に導入した場合に、セリンプロテアーゼ活性に起因する副作用を低減できると考えられる。
　本実施例により、グランザイムＡは、抗原特異的な免疫賦活化を誘導できることが明らかとなった。特にグランザイムＡは、抗原特異的なＴ細胞の賦活化を誘導した。このことから、グランザイムＡは、アジュバントとして有用であることも明らかとなった。
　また、本実施例では、グランザイムＡは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の細胞内に発現していると考えられる。グランザイムＡは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から放出されている訳ではなかったため、マウス体内の免疫細胞により破壊され、細胞の内容物として放出されることによりアジュバント効果を発揮することが示唆された。
実施例２：骨髄由来樹状細胞への成熟化に対するグランザイムＡの効果
　上記実施例では、グランザイムＡが免疫賦活化を誘導することを明らかにした。本実施例では、骨髄由来樹状細胞（以下「ＤＣ」と略す）への成熟に対するグランザイムＡの効果を調べた。
　昆虫細胞(sf9細胞)－バキュロウイルス発現系を用い、製造者マニュアルに従ってグランザイムＡのタンパク質を合成した。
　マウス骨髄細胞は、病原菌フリーのＣ５７ＢＬ／６マウスの末梢血から得た。具体的には、マウス大腿骨、頸骨より骨髄細胞を採取し、マウスFLT3L(ぺプロテック社 250-31L) 200ng/mlを添加し、樹状細胞を培養誘導した。
　培養誘導したＣＤ１１陽性樹状細胞の培養系に、合成されたグランザイムＡ（濃度：1000ng/mL）を添加し、２４時間後に細胞を回収して洗浄し、フローサイトメトリーによって抗ＣＤ８６抗体（BD社製、製品番号：553690）およびStreptavidin-PE(ebioscience社製　製品番号：12-4317-87)を用いてＣＤ８６発現強度により樹状細胞の成熟化について調べた。陽性対照としては、グランザイムＡの代わりにＬＰＳ（Invivogen社製、製品番号：tlrl-eklps）をＣＤ１１陽性単球の培養系に100ng/mlで添加した。陰性対照としては、グランザイムＡもＬＰＳも添加しないもの、および抗ＣＤ８６抗体の代わりにアイソタイプ抗体を用いたものとした。結果は、図３に示される通りであった。
　図３に示されるように、グランザイムＡとＬＰＳの双方においてＣＤ８６陽性細胞の増加が確認され、グランザイムＡはＬＰＳと同等に樹状細胞を成熟化することが確認された。
　このように、インビボの系においてグランザイムＡタンパク質は、骨髄由来樹状細胞を成熟化させる作用を有していた。次に、インビボにおけるグランザイムＡの効果を確認した。
　マウスに、合成したグランザイムＡ　２０μｇを静脈投与した。投与１６時間後に脾臓を回収して、樹状細胞を十分量得るためにコラゲナーゼD (Roche社製、製品番号：11088882001)を用いて酵素処理を行った。次いで、脾臓の樹状細胞を抗CD11c抗体 (BD社製、製品番号550261)、抗CD8a抗体（Biolegend社製、製品番号：100706）で染色し、ＣＤ８陽性樹状細胞とＣＤ８陰性樹状細胞とに分けた。それぞれについて、上記の通りCD86発現強度により成熟化を検討した。結果は、図４に示される通りであった。
　図４に示されるように、グランザイムＡを投与したマウスでは、ＣＤ８陽性の樹状細胞およびＣＤ８陰性の樹状細胞のいずれも、ＬＰＳ投与マウスと同様に確認された。このことから、グランザイムＡは、生体内においても、ＬＰＳと同様に樹状細胞を成熟化させる効果を有することが明らかとなった。
実施例３：生体内におけるグランザイムＡによる免疫誘導
　実施例１では、グランザイムＡと抗原の両方を発現する細胞を生体に投与した。本実施例では、グランザイムＡをタンパク質として生体に投与した。
　Fujii S. et al., Journal of Experimental Medicine, 198(2): 267-279, 2003に記載の方法に従ってマウスにＯＶＡ抗原を免疫して、抗原特異的Ｔ細胞の有無について検討した。具体的には、病原菌フリーのＣ５７ＢＬ／６マウスの腹水より、脾細胞を回収した。得られた脾細胞を、ＯＶＡ抗原１０ｍｇ／ｍＬの存在下、高浸透圧培地（Hyper0.5M sucrose, 10%wt/vol polyethylene glycol1540, 10mM Hepes containing RPMI）に３７℃で１０分間インキュベートし、続けてアポトーシスを誘導するように低浸透圧溶液(DDW plus RPMI medium)で２分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄してＯＶＡ抗原取込み脾細胞を準備した。得られたＯＶＡ抗原取込み脾細胞を、無細胞タンパク質合成系により合成された２０μｇのグランザイムＡと共にマウスに投与し、脾臓を回収して、脾臓由来単核球を得た。得られた脾臓単核球とＯＶＡ２５７-２６４ペプチドのテトラマーと反応させ、フローサイトメーターでＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答を検出した。陽性対照としては、２０μｇＬＰＳとＯＶＡ抗原取込み脾細胞を投与したものを用い、陰性対照としてはバッファーのみを投与したものを用いた。結果は、図５に記載される通りであった。
　図５に記載されるように、ＯＶＡ抗原取込み脾細胞とグランザイムＡを投与した群では、ＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導が確認された（図５Ａ右）。一方で、ＯＶＡ抗原取込み脾細胞とＬＰＳを投与した群では、ＯＶＡ特異的なＴ細胞誘導は確認されなかった（図５Ａ真ん中）。
　次に、単離した単核球をＯＶＡペプチド（濃度 1 μM）の非存在下または存在下で６時間培養し、培養前後におけるインターフェロンγの産生量の変化（Ｔ細胞応答）を調べた。インターフェロンγは、細胞内染色法により測定した。結果は、図５に示される通りであった。
　図５に示されるように、ＬＰＳ投与群から得られた単核球ではＯＶＡペプチドの刺激による変化は見られなかったが、グランザイムＡ投与群から得られた単核球では、ＯＶＡペプチドによって刺激されてインターフェロンγが顕著に産生されることが確認された（図５Ｂ）。このことは、グランザイムＡは、従来のアジュバントでは困難であった抗原特異的Ｔ細胞の誘導および免疫応答を誘導し得ることを意味する。
実施例４：がんワクチンとしての使用
　上述の実施例により、グランザイムＡが抗原特異的な免疫応答を誘導できる、アジュバントとして利用できることを明らかにした。本実施例では、誘導した免疫応答によるがん細胞の抑制効果を調べた。
　実施例３と同じようにＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞を調製した。２×１０７個のＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞を２０μｇのグランザイムＡと共にマウスに静脈投与し、その７日後に１×１０５個のＭＯ４細胞を皮下投与して、ＭＯ４細胞の体内での増殖効果を確認した。ＭＯ４細胞は、ＯＶＡを強制発現したマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞として知られている。対照としては、ＭＯ４細胞の投与のみを行ったマウスを用いた。結果は、図６に示される通りであった。
　図６に示されるように、ＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞とグランザイムＡとを事前投与をしなかった対照群では、腫瘍サイズが急速に増大したのに対して、事前投与した群では、腫瘍サイズの増加が顕著に抑制された。このことから、グランザイムＡは、強いアジュバント効果を有し、がんワクチンとして有望であることが示された。
実施例５：グランザイムＡにより誘導される免疫応答の解析
　本実施例では、グランザイムＡにより誘導される免疫応答をより詳細に解析した。
　実施例４と同様に、マウスにＯＶＡ懸濁液100 μl (OVA蛋白100 μg)と２０μｇのグランザイムＡとを腹腔内投与した。対照として、グランザイムＡの代わりにOVA懸濁液と同量の水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）をアジュバントとする系、およびＯＶＡ抗原取込み脾臓細胞のみを投与する系を用いた。
　投与１４日後に、マウスから末梢血を回収した。回収された末梢血中のＩｇＧ１溝大量とＩｇＧ２抗体量とをそれぞれ常法を用いて測定した。結果は、図７に示される通りであった。
　図７に示されるように、Ａｌｕｍをアジュバントとして用いた場合には、ＩｇＧ１抗体の産生量が増大するのに対して、グランザイムＡをアジュバントとして用いた場合には、ＩｇＧ２抗体の産生量が増大した。このことからグランザイムＡはＴ細胞だけでなくＢ細胞免疫を賦活化することが明らかとなった。また、グランザイムＡによる免疫賦活化は、Ａｌｕｍなどとは異なる新しい機構により達成されることが明らかとなった。
　グランザイムＡは、生体のタンパク質であるので副作用の低減が期待される。
 

Claims (20)

  1. 　グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、アジュバント組成物。
  2. 　グランザイムＡが、セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
  3. 　セリンプロテアーゼ活性が野生型よりも低下したグランザイムＡが、配列番号３に示されるアミノ酸配列の１８４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がセリンから他のアミノ酸に置換されたグランザイムＡである、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
  4. 　Ｔ細胞性免疫またはＢ細胞性免疫を賦活化することに用いるための、請求項１～３のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
  5. 　樹状細胞を成熟化させることに用いるための、請求項１～４のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
  6. 　アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質と、免疫原性物質とを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
  7. 　アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、免疫原性物質とのコンジュゲートの形態で含む、請求項６に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
  8. 　請求項６または７に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物であって、免疫原性物質がポリペプチドであり、アジュバントとしての有効量のグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を、前記免疫原性物質との融合タンパク質の形態で含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
  9. 　免疫原性物質が、がん抗原である、請求項６～８のいずれか一項に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
  10. 　ワクチンとして用いるための、請求項７～９のいずれか一項に記載の抗原特異的免疫活性化用組成物。
  11. 　グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む、免疫を賦活化することに用いるための組成物。
  12. 　請求項１１で定義された核酸と、ペプチド性の免疫原性物質をコードする核酸との組合せであって、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
  13. 　請求項１２に記載の組合せが、１つのベクターまたは別々に含む２つ以上のベクターに含まれる、前記ペプチド性の免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組成物。
  14. 　請求項１３に記載の組成物で形質転換され、グランザイムＡと前記免疫原性物質とを発現する、動物細胞。
  15. 　ペプチド性の免疫原性物質とグランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質との融合タンパク質であって、免疫原性を有する融合タンパク質。
  16. 　請求項１５に記載の融合タンパク質を有する動物細胞。
  17. 　請求項１４または１６に記載の細胞を有効成分として含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
  18. 　グランザイムＡまたはグランザイムＡと８０％以上のアミノ酸相同性を有するタンパク質を含む動物細胞と免疫原性物質との組合せであって、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための組合せ。
  19. 　請求項１７に記載の組合せを含む、抗原特異的免疫活性化用組成物。
  20. 　免疫原性物質取込み脾臓細胞と組み合わせて投与される、前記免疫原性物質に対する免疫を賦活化することに用いるための請求項１～５のいずれか一項に記載のアジュバント組成物。
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