CN118005805A - 基于铁蛋白合理设计的具有抗原、siRNA共递送的可增强机体免疫的纳米疫苗 - Google Patents
基于铁蛋白合理设计的具有抗原、siRNA共递送的可增强机体免疫的纳米疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基于铁蛋白合理设计的具有抗原、siRNA共递送的可增强机体免疫的纳米疫苗，属于生物医药技术领域。本发明构建了含有细胞膜穿透肽、人轻链铁蛋白、T细胞或B细胞抗原决定簇抗原肽的融合蛋白，并制备了应用所述融合蛋白负载siRNA的纳米疫苗，具有较强的免疫原性和肿瘤免疫治疗作用，在医药领域具有很大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及基于铁蛋白合理设计的具有抗原、siRNA共递送的可增强机体免疫的纳米疫苗，属于生物医药技术领域。
背景技术
癌症免疫治疗中的癌症疫苗可通过激活患者的免疫系统，帮助其更有效地辨识和攻击癌细胞。这些疫苗可包含特定癌细胞抗原，引导免疫系统产生有针对性的反应，为个性化、精准的癌症治疗提供了新的可能性。其中基于肿瘤抗原表位，存在于肿瘤细胞表面或内部的特定蛋白质片段或多肽链，它们可以被免疫系统细胞识别，并引发免疫反应。这些抗原表位能激活和刺激增殖特异性抗原肿瘤T细胞，从而发挥精准控制肿瘤的反应。这些纯化后的抗原蛋白亚单位有助于疫苗的良好安全性和耐受性。然而在临床应用中亚单位疫苗的效力差强人意，造成这种现象的原因包括蛋白不稳定易在体内水解，免疫原性较低需要佐剂和重复接种，抗原转运至局部引流淋巴结的效率低下以及肿瘤微环境糟糕的免疫抑制情况等多种原因。
为了加强疫苗的效力，通常会在疫苗配方中复配佐剂，从广义来说在疫苗中添加其他物质可以显著提高疫苗的效果。佐剂的研究发展至今FDA仅许可批准的是以以下几种成分或单独或复配使用的佐剂，分别为含铝制剂、脂质角鲨烯类物质脂多糖、短的合成单链DNA分子，在特定序列环境中含有未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)。然而令人沮丧的是，大多数复配佐剂的疫苗由于其尺度的问题，很难通过淋巴管引流至淋巴结或脾脏等次级免疫器官，从而主动激活驻留抗原提呈细胞摄取提呈。而且大部分免疫佐剂只能刺激体液免疫极少可以提高细胞免疫，然而研究表明在癌症免疫中，特异性杀伤T细胞以及他的相关辅助T细胞至关重要。那么设计开发具有靶向淋巴结激活DC细胞并增强细胞免疫的具有佐剂效益的疫苗意义重大。
树突状细胞(DC)，在抗肿瘤疫苗中扮演十分重要的角色，在成熟的肿瘤中，癌细胞抑制稳定状态的树突状细胞(也称为肿瘤浸润树突状细胞TIDCs)，使其处在不成熟状态。未成熟的TIDCs表现出抗原提呈能力的功能障碍、内吞活性被抑制、运动异常和其他各种不成熟的特征，并且表面大量表达DC-SIGN(SIGNR)受体。在整个进化过程中，铁蛋白一直是大多数生物体的主要铁储存蛋白，在铁代谢中发挥着至关重要的作用。经典铁蛋白是由24个亚基组成的十二面体，表面带负电。研究发现，铁蛋白轻链对清道夫受体A类成员5具有固有的亲和力，并具有靶向SIGNR+树突状细胞(激活滤泡辅助T细胞)以及淋巴结相关SIGNR1+巨噬细胞(激活B细胞)的能力。
发明内容
本发明提供了一种多亚基聚集的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由细胞膜穿透肽，人轻链铁蛋白，T细胞或B细胞抗原决定簇抗原肽组成；所述人轻链铁蛋白具有NCBI登录号：NP_000137.2所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。
在一种实施方式中，所述细胞膜穿透肽包括但不限于KALA肽；所述KALA肽的氨基酸序列为WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA。
在一种实施方式中，所述抗原肽为鸡卵清蛋白的T细胞抗原决定簇SIINFEKL、小鼠黑色素瘤相关抗原gp100的T细胞抗原决定簇EGPRNQDWL、Human Papillomavirus(HPV)16病毒E7抗原肽YNIVTFCCKCD或融合丙肝病毒Hepatitis C virus E1抗原肽SPTATMILAYVMRVP。
在一种实施方式中，所述人轻链铁蛋白和所述抗原肽之间通过GS连接肽连接。
在一种实施方式中，所述连接肽由甘氨酸和丝氨酸组合而成，采用GSSSS为单位的多单位连接实现。
在一种实施方式中，所述融合蛋白还含有有助于蛋白质纯化的标签，所述标签包括但不限于His标签、MBP标签、GST标签、FLAG标签等亲和纯化标签。
在一种实施方式中，所述标签连接在所述融合蛋白结构域的N端或C端。
本发明还提供了编码所述重组融合蛋白的基因。
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8任一所示。
本发明还提供了制备所述重组融合蛋白的方法，包括如下步骤：构建含有所述融合蛋白编码多核苷酸的重组表达载体，然后将所述表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述融合蛋白。
在一种实施方式中，所述表达载体可采用pET系列质粒，包括但不限于pET28α(+)。
在一种实施方式中，所述宿主细胞可以采用细菌细胞或真菌细胞。
在一种实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或昆虫细胞。
本发明还提供所述重组融合蛋白在负载siRNA中的应用。
在一种实施方式中，所述应用将浓度为1～5mg/mL的重组融合蛋白加入至含浓度≥20mmol/L siRNA的水溶液中，于20～25℃静置0.5h。
在一种实施方式中，所述重组融合蛋白和所述siRNA的N/P摩尔比为5～50。
本发明还提供了所述重组融合蛋白在制备药物中的应用。
本发明还提供了纳米疫苗，所述纳米疫苗应用所述重组融合蛋白负载siRNA。
在一种实施方式中，所述重组融合蛋白和所述siRNA的N/P摩尔比为5～50。
在一种实施方式中，所述siRNA具有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的序列。
在一种实施方式中，所述siRNA具有SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的序列。
有益效果：
(1)本发明利用人轻链铁蛋白结构特点，利用铁蛋白的自组装特性，实现抗原片段的富集，从而避免抗原在体内易水解不稳定的情况。同时利用其固有的亲和SIGNR1阳性APC及SCARA-5受体能力，实现靶向树突状细胞。
(2)本发明在人轻链铁蛋白N端融合能够在生理pH下保持α-螺旋结构，具有细胞膜穿透作用又具备利用静电作用的细胞膜穿透肽KALA肽，利用铁蛋白的自组装特性，从而实现阳离子细胞膜穿透肽富集。在应用RNAi技术时能更好的增强与核酸互相作用的稳定性；负载可调节任意可调节机体抗原提呈细胞免疫表型的siRNA，从而加强疫苗整体免疫原性。
(3)本发明通过细胞实验证明了本发明制备的纳米疫苗具有促进体外非成熟抗原提呈细胞的成熟的作用，所表达的纳米佐剂相对于商用铝佐剂具有更好的激活T细胞免疫的效果，及更优的抗肿瘤效果。
附图说明
图1是本发明实施例1-4制备的重组融合蛋白纯化SDS-PAGE图。
图2是本发明实施例1-4制备的重组融合蛋白在BMDC中相对细胞活性图。
图3是本发明实施例1-4制备的重组蛋白负载siRNA后粒径分布。
图4是本发明实施例1-4制备的重组融合蛋白负载siRNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图。
图5是本发明实施例1-4制备的重组融合蛋白使用实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后基因表达相对定量图。
图6是本发明实施例1-4制备的重组融合蛋白使用实施例6的方法制备的纳米疫苗对M2型巨噬细胞转染STAT6 siRNA后基因表达相对定量图。
图7是本发明实施例1制备的重组融合蛋白使用实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后IL-6和TNF-α细胞因子表达含量图。
图8是本发明实施例2制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后IL-6和TNF-α细胞因子表达含量图。
图9是本发明实施例1制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后树突状细胞表面共刺激因子CD80、CD86的表达情况。
图10是本发明实施例2制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后树突状细胞表面共刺激因子CD80、CD86的表达情况。
图11是本发明实施例1制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后与CFSE预染色的CD3+T细胞共孵育后，T细胞增殖情况以及IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子表达含量图。
图12是本发明实施例2制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗对BMDC转染SOCS1 siRNA后与CFSE预染色的CD3+T细胞共孵育后，T细胞增殖情况以及IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子表达含量图。
图13是本发明实施例1制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗在肿瘤模型B16-OVA中治疗作用的肿瘤体积测量曲线。
图14是本发明实施例2制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗在肿瘤模型B16-F10中治疗作用的肿瘤体积测量曲线。
图15是本发明实施例3制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗在体内免疫C57BL/6小鼠血清中IL-2、IFN-γ和IgG的表达水平。
图16是本发明实施例4制备的重组融合蛋白用于实施例6的方法制备的纳米疫苗在体内免疫BALB/C小鼠血清中IgG的表达水平。
具体实施方式
N/P摩尔比计算公式为：
1mol P＝1/42mol siRNA，1mol N＝1/7mol KALA-hFLn-SIINFEKL；
1mol N＝1/7mol KALA-hFLn-gp100；
1mol N＝1/7mol KALA-hFLn-HPVE7；
1mol N＝1/7mol KALA-hFLn-HCVE1。
表1融合蛋白氨基酸序列
表2融合蛋白的编码基因
表3siRNA序列
实施例1KALA-hFLn-SIINFEKL融合蛋白的制备
(1)构建pET28α(+)-KALA-hFLn-SIINFEKL表达载体：截取野生型人源轻链铁蛋白5-154aa，在其N端添加具有跨膜和负载siRNA能力的KALA肽(即WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA)，在其C端通过GS连接肽融合OVA(鸡卵清蛋白)的T细胞抗原决定簇SIINFEKL。以质粒pET28α(+)为基础，设计含有SEQ ID NO.5所示的KALA-hFLn-SIINFEKL基因序列的重组质粒。由安达升生物科技公司进行基因全合成，获得质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-SIINFEKL。
(2)构建表达所述重组蛋白的基因工程菌株：将步骤(1)构建的质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-SIINFEKL转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取单菌落，利用菌落PCR技术，以T7启动子和终止子作为上下游引物进行测序鉴定构建基因工程菌株成功与否。测序正确的单菌落接种于含有Kana+抗生素的LB液体培养基中，过夜培养，随后加入50％甘油-80℃保存，即为表达重组蛋白KALA-hFLn-SIINFEKL的基因工程菌。
(3)重组融合蛋白KALA-hFLn-SIINFEKL的诱导表达及纯化：将步骤(2)构建的基因工程菌经在含有Kana+抗性的平板上划线培养，挑取单克隆，接入10mL含有50μg/mL的Kana+的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜。按1％接种量将菌液转接于300mL LB液体培养基，37℃、220rpm震荡培养至菌液OD600为0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG至终浓度0.3mmol/L，37℃继续诱导培养6h。7500rpm、4℃离心10min收集菌体。将收集的菌体用平衡缓冲液重悬，5℃下使用900bar高压均质机破碎。11000rpm，4℃离心45min去除沉淀。使用广谱核酸酶Binuclease以4U/mL的用量，4℃酶解过夜去除核酸，4℃离心45min去除沉淀，取上清作为蛋白初始样品，进行镍离子螯合层析梯度洗脱纯化，得到纯化的重组蛋白悬液KALA-hFLn-SIINFEKL。结果见图1a，通过纯化，获得纯度较高的KALA-hFLn-SIINFEKL蛋白，单体亚基分子量为27.0kDa。
实施例2KALA-hFLn-gp100融合蛋白的制备
(1)构建pET28α(+)-KALA-hFLn-gp100表达载体：截取野生型人源轻链铁蛋白5-154aa，在其N端添加具有跨膜和负载siRNA能力的KALA肽(即WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA)，在其C端通过GS连接肽融合小鼠黑色素瘤相关抗原gp100的T细胞抗原决定簇EGPRNQDWL。以质粒pET28α(+)为基础，设计含有SEQ ID NO.6所示KALA-hFLn-gp10基因序列的重组质粒。由安达升生物科技公司进行基因全合成，获得质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-gp100。
(2)构建表达所述重组蛋白的基因工程菌株：将步骤(1)构建的质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-gp100转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取单菌落，利用菌落PCR技术，以T7启动子和终止子作为上下游引物进行测序鉴定构建基因工程菌株成功与否。测序正确的单菌落接种于含有Kana+抗生素的LB液体培养基中，过夜培养，随后加入50％甘油-80℃保存，即为表达重组蛋白KALA-hFLn-gp100的基因工程菌。
(3)重组融合蛋白KALA-hFLn-gp100的诱导表达及纯化：将步骤(2)构建的基因工程菌经在含有Kana+抗性的平板上划线培养，挑取单克隆，接入10mL含有50μg/mL的Kana+的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜。按1％接种量将菌液转接于300mL LB液体培养基，37℃、220rpm震荡培养至菌液OD600为0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续诱导培养6h。7500rpm 4℃离心10min收集菌体。将收集的菌体用平衡缓冲液重悬，5℃下使用900bar高压均质机破碎。11000rpm，4℃离心45min去除沉淀。使用广谱核酸酶Binuclease以4U/mL的用量，4℃酶解过夜去除核酸，4℃离心45min去除沉淀，取上清作为蛋白初始样品，进行镍离子螯合层析梯度洗脱纯化，得到重组蛋白悬液KALA-hFLn-gp100。结果见图1b，通过纯化，获得纯度较高的KALA-hFLn-gp100蛋白，单体亚基分子量为27.2kDa。
实施例3KALA-hFLn-HPVE7融合蛋白的制备
(1)构建pET28α(+)-KALA-hFLn-HPVE7表达载体：截取野生型人源轻链铁蛋白5-154aa，在其N端添加具有跨膜和负载siRNA能力的KALA肽(即WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA)，在其C端通过GS连接肽融合Human Papillomavirus(HPV)16病毒E7抗原肽52-62aa，序列为YNIVTFCCKCD。以质粒pET28α(+)为基础，设计含有SEQ IDNO.7所示的KALA-hFLn-HPVE7基因序列的重组质粒。由安达升生物科技公司进行基因全合成，获得质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-HPVE7。
(2)构建表达所述重组蛋白的基因工程菌株：将步骤(1)构建的质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-HPVE7转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取单菌落，利用菌落PCR技术，以T7启动子和终止子作为上下游引物进行测序鉴定构建基因工程菌株成功与否。测序正确的单菌落接种于含有Kana+抗生素的LB液体培养基中，过夜培养，随后加入50％甘油-80℃保存，即为表达重组蛋白KALA-hFLn-HPVE7的基因工程菌。
(3)重组融合蛋白KALA-hFLn-HPVE7的诱导表达及纯化：将步骤(2)构建的基因工程菌经在含有Kana+抗性的平板上划线培养，挑取单克隆，接入10mL含有50μg/mL的Kana+的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜。按1％接种量将菌液转接于300mL LB液体培养基，37℃、220rpm震荡培养至菌液OD600为0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续诱导培养6h。7500rpm 4℃离心10min收集菌体。将收集的菌体用平衡缓冲液重悬，5℃下使用900bar高压均质机破碎。11000rpm，4℃离心45min去除沉淀。使用广谱核酸酶Binuclease以4U/mL的用量，4℃酶解过夜去除核酸，4℃离心45min去除沉淀，取上清作为蛋白初始样品，进行镍离子螯合层析梯度洗脱纯化，得到重组蛋白悬液KALA-hFLn-HPVE7。结果见图1c，通过纯化，获得纯度较高的KALA-hFLn-HPVE7蛋白，单体亚基分子量为27.1kDa。
实施例4KALA-hFLn-HCVE1融合蛋白的制备
(1)构建pET28α(+)-KALA-hFLn-HCVE1表达载体：截取野生型人源轻链铁蛋白5-154aa，在其N端添加具有跨膜和负载siRNA能力的KALA肽(即WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA)，在C端通过GS连接肽融合丙肝病毒Hepatitis C virusE1抗原肽327-341aa，序列为SPTATMILAYVMRVP。以质粒pET28α(+)为基础，设计含有SEQ IDNO.8所示的KALA-hFLn-HCVE1基因序列的重组质粒，交由安达升生物科技公司进行基因全合成，获得质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-HCVE1。
(2)构建表达所述重组蛋白的基因工程菌株：将步骤(1)构建的质粒pET28α(+)-KALA-hFLn-HCVE1转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取单菌落，利用菌落PCR技术，以T7启动子和终止子作为上下游引物进行测序鉴定构建基因工程菌株成功与否。测序正确的单菌落接种于含有Kana+抗生素的LB液体培养基中，过夜培养，随后加入50％甘油-80℃保存，即为重组蛋白基因工程菌。
(3)重组融合蛋白KALA-hFLn-HCVE1的诱导表达及纯化：将步骤(2)构建的重组融合蛋白基因工程菌经在含有Kana+抗性的平板上划线培养，挑取单克隆，接入10mL含有50μg/mL的Kana+的LB液体培养基中，37℃ 220rpm培养过夜。按1％接种量将菌液转接于300mLLB液体培养基，37、℃ 220rpm震荡培养至菌液OD600为0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/L，37、℃继续诱导培养6h。7500rpm 4℃离心10min收集菌体。将收集的菌体用平衡缓冲液重悬，5℃下使用900bar高压均质机破碎。11000rpm，4℃离心45min去除沉淀。使用广谱核酸酶Binuclease以4U/mL的用量，4℃酶解过夜去除核酸，4℃离心45min去除沉淀，取上清作为蛋白初始样品，进行镍离子螯合层析梯度洗脱纯化，得到重组蛋白悬液KALA-hFLn-HCVE1。结果见图1d，通过纯化，获得纯度较高的KALA-hFLn-HCVE1蛋白，单体亚基分子量为27.4kDa。
实施例5重组融合蛋白生物相容性
重组融合蛋白的细胞毒性由MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价，包括如下步骤：将小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC细胞)接种到96孔板中(1×104细胞/孔)含有10％ FBS和1％双抗和终浓度为5μmol/Lβ-巯基乙醇的RPMI1640细胞培养基中，将实施例1～4任一制备的重组融合蛋白以不同浓度(5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、300μg/mL)与前述培养基混合均匀并加入孔板内，37℃，5％ CO2孵育48小时。孵育结束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL(PBS缓冲液为溶剂)，继续培养4小时。离心后，弃去孔内液体，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10分钟。
用酶标仪在490纳米波长处测量各孔光密度值。利用如下公式计算相对细胞活性(％)：
细胞相对活性＝OD490’/avg(OD490Ctrl)；
其中OD490’为实验组吸光度；avg(OD490Ctrl)为对照组吸光度平均值。
结果如图2，实施例1-4制备的融合蛋白在300μg/mL的浓度下小鼠骨髓源树突状细胞有80％以上的存活率，说明融合蛋白的生物相容性良好。
实施例6重组融合蛋白负载可调节抗原提呈细胞的siRNA构建纳米疫苗
将实施例1～4制备的重组融合蛋白与SOCS1 siRNA(序列如SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示)或STAT6 siRNA(序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示)制备纳米疫苗，步骤如下：
向浓度为20μmol/L的siRNA DEPC水溶液中以不同N/P摩尔比分别滴加实施例1～4任一制备的浓度范围为1～5mg/mL重组蛋白溶液，室温静置0.5小时，得到核酸载体复合物。
使用马尔文粒度仪对负载siRNA后的纳米疫苗进行粒径测定。图3显示所有纳米疫苗粒径在25-35nm间，是最适宜通过淋巴管靶向淋巴结的尺寸范围。
在GEL-RED预染的2％琼脂糖凝胶上进行电泳，以游离siRNA作为对照，检验重组融合蛋白对siRNA的负载能力。图4a为实施例1制备的KALA-hFLn-SIINFEKL以不同N/P摩尔比孵育后的核酸蛋白复合物琼脂糖凝胶电泳结果，可见在N/P为50时对比游离siRNA，游离siRNA条带变模糊，已有部分核酸负载在蛋白上，当N/P为100时有核酸阻滞在加样孔内。
图4b为实施例2制备的KALA-hFLn-gp100以不同N/P摩尔比孵育后的核酸蛋白复合物琼脂糖凝胶电泳结果，随着N/P摩尔比的增加，siRNA条带出现阻滞。
图4c和图4d分别为实施例3制备的KALA-hFLn-HPVE7和实施例4制备的KALA-hFLn-HCVE1与核酸孵育后的琼脂糖凝胶电泳结果，在N/P摩尔比为100时可实现核酸全部负载。
实施例7纳米疫苗对非成熟小鼠骨髓源树突状细胞转染能力
获取非成熟小鼠骨髓源树突细胞的具体步骤如下：在无菌状态下，取小鼠股骨和胫骨，出去肌肉和组织，在培养皿中注入70％乙醇，将骨头浸泡10秒完成外部消毒，在超净台中剪去骨头两端，注射器中吸去灭菌PBS，将注射器针头插入骨头，将骨髓冲出，冲洗若干次直至骨头变白。吹吸数次分散团块后，用红细胞裂解液室温裂解红细胞5分钟，离心后，将沉淀细胞重选于含有20ng/mL GM-CSF的10％ FBS和1％双抗和终浓度为5μmol/Lβ-巯基乙醇的RPMI1640细胞培养基中，隔天半换液，第八天获得非成熟骨髓源DC。
将BMDC以2.5×105个/孔的密度接种至12孔板，SOCS1 siRNA(序列如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10)的终浓度为50nmol/L，以N/P摩尔比50的比例分别滴加实施例1～4任一制备的浓度范围为1～5mg/mL重组蛋白溶液，室温静置0.5小时，以无抗生素无血清的RPMI1640添加到终体积为每孔500μL。孵育4小时后，加入血清再培养26小时。以添加等剂量SOCS1siRNA作为游离核酸组、以及同摩尔浓度的融合蛋白作为对照组，添加含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基到终体积为每孔500μL。孵育30小时后。培养结束后温和离心收获细胞。细胞用Trizol法提取总RNA，并用RT-PCR法定量SOCS1 mRNA的相对表达量。
结果如图5所示，实施例1～4制备的融合蛋白负载SOCS1 siRNA的纳米疫苗对未成熟DC转染30h后，SOCS1 mRNA转录水平下降，其基因沉默效率为43～53％。
实施例8纳米疫苗对M2型小鼠巨噬细胞转染能力
含有10ng/mL IL-4的10％ FBS和1％双抗的高糖DMEM细胞培养基诱导M0型RAW264.7细胞12h获得了M2型巨噬细胞。将M2型巨噬细胞以2.5×105个/孔的密度接种至12孔板，STAT6 siRNA(序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示)的终浓度为50nmol/L，以N/P摩尔比50的比例分别滴加实施例1～4任一制备的浓度范围为1～5mg/mL重组蛋白溶液，室温静置0.5小时，以无抗生素无血清的RPMI1640添加到终体积为每孔500μL。孵育4小时后，加入血清再培养26小时。以添加等剂量STAT6 siRNA作为游离核酸组、以及同摩尔浓度的融合蛋白作为对照组，添加含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基到终体积为每孔500μL。孵育30小时后。培养结束后温和离心收获细胞。细胞用Trizol法提取总RNA，并用RT-PCR法定量STAT6 mRNA的相对表达量。
结果如图6所示，实施例1～4制备的融合蛋白负载STAT6 siRNA的纳米疫苗对M2型巨噬细胞转染30h后，STAT6 mRNA转录水平下降，其基因沉默效率为37～53％。
实施例9纳米疫苗对非成熟小鼠骨髓源树突状细胞促成熟能力
按照实施例7的方法制备非成熟小鼠骨髓源树突细胞。
将BMDC以2.5×105个/孔的密度接种至12孔板，SOCS1 siRNA(序列如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示)的终浓度为50nmol/L，以N/P摩尔比50的比例分别滴加实施例1、实施例2制备的浓度范围为1～5mg/mL重组蛋白溶液，室温静置0.5小时，以无抗生素无血清的RPMI1640添加到终体积为每孔500μL。孵育4小时后，加入血清再培养26小时。
其余对照组的分组如下：
游离核酸组：添加等剂量SOCS1 siRNA；
融合蛋白组：添加同摩尔浓度实施例1、实施例2制备的融合蛋白；
游离抗原肽组：添加同摩尔浓度的游离抗原肽(SIINFEKL、gp100、HPVE7或HCVE1)
游离抗原肽+siRNA组：添加同摩尔浓度游离抗原肽物理混合等剂量SOCS1 siRNA。
在上述分组中分别添加含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基到终体积为每孔500μL。孵育30小时后。培养结束后温和离心收获培养基和细胞。用ELISA法检测培养基中TNF-α和IL-6的表达量。
结果如图7-8所示，纳米疫苗组相对于游离抗原肽或者抗原肽物理混合siRNA能够分泌更多炎性因子IL-6和TNF-α能力，显示出较强的促进DC细胞成熟的能力。
将未成熟的BMDC(2.5×105/mL)铺在12孔板培养，SOCS1 siRNA(序列如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示)的终浓度为50nmol/L，以N/P摩尔比10的比例分别滴加实施例1、实施例2制备的浓度范围为1～5mg/mL重组蛋白溶液，室温静置0.5小时，以无抗生素无血清的RPMI1640添加到终体积为每孔500μL。孵育4小时后，加入血清再培养26小时。以添加同摩尔浓度实施例1和2制备的融合蛋白、同摩尔浓度的游离抗原肽以及同摩尔浓度游离抗原肽物理混合等剂量SOCS1 siRNA作为对照组，添加含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基到终体积为每孔500μL。孵育30小时后。培养结束后温和离心收获细胞。对于BMDC的激活分析，使用抗CD11c(0.25μg/100μL)、抗CD80(1.0μg/100μL)、抗CD86(1.0μg/100μL)抗体在冰上染色30min。然后用FACS缓冲液洗涤BMDC，并使用流式细胞术进行分析。
结果如图9和图10，纳米疫苗对比其他组别可刺激DC表达更多共刺激因子，说明其成熟程度高。
实施例10纳米疫苗激活T细胞
将未成熟的BMDC(2.5×105/mL)铺在12孔板培养，SOCS1 siRNA(序列如SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示)的终浓度为50nmol/L，以N/P摩尔比50的比例分别滴加实施例1、实施例2制备的浓度范围为1～5mg/mL重组蛋白溶液，室温静置0.5小时，以无抗生素无血清的RPMI1640添加到终体积为每孔500μL。孵育4小时后，加入血清再培养20小时。以添加同摩尔浓度实施例1、实施例2制备的融合蛋白、同摩尔浓度的游离抗原肽以及同摩尔浓度游离抗原肽物理混合等剂量SOCS1 siRNA作为对照组，添加含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基到终体积为每孔500μL。孵育24小时后。培养结束后温和离心收获细胞。无菌操作获取C57BL/6小鼠(8周龄)的脾脏。加入2mL无菌1×PBS，用5mL的注射器研磨组织，过70μm细胞筛，获得单细胞悬液后，500×g离心5min后，用红细胞裂解液室温温和裂解5min。离心后，使用Beaver Biosciences Inc.试剂盒按照供应商的说明进行CD3+T细胞磁珠分选。分选后的CD3+T细胞重选于CFDA,SE染色液，37℃孵育15min后加入含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基终止标记染色反应，离心弃去上清后，重悬于含1％双抗和10％胎牛血清的RPMI1640培养基。经过不同组别处理后的DC与经过CFSE染色的T细胞以1：5的数量比共孵育24小时，培养技术后温和离心收获细胞和培养基。对于T细胞的增殖水平，使用流式细胞术在FITC通道下查看，并用ELISA法检测培养基中TNF-α和IL-6和IFN-γ的表达量。
结果如图11显示以实施例1制备的OVA蛋白T细胞抗原决定簇制备的负载SOCS1siRNA的纳米疫苗组中CFSE强度高的细胞数量显着减少76.85％，表明T细胞分裂增殖频率更高。相对于游离抗原肽或者抗原肽物理混合siRNA能够分泌更多炎性因子IL-6、TNF-α、IFN-γ能力，显示出较强的激活T细胞水平。图12显示以实施例2制备的黑色素瘤相关性抗原T细胞抗原决定簇制备的负载SOCS1 siRNA的纳米疫苗组中CFSE强度值降低77.83％，并相对于其他组别分泌更高水平炎性因子。
实施例11纳米疫苗抗肿瘤作用
(一)为了评估以实施例1的融合蛋白制备的纳米疫苗的体内治疗效果，第0天，C57BL/6小鼠在小鼠背部右后侧皮下接种2×105B16-OVA黑色素瘤细胞(悬浮于100μL1×PBS中)让肿瘤生长10天，并将这些荷瘤小鼠随机分为6组(每组n＝6)。分别为生理盐水组(saline)，游离抗原肽组(SIINFEKL，肽氨基酸序列为SIINFEKL，5nmol/只)，游离抗原肽物理混合SOCS1 siRNA组(SIINFEKL+siRNA；siRNA序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10，抗原肽为5nmol/只混合SOCS1 siRNA 0.1nmol/只)，游离抗原肽联合商用铝佐剂组(SIINFEKL+Alum，抗原肽为5nmol/只，铝佐剂与抗原肽质量比为1：3)，纳米疫苗组为实施例6制备的由融合蛋白KALA-hFLn-SIINFEKL负载SOCS1 siRNA的纳米疫苗(KFS@siRNA，siRNA序列如SEQID NO.9、SEQ ID NO.10所示，实施例1制备的融合蛋白剂量5nmol/只，SOCS1 siRNA剂量0.1nmol/只)。每隔一天使用卡尺监测肿瘤。使用公式V＝0.5×L×S2计算肿瘤体积，其中L和S分别是较大直径和较小直径。
结果如图13，通过测量肿瘤生长来评估不同方案的免疫治疗效应。未经治疗的盐水组在接种肿瘤中的所有小鼠在22天内死亡。游离抗原肽处理的组，其与等摩尔SOCS1siRNA的物理混合物，以及抗原肽与商用铝佐剂的组合没有显示出明显的肿瘤生长抑制抑制或生存率益处。而实施例1制备的具有OVA蛋白抗原决定簇的融合蛋白负载SOCS1 siRNA具有较高的抗肿瘤水平。
(二)为了评估以实施例2的融合蛋白制备的纳米佐剂的体内治疗效果，第0天，C57BL/6小鼠在小鼠背部右后侧皮下接种2×105B16F10黑色素瘤细胞(悬浮于100μL1×PBS中)让肿瘤生长7天，并将这些荷瘤小鼠随机分为6组(每组n＝6)。分别为生理盐水组，游离抗原肽组(抗原肽氨基酸序列为EGPRNQDWL，5nmol/只)，游离抗原肽物理混合STAT6 siRNA组(gp100+siRNA，siRNA序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，抗原肽剂量为5nmol/只，混合剂量STAT6 siRNA 0.1nmol/只)，游离抗原肽联合商用铝佐剂组(gp100+Alum，抗原肽剂量为5nmol/只，铝佐剂与抗原肽质量比为1：3)，纳米疫苗组为实施例6制备的由融合蛋白KALA-hFLn-gp100负载STAT6 siRNA的纳米疫苗(其中，siRNA序列如SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12，实施例2制备的融合蛋白剂量为5nmol/只，STAT6siRNA剂量为0.1nmol/只)。每隔一天使用卡尺监测肿瘤。使用公式V＝0.5×L×S2计算肿瘤体积，其中L和S分别是较大直径和较小直径。结果见图14，通过测量肿瘤生长来评估不同方案的免疫治疗效应。未经治疗的盐水组在接种肿瘤中的所有小鼠在18天内死亡。游离抗原肽处理的组，其与等摩尔STAT6siRNA的物理混合物，以及抗原肽与商用铝佐剂的组合没有显示出明显的肿瘤生长抑制或生存率益处。而实施例2制备的具有黑色素瘤相关性抗原gp100蛋白抗原决定簇的融合蛋白负载STAT6 siRNA具有较高的抗肿瘤水平。
实施例12纳米疫苗KALA-hFLn-HPVE7在体内免疫水平测定
将6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为4组，分别为生理盐水组、HPV16 E7游离抗原肽组(5nmol/只)，KALA-hFLn-HPVE7(5nmol/只)，以及以实施例6制备的纳米疫苗KALA-hFLn-HPVE7@siRNA(siRNA序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，实施例3制备的融合蛋白剂量为5nmol/只，SOCS1 siRNA剂量为0.1nmol/只)皮下注射免疫4组小鼠。每两周加强免疫一次，共两次，两次剂量相同。注射疫苗后小鼠在第二次加强注射后两周从眼眶内眦取血，室温静置2小时后，3000rpm离心15min，获取血清，使用ELISA评估IL-2和IFN-γ以及抗HPV16 E7蛋白IgG水平(稀释倍数为1：50)。结果见图15，表明纳米疫苗KALA-hFLn-HPVE7@siRNA能在体内激起有效的细胞和体液免疫。
实施例13纳米疫苗KALA-hFLn-HCVE1在体内免疫水平测定
将6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，分别为生理盐水组、HCVE1游离抗原肽组(5nmol/只)，KALA-hFLn-HCVE1(5nmol/只)，以及以实施例6制备的纳米疫苗KALA-hFLn-HCVE1@siRNA(siRNA序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10，实施例4制备的融合蛋白剂量为5nmol/只，SOCS1 siRNA剂量0.1nmol/只)肌肉注射免疫。每10天免疫一次，共免疫三次。注射疫苗后ELISA检测免疫后小鼠血清中特异性IgG表达水平(稀释倍数为1：100)。结果见图16，纳米疫苗KALA-hFLn-HCVE1@siRNA能在体内激起有效体液免疫。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种多亚基聚集的重组融合蛋白，其特征在于，含有细胞膜穿透肽，人轻链铁蛋白，T细胞或B细胞抗原决定簇抗原肽；所述细胞膜穿透肽包括但不限于KALA肽；所述人轻链铁蛋白具有NCBI登录号：NP_000137.2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述T细胞或B细胞抗原决定簇抗原肽包括但不限于：SIINFEKL、EGPRNQDWL、YNIVTFCCKCD或SPTATMILAYVMRVP。
3.根据权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述人轻链铁蛋白和所述抗原肽之间通过GS连接肽连接。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示。
5.编码权利要求1～4任一所述重组融合蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8任一所示。
7.权利要求1～4任一所述重组融合蛋白在负载siRNA中的应用。
8.权利要求1～4任一所述重组融合蛋白在制备药物中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，将浓度为1～5mg/mL的重组融合蛋白加入至含浓度≥20mmol/L siRNA的水溶液中，于20～25℃静置一段时间。
10.一种纳米疫苗，其特征在于，应用权利要求1～4任一所述的重组融合蛋白负载siRNA；所述siRNA为(a)或(b)：
(a)由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10编码的序列；
(b)由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12编码的序列。
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