NO178663B

NO178663B - Framgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid

Info

Publication number: NO178663B
Application number: NO940078A
Authority: NO
Inventors: Takanori Nakamura; Sadaaki Iwanaga; Motonori Ohno; Kyosuke Miyazaki
Original assignee: Seikagaku Kogyo Kk Seikagaku C
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1994-01-10
Publication date: 1996-01-29
Also published as: WO1989001492A1; EP0343248A1; CN1031379A; EP0343248B1; NO940078D0; NO178663C; DE3880481D1; JPH02500194A; DK193589D0; AU642089B2; CA1337781C; AU620345B2; ATE88480T1; DE3880481T2; DK193589A; NO940078L; NO891572D0; KR970001811B1; AU2311388A; US5416194A

Description

Oppfinnelsen angår en framgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid som angitt i den innledende del av patentkrav 1.

Bakgrunn.

Endotoksin er også kalt et intracellulært toksin, hvis betegnelse i videste forstand viser til giftige forbindelser som eksisterer i cellene i Gram-negative bakterier. Bestanddelene i endotoksin er lipopolysakkarider (nedenfor kalt "LPS").

I kjent teknikk er pyrolyse, ultrafiltrering og affinitetskromatografi med polymixin B kjente framgangsmåter for fjerning av endotoksin.

Imidlertid er pyrolyse en framgangsmåte som termisk dekomponerer LPS ved en tørr varmebehandling ved 250°C eller høyere for å fjerne LPS fra glasskår, etc. ved dekomponering. Denne pyrolyseframgangsmåten kan ikke brukes for å separere LPS fra en substans som er ustabil overfor varme. Ultrafiltreirngsmetoden er effektiv for å separere LPS fra forbindelser med lav molvekt, men er i prinsippet ikke anvendbar for separering av endotoksin fra forbindelser med høy molvekt. Affinitets-kromatografi-metoden med polymixin B kan forventes å kunne anvendes i praksis ved å utnytte affiniteten til polymixin B overfor LPS, men bruken er begrenset på grunn av giftigheten av polymixin B, og således har denne framgangsmåten fram til i dag ikke fått noen praktisk anvendelse.

Således er der ennå ikke funnet noen praktisk effektiv framgangsmåte for å separere LPS effektivt og stabilt fra blandinger med fysiologisk aktive forbindelser med høy molvekt.

Formål

Hovedformålet med oppfinnelsen er å anvise en framgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid som oppviser affinitet overfor LPS.

Oppfinnelsen.

Oppfinnelsen er angitt i den karakteriserende del av patentkrav 1. Ytterligere fordelaktige trekk framgår av patentkrav 2.

Oppfinnelsen angår en framgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid med molvekt på omlag 2000 og med affinitet overfor lipopolysakkarider, særlig et polypeptid angitt ved formelen:

hvor Lys angir lysin, Trp tryptophan, Cys cystein, Phe fenylalanin, Arg arginin, Val valin, Tyr tyrosin, Gly glycin, Ile isoleucin og X en hydroksylgruppe eller en aminogruppe.

Følgelig har de lykkes i å ekstrahere og isolere et nytt polypeptid fra hesteskokrabbe-hemocytt, og fant videre at dette polypeptidet oppviser sterk affinitet overfor LPS og har biologiske effekter slik som antibakteriell aktivitet og inhiberende virkning på blastgenesis, etc. I den foreliggende sammenheng kalles denne forbindelsen LPS-bindende polypeptid (fra tid til annen forkortet til LBP).

Forbindelsen framskaffet ifølge oppfinnelsen er et polypeptid bestående av 17 aminosyrer, hvori karboksylgruppen i arginin, som er aminosyren i C-enden, amideres under ekstraksjons- eller isolasjonsbetingelsene. Selv når dette polypeptidet konverteres til en syre ved hydrolyse, forblir affiniteten overfor LPS høy.

Polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen ekstraheres og isoleres fra hesteskokrabbe-hemocytt av Tachypleus tridentatus eller Tachypleus gi gas, som

beskrevet nedenfor.

Nærmere bestemt ekstraheres residuet etter hypotonisk ekstraksjon av hemocytten fra Tar. hyplp. ns triHp. ntahis under sure betingelser, f.eks. i en fortynnet mineralsyre slik som saltsyre, salpetersyre, svovelsyre, etc; eller i en organisk syre, f.eks. i lavere alifatiske syrer slik som edikksyre, etc. Ekstraktet oppnådd underkastes så rensing, slik som gelfiltrering, kromatografi, etc, hvormed polypeptidet kan isoleres.

Polypeptidet således oppnådd kan renses ved konvensjonelle midler slik som ekstraksjon, rekrystallisering, forskjellige typer kromatografi (gelfiltrering, ionebytting, deling, adsorbsjon, motfase), elektroforese, motstrøms deling, etc, men framgangsmåten med motfase-kromatografi med høy ytelse er den mest effektive.

Kort beskrivelse av figurene.

Fig. 1 er et diagram som viser resultatene fra en SDS polyakrylamidgel-elektroforese av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen. Fig. 2 og fig. 3 ér diagram som viser testresultatene angående den inhiberende effekt av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen mot aktivering av C faktor av

LPS.

Fig. 4 er et spektrum for absorbsjon av UV-stråler for polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen. Fig. 5 viser effekten av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen mot blastogenese av lymfocytt fra mus som følge av LPS-stimulering. Fig. 6 er et mikrofotografi som viser blastogenese av lymfocytt når 50 /ug/ml LPS tilsettes. Fig. 7, fig. 8 og fig. 9 er mikrofotografier til hvilke, etter 0.2, 2 og 20 fig/ ml polypeptid framskaffet ifølge oppfinnelsen hver er tilsatt hhv. 50 ug/ ml LPS. Fig. 10 er et diagram som viser effekten av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen mot blastogenese av menneskelig perifer lymfocytt som følge av LPS stimulering.

Den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i nærmere detalj i de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1.

A. Ekstraksjon og rensing av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen.

Til omtrent 50 gram av hemocytten fra tachypleus tridentatus, ble det tilsatt 150 ml 20 mM tris-HCl/50mM NaCl pH 8.0 buffer, og blandingen ble homogenisert med høyhastighets-homogenisator, Hiscotron (handelsnavn; produsert av Nippon Seimitsu Kogyo K.K.) i 3 minutter, og så sentrifugert (8000 opm, 30 min. 4°C). For det således utskilte bunnfallet ble operasjonen ovenfor gjentatt 2 ganger, og løselige bestanddeler i hemocytten ble tilstrekkelig ekstrahert for å oppnå residuet.

Til residuet ble det tilsatt 150 ml 20 mM HC1, blandingen ble homogenisert med en høyhastighets-homogenisator i 3 min., og etter sentrifugering ble det oppnådd en supernatant av surt ekstrakt. Ved å gjenta denne operasjonen totalt 3 ganger ble det oppnådd omtrent 400 ml ekstrakt. Supernatantfraksjonen ble tørket og konsenstrert ved lyofilisering.

Det sure ekstraktet, konsentrert og tørket, ble gjenoppløst i 20 mM HC1 (aq) og så tilført til en Sephadex G-50 kolonne (3.0 x 90.0 cm) (på forhånd behandlet med 20 mM HC1 (aq)) for å utføre gelfiltrering. De utvaskede fraksjonene som inhiberer aktivering av C faktor med LPS (en utvunnet fra E. knli 0111 B4 arten ble brukt)

(hesteskokrabbe blodkoagulerende serin protease utgangsmateriale; LPS-sensitiv faktor navngitt av oppfinnerene for den foreliggende oppfinnelsen, Nakamura et al., Eur J. Biochem, 154, 511 (1986)) ble samlet opp, og pH i de oppsamlede fraksjonene ble justert til 6.0 med NaOH (aq).

Prøven ble injisert i en CM-Sepharose CL-6B kolonne på forhånd behandlet med 20 mM acetatbuffer (pH 6.0), og utvasking ble utført med en gradient av 20 mM acetatbuffer (pH 6.0) inneholdende fra 0 til 0.3 M NaCl. Fraksjonene som inhiberer aktivering av C-faktor ble samlet opp for å gi de ferdig rensete preparatene av den LPS-bindende substansen (polypeptid framskaffet ifølge oppfinnelsen). Utbyttet var omtrent 30 mg fra omtrent 50 g hemocytt.

B. Renhetsanafyse

(1) SDS polyakrylamidgel-elektroforese.

LPS-bindende polypeptid ble underkastet 12 % polyakrylamidgel-elektroforese inneholdende 8M urea med eller uten et reduksjonsmiddel (fi-merkaptoetanol) og farget med Coomassie Brilliant blått R-250, hvormed et enkelt bånd med en molvekt på omlag 2000 fremkom i begge tilfeller. Resultatene er vist i fig. 1. I fig. 1 er båndet på den venstre side polypeptidet uten reduksjonsmidlet; båndet i midten viser polypeptidet med reduksjonsmidlet; båndet på høyre side indikerer myoglobinposisj onene ved en myoglobin-standard proteinmarkør [SDS PAGE Marker III, Fluka AG (Sveits)] (16.9 kDa), myoglobin I + II (14.4 kDa), myoglobin I (8.2 kDa), myoglobin II (6.2 kDa) og myoglobin III (2.5 kDa).

(2) Motfase væskekromatografi med høy yteevne.

Når polypeptidet framskaffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen ble analysert med motfase-væskekromatografi med høy yteevne (kolonnen var Cosmosil 5ClgP, peptid utvasket med et gradientsystem av 0.1 % trifluoredikksyre/acetonitril fra 0 til 98%), fremkom en enkelt topp.

C. Aminosyre- sammensetning.

Prøven ble hydrolysert med 5.7 M HC1 (aq) ved 110°C i 24, 48 og 72 timer, og så analysert med en Hitachi 835 aminosyre-analysator. For halvcysteinet ble prøven oksidert med permaursyre og så hydrolysert med 5.7 M HC1 (aq) ved 110°C i 24 timer. For tryptophan ble prøven hydrolysert med 3 M merkaptoetansulfonsyre ved 110°C i 24 timer, og deretter analysert med aminosyre-analysatoren. Fra molvekten bestemt ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese ble dette peptidet funnet å være et enkelt basisk polypeptid bestående av 17 aminosyrer. Resultatene av analysene av aminosyrer er vist i tabell 1.

D. Bestemmelse av aminosyrerekkefølge og identifisering av

argininamidet i C- enden.

Aminosyrerekkefølgen kunne identifiseres fra aminoenden opptil det 15. residuet (unntatt halv-cystein) ved bruk av omtrent 23 ug av intakt preparat ved hjelp av en Beckman 890 D sequenser. Ved bruk av omtrent 36 fig av en prøve alkylert ved reduksjon (polypeptidet framstilt ifølge oppfinnelsen underkastet S-pyridyletylering ved framgangsmåten til M.A. Hermodson, et.al), kunne også identifisering gjøres opptil det 16. residuet (inkludert halvcystein). Den gjenværende 17. aminosyre-resten (C-ende-resten) kunne estimeres til å være arginin fra aminosyreanalyse-verdier. Imidlertid kunne det ikke detekteres arginin i C-enden selv når et intakt preparat, pyridyletylert preparat, ble brukt og oppløst med karboksypeptidase (heretter angitt som "CPase") Y og B. Følgelig ble prøven hydrolysert en gang med 30 mM HC1 (aq) under milde betingelser ved 110°C i 10 timer, og igjen behandlet med CPase B. Som resultat ble det slått fast at omtrent 0.5 mol arginin ble frigjort pr. mol polypeptid framskaffet ifølge oppfinnelsen, og karboksylgruppen på C-enden ble antatt med stor sansynlighet å være amidert. Fordi den teoretiske molvekten av amidforbindelsen (beregnet molvekt = 2264) var fullstendig sammenfallende med verdien funnet ved masseanalyse, ble det bekreftet at karboksylgruppen i arginin på C-enden var amidert.

E. Identifisering av disulfidbindinger ( S- S)

Fire halvcysteiner er identifisert i polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen, og disse ble alle funnet å være underkastet disulfidbinding fra de sammenlignende eksperimentene for S-pyridyletylering med eller uten et reduksjonsmiddel (dithiothreitol). For identifisering av posisjonene for disulfidbindingene ble følgelig et intakt preparat oppløst med trypsin under betingelser hvor ingen utbyttingsreaksjon med disulfidbinding opptrer (under sure betingelser med pH=6.5), og det oppløste produktet ble separert ved motfasevæskekrommatografi med høy yteevne som beskrevet ovenfor (kolonnen var Cosmosil 5Ci8P, peptid utvasket med 0.1% trifluoredikksyre/acetonitril-system). Når aminosyresammensetningen av det oppnådde peptid var gransket, ble det slått fast at den 3. og den 16., den 7. og 12. fra aminoenden var underkastet disulfidbinding.

F. LPS- bindingsaktivitet til polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen.

Polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen inhiberte aktivering av C-faktor med 0.1 jtg/ml LPS (et utvunnet fra E. coli 0111 B4 arten ble brukt) (angitt som "C - faktor"), 50 % med 0.05 (0.12 uglnå) og fullstendig med 1/xM (2.3 ^g/ml). Polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen ble også observert å danne et polymer-kompleks med LPS og å danne en sedimenteringslinje i den doble diffusjonsprøven ved bruk av 1 % agarosegel.

Testresultatene for inhiberingseffekten til polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen mot aktivering av C-faktor av LPS er vist i fig. 2 og fig. 3. Fig. 2 og fig. 3 viser resultatene henholdsvis med og uten (IM) natriumklorid. Polylysin, en basisk forbindelse med høy molvekt som oppviser elektronbinding med LPS ble brukt som kontroll. Denne egenskapen til elektronbinding med LPS er oppdaget av oppfinnerne for den foreliggende oppfinnelsen. På fig. 2 og fig. 3 viser symbolene (o) og (•) resultatene for henholdsvis polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen og polylysin.

Fra disse resultatene kan det forstås at det nye polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen ikke bare fremviser elektronbindinger med LPS, men også sterk affinitet overfor LPS som ikke påvirkes av saltkonsenstrasjonen.

G. Måling av absorbsjon.

Fig. 4 viser absorbsjonsspektret for UV-stråler til en vandig 99.2 /tg/ml oppløsning av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen. Det har absorbsjonstoppen ved 276 nm. Siden absorbsjonen ved 280 nm er 0.3842, er absorbsjonen til en 1 % vandig oppløsning ved 280 nm beregnet å være 38.7.

Eksperimentelt eksempel 1.

(biologisk aktivitet av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen)

A. Utgangsmateriale og framgangsmåte.

(1) LPS

Det ble brukt rensede LPS'er hvis S-type var Salmonella minesota 1114 W, E. koli 0,111:B4, E.coli 0113 og Re-type var Salmonella minnesota R595, E. coli J5.

(2) LPS-erytrocytt sensitivisert med LPS

Til 1 ml suspensjon inneholdende hovedsakelig 2.5% humanerytrocytt type O ble det tilsatt 0.5 ml LPS (1 mg/ml) og blandingen ble ristet ved 3.7°C i 1 time for å blandes, etterfulgt av vasking med en saltoppløsning.

(3) Hemolyseaktivitet

En blanding av 50 /il av 0.5 % LPS-sensitivisert erytrocytt, 50 /ti av en oppløsning av 0.5% polypeptid framskaffet ifølge oppfinnelsen fortynnet 2 ganger og 100 fil av Tris-HCl bufret saltoppløsning (pH 7.2) ble holdt ved 37°C i 1 time, og deretter ble det tilsatt 2.3 ml fysiologisk saltoppløsning, etterfulgt av sentrifugering ved 2500 opm i 10 min. Mengden hemoglobin i supernatanten ble bestemt ved bruk av absorpsjon ved 412 nm. Hemolysemønsteret på en mikroplate ble også bestemt ved bruk av en mikroplateavleser (Corona MPT-100: handelsnavn) etter at en blanding av 50 /ul 0.5% LPS-sensitivisert erytrocytt og 50 /il 0.5% polypeptidoppløsning fortynnet 2 ganger var holdt ved 37 °C i 1 time.

(4) Antibakteriell aktivitet.

20 fil av en 0.5% oppløsning av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen fortynnet 2 ganger og 20 få av en bakterieoppløsning (IO<6> til 107/ml) ble dyrket på 160 fil kultiveringsmedium fra Penassay eller et syntetisk medium fra Jarvis. Etter 18 timer ved 37°C, ble dets grumsethet målt ved bruk av en mikroplateavleser ved 550 nm, og antall delvis levende bakterier og inhiberingssirkel ble også målt.

(5) Gel-utfellingsreaksjon

I en oppløsning av 1 % agarose (0.1 % NaN3 var tilsatt) oppløst i Tris-HCl bufret saltoppløsning med pH 7.2, Beronall-buffer med pH 8.6 og acetatbuffer med pH 4.6, ble det formet en sedimenteirngslinje mellom LPS og polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen eller anti-LPS faktor (basisk protein med molvekt på 11600, bestående av aminosyre 102 -rest oppnådd fra ekstrakt (lysat) av Tachypleus tridentahis hemocytt; nedenfor angitt som "ALF"). Linjen var farget med amid svart. Fortynningsmidlet brukt for polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen var 50 mM Tris-HCl - 0.15 M NaCl (Ph 7.2).

B. Resultater

(1) Hemolyseaktivitet

Polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen fremviste hemolyse ved 2 til 3 /tg/ml for erytrocytt sensitivisert av enhver LPS fra salmonella minnesota 1114 W, R595 og E. coli 0113 og framviste ved høy konsentrasjon med letthet hemolyse selv ved romtemperatur. Selv om hemolyse var inhibert ved en fri LPS som på lignende måte inhiberer ALF, ble hemolyse av ikke-sensitivisert erytrocyt observert i en mengde av 3.13 fig/ ml eller mer. Generelt var hemolyseaktiviteten til polypeptidet framskaffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen svakere enn den for ALF.

(2) Antibakteriell aktivitet

Polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen fremviste antibakteriell aktivitet for enhver av Salmonella typhimurium LT 2(S), 1102(Re), Salmonella minnesota 1114

W(S) og R 595(Re). En minimal antibakteriell dose var 3.13 ng/ ml for LT2 og 1.56 H<g>/ ml for 1102. Videre fremviste den antibakteriell aktivitet selv overfor Gram positive bakterier, slik som Staphylococcus aureus. På en agar inneholdende bakterier var inhiberingssirkelen dannet avhengig av konsentrasjonen. Den antibakterielle aktiviteten av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen var generelt sterkere enn den til ALF.

(3) Gel-utfellingsreaksjon

Polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen fremviste skarpe sedimentasjonslinjer i gel-utfellingsreaksjonen for enhver LPS fra Samonella minnesota 1114 W, R595, E.coli 0111:B4, 0113 og J5. Sedimentasjonslinjer for heterogene LPS fløt sammen med hverandre.

Fra det ovenstående fremgår det at polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen fremviser sterk affinitet overfor LPS og er egnet som et middel for å fjerne endotoksin og som et terapeutisk middel for behandling av infeksjoner fra mikroorganismer.

Eksperimentelt eksempel 2.

(Inhibisjonseffekt av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen mot blastgenese av lymfocytt av LPS)

A. Materiale og framgangsmåte

Celler fra milten (SC) fra C57BL hannmus (5 uker gamle) ble samlet opp ved bruk av Ficoll-Hypaque gravitasjons-sentrifugering og suspendert i RPMI-1640 kultiveringsmedium (uten serum eller tilsatt BSA, FCS). Det resulterende kultiveringsmediet ble justert til 3 x IO6 celler/ml og 100 /ti ble fordelt i hver av de 96 hullene i en "microtiter" plate. 10 pel hver av 0.4, 4, 40 og 400 /tg/ml polypeptid framskaffet ifølge oppfinnelsen (LBP), deretter 80 fil av kultiveringsmediet, og til slutt 10 fil 400 /ig/ml LPS ble tilsatt til det fordelte kultiveringsmediet, etterfulgt av inkubasjon i en inkubator med 5%C02i 72 timer. <3>H-tymidin (<3>H-TdR) ble tilsatt dertil i en mengde av 1 uci/10 fil 18 timer før utløpet av inkubasjonstiden. Mengden av <3>H-TdR samlet opp etter avtrekking av celler ved bruk av en cellehøster ble målt ved bruk av en flytende skintillasjonsteller for å avdekke faktoren for cellemultiplikasj on.

Cellemultiplikasjon ble observert ved bruk av et mikroskop for å ta et omvendt avbildende mikrofotografi.

B. Resultater

Fig. 5 viser inhiberingsvirkningen av LBP mot blastogenese av musemilt SC (cellemultiplikasjonsreaksjon) i nærvær av LPS. Som det klart fremgår fra figuren, inhiberer 2 /tg/ml og 20 /tg/ml av LBP 90% eller mer av blastogenese av lymfocytt. Videre, ved å observere gjennom et mikroskop som gir et invertert bilde, ble forstørring og kolonisering (blastogenese) innlysende avdekket etter tilsats av 50 /tg/ml LPS og påfølgende inkubasjon i tre dager (fig. 6). Selv om få forandringer ble avslørt i tilfelle hvor LPS ble tilsatt etter tilsetning av 0.2 /tg/ml LBP (Fig. 7), ble forstørrelse og kolonisering knapt avdekket i tilfellet med bruk av 2 /tg/ml LBP og 20 /tg/ml LBP for å fremvise inhiberingsvirkning mot blastogenese av LPS (fig. 8 og fig. 9).

Eksperimentelt eksempel 3.

(Inhiberingsvirkning av polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen mot blastogenese av lymfocytt fra LPS)

A. Materialer og framgangsmåte

Enkjernete periferal blodceller (PBNC) fra friske mennesker (mann, 30 år gammel) ble samlet opp ved hjelp av Ficoll-Hypaque gravitasjons-sentrifugering og suspendert i RPMI-1640 kultiveringsmedium (uten serum eller tilsats av BSA, FCS). Det resulterende kultiveringsmediet ble justert til 2xl06 celler/ml og 100 /il ble fordelt i hver av de 96 hullene i en "microtiter" plate. 10 /ti av 200 /tg/ml LBP, deretter 80 /ti av kultiveringsmediet, og til slutt 10 /ti av 400 /tg/ml LPS ble tilsatt til det fordelte kulturmediet, etterfulgt av inkubasjon i en inkubator i 5% C02 i 72 timer. <3>H-tymidin (<3>H-TdR) ble tilsatt dertil i en mengde av 1 uti/10 /ti 18 timer før fullføring av inkuberingen. Mengden av <3>H-TdR oppsamlet etter avtrekking av celler ved bruk av en cellehøster ble målt ved bruk av en flytende skintillasjonsteller for å avdekke raktoren for cellemultiplikasjon.

B. Resultater

Fig. 10 viser inhiberingsvirkningen av LBP mot blastogenese av PBMC (celle multiplikasjonsreaksjon) i nærvær av LPS. Som det klart fremgår fra figuren, inhiberer 10 /tg/ml med LBP omtrent 100% blastogenese av lymfocytten fra 50 /xg/ml

LPS.

Fra de ovenfor angitte resultater fremgår det at LBP kan omtrent fullstendig inhibere blastogenese av lymfocytt fra menneske og mus på grunn av LPS -stimulering i en mengde av 1/25 til 1/5 på basis av mengden av LPS.

Bindingsaktiviteten mellom LBP og LPS ble målt ved bruk av C-faktor - aktivitetsinhiberingen som en indeks for å vise omtrent 20 ganger mengden av LPS-mengde. Følgelig anses inhiberingsvirkningen av LBP mot blastogenese av lymfocytt å være avdekket ved bindingsevnen med LPS, og antagonisme med en LPS-reseptor eksisterende på cellemembranen av lymfocytten (T-celle, B-celle) og monocytt eller cellemembranens modifikasjon på grunn av positiv ladning av LBP.

En LPS-reseptor eksisterer i forskjellige celler, forskjellig fra cellene nevnt ovenfor, makrofager, nøytrofile, erytrocytt, trombocytt, blodkar, endotelialceller, hepatocytt, etc., og det antas at stimulering med LPS forårsaker forskjellige immunreaksjoner slik som B-celle-blastogenese, hjelpe-effekt, polyklonal B-celle- aktivering, interlaukin-produksjon, interferon-produksjon, TNF-produksjon, etc; inflammasjon, slik som prostaglandin-produksjon, produksjon av aktivt oksygen, komplement-aktivering, etc.

Det er forventet at LBP direkte eller indirekte nesten fullstendig kan inhibere ovennevnte immunreaksjoner og inflammasjon forårsaket av LPS i 1/25 til 1/5 mengde i forhold til LPS-mengden. Følgelig kan polypeptidet framskaffet ifølge oppfinnelsen forventes å være effektivt mot følgende sykdommer: infeksjoner, slik som luftveisinfeksjon, enhets-infeksjon, etc, hudsykdommer, slik som liggesår, forbrenning eller skolding etc, kolitt.slik som verkende kolitt, klonisk sykdom etc, hepatopati.slik som cirrhose, leversvikt etc, og postoperative komplikasjoner i kirurgi.

Mulighet for industriell anvendelse

Polypeptidet framskaffet ifølge den fremviser sterk affinitet overfor lipo-polysakkarid, og er egnet til fjerning av endotoxin og som et terapeutisk middel mot bakterieinfeksjoner.

Claims

1. Framgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid med molvekt på omlag 2000 og med affinitet overfor lipopolysakkarider, særlig et polypeptid med formel - hvor Lys angir lysin, Trp tryptophan, Cys cystein, Phe fenylalanin, Arg arginin, Val valin, Tyr tyrosin, Gly glycin, Ile isoleucin og X en hydroksylgruppe eller en aminogruppe, karakterisert ved å a) framskaffe en hypotonisk ekstraksjonsrest fra hemocytt fra hesteskokrabbe ved å tilsette en buffer til hemocytten, homogenisere og sentrifugere blandingen, hvorved de løselige bestanddeler i hemocytten ekstraheres for å oppnå en rest, b) tilsette til resten fra a) en fortynnet mineralsyre eller en organisk syre, homogenisere og sentrifugere den resulterende blandingen, for slik å oppnå en supernatant av surt ekstrakt, tørke og konsentrere supernatantfraksjonen, gjenoppløse det resulterende ekstrakt i en syre og underlegge den resulterende løsningen for gelfiltrering med en Sephadex G-50 kolonne, hvorved de oppsamlete fraksjonene pH-justeres til omlag 6.0, og rense de oppsamlete fraksjonene i en CM-Sepharose CL-6B-kolonne, forbenandlet med en buffer (pH omlag 6.0).

2. Framgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som hesteskokrabbe anvendes Tar. hyplp. ns rririenrariis og/eller Tar. hyplp. ns gigas.