FI92708C - Menetelmä uuden lääkeaineena käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

92708 MENETELMA UUDEN LÅAKEAINEENA KAYTTOKELPOISEN POLYPEPTIDIN VAL-

MISTAMISEKSI

Keksinnon kohteena on menetelmå uuden lååkeaineena kåyttokel-poisen polypeptidin valmistamiseksi, erityisesti kohteena on menetelma uuden polypeptidin valmistamiseksi, jolla on voimakas affiniteetti lipopolysakkarideille (endotoksiineille).

Endotoksiinia kutsutaan myos solunsisåiseksi toksiiniksi, mikå termi viittaa laajasti Gram-negatiivisten solujen sisåltåmiin toksisiin yhdisteisiin. Endotoksiinien komponentit ovat lipopo-lysakkarideja (tåstedes lyhennettyna "LPS").

Tunnettuja menetelmiå endotoksiinin poistamiseksi ovat pyro-lyysimenetelmå, ultrasuodatusmenetelmå sekå polymyksiini-B-af f initeettikromatograf iamenetelmå.

Kuitenkin, pyrolyysimenetelmåsså LPS poistetaan lasiastioista jne. termisesti hajottamalla LPS kuivalla kuumennuksella lSmpd-tilan ollessa 250°C tai enemmån. Pyrolyysimenetelmåa ei voida kayttaa poistettaessa LPS:a aineesta, joka ei kestH kuumuutta. Ultrasuodatusmenetelma on tehokas erotettaessa LPS:a aineista, joiden molekyylimassa on pieni, mutta se ei sovellu periaat-teessa endotoksiinin erottamiseen aineista, joiden molekyyli-• mas s a on suuri. Polymyksiini-B-affiniteettikromatografiame- ♦ netelmåa voidaan olettaa kåytettåvån hyddynnettåesså polymyk-siini B:n affiniteettia LPS:Ile, mutta polymyksiini B:n tok-sisuus rajoittaa kåyttdå, joten menetelmåå ei tållå hetkellå kåytetå yleisesti.

Morita et.al. ovat julkaisussa J. Biochem. (97) pp. 1611-1620 (1985) esittåneet menetelmån anti-LPS-tekijan (ALF) eristami-seksi hevosenkenkåravusta. Menetelmåsså hevosenkenkåravun he-mosyyttilysaatti absorboidaan ja puhdistetaan dekstraanisul-faatti-Sepharose- ja Sephadex-pylvåskromatografialla heikosti alkalisissa olosuhteissa. Nåin saatu proteiini koostui suora-ketjuisesta polypeptidistå, jonka molekyylipaino oli noin 2 92708 15000. Tålla anti-LPS-tekijållå ei kuitenkaan ole laajaa anti-bakteerista spektriå, koska sillå ei ole aktiivisuutta gram-positiivisia bakteereja vastaan.

Tåhån liittyen, keksijåt ovat tehneet intensiivisiå tutkimuksia loytååkseen uusia yhdisteitå, joilla olisi affiniteettia LPS:lle. Tåsså keksinnosså yhdistettå kutsutaan LPS-sitovaksi polypeptidiksi (toisinaan lyhennettynå LBP). Nåin olien, he eristivåt tehokkaasti uuden polypeptidin hevosenkenkåravun hemosyytistå, syntetisoivat tåmån polypeptidin synteettisin menetelmin, kuten kiinteåfaasipeptidisynteesillå ja edelleen havaitsivat, ettå tållå polypeptidillå on voimakas affiniteetti LPS:lle ja ettå sillå on voimakkaita biologisia vaikutuksia, kuten antibakteerisia vaikutuksia ja blastogeneesiå inhiboiva vaikutus jne., ja nåin saavutettiin tåmå keksinto.

Keksinndn selitys

Keksinto koskee menetelmåå lååkeaineena kayttokelpoisen polypeptidin, jolla on molekyylipaino suunnilleen 2000 ja jolla on affiniteettia lipopolysakkarideille, tai sen homologien, joilla on sama molekyylipaino ja affiniteettia lipopolysakkarideille, valmistamiseksi, jolla polypeptidillå on seuraava kaavaa (I): A r r - G1 y / \

Tyr lle \ ^ (I) C y s - C y s / \

Val T*r I '

Arg Ar g 1 1 P h e Arg *; \ /

H-Lys-Trp- C y s - Cys-Arg-X

II

3 92708 jossa Lys vastaa lysiiniå, Trp tryptofaania, Cys kysteiiniå,

Phe fenylalaniinia, Arg arginiinia, Val valiinia, Tyr tyrosii-nia, Gly glysiinia, Ile isoleusilnia ja X on hydroksyyliryhmå tai aminoryhma, ja sille on tunnusomaista se rnita on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinndn mukainen yhdiste on polypeptidi/ joka koostuu 17 aminohaposta, joista C-paana toimivan arginiinin karboksyy-liryhma. on amidoitu uutetussa tai eristetysså tilassa. Vaikka tåmå yhdiste olisi muutettu hapoksi hydrolyysillå, sen af-finiteetti LPS:iin såilyy korkeana.

Keksinnon mukainen polypeptidi voidaan eristaa hevosenkenkara-vun Tachvpleus tridentatus. Tachvpleus aioas ja Limulus Polyphemus hemosyytista tavalla, joka selostetaan alia.

Tarkemmin, Tachvpleus tridentatus hemosyytin hypotonisen uutta-misen jaannos, uutetaan happamissa olosuhteissa, esim.r laimen-netussa mineraalihapossa, kuten kloorivetyhapossa, typpihapos-sa, rikkihapossa jne. tai orgaanisessa hapossa, esim. alemmassa alifaattisessa hapossa, kuten etikkahapossa jne. Saatuun uut-teeseen kaytettiin puhdistusmenetelmia, kuten geelisuodatusta, kromatografiaa, jne. jolloin saatiin eristettyå polypeptidi.

Keksinnon mukainen polypeptidi voidaan tuottaa synteettisin me-] netelmin, kuten peptidisynteesimenetelmillA, esim. kiinteafaa-sipeptidisynteesimenetelmalla, nestefaasipeptidisynteesi-menetelmalla jne.

Tarkemmin, esim. kiinteåfaasisynteesimenetelmaa kåyttåen, kun N-suojatun arginiinin karboksyy1iryhma on sidottu liukenematto-maan hartsiin, jossa on aminoryhmia, joskus kåyttåen vålittå-jaa, jossa on sekå karboksyyliryhmå, ettå funktionaalinen ryh-må, joka voi sitoutua karboksyyliryhmåån, suojatut aminohapot, jotka vastaavat asemaa 16-1 peptidisekvenssisså, jota kuvataan kaavalla: 4 92708 1 5 10 H-Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly 1 5 - 1le-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg (jossa symbolit ovat kuin edella) sidotaan arginiiniin joka oli sidottu liukenemattomaan hartsiin, jarjestyksessa kiinteafaasi-peptidisynteesimenetelmSn mukaisesti ettå saataisiin suojattu polypeptidi, liukenematon hartsi ja aroinohappojen suojaryhmSt poistetaan etta saataisiin polypeptidi, joka vastaa kaavaa (II): 1 5 10 H -Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly 1 5

Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg— N H 2 jossa symbolit ovat samat kuin edella ja sidotaan kysteiinit 3-ja 16-asemissa sekå 7- ja 12-asemissa toisiinsa vastaavien mer-kaptoryhmien kautta, disulfidisiltojen muodostamiseksi, jolloin saadaan tåmån keksinnon mukaisia polypeptideja.

Aminoryhmia sisåltavåna liukenemattomana hartsina voidaan kåyt-taa mita tahansa hartsia, joka voi sitoa N-suojatun arginiinin (tai joissain tapauksissa siihen sitoutuneen vaiitt&j&n) kar-,, boksyyliryhmån, ja joka voidaan tamSn jalkeen poistaa.

Esimerkkejå tallaisista liukenemattomista hartseista voivat olla aminometyylihartsit [aminometyyli-poly(styreeni-CO-divi-nyylibentseeni)], bentshydryyliamiinihartsit, metyylibents-hydryyliamiinihartsit, 4-(aminometyyli)fenoksimetyylihartsi jne. Kåyttamållå bentshydryyliamiinihartsia, metyylibents-hydryyliamiinihartsia ja 4-(aminometyyli)fenoksimetyylihartsia, saadaan amidi suoraan lohkaisemalla, mutta aminometyylihartsia suositellaan saannon kannalta.

, Valittåjan, jossa on seka karboksyyliryhma, kuten edella maini-’ tussa tapauksessa, ja funktionaalinen ryhma, joka voi sitoutua

II

5 92708 karboksyyliryhmåån, tulee olla sellainen, joka voi muuttaa ar-giniinin karboksyyliryhmån p-karboksimetyylibentsyyliesteriksi# mutta vålittåjån valintaa ei ole erityisesti rajattu.

4 - (t-Butoks ikarbonyyl i-G-tosyyl i-L-arginyyl ioks imetyyli) fenyy-lietikkahappoa, joka sisåltåa tållaisen valittajan sidottuna suojattuun arginiiniin voidaan valmistaa menetelmållå, jonka esittivåt J.P. Tam et. al. ("Synthesis" (1979)/ ss. 955-957).

Suojattu aminohappo on aminohappo, jonka funktionaalinen ryhmå on suojattu suojaavalla ryhmållå tunnetulla menetelmalla, ja erilaisia suojattuja aminohappoja on kaupallisesti saatavissa. Syntetisoitaessa keksinnon mukaista polypeptidiå, on edullises-ti valittava jokin alla mainituista suojaavista ryhmista. En-siksi, aminohapon α-aminoryhmån suojaryhma on Boc (t-butyyliok-sikarbonyyli) tai Fmoc (9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli). Argsn guanidinoryhmån suojaryhmiå voivat olla Tos (tosyyli), N02 (nitro) tai Mtr (4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentseenisul-fonyyli). Kysteiinin merkaptoryhman suojaryhmia voivat olla Bzl (bentsyyli), M.Bzl (4-metoksibentsyyli), 4-MeBzl (4-metyyli-bentsyyli), Acm (asetamidometyyli), Trt (trityyli). Npys (3-nitropyridiinisulfenyyli), t-Bu (t-butyyli) tai t-BuS (t-bu-tyylimerkapto). Nåistå suositeltavimpia ovat 4-MeBzl, Acm ja Npys. Tyrosiinin hydroksyylin suojaryhmiå voivat olla Bzl, Cl2Bzl (2,6-diklooribentsyyli) ja t-Bu tai tåmå hydroksyyli-ryhmå voidaan jåttåå suojaamatta. Lysiinin aminoryhmån suoja-ryhmiå voivat olla Z (bentsyylioksikarbonyyli), Cl-Z (2-kloo-ribentsyylioksikarbonyyli), Boc tai Nyps. On tårkeåå, ettå suojaryhmiksi valitaan sopivia ryhmiå riippuen peptidisynteesin olosuhteista.

. Suojaryhmå voidaan sitoa tavanomaisilla kondensaatiomenetelmi-llå, kuten DCC-menetelmållå (disykloheksyylikarbodi-imidi), ak-tiivisella esteri-menetelmållå, seka- tai symmetrinen happoan-hydridi-menetelmållå, karbonyylidi-lmidatsolimenetelmållå, DCC-HOBt (l-hydroksibentsotriatsoli)-menetelmållå, difenyylifosfo-ryyliatsidimenetelmålla jne. mutta suositeltavimpia ovat DCC-, DCC-HOBt- ja symmetrinen happoanhydridi-menetelmå. Nåmå ------· T7” 92708 6 kondensaatioreaktiot suoritetaan yleisesti orgaanisessa liuot-timessa kuten dikloorimetaanissa, dimetyyliforroamidissa jne. tai niiden seoksessa. α-Aminoryhmån suojaryhmån eliminoivana aineena voidaan kåyttåå trifluorietikkahappo/dikloorimetaania, HCl/dioksaania, piperidiini/dimetyyliformamidia jne. Valinta riippuu siitå, mitå suojaryhmaa on kaytetty. Kondensaatioreak-tion etenemisastetta synteesin vastaavissa vaiheissa on tut-kittu menetelmållå, jonka esittivat E. Kaiser et. al. [Anal. Biochem. 34, 595 (1970)] (ninhydriinireaktiomenetelmå).

Kuten edellå on kuvattu, voidaan saada suojattua peptidihart-sia, jolla on haluttu aminohapposekvenssi.

Kun liukenemattomana hartsina kaytetåån aminometyylihartsia, voidaan esim. kasittelemalla hartsia ammoniakilla halutussa liuottimessa eliminoida hartsi. Seuraavaksi, kåsittelemållå hartsia fluorivetyhapolla voidaan saada kaavan (II) roukaista polypeptidia, jonka kaikki suojaryhmat on eliminoitu. Kun liu-kenemattomana hartsina kaytetåån bentshydryyliaroiinihartsia, raetyylibentshydryyliamiinihartsia tai 4-(aminometyyli)fenoksi-metyylihartsia, hartsi ja suojaryhmå voidaan eliminoida saman-aikaisesti kåyttåmålla fluorivetyå.

Seuraavaksi, kun on pelkiståmållå mieluiten 2-merkaptoetanolilia varmistuttu siitå, ettå kysteiinien merkaptoryhma on pel-' kistyneesså muodossa, suoritetaan hapetus ettå saataisiin kaa- » van (I) mukainen syklinen polypeptidi amidina.

Hapetus voidaan tåsså tapauksessa suorittaa kayttåen tunnettua menetelmåå, ja yleisesti kaytetåån hapettavaa ainetta, kuten ilman happea tai £errisyanaattia (esim. kaliumferrisyanaattia).

• Nåin saatu polypeptidi voidaan puhdistaa tavanomaisinmenetel-min, kuten uuttamalla, uudelleenkiteytyksellå, eri kromatogra-fiamenetelmillå (geelisuodatus-, ioninvaihto-, partitio, adsor-ptio-, kåånteisfaasi-), elektroforeesilla, vastavirtapartitiol-la jne. mutta kåånteisfaasi-HPC on tehokkain menetelmå.

7 92708

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1. on kartta, jossa kuvataan keksinnon mukaisen polypepti-din SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Kuvat 2. ja 3. ovat diagrammeja, jotka esittåvat testituloksia koskien keksin-ηΰη mukaisen polypeptidin inhiboivaa tehoa C-tekijan aktivoitu-miseen LPS:lla nahden. Kuva 4. on keksinnon mukaisen polypeptidin UV-absorptiospektri. Kuva 5. osoittaa keksinnon mukaisen polypeptidin tehoa LPS:n stimuloimaa hiiren lymfosyytin blasto-geneesia vastaan. Kuva 6. on mikrovalokuva lymfosyytin blasto-geneesista, kun on lis&tty 50 μg/ml LPS:a. Kuvat 7, 8 ja 9 ovat kukin mikrovalokuvia, joissa on lisatty 0,2, 2 ja 20 μg/ml keksinnon mukaista polypeptidia, vastaavasti ja 50 μg/ml LPS:a, vastaavasti. Kuva 10 on diagramma, jossa esitetaan keksinnon mukaisen polypeptidin teho ihmisen periferisen lymfosyytin LPS:lla stimuloitua blastogeneesia vastaan.

KeksinnQn parhaat toteutustavat

KeksintdH kuvaillaan tarkemmin seuraavissa esimerkeissa. Esimerkki 1 A. KeksinnSn mukaisen polypeptidin eristys ja puhdistaminen N. 50 g:aan Tachypleus tridentatuksen hemosyytteja lisattiin 150 ml 20mM tris-HCl/50 mM NaCl pH 8,0 puskuria ja seos homo-genisoitiin nopealla Hiscotron (kauppanimi, valmistanut Nippon Seimiksu Kogyo K.K.)-homogenisaattori11a 3 min ajan ja sitten sentrifugoitiin (8000 rpm, 30 min, 4°C ). Edella mainittu ope-raatio toistettiin nain kaksi kertaa erotetulle sakalle ja he-mosyyttien liukenevat osat uutettiin ja j3Hnnos otettiin eril-leen.

jSSnndkseen lisSttiin 150 ml 20mM HCl:a, seosta homogenisoitiin 3 minuutin ajan nopealla homogenisaattorilla ja happouutteen .. supernatantti otettiin erilleen. Toistamalla tamå toimenpide • yhteensa kolmesti, saatiin yhteensa n. 400 ml uutetta.

8 92708

Supernatanttifraktio kuivattiin ja våkevoitiin lyofilisoimalla.

Hapan uute, konsentroituna ja kuivattuna, liuotettiin uudelleen 20 mM HC1 vesiliuokseen ja siirrettiin Sephadex G-50-pylvaaseen (3,0 x 90,0 cm) (aiemmin tasapainotettu 20 mM HC1 vesiliuoksel-la) ja suoritettiin geelisuodatus. Eluoidut fraktiot, jotka inhiboivat C-tekijån aktivoitumisen LPSslla (kaytettiin E. coli 0111 B4-kannasta erotettua) (hevosenkenkåravun veren koagu-loivan seriiniproteaasin prekursori; LPS-sensitiivinen tekijå, jonka nimesivåt tåman keksinndn keksijat Nakamura et al., Eur J. Biochem., 154 511 (1986)) keråttiin ja keråttyjen fraktioi-den pH såådettiin 6,0:aan NaOH vesiliuoksella.

Nayte siirrettiin CM-Sepharose CL-6B-pylvååseen joka oli aiemmin tasapainotettu 20mM asetaattipuskurilla (pH 6,0) ja eluoi-tiin 20mM asetaattipuskurigradientilla (pH 6,0) joka sisalsi 0 - 0,3M NaCl. Fraktiot, joilla oli C-tekijån aktivoitumista inhiboivaa vaikutusta keråttiin ja saatiin lopullinen valmiste LPS:a sitovaa ainetta (keksinnon mukainen uusi polypeptidi). Saanto oli n.30 mg 50g:sta hemosyyttejå.

B. Puhtauskoe (1) SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi " LPS:a sitova polypeptidi siirrettiin 12% polyakryyliamidigee-lielektroforeesiin, jossa oli 8M ureaa pelkiståvån aineen (β-merkaptoetanolin) låsnåollessa tai ilman sitå ja vårjåttiin Coomassie Brilliant Blue R-250-vårillå ja molemmissa tapauksis-sa saatiin yksi raita, jonka molekyylimassa oli 2000. Tulokset on esitetty kuvassa 1. Kuvassa 1. vasemmanpuoleinen raita nåyt-tåå polypeptidin ilman pelkiståvåå ainetta; keskiromåinen raita nåyttåå polypeptidin pelkiståvån aineen kanssa; oikeanpuoleinen raita osoittaa myoglobiinin sijaintipaikat kåytettåesså myoglo-biinistandardiproteiinimarkkeria [SDS PAGE Marker III; Fluka AG (Sveitsi)] (16,9 kDa), myoglobiini I + II (14,4 kDa), myoglo-biini I (8,2 kDa), myoglobiini II (6,2 kDa) ja myoglobiini III (2,5 kDa).

9 92708

(2) Kaånteisfaasi-HPLC

Kun keksinnon mukaista polypeptidia analysoitiin kaanteisfaasi-HPLC:lla (pylvaana oli Cosmosil 5C 18 P, peptidi eluoitiin gra-dienttisysteemillå 0,1% trifluorietikkahappoa/O - 98% asetonit-riilia) saatiin yksittSinen huippu.

C. Axninohappokoostumusarvot Nåytettå hydrolysoitiin 5,7H HCl-vesiliuoksella 110°C:ssa 24, 48 ja 72 tuntia, ja analysoitiin Hitachi 835-aminohappoana-lysaattorilla. Kysteiinin puolikkaiden (=kysteiinien) saaxni-seksi nayte hapetettiin permuurahaishapolla ja hydrolysoitiin 5,7H HCl-vesiliuoksella 110°C:ssa 24 tunnin ajan. Tryptofaanin saamiseksi naytetta hydrolysoitiin 3M merkaptoetaanisulfoniha-polla 110°C:ssa 24 tunnin ajan ja analysoitiin sitten amino-happoanalysaattorilla. SDS-Polyakryyliamidigeelielektroforeesin antamalla raolekyylimassalla saatiin peptidiksi yksinkertainen polypeptidi, jossa oli 17 aminohappoa. Aminohappoanalyysin tulokset on esitetty taulukossa.

Taulukko 1

Aminohappo Jaannos/molekyyli

Gly 1,2 (1)

Cys/2 3,8 (4)

Val 1,0 (1)

Ile 0,9 (1)

Tyr 1,8 (1)

Phe 1,0 (1)

Lys 0,9 (1)

Trp 1,0 (1)

Arg 4,8 (5)

Yhteensa 17 « ♦ 10 92708 D. Aminohapposekvenssin måårittåminen ja C-påån arginiini-amidin tunnistaminen

Aminohapposekvenssi voidaan måårittåå 15:nnen yksikon amino-pååstå (poislukien kysteiinin puolikkaat) kåyttåen n. 23 μς intaktia preparaattia laitteiston ollessa Beckman 890 D sek-vensseri. Myoskin, kåyttåmållå n. 36 μ9 pelkiståen alkyloitua nåytettå [keksinnon mukaiselle polypeptidille suoritettiin S-pyridyylietylointi kåyttåmållå menetelmåa M.A. Hermodson et. al., Biochemistry, 12, 3146 (1973)], mååritys voidaan tehdå 16:een yksikkoon asti (mukaanlukien kystiinin puolikkaat). Jåljelle jåånyt 17. aminohappotåhde (C-terminaali) voitiin måårittaå arginiiniksi aminohappoanalyysin arvojen perusteella. Kuitenkaan C-påån arginiinia ei voitu osoittaa edes kåytettåes-så intaktia preparaattia. Pyridyylietyloitua preparaattia kåy-tettiin ja hajotettiin karboksipeptidaasilla (tåstedes kåytetty nimeå CPase) Y ja B. Myoskin nåyte hydrolysoitiin kerran 30mM HCl-vesiliuoksella lievisså olosuhteissa 110°C:ssa 10 tunnin ajan ja kåsiteltiin taas CPase B:lla. Tuloksena tunnistettiin vapautuneen 0,5 moolia arginiinia moolista keksinnon mukaista polypeptidiå, ja C-påån karboksyyliryhmån pååteltiin suurella todennåkoisyydellå olevan amidoitu. Koska amidiyhdisteen teo-reettisen molekyylimassan (lask. MW=2264) havaittiin pitåvån tåysin yhtå massa-analyysin antaman arvon kanssa, C-påån ar-giniinin karboksyyliryhmån osoitettiin olevan amidoitu.

E. Disulfidisillan (S-S) tunnistaminen.

Keksinnon mukaisessa polypeptidisså osoitettiin olevan neljå kysteiiniå ja nåiden kaikkien havaittiin muodostavan disulfi-disiltoja vertailevin tutkimuksin S-pyridyylietyloinnilla pel-kiståjån (ditiotreitolin) låsnåollessa tai ilman sitå. Nåin, disulfidisiltojen sijainnin tunnistamiseksi intaktia preparaattia hajotettiin trypsiinillå olosuhteissa, joissa ei esiintynyt disulfidisiltojen vaihtoreaktioita (happamat olosuhteet, pH 6,5), ja hajotettu tuote separoitiin kåånteisfaasi-HPLCslla kuten edellå on kuvattu (pylvåånå oli Cosmosil 5C 18 P, peptidi • eluoitiin 0,1% trifluorietikkahappo/asetonitriilisysteemillå).

11 92708

Kun saatu peptidin aminohappokoostumus tutkittiin, havaittiin, ettå aminopååstå laskettuna valeissa 3 - 16 ja 7 - 12 oli di-sulfidisilta.

F. Keksinnon mukaisen polypeptidin LPS:a sitova aktiivisuus Keksinndn mukainen polypeptidi inhiboi C-tekijan aktivoitumista 0,1 μ9/πι1ί1ΐ3 LPS:a (E. coli 0111 B4-kannasta johdettu) (jat-kossa kutsutaan nimellå "C-tekijå") 50%:sesti 0,05 μΜ (0,12 μ9/πι1) ja tåysin 1 μΜ (2,3 μ9/ιη1) pitoisuudessa. Myoskin, kek-sinndn mukaisen polypeptidin havaittiin muodostavan polymeeri-kompleksin LPS:n kanssa ja muodostavan sedimentaatioviivan kak-soisdiffuusiotestissa, jossa kaytettiin l%:sta agaroosigeeliå.

Testitulokset keksinnon mukaisen polypeptidin inhibointitehosta C-tekijSn aktivoitumiseen LPS:lla esitetaån kuvissa 2. ja 3. Kuvat 2. ja 3. esittåvat tulokset natriumkloridin (1M) poissa-ollessa tai lasnaollessa, vastaavasti. Polylysiinia, suurimole-kyylimassaista yhdistettS, joka voi sahkoisesti sitoutua LPS: iin, kaytettiin kontrollina. Taman såhkoisen sitoutumisen LPS: iin ovat osoittaneet tamån keksinndn keksijat. Kuvissa 2. ja 3. merkit (0) ja (·) osoittavat keksinnon mukaisen polypeptidin ja vastaavasti polylysiinin tulokset.

Måistå tuloksista voidaan huomata, ettå keksinnon mukainen uusi polypeptidi ei ainoastaan sitoutudu sitoudu såhkoisesti LPS: iin, vaan sillå on myos voimakas affiniteetti LPS:iin mihin ei vaikuta suolakonsentraatio.

6. Absorbanssimittaus

Kuva 4. esittåå keksinnon mukaisen polypeptidin 99,2 μg/ml-• vesiliuoksen UV-absorptiospektriå. Sen absorptiohuippu on 276 nm. Koska absorbanssi 280 nm:ssa on 0.3842, laskettiin l%:isen vesiliuoksen absorbanssin olevan 38,7.

Esimerkki 2 A. Arginiinin liittåminen aminometyylihartsiin 12 92708 (1) 4-(broiaimetyyli) fenyylietikkahapon fenasyyliesterin valmis-taminen 75 ml:aan asetonitriiliå suspendoitiin 3,98 g (20 mmol) a-bro-miasetofenonia ja 3,49 g (60 mmol) kaliumfluoridia huoneen låmpotilassa. 4,58 g (20 mmol) 4-(Bromimetyyli)fenyylietikka-happoa jaettiin kuuteen yhtåsuureen osaan ja nåmå osat lisåt-tiin suspensioon sekoituksen aikana 30 min valein ja sekoitusta jatkettiin viela 2 h ajan. Reaktion tapahduttua tåysin, liu-kenemattomat tuotteet suodatettiin pois ja liuottimet tislat-tiin pois suodoksesta. Jaannos liuotettiin uudelleen etyy-liasetaattiin ja pestiin kyllaisellå natriumvetykarbonaatin ve-siliuoksella kahdesti ja taman jalkeen tislatulla vedella, sitruunahapolla ja tislatulla vedella, kullakin kerran ja kui-vattiin natriumsulfaatilla. Etyyliasetaatti tislattiin pois ja jaannos kiteytettiin petrolieetterista ja saatiin 5,5 g halut-tua tuotetta, (sulamispiste: 84-85°C). Tuote kiteytettiin uudelleen ja saatiin 5,2 g kiteitå, joiden sulamispiste oli 85-86°C (saanto 75%).

(2) 4-(t-Butoksikarbonyyli-G-tosyyli-L-arginyylioksiroetyy-li)fenyylietikkahapon valraistaminen

Seosta, jossa oli 4,71 g (11 mmol) t-butoksikarbonyyli-G-tosyy-li-L-arginiinia, 3,47 g (10 mmol) 4-bromimetyylifenyylietikka-* hapon fenasyyliesteriå, 1,28 g (22 mmol) kaliumfluoridia, 0,8 ml (44 mmol) vetta, 50 ml asetonitriilia ja 10 ml dimetyylifor-mamidia sekoitettiin huoneenlMmpdtilassa voimakkaasti 24 tunnin ajan. Saatu liukeriematon tuote suodatettiin pois ja suodos kon-sentroitiin 15-20 ml:aan haihduttamalla. Kun oli lisStty 80 ml etyyliasetaattia, konsentraatti pestiin kyllåisellå natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella kahdesti, tislatulla vedellS kerran, sitruunahapon kyllaisellå vesiliuoksella kahdesti ja tislatulla vedellå kerran ja tåmån jålkeen kuivattiin natriumsulfaatilla. Liuotin tislattiin pois ja jåånndstå kåsiteltiin petrolieetterillå ja saatiin 4-(t-butoksikarbonyyli-G-tosyyli-L-arginyylioksimetyyli)fenyylietikkahapon fenasyyliesteriå puolikiinteåsså tilassa. Se liuotettiin 105 mlsaan

II

927 0 8 13 etikkahappoa ja siihen lisattiin 19 ml vetta ja 13,1 g sinkkiå, ja seosta sekoitettiin voimakkaasti huoneen lampotilassa 5,5 h ajan. Sinkki suodatettiin pois kayttaen Hyflo Super Cel:ia ja etyyliasetaattia ja suodos lisattiin 400 ml:aan etyyliasetaat-tia ja 300 mlsaan vetta. Etyyliasetaattifaasi otettiin talteen ja pestiin vedellå kymmeneen kertaa. Natriumsulfaatilla kuivaa-misen jalkeen liuotin tislattiin pois ja jåannos jauhettiin petrolieetteriin ja saatiin 4,77 g 4-(t-butoksikarbonyyli-G-tosyyli-L-arginyylioksimetyyli) fenyylietikkahappoa. Tama aine saatiin lahes puhtaana tuotteena yhdesta taplastå kaytettaessa ohutkerroskromatografiaa.

(3) 4-( t-Butoksikarbonyyli-G-tosyyli-L-arginyylioksimetyyli) -fenyyliasetamidometyylihartsin valmistaminen 577 mgs lie (1,0 mmol) 4-( t-butoksikarbonyyli-G-tosyyli-L-ar-ginyylioksimetyyli)fenyylietikkahappoa, 2.00 g:lle aminometyy-lihartsia (tuottanut Peptide Laboratory K.K.; 1% risti-sidok-sia) ja 206 mg:lie (1,0 mmol) DCCsta aikaansaatiin kytkentS-reaktio dikloorimetaanissa tavanomaisella menetelmalla. Loppu-tuloksena oli 0,284 mmol kytkeytyminen 1 g:a hartsia kohti.

B. 16-aseman kysteiinin liittaminen 1,0 g (0,284 mmol Arg(Tos)/g hartsia) 4-(t-butoksikarbonyyli-G-tosyyli-L-arginyylioksimetyyli) f enyyliasetamidometyylihartsia pestiin 25 ml:11a dikloorimetaania neljSsti, minuutti kerral-laan, ja suodatettiin. Saatuun hartsiin lisattiin 25 ml 30%:sta trifluorietikkahappoliuosta (liuottimena dikloorime-taani) ja seosta sekoitettiin 30 min ajan jonka jalkeen Boc-ryhmM eliminoitui. Saatua hartsia kåsiteltiin perakkain 25 ml:11a kutakin seuraavaa liuotinta suodattaen kunkin kasitte-lyn jalkeen.

Dikloorimetaani (kerran, 1 min)

Dioksaani (kerran, 1 min)

Dikloorimetaani (kerran, 1 min)

Dioksaani (kerran, 1 min) 92708 - ---—— - -· T” 14

Dikloorimetaani (kahdesti, kumpikin 2 min) 10% Trimetyyliamiini (dikloorimetaaniliuos) (kerran, 2 min; kerran, 5 min)

Dikloorimetaani (neljåsti, kukin 1 min)

Taman jalkeen hartsia sekoitettiin 25 ml:n dikloorimetaania ja 3,5-kertaisen måarån suojattua aminohappoa arginiinin kokonais-maarasta laskettuna, nimittain 310 mg:n (0,994 mmol) Boc-Cys(4-MeBzl) kanssa 1 minuutin ajan. Saatuun seokseen lisattiin 25 ml dikloorimetaaniliuosta, joka sisalsi 205 mg (0,994 mmol) DCC:ta ja seosta sekoitettiin 2 h ajan. Saatua hartsia kasiteltiin pe-råkkain 25 ml:11a kutakin seuraavaa liuotinta suodattaen kunkin kåsittelyn jalkeen.

Dikloorimetaani (kerran, 1 min)

Isopropanoli (kerran, 1 min)

Dikloorimetaani (kerran, 1 min)

Isopropanoli (kerran, 1 min)

Dikloorimetaani (kolmesti, kukin 1 min) C. 15 - 1-asemien aminohappojen liittaminen

Aiemmin saatuun hartsiin kytkettiin jSrjestyksesså kohdassa B * kuvatulla tavalla vastaavia rakenneaminohappoja vastaavat suo-jatut aminohapot polypeptidin asemasta 15 asemaan 1 asti. Vas-taavissa reaktiovaiheissa kaytetyt suojatut aminohapot on esi-tetty taulukossa 2. Suojattujen aminohappojen madrat olivat aina 3,5-kertaiset laskettuna kokonaisarginiinimSlarasta. Boc-Arg(Tos)-kytkentSreaktio toteutettiin DCC-HOBt-menetelmån mukaisesti kSyttSen H0Bt:a kaksinkertainen madra DCCshen ndhden.

15 92708

Taulukko 2

Aminohapon asema Suojattu aminohappo 15 Boc-Arg(Tos) 14 Boc-Arg(Tos) 13 Boc-Tyr(Bzl) 12 Boc-Cys(4-MeBzl) 11 Boc-Ile 10 Boc-Gly 9 Boc-Arg(Tos) 8 Boc-Tyr(Bzl) | 7 Boc-Cys(4-MeBzl) 6 Boc-Val 5 Boc-Arg(Tos) 4 Boc-Phe 3 Boc-Cys(4-MeBzl) j 2 Boc-Trp j 1 Boc-Lys(Cl*Z) i_____

Kun 1-aseman aminohappo oli kytketty, hartsiin kytketty peptidi otettiin talteen lasisuodattimella kåyttåen dikloorimetaania ja kuivattiin alipaineessa ja saatiin 1,781 g kuivaa peptidia hartsissa.

D. Hartsin eliminointi

Kohdassa C saatua kuivaa peptidiå hartsissa kåsiteltiin ve-dettdmSllå ammoniakilla metanolissa ja dimetyyliformamidissa hartsin eliminoimiseksi. Nain saadun suojatun polypeptidin, joka vastaa kaavaa: H -Lys (Cl Z)-Trp-Cys (4-MeBzl) -Phe-Arg (Tos) -Val-Cys(4-MeBzl)-Tyr (Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Ile-

Cys (4-MeBzl) -Tyr (Bzl) - Arg (Tos) -Arg (Tos) -Cys (4-MeBzl)-Arg(Tos)- N H z 16 92708 saanto oli 0,765 g (0,196 mmol). Molekyylimassa oli 3904.

E. Suojaryhmien eliminointi

Kohdassa D saatua suojattua polypeptidiå kåsiteltiin vety-fluoridilla anisolissa etaaniditiolin låsnåollessa suojaryhmien poistamiseksi ja tåmån jålkeen sita kåsiteltiin anionin-vaihtohartsilla (Cl- -tyyppia) ja lyofilisoitiin jolloin saa-tiin 470 mg (0,186 mrnol) seuraavan kaavans j-j -Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly -Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg— N H a- 7 H C 1 mukaista polypeptidihydrokloridia. Molekyylimassa oli 2523.

F. Polypeptidin syklisointi

Kohdassa E saatua polypeptidihydrokloridia laitettiin 30 mg seisomaan 0,1 M tris-HCl:iin (pH 8,5) jossa oli 200-kertainen molaarinen ylimåårå 2-merkaptoetanolia huoneenlampotilassa yon yli. Taman jålkeen sita kåsiteltiin Sephadex G-10-pylvååsså, joka oli tasapainotettu l%:isella etikkahapolla ja saatiin polypeptidejå sisåltåvå fraktio. Fraktio laimennettiin kymme-nesosaan (0,1 mg/ml) vedellå, pH såådettiin 8,5:een 0,5M:lla NaOH: 11a ja annettiin seistå huoneenlåmpdtilassa 30 tunnin ajan ja lyofilisoitiin. Tåmån jålkeen sitå kåsiteltiin Sephadex G-10-pylvååsså, joka oli tasapainotettu 1%sisella etikkahapolla ja saatiin 8,5 mg hapotettua polypeptidia.

Nåin saatu polypeptidi analysoitiin kåånteisfaasi-HPLCslla (pylvååna oli TSK-geeli ODS-12T (0,46 x 25 cm), peptidin elu-ointi tehtiin kåyttåen (A) 0,01M muurahaishappo-trietyyliamii- nia (pH 4,5) - (B) asetonitriiliå, joka sisålsi 20% (A):ta]. Tuloksena havaittiin huippu, joka vastasi esimerkin 1 luonnon polypeptidistå saatua. Edelleen, nåiden seos antoi saman huipun . kaksinkertaisena ja nåin niiden identtisyys tunnistettiin.

17 92708

Kokeellinen esimerkki 1 (Keksinnon mukaisen polypeptidin biologinen aktiivisuus) A. Låhtoaineet ja menetelmå

(1) LPS

Kaytettiin puhdistettuja LPS:eja, joiden S-tyyppi oli Salmonella minnesota 1114 W, E. coli 0111:B4, E. coli 0113 ja Re-tyyppi oli Salmonella minnesota R595, E. coli J5.

(2) LPS-herkistettyja erytrosyytteja 1 ml:aan suspensiota, joka sisalsi 2,5% ihmisen O-tyypin erytrosyytte ja lisattiin 0,5 ml LPS:a (1 mg/ml) ja seosta ravistel-tiin 3,7°C:ssa tunnin ajan ja pestiin suolaliuoksella.

(3) Hemolyyttinen aktiivisuus

Seosta, jossa oli 50 μΐ 0,5% LPS-herkistettyja erytrosyyttejS, 50 μΐ kaksinkertaisesta laimennussarjasta 0,5%:sta keksinnon mukaista polypeptidia. ja 100 μΐ tris-HCl-puskuroitua suolaliu-osta (pH 7,2) pidettiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan. Taman jalkeen siihen lisSttiin 2,3 ml fysiologista suolaliuosta ja sentrifu-goitiin 2500 rpm 10 min ajan. Hemoglobiinin maårå supernatan-tissa mååritettiin mittaamalla 412 μm-absorptio. Myoskin hemo-lyysi mikrolevylla mååritettiin kåyttåen mikrolevynlukijaa (Corona MPT-100-kauppanimi) kun seosta, jossa oli 50 μΐ 0,5% ... LPS-herkistettyja erytrosyytte ja ja 50 μΐ kaksinkertaisen laimennussarjan 0,5% polypeptidia oli pidetty 37°C:ssa tunnin ajan.

(4) Antibakteerinen aktiivisuus 20 μΐ kaksinkertaiseen tilavuuteen laimennettua liuosta, joka ·· sisalsi 0,5% keksinndn mukaista polypeptidia ja 20 μΐ bakteeri-liuosta (106 - 107 /ml) viljeltiin 160 ul:ssa Penassay-kas- vualustaa tai Jarvis:n synteettistå alustaa. Kun oli kulunut 18 tuntia 37°C:ssa sen turbiditeetti mitattiin kayttaen mikrolevy-lukijaa 550 nm:ssa ja myos eiavien bakteerien lukumaara ja in-hibitiorengas mitattiin.

18 92708 (5) Geelisakkautumisreaktio

Liuokseen, jossa oli 1%: agaroosia (0,1% NaN 3 :a lisatty) liuotettuna Tris-HCl-puskuroituun suolaliuokseen, pH 7,2, Be-ronall-puskuriin, pH 8,6 ja asetaattipuskuriin, pH 4,6 muodos-tui sedimentaatiolinja LPS:n ja keksinnon mukaisen polypeptidin tai anti-LPS-tekijån [emaksinen proteiini, jonka molekyylipaino on 11600, joka koostuu aminohappo 102-jåånteestå, joka on saatu Tachypleus tridentatus-hemosyyttiuutteesta (lysaatista); tastedes kutsutaan nimellå "ALF"]. Linja varjattiin amidimustalla. Kåytetty laimennin keksinnon mukaiselle polypeptidille oli 50 mM Tris-HCl - 0,15M NaCl (pH 7,2).

B. Tulokset (1) Hemolyysiaktiivisuus

Keksinnon mukainen polypeptidi sai aikaan hemolyysin pitoisuuk-sissa 2-3 pg/ml erytrosyyteisså, jotka oli herkistetty jol-lekin LPStlle Salmonella minnesota 1114 W, R595 ja E. coli 0113 ja, korkeammassa pitoisuudessa sai aikaan hemolyysin helposti jopa huoneen låmpotilassa. Vaikka hemolyysi inhiboitui vapaalla LPSslla, joka saraoin inhiboi ALF:n, ei-herkistettyjen eryt-rosyyttien hemolyysiå havaittiin måårisså 3,13 pg/ml ja enem-mån. Yleisesti, keksinnon mukaisen polypeptidin hemolyysiaktiivisuus oli heikompi kuin ALF:11a.

• (2) Antibakteerinen aktiivisuus

Keksinndn mukaisella polypeptidillå on antibakteerista ak-tiivisuutta kaikkia seuraavia kohtaan, Salmonella typhimurium LT 2(S), 1102 (Re), Salmonella minnesota 1114 W(S) ja R 595-(Re). Pienin antibakteerinen annos oli 3,13 ^g/ml LT2:lle ja 1,56 ;ug/ml 1102:Ile. Vielå, sillå oli antibakteerista aktiivi-suutta jopa Gram-positiivisille bakteereille kuten Stafylococ-cus aureukselle. Bakteereja sisåltåvålle agarille muodostui inhibitiorengas konsentraatiosta riippuen. KeksinnQn mukaisen polypeptidin antibakteerinen aktiivisuus oli yleisesti suurempi kuin ALF:11a.

«

II

19 92708 (3) Geelisakkautumisreaktio

Keksinnon mukainen polypeptidi muodosti tarkat sedimentaa-tioviivat geelisakkautumisreaktiossa kullekin Salmonella min-nesota 1114 W, R595, E. coli 0111:B4, 0113 ja J5 LPStlle. Heterogeenisen LPS:n sedimentaatioviivat fuusioituivat toisiin-sa.

Edella olevasta ilmenee, etta keksinndn mukaisella polypepti-dillS on voimakas affiniteetti LPSslle ja etta se on kSyttd-kelpoinen endotoksiineja poistettaessa ja terapeuttisena ai-neena hoidettaessa mikro-organismien aiheuttamia infektioita.

Koe 2 (Keksinnon mukaisen polypeptidin aikaansaama lymfosyytin LPSsn aiheuttaman blastogeneesin inhibitio) A. Materiaali ja menetelma

Koiraspuolisen (5 viikon ikaisen) C57BL-hiiren pernasoluja (SC) kerattiin kåyttåmålla Ficoll-Hypaque gravity-sentrifugointia ja suspendoitiin RPMI-164O-viljelyalustaan (ei seerumia tai lisåttyna BSA, FCS). Saatu viljelyalusta tasmattiin 3 x 106 solua/ml ja kuhunkin mikrotiitterilevyn 96 koloon annosteltiin 100 ul. Annosteltuun 100 ul:aan lisåttiin 10 μΐ kutakin 0,4, 4, 40 ja 400 μg/ml keksinnttn mukaista polypeptidia (LBP), sitten 80 μΐ viljelyalustaa ja lopuksi 10 μΐ 400 μg/ml LPS:a ja inlcu-boitiin 5%:isessa C02:ssa inkubaattorissa 72 tunnin ajan. Sii-hen lisåttiin 1 μοί/10 μΐ 3 H-tymidiinia (3 H-TdR) 18 tuntia ennen inkuboinnin lopettamista. Solujen kuorimisella kSyttSen solukeråajaa saadun 3 H-TdR:n maelrå mitattiin kåyttamSHS nes-tetuikelaskuria, josta saatiin maariteltya solumonistumisen mååra.

Solumonistumista havainnoitiin kSyttSmSlla mikroskooppia, jolla otettiin kaanteismikrovalokuva.

B. Tulokset τ~ 20 92708

Kuva 5. esittaa LBP:n hiiren lienis-SC-blastogeneesin inhibi-tiota LPS:n lasnaollessa. Kuten kuvasta ilmenee, 2 μς/ιηΐ ja 20 pg/ml LBP:ta inhiboi 90% tai eneroman lymfosyytin blastogenee-sista. Edelleen havainnoitaessa kåånteiskuvamikroskoopilla, kasvu ja kolonisoituminen (blastogeneesi) nåkyvasti ilmeni kun oli lisatty 50 μg/ml LPS:a ja inkuboitu kolmen påivan ajan, (Kuva 6.)* Vaikka muutamia muutoksia ilmeni tapauksissa, joissa oli lisatty LPS:a sen jalkeen kun oli lisatty LBP:ta 0,2 μς/ιηΐ (kuva 7.), kasvua ja kolonisoitumista tuskin ilmeni kSytettSes-sa 2 μg/ml LBP:ta ja 20 μg/ml LBP:ta mika osoitti inhibitiovai-kutuksen LPS:n aiheuttamaa blastogeneesia vastaan (kuvat 8 ja 9)·

Koe 3 (Keksinnon mukaisen polypeptidin inhibitiovaikutus LPSsn aihe-uttamaan lymfosyytin blastogeneesiin) A. Hateriaalit ja menetelmå

Teirveen ihmisen (miespuolinen, ikå 30) perifeerisen veren mono-nukleaarisia soluja kerSttiin Ficoll-Hypaque gravity-sentrifu-goinnilla ja suspendoitiin RPMI-1640 viljelyalustaan (ei see-rumia tai BSA,FCS-lisays). Saatu viljelyalusta tasmattiin 2 x 106 solua/ml:aan ja sita lisattiin 100 μΐ kuhunkin mikrotiitte-rilevyn 96:een koloon. Viljelyalustaan lisattiin 10 μΐ 200 μg/- • .

mlssta LBP:ta, sitten 80 μΐ viljelyalustaa ja lopuksi 10 μΐ 400 μς/πιΐ LPS:a ja inkuboitiin 5%:isessa C02:ssa inkvibaatto-rissa 72 tunnin ajan. Siihen lisattiin 1 μοχ/ΙΟ μΐ 3 H-tymidii-nia ( 3 H-TdR) 18 h ennen inkuboinnin lopettamista. Solujen kuorimisella kayttaen solukeraajaa saadun 3 H-TdR:n maara mi-tattiin kayttamaila nestetuikelaskuria josta saatiin maari-teltya solumonistumisen maara.

B. Tulokset

Kuva 10. esittaa LBP:n PBMC:n blastogeneesin (solumonistumisre-aktio) inhibitiota LPSsn lasnaollessa. Kuten kuvasta ilmenee, 10 μg/ml LBPsta inhiboi n. 100%:isesti lymfosyytin blastogenee- 21 92708 10 μς/πιΐ LBP:ta inhiboi η. 100% s sesti lymfosyytin blastogenee-sia 50 μ9/ιη1:η LPS:a vaikuttaessa.

Edella olevista tuloksista on havaittavissa, etta LBP voi låhes taysin inhiboida LPS-stimuloidun ihmisen ja hiiren lymfosyytin blastogeneesin måårisså 1/25 - 1/5 LPS:n mååråstå laskettuna.

LBPsn ja LPS:n vålinen sitoutumisaktiivisuus mitattiin kåyttå-mållå C-tekijån aktiivisuuden inhibitiota indeksinå maaran ol-lessa 20-kertainen LPS:n mååråån. TahSn liittyen LBP:n inhibition lymfosyytin blastogeneesille havaittiin ilmenevan sitoutu-miskyvysså LPS:iin, ja lymfosyytin (T-solu, B-solu) tax mo-nosyytin solukalvossa olevan LPS-reseptorin antagonismissa tai LBPsn positiivisesta varauksesta johtuvassa solukalvomuutokses-sa.

LPS-reseptoreita on eri soluissa, muissa kuin edella mainituis-sa, makrofaageissa, neutrofiileissa, erytrosyyteissa, trombo-syyteisså, verisuonissa, endoteelisoluissa, hepatosyyteisså jne. ja on arvioitu, etta LPS-stimulaatio saa aikaan erilaisia immuunireaktioita, kuten B-solublastogeneesia, adjuvanssitoi-mintaa, polyklonaalista B-soluaktivaatiota, interleukiinituo-tantoa, interferonituotantoa, TNF-tuotantoa jne., tulehduksia, kuten prostaglandiinituotantoa, aktiivihapen tuottoa, komple-mentin aktivoitumista jne.

i

Oletetaan, etta LBP voi lahes taysin inhiboida suoraan tai epa-suorasti edella mainitut LPS:n aiheuttamat immuunireaktiot ja tulehdukset maarissa, jotka ovat 1/25 - 1/5 laskettuna LPS:n maaråsta. Tåhån liittyen keksinnon mukaisen polypeptidin voi-daan riittåvåsti olettaa olevan tehokkaan seuraavia sairauksia vastaan: tulehdukset, kuten henkitorven ja keuhkoputken tulehdus, pai-kalliset infektiot, esim. ihosairaudet, kuten makuuhaavat, palovammat jne., paksusuolitulehdukset, kuten haavainen pak-susuolentulehdus, clone disease jne., maksataudit, kuten kir-; roosi, maksainsuffisienssi jne., sekå kirurgian postoperatiivi-set komplikaatiot.

22 92708

Teollisuuskåyton mahdollisuus

Keksinnon mukaisella polypeptidillå on voimakas affiniteetti lipopolysakkarideja kohtaan ja se on hyodyllinen endotoksiineja poistettaessa ja terapeuttisena aineena bakteeri-infektioissa.

• · I · • i

II

Claims (2)

23 92708

1. Menetelma låakeaineena kayttdkelpoisen polypeptidin, jonka molekyylipaino on suunnilleen 2000 ja jolla on affiniteettia lipopolysakkarideille, tai sen homologien, joilla on sama mole-kyylipaino ja affiniteettia lipopolysakkarideille, valmistami-seksi, jolla polypeptidilla on seuraava kaava (I): Arg -- Gly Tyr 'V. <D _Cys -- Cy\^ val V ! i Ars A.r9 . Phe ^^Arg H - Lys - Trp - Cys---- Cys - Arg - X jossa Lys vastaa lysiiniS, Trp tryptofaania, Cys kysteiinia, Phe fenylalaniinia, Arg arginiinia, Val valiinia, Tyr tyrosii-nia, Gly glysiinia, Ile isoleusiinia ja X on hydroksyyliryhma tai aminoryhmå, tunnettu siita, etta; (a) uutetaan hypotonisesti hevosenkenkåravun hemosyytteja, jolloin saadaan hypotonisen uutteen jaannos; uutetaan mainittu jaannos happamissa olosuhteissa, jolloin hypotonisen uutteen jåannoksesta vapautuu mainittu polypeptidi, jolloin saadaan hypotoninen uute; ja puhdistetaan uutteen mainittu polypeptidi, tai (b) sidotaan N-suojatun arginiinin karboksyyliryhmå liu-kenemattomaan hartsiin, jossa on aminoryhmiå, joskus kayttaen vålittåjåa, jossa on sekå karboksyyliryhmå, etta funktionaa- . . linen ryhma, joka voi sitoutua karboksyy1iryhmåån; 24 92708 sidotaan suojatut aminohapot, jotka vastaavat asemia 16-1 peptidisekvenssisså, jota kuvataan kaavalla: 1 5 10 H -Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly 1 5 -Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg (jossa symbolit tarkoittavat samaa kuin edella) arginiiniin, joka on sidottu liukenemattomaan hartsiin, jårjestyksesså kiinteåfaasipeptidisynteesimenetelmån mukaisesti, jolloin saadaan suojattu polypeptidi; eliminoidaan mainittu liukenematon hartsi ja aminohappojen suojaryhmat, jolloin saadaan polypeptidi, joka vastaa kaavaa (II): 1 5 10 H -Lys-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly 1 δ -Ile-Cys-Tyr-Arg-Arg-Cys-Arg- N H 2 jossa symbolit tarkoittavat samaa kuin edella; ja sidotaan kysteiinit 3- ja 16-asemissa seka 7- ja 12-ase-missa toisiinsa vastaavien merkaptoryhmien kautta, jolloin muodostuu disulf idis idoks ia.

2. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polypeptidien valmistus-menetelma, tunnettu siitå, etta hevosenkenkarapu on jokin seuraavista: Tachypleus tridentatus. Tachypleus qiqas > * ja Limulus Polyphemus. « 25 92708