SE535754C2 - Förfarande för isolering av katjoniska nukleoproteiner - Google Patents

Abstract

Föreliggande uppfinning avser skumfraktionering som metod för avskiljning av nukleoproteinunder samtidig koncentration av växtextrakt, utan DNA- eller stärkelsekontamination.Cellkärneproteiner från växter utvinnes först genom extraktion med utspädd syra eller i högsaltkoncentration. Luft införs därefter som bubblor i växtextraktet till skumbildning. Skumrnetkollapsar spontant som en koncentrerad blandning av växtkärneproteiner innehållandenaturliga antiinfektiösa histoner, vilka är både antimikrobiella och antivirala. Uppfinningen avser en process for isolering av nukleoproteiner från Växtriket, användningenav dessa som biocider eller icke terapeutiska läkemedel, innehållande antiinfektivanukleoproteinisolat. Växthistoner, framställda genom skumfraktionering, utgör en i principobegränsad källa för naturliga, biologiskt nedbrytbara peptidantibiotika och antivirala medel.

Description

535 754 .l skulle vara anledningen till att histoner i höga koncentrationer är toxiska för däggdjur endotelceller vid sepsis (Xu, J. et al. Nature Medicine 15, 1318-1321, 2009).

Växter och djur har utvecklat antimikrobiella (poly)peptider, som kan bilda porer i cytoplasmarnembran av invaderande mikroorganismer. Människors hud och andra epitelbarriärer är rika källor för egentillverkade peptidantibiotika som åstadkommer ett extraordinärt infektionsmotstånd i dessa vävnader. Allmänt beskrivna som defensiner, har dessa peptider som gemensamt att vara både katjoniska och amfifila samtidigt, med detergent-liknande verkan via direkta biofysiska stömingar av bakteriella cellmembran.

Följaktligen är verkningsmekanismen bakteriedödande snarare än bakteriostatisk, till skillnad från de flesta befintliga antibiotika med ursprung från svampar, vilka riktar sin verkan mot bakteriemas intracellulära biokemiska vägar. Direkt upplösning av bakteiiecellmembran minimerar risken att resistenta bakterier uppstår. Därför efterliknar defensiner och histoner det tidiga medfödda immunitetsvaret som skyddrar individen före ett sekundärt antikroppsbaserat immunförsvar som utvecklas dagar eller veckor efier primärinfektion. En sådan första försvarslinje är det enda immunsystemet för hos många arter, inklusive insekter och groddjur, och anmärkningsvärt väl bevarat under evolutionen. I Växtriket motsvaras polypeptiddefensiner av thioniner, som i huvudsak är anti-svampmedel. Samma försvarsprincip förefaller att upprepas i alla flertalet organismer, även gällande bakteriema själva, där katjoniska peptider förekommer som konkurrensbegränsande faktorer för näring och överlevnad (bacteriociner). Alla andra antibakteriella peptider som beskrivits hittills är inducerbara och transkriptionellt reglerade.

Lärdomar från naturens eget försvar mot bakterier, har medfört att katjoniska polypeptider nu övervägs som nya klasser av antibiotika och antivirala medel, förutsatt att sådana skulle kunna göras tillgängliga i kommersiella kvantiteter. Detta har hittills inte kunnat realiserats med något biologiskt material som råvara på grund av för låga halter, inte heller med altemativet rekombinant genteknik på grund av egentoxicitet mot producerande mikroorganism under jäsning. Med tanke på att histoner är strukturellt nästan identiska mellan artema, inklusive alla levande växter, föreligger en extraordinär möjlighet genom direkt extraktion och användning av antiinfektiösa histoner från Växtriket, enligt EP 1420646. Djur- och växthistoner är helt utbytbara mot varandra i nukleosomen (Liberati-Langenbuch J. et al. BBRC 94, 1l6 l -l 168, 1980), och deras respektive antimikrobiella aktivitet är likaledes oskiljbar.

EP 1420646, utfärdat till Rothman, beskriver att växthistoner som i stor utsträckning syntetiseras under celldelning, är starka bredspektrum och defensin-mimetiska antibiotika vars biologiska aktivitet är jäniförbara med tetracykliner. Histonema är ospecifika, precis som alla andra tidigare beskrivna bacteriociner, defensiner eller thioniner. Dessutom är växthistoner effektiva mot både gram (+) positiva och gram (-) negativa bakterier, en ovanlig egenskap bland peptidantibiotika. Växthistoner kan således utföra flera uppgifter, förutom att vara DNArs förpackningsmaterial. Dissocierat växtkromatin blir ett antibiotikum eftersom extraherade eller fria histoner kan ersätta eller komplettera endogena histoner eller ex vivo i andra sammanhang. Konsekvensen av EPl420646 är att flera av våra vanligaste ätliga varor kan vara råvarakälla till peptidantibiotika, bekämpningsmedel, konserveringsmedel i mat eller som neutraceuticals. Ett särskilt fórdelaktig källa för storskalig produktion av histoner är spannmål som utgångsmaterial på grund av deras relativt stora genom-storlekar, många mer än 3,000 Mb/ IC, motsvarande en avkastning av 500 g histoner från en hektar. Men viss komplexitet, instabilitet under processen samt närvaro av stärkelse gör separation och isolering av nukleoproteiner till en komplicerad och ekonomiskt krävande process. 535 754 5 Moderna protokoll för histonutvinning är baserade på löslighet av histoner i syror, antingen i utspädd saltsyra eller 0,1 - 0,2M svavelsyra som dissocierar nukleinsyror från histoner men fäller flesta andra nukleära proteiner och nukleinsyror. Alternativt dissocierar hög salthalt vid extraktion med 2M - 4M natriurnklorid också kromatin vid bibehållet neutralt pH. Den viktigaste nackdelen med saltextraktion är att cellulära enzym och proteaser kan vara aktiva under längre tid än med syraextraktionmetoden. Det är därför viktigt med proteashämmare ingår reningen. Enligt föreliggande uppfinning erhålles en god proteaskontroll genom närvaro av natriumbisulfit samt värme, >55°C under extraktionen.

Standardiserade histonutvinningsprotokoll låter sig inte lätt översättas till växter på grund av naturlig stärkelse som orsakar klibbighet och olöslighetproblem. Dessutom innehåller växthistonpreparationer olika polyfenoler som grumlar eller faller ut separerade proteiner.

Under arbete med sådana extraktioner, noterades det att de flesta preparationer skummade spontant utan särskild agitation, och att detta skum lätt adhererade till glas och plastytor, vanligtvis ett oönskad beteende i proteinkemi. Överraskningsvis konstaterades det att själva skummet i sig egentligen utgör den eftersträvade nukleoproteinblandningen med högt histoninnehåll, under det att DNA, polyfenoler och stärkelse förblir i den ursprungliga lösningen. Anledningen till detta är att katjoniska histonmolekyler beter sig som naturliga detergenter, ett fenomen som tilltar under reningsförloppet på grund av ökande denaturering med åtföljande hydrofobicitet.

Resultatet av denna oväntade iakttagelse är en mycket effektiv process för att isolera växtnukleoproteiner under samtidig lösning av stärkelseproblemet.

Uppfinningen medger en automatisk industriell utvinningsprocess som möjliggör en synnerligen enkel och snabb isolering av växtnukleoprotein till låg kostnad.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning möjliggör en ett-steg nukleoproteinrening från lösningar med låg proteinhalt utan ytterligare tillsatser, vilket uppnås genom att helt enkelt försätta ett syra- eller saltbehandlat växtextrakt under skumbildning med luft, kväve eller vattenånga, varvid skumfraktionen tillvaratages som den slutliga produkten. Denna är samtidigt utan DNA- och stärkelsekontamination, tillika avsaltad och koncentrerad, allt i samma fång, vilket antyder möjligheten till utvidgad användning av ett stort antal växtlivsmiedel, djurfoder, vegetabiliska oljeväxtrester , biprodukter från bränsle- eller dryckes- etanolprocesser som utgångsmaterial för nukleoproteinproduktion i stor skala.

Växtriukleoproteinskum kan lätt framställas från utspädda biomassor inklusive sådana vars arvsmassa har lägre c-värden, med proportionellt följande lägre histoninnehåll, mindre än 3,000 Mbp/ IC (haploid storlek av genom), vilket möjliggör en ekonomisk genomförbar extraktion av de fyra största grödoma (konventionella eller genetiskt modifierade organismer), raps (1,l00 Mbp), sojabönor (1,l00 Mbp), majs (2,500 Mbp), bomullsfrö (2,800 Mbp). Även mindre genom från tomat (l,000 Mbp), äpple (750 Mbp), vinrankor (500 Mbp), vanliga rester från juice- och vinindustrier, blir realistiska mål för utvinning av antiinfektiösa nukleoproteinisolat enligt föreliggande uppfinning, som alltså kompenserar för låga C-värden.

Historiskt har olika flotationseparationsmetoder används inom avloppsrening och mineralindustri bearbetning. Skumfraktionering som en kemisk reningsmetod rapporterades första gången av Sebba (J. Colloid interface Sci., 35 (4), 643, 1971) som 10-100 um mikrobubblor eller kolloidala gasaphroner skapade under intensiv omröming av en utspädd tensid i en proteinlösning. Proteiner bindes till att bubbel gas/vätska gränssnittet genom hydrofobicitet och elektrostatik under koncentration i skunimet. Lalchew et al. 535 754 ff (Biotechnology and Bioengineering, 24, 2253-2262, 1982) utförde skumseparation av DNA och proteiner från laboratorieblandningar av kalvbrässkromatin i saltlösningar. I ett senare skede, användes skumfraktionering som proteinrening av Jauregi et al. (Chemical Engineering Journal 65 (1), l-11,l997). US Patent nr 3.969.336, utfärdat till Criswell, beskriver skumfraktionering av vassleproteiner.

En särskilt fördelaktig utföringsforrn av denna uppfinning är kontinuerlig tillförsel av tryckluft som matas till ett växtextrakt innehållande dissocierat kromatin. Alternativt kan en grovrening av växthistoner åstadkommas genom att helt enkelt behandla valfri biomassa med utspädd syra under proteasskydd med natríumbisulfit utan Föregående preparation av cellkärnor eller kromatin, följt av blåsning med gas eller vattenånga vid pH > 5,8 i en apparatur som annars förekommer vid kontinuerlig flotation i vattenreningsverk.

Enligt föreliggande uppfinning, behöver processen inget ytterligare tvättmedel för skumbildning eftersom histoner har karaktären av självskummande detergent, i motsats till andra kända gasaphron metoder, som är beroende av extra tvättmedel för skumbildning.

Denaturerade och termoresistenta växthistoner enligt uppfinningen skummar alltmer under isolering utan att påverka deras antiinfektiva egenskaper.

En mer omfattande förståelse av uppfinningen kan erhållas genom att betrakta följande exempel. Det bör dock förstås att dessa exempel inte avses att vara ett alltför begränsande av uppfinningen på något sätt.

Exempel 1 100 g vetegroddar (Kungsömen, Sverige) homogeniserades under 10 min med full hastighet med hjälp av en Braun hushållsmixer i 400 ml kranvatten innehållande 0,5% (w/v) Triton X- 100. Ytterligare 100 ml vattenledningsvatten tillsattes under omrörning i 10 min. Överblivna cellrester avlägsnades med centrifugering vid lågt varvtal, 4,000 x g under 5 minuter.

Supematanten fälldes med avseende på kromatin genom droppvis tillsats av 3M ammoniumsulfat till en slutlig koncentration av 0,05 M. Kromatinet pelleterades genom centrifugering vid 4,000x g i 10 min. Supematanten dekanterades bort och kvarvarande pellet suspenderades i 100 ml 0,1 x natriumcitrat buffert innehållande 5 mM natríumbisulfit. En sådan 100 ml batch med grovrenat växtkromatin dissocierades till beståndsdelama nukleinsyra respektive kromosomala proteiner genom tillsats av 25 ml 0,5M svavelsyra till en slutlig koncentration av 0,1M svavelsyra, före omrörning under 6 timmar i kyla. Det sålunda dissocierade växtkromatinmaterialet är emellertid fortfarande en komplex blandning av DNA-molekyler, olika histoner och icke-histoner, dessvärre förorenade med stärkelse vilket framgår av en stark blå reaktion med jod och som resulterar i grumlighet och och andra komponenter som motstår centrifugering. Eñer justering av pH till 7,0 med NaOH, utfördes skurnfraktionering i en 250 ml graderat mätglas försedd med en airstone (Aqua FizzzzTM, USA) matad med fuktad tryckluft , vid 0,90 cm/sek ytgashastighet, under 15 minuter vid rumstemperatur. De stigande bubbloma på toppen av anläggningen tillvaratogs i 0,1% ättiksyra och frystorkades. F rystorkade preparat är lättlösliga i destillerat vatten eller saltlösning. Ingen stärkelse upptäcktes med jodprov. En intensiv reaktion med Fast green kunde motverkas av heparin, vilket tyder på förekomst av basiska katjoniska proteiner.

Bubbelfraktíonen uppvisar fallningsbildande egenskaper med 0,1% soj alecitín vid pH 7,5.

Sådana olösliga salt-liknande komplex med fosfolipider löses av dimetyleter, 95% etanol vid 60°C eller 2-pentanon. Testema indikerar således förekomst av histoner i den nukleoproteinmix som bildar skum. 535 754 5 Skumfraktionerade katjoniska växt nukleoproteinfraktioner enligt ovan har framgångsrikt testats med avseende på antiinfektiösa egenskaper med Hygicult® (Orion Diagnostica Oy, Finland) system for hygienkontroll i köksmiljöer, varvid biologisk aktivitet har konstaterats mot både grarnpositiva och gramnegativa bakterier.

Exempel 2 Ett enklare nukleoproteinpreparat framställs på ett mycket enkelt sätt genom att direkt behandla utgångsmaterialet av någon biomassa med utspädd syra utan den inledande kromatinreningen enligt Exempel 1. Således inkuberades 100 g färska vetegroddar över natten under ornröming i rumstemperatur med 500 ml 0,4M svavelsyra, därefter justeras med NaOH till pH 6,0 innan skumfraktionering som i exempel 1. Skummet uppvisar tydliga antiinfektiösa egenskaper i Hygicult®-analyser.

Exempel 3 Konsumentvetegroddar från en hälsokostaffár (100 g) suspenderades i 400 ml 4M NaCl i under natten i kylskåp och homogeniserades därefter under 10 minuter i en Braun mixer. Den höga saltkoncentrationen skiljer kromatin i sina beståndsdelar, DNA och proteiner.

Homogenatet späddes stegvis med destillerat vatten till 0,3 M NaCl, filtrerades genom en 0,3 mm nylon sil, och ñltratet (vid O,3M NaCl) har underkastades ett skumfraktioneringsförfarande vid pH 6,0 under liknande parametrar som i exempel l. Den tillvaratagna skumfraktion är antimikrobiell.

Exempel 4 ExPro rapsmjöl (200 g, AarhusKarlshamn, Sverige), en biprodukt efter utvinning av rapsolja, var homogeniserades under 4 timmar i 2,000 ml 4M NaCl varefter detsamma spädes ytterligare till 0,3 M innan växtmaterialet försattes med vattenånga. Detta utfördes genom att rikta en 19 bar ångstråle från en espresso maskin (Jura Impressa 501, Schweiz) mot homogenat-vätskeytan tills skummning. Översvämmande skum uppsamlades i 0,l% ättiksyra före frysning vid -20°C. Produkten är en lättlöslig växthistonblandning, utan kontamination av DNA eller stärkelse, vilken har en stark antimikrobiell aktivitet i Hygicult® testsystemet.

Exempel 5 Sjuttio liter drank (DDGS), en biprodukt (vattenhalt 90 %, 4 l 6 g protein/kg efter torkning, pH 3,9) efter etanoljäsning (Nöbbelöv, Sverige), försattes med fast natriumklorid till 0,3M och ångades vid cirka pH 6,0 under 30 minuter, varvid det genererades 10 liter skum med en proteinhalt av 2 mg protein/ ml efter kollaps av bubblorna. Den biologiska aktiviteten avseende avseende antimikrobiell verkan av närvarande växtnukleoproteiner är intakt efter detta stränga förfarande.

Claims (10)

1. 535 754 Patentkrav: 1. Förfarande för samtidig borttagning av kolhydrater, DNA och polyfenoler från biomassor oavsett genomets storlek i cellkämor, likväl under samtidig isolering, koncentrering samt avsaltning av katjoniska nukleoproteiner med antiinfektiva egenskaper från växter, bestående av stegen: vattenlöslíga växtkromatiner bereds genom konventionella reningsmetoder som fállning med arnrnoniumsulfat; nämnda växtkromatiner extraheras med avseende på nukleoprotein genom sur extraktion eller med salt i hög jonstyrka; underkasta nämnda dissocierade växtextrakt ett skumfraktioneringsförfarande utan tillsats av ytaktiva medel; uppfångning av gasbubblor av luft, kväve eller het ånga som fås passera nämnda kromatinextrakt under skumbildning vari katjoniska nukleoproteiner ansamlas som stigande skum på toppen av reaktionskärlet, varvid DNA och stärkelse kvarlärnnas i den ursprungliga lösningen; sagda skum uppsamlas och får möjlighet att kollapsa till ett koncentrat av katjoniska nukleoproteiner; Förfarandet enligt krav 1, där biomassan är vald från ett grönfoder som alfalfa, kom, käringtand, kålsorter, kassava, klöver, bomullsfrö, olika gräs inkluderande ris, jatropha, majs, hirs, havre, palmkämoljapresskaka, raps, sorghum, sojabönor, solrosor, vete och dess biprodukter som erhålls vid malning till mjöl, andra vegetabiliska oljepressbiprodukter , frön, kärnor och groddar antingen hela eller beredda genom krossning eller malning, grodda kärnor, baljväxter, alger, marina makroal ger, mikroalger i dammar eller bioreaktorer, jäst jämte kombinationer eller blandningar av dessa. Förfarande enligt krav 1, vari utgångsmaterialet är majs- eller sparmmålbiprodukter efter framställning av bioetanol. Förfarande enligt krav 1 van' nämnda växtkromatin innehåller desoxyribonukleinsyra (DNA) med ett C-värde som är mindre än 3,000 megabaspar (Mbp). Förfarande enligt krav l, vari nämnda skum genereras av en kontinuerligt skumbildande vattenångstråle placerad vid ytan av kromatinlösningen under bibehållande av temperaturen på vätskan i systemet i intervallet +55 ° C till ca +70°C, under bildning av ett växtnukleoproteinkoncentrat. Ett förfarande får separation av katj oniska nukleoproteiner genom en enkel skumfraktionering av biomassa oavsett genom-storlek, efter extraktion av hela växtrnaterialet med utspädd mineralsyra utan initial kromatinisolering, bestående av stegen: ett vattenhomogenat av biomassa beredes som en slurry; 10. 535 754 ä' sådan biomassa-slurry behandlas med utspädd syra som löser ut katjoniska nukleoproteiner; det sura extraktets pH-värde höjs till pH 5,8 - pH 10,0; nämnda extrakt behandlas i en skumfraktioneringsanordning som arbetar över pH 6,0; nämnda skumfraktioneringsanordning matas med gasbubblor eller vattenånga som ledes genom lösningen, varvid katjoniska nukleoproteiner företrädesvis adsorberas till gas- vätske-gränssnittet För bubblor under bildandet av ett skum på toppen av reaktionskärlet; skummet kollapsar spontant till en lösning, innehållande katjoniska nukleoproteiner. Förfarande enligt krav 6 vari vald biomassa kommer från grönfoder som alfalfa, korn, käringtand, kålsorter, kassava, klöver, bomullsfrö, gräs även innefattande ris, jatropha, majs, hirs, havre, palmkärnoljepresskaka, raps, sorghum, soj abönor, solrosor, vete och dess biprodukter som erhålls vid malning till mjöl, vegetabiliska oljepresskakor, frön, kärnor och groddar antingen hela eller beredda genom krossning eller malning, grodda kärnor, baljväxter, alger, marina makroalger , mikroalger i dammar eller bioreaktorer, jäst och kombinationer eller blandningar av dessa. Förfarande enligt krav 6, vari utgångsmaterialet är majs- eller spannmålbiprodukter efier framställning av bioetanol. Förfarande enligt krav 6, vari biomassans utgångsmaterial innehåller desoxyribonukleinsyra (DNA) med ett C-värde mindre än 3,000 megabaspar (Mpb). Förfarande enligt krav 6, vari nämnda skum genereras av en kontinuerligt skumbildande vattenångstråle placerad vid ytan av kromatinlösningen under bibehållande av temperaturen i systemet i intervallet +55°C till ca. +70°C, under bildning av ett växtnukleoproteinkoncentrat.