SU843915A1 - Способ получени суммарного гистонаиз жиВОТНОгО СыРь - Google Patents

Description

3 ч. Выход хроматина составл ет 70% (по дезоксирибонуклеиновой кислоте). Осадок хроматина суспендируют в 0,01 М трис-буфере , рН 3, и диализируют против того же буфера в течение 18 ч. После диализа осадох хроматина раствор ют в 10 объемах 0,015 М NaCl + 0,001 М натрий линоннокнслый . Нерастворившиес  частицы удал ют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. К полученному раствору добавл ют 1/4 объема 1 н. H2SO4, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют 20 мин при 1200 об/мин. Экстракт сохран ют . Осадок после центрифугировани  повторно обрабатывают уже 0,4 н. H2SO4 (1/4 объема) и экстракты объедин ют. К объединенным экстрактам добавл ют 4 объема охлажденного абсолютного этанола . Смесь выдерживают 24 ч при -10°С. Выпадает осадок суммарного гистона. Осадок собирают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в абсолютном этаноле и центрифугируют при 10000 об/мин. Промывание осадка этанолом повтор ют еще два раза, после чего его высушивают. Препарат суммарного гистона, полученный этпм способом, характеризуетс  следуюш,имИ показател ми: содержание белка 90%, примеси негнстоновых белков 10%, содержание фракции аргининбогатых до 30-50%, бактерицидна  активность гистонов не исследовалось.

Указанный способ имеет следующие недостатки:

Конечный продукт имеет недостаточную чистоту - до 10% негистоиовых примесей; в нем отсутствуют определенные . фракции гистонов (аргининбогатые) из-за их агрегации с примесными негистоновыми белками, неполноты осаждени  из раствора прн использовании этапола.

Осаждение суммарного гистона нз кислотного экстракта этанолом не обеспечивает выделение фракций аргипинбогатых гистонов , IB состав которых входит значительное количество непол рных аминокислот, в силу чего они наход тс  в растворимом состо нии в этаноле.

Бактерицидна  активность в суммарном препарате сниженна  за счет отсутстви  фракций аргининбОГатых гистонов.

Целью изобретени   вл етс  повышение чистоты, выхода и сохранение бактерицидной активности конечного продукта.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что в известном способе получени  суммарного гистона из животного сырь , включающем гомогенизацию в буферном растворе при рН 8, осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, в раствор гомогенизации ввод т лимоннокислый натрий и бисульфит натри , экстракцию суммарного гистона провод т непосредственно из осадка хроматина, а осаждение осуществл ют ацетоном в течение 0,5-1,0 часа при

температуре -f4°С, причем объемное соотношение экстракта и ацетона равно 1 :7-10.

Изобретение обеспечивает содержание белка не менее 98%, содержание примеси негистоновых белков 1-2%, содержание фракций аргининбогатых гистонов 80- 95%.

Бактерицидна  активность сохран етс  1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Обеспечение чистоты препарата суммарного гистона, т. е. исключение содержани  в нем негистоновых белков, достигаетс  экстракцией суммарного гистона непосредственно из осадка хроматина.

Хроматин  дер клеток животных представл ет дезоксирибонуклеопротендный комплекс (ДНП) с рибонуклеиновой кислотой , с двум  классамн белков: белки основного характера - гистоны, на долю носледних приходитс  70-80% от общего количества белков хроматина и кислые белки -  дерные ферменты.

Известно, что прн растворении хроматина в растворах низкой ионной силы нарушаетс  пространственна  структура ДНП и при этом гистоны могут формировать комплексы с негистоновыми белками. При последующем извлечении гистонов из раствора хроматина негистоновые белки могут соэкстрагнроватьс  с гистонами и тем самым загр зн ть конечный продукт.

Прием экстракции суммарного гистона непосредственно из осадка хро-матина обеспечивает полную и избирательную экстракцию гистонов и позвол ет избежать загр знени  препарата негистоновыми белками, так как последние остаютс  св занными с ДНК.

Дл  обеспечени  максимального выхода суммарного гистона, содержащего все п ть фракций гистона, в предлагаемом способе в раствор при гомогенизации ткани ввод т натрий бисульфит и натрий лимоннокислый дл  ингибировани  протеиназ, что исключает протеолиз фракций гистонов HI н Н4.

Выход полноценного конечного продукта , содержащего все п ть фракций гистонов (HI, Н2А, Н2В, НЗ, Н4) в эквимол рном соотношении (20% ло весу) достигаетс  использованием высоких объемов ацетона (при объемном соотношении экстракта и ацетона 1:7-10), а также проведением процесса осаждени  при -Ь4°С в теченне 0,5-1 ч, так как в данных услови х все фракции гистонов находитс  в пативной аформе в нерастворимом состо нии.

Получение суммарного препарата, содерлсащего п ть фракций гистона, обеспечивает его высокую бактерицидную активность в отношении Е. соИ. Пололсительный эффект наблюдаетс  при добавлении 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Таким образом, предлагаемый способ заключаетс  в следующем.

Свежезамороженный тимус тел т измельчают на м сорубке и по порци м гомогенизируют с буферным раствором рН 8, содержащим 0,14 М натри  хлористого, 0,05 М натри  бисульфата и 0,01 М натри  лимоннокислого.

Гомогенат фильтруют через два сло  марли, через четыре сло  марли, потом через восемь слоев марли. Фильтрат центрифугируют . Осадок собирают   промывают буферным раствором рН 8. Осадок гомогенизируют с 0,4 н. серной кислотой и выдерживают при +4°С 10-12ч.

Экстракт отдел ют центрифугированием и фильтруют.

К экстракту прибавл ют охлажденный, подкисленный ацетон в объемных соотношении экстракта и ацетона 1 :7-10 и выдерживают 0,5-1 ч при +4°С.

Осадок суммарного гистона собирают на фильтре, промывают ацетоном и высушивают .

Содержание белка не менее 987о. Чистота по электрофрезу наПАГЭ: содержит все п ть фракций; нримеси негистоновых белков до 1-2%.

Бактерицидна  активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии .

Пример 1. 2 кг свежезамороженного тимуса тел т измельчают на м сорубке и измельченную массу по порци м гомогенизируют с 10 л раствора, содержащего 0,14 М натри  хлористого, 0,05 М натри  бисульфита и 0,01 М натри  лимоннокислого, рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин при О-4°С.

Осадок собирают и заливают 4 л раствора , содержащего 0,14 М натри  хлористого , 0,05 М натри  бисульфита и 0,01 М. натри  лимоннокислого, рН 8.

Смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Осадок собирают и измер ют его объем. Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. раствор серной кислоты и по порци м гомогенизируют .

Гомогенизированную смесь оставл ют экстрагироватьс  при О-4°С в течении 10-12 ч.

После экстрагировани  смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фильтрату при перемешивании приливают 7 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мл конц. №504 иа 2 л ацетона). Суспензию выдерживают при +4°С 1 ч.

Осадок гистона суммарного оседает на

ДНО сосуда. Надосадочный слой сливают. Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтру  суспензию через стеклоткань. Отфильтрованный осадок высушивают на воздухе до исчезновени  запаха ацетона, потом сушат в вакуумэксикаторе над. едким кали.

Выход: 20 г гистона суммарного; содержание белка 100%; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содерлшт все п ть фракций примеси негистоновых белков - следы.

Бактерицидна  активность - 1 мл суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии .

Пример 2. 1,8 кг свежезаморолсенного тимуса тел т измельчают на м сорубке и измельченную массу по порци м гомогенизируют с 9 л раствора, содержащего 0,14 М натри  хлористого, 0,05 М натри  бисульфита , 0,01 М натри  лимоннокислого, рЫ 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, темпесатура О-4°С.

Осадок собирают и заливают 3,5 л раствора , содержащего 0,14 М натри  хлористого , 0,05 М натри  бисульфита, 0,01 М натри  лимоннокислого рН 8.

Смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Осадок собирают и измер ют его объем. Осадок суспендируют в 3,5 л 0,4 н. раствора серной кислоты н по порци м гомогенизируют .

Гомогенизированную смесь оставл ют экстрагироватьс  при О-4°С, в течение 10-12 ч. После экстрагировани  смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фильтрату при перемешивании приливают 10 объемов охлажденного, подкисленного ацетона (1 мл конц. H2SO4 на 2 л ацетона). Суспензию выдерживают при -f 4°С 0,5 ч.

Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают. Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтру  суспензию через стеклоткань.

Отфильтрованный осадок высушивают на воздухе до исчезновени  запаха ацетона , йотом cyniaT в вакуум-эксикаторе над едким кали.

Вывод: 20 г гистона суммарного; содержание белка 99,5%; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содержит все п ть фракций, примеси негистоновых белков - следы.

Бактерицидна  активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии .

Пример 3. 2 кг свежезамороженного тимуса тел т измельчают на м сорубке и измельченную массу по порци м гомогенизируют с 10 л раствора, содержащего 0,14 М натри  хлористого, 0,05 М натри  бисульфита и 0,01 М натри  лимоннокислого , рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4Х.

Осадок собирают и заливают 4 л раствора , содержащего 0,14 М натри  хлористого , 0,05 М натри  бисульфита, 0,01 М натри  лимоннокислого, рН 8.

Смесь центрифугируют .при 1500 об/мин, в течение 15 мин, температура .

Осадок собирают и измер ют его объем. Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. серной кислоты и по порци м гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставл ют экстрагироватьс  при О-4°С в течение 10-- 12 ч. После экстрагировани  смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С. Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты И марли.

К фильтрату при перемешивании приливают 9 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мг конц. H2SO4 на 2 л ацетона ).

Суспензию выдерживают при температуре 4°С в течение 45 мин. i Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают. Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтру  суспензию через стеклоткань.

Отфильтрованный осадок высушиваюг на воздухе до исчезновени  запаха ацетона, потом сушат в вакуум-сушильном эксикаторе «ад едким кали.

Выход 20 г гистона суммарного; содержание белка 98%; чистота по электрофорезу на ПАГЭ: содержит все п ть фракций; примеси негистоновых белков 0,5%.

Бактерицидна  активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии .

Технико-экономический эффект изобретени  заключаетс  в выделении суммарного гистона высокого качества: не содержащего негистоновых примесей, обладающего хорошей растворимостью, содержащего все п ть фракций и обладающего бактерицидной активностью.

Таким образом, получение высококачественного препарата суммарного гистона обеспечит его применение в научных исследовани х в области молекул рной биологии (изучение структуры хроматинов в модельных опытах), в препаративной биохимии (получение отдельных фракций), как субстрата при ферментативных реакци х (опыты по ацетилированию и фосфорилиронанию гистонов), при исследовани х антибактериальных и антивирусных свойств и з практической медицине (при лечении р да кожных заболеваний). Способ легко осуществим в промышленных услови х и по сравнению с известным способом дает экономию 3000 руб. на 1 кг продукта и обеспечивает экономию сырь , материалов и рабочего времени.

Claims (4)

1.G. Molec. Biology, v. 1, p. 1-20, 1959.

2.Methods in Cell. Biology, v. 17, ch. 3. p. 27-50, 1978.

3.Methods in Enzymology, v. 12. part. В., 60 sect. 5, p. 65-84, 1968.

4.Methods in Enzymology, v. 12, part. В., sect. 1, p. 3-65, 1968 (прототип).