вого фракционировани вли ет на качество получаемого продукта, так как удельна активность L-аспарагиназы, полученной на стаСпособ очистки L-аспарагиназы в единой технологической схеме
дии спиртового осаждени при 20-30°С, в 5-10 раз больше той, котора получаетс на этой стадии при .
Таблица
Пример I. Культуру Е. соИ В 318 выращивают в ферментере емкостью 250 л на среде с 5% кукурузного экстракта с добавлением солей в течение 10 час с аэрацией и неремешиванием при рН 7,0-7,2, после биомассу отдел ют центрифугированием, промывают водой , обрабатывают ацетоном лри комнатной температуре и высушивают, получают сухой ацетоновый порошок Е. соИ, содержащий L-аспарагиназу, 50 г ацетонового порошка Е. соИ размешивают в 1 л дистиллированной воды и оставл ют сто ть при 37°С в течение 2 час. Далее к экстракту при комнатной температуре добавл ют 1,0 М. раствор уксусной кислоты до рН 4,5, скоагулированный осадок отдел ют центрифугированием (15 мин при 6000 об/мин) и отбрасывают. К супернатанту, вл ющемус подкисленным водным экстрактом L-аспарагиназы, добавл ют сульфат аммони до 50% от насыщени (275 г соли на 950 мл экстракта). Раствор помещают в вод ную баню на 30 мин при 55°С, охлаждают до комнагной температуры и скоагулированный осадок денатурированных белков отдел ют фильтрованием через складчатый бумажный фильтр (или центрифугированием 15 мин при 6000 об/мин). К суперна танту добавл ют сульфат аммони до 90% насыщени (400 г соли на 1 л жидкости) и оставл ют сто ть в холодильнике на ночь, после чего центрифугируют. Осадок, содержащий L-аспарагиназу, вместе с остатками раствора сульфата аммони раствор ют в 60 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего 0,01 М L-аспарагина. К раствору добавл ют лри комнатной температуре два объема спирта (концентраци , не ниже 98%), осадок отдел ют центрифугированием и раствор ют при комнатной температуре в 16 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего 0,01 М L-аспарагина. Нерастворивщуюс часть балластных белков отдел ют центрифугированием. К супернатанту повторно добавл ют два объема спирта при комнатной температуре, осадок собирают .центрифугированием и раствор ют в 12 мл трис-буфера, рН 8,5, содержащего L-аспарагин при комнатной температуре. Нерастворивщуюс часть балластных белков повторно отдел ют центрифугированием. Раствор с L-аопарагиназой пролускают через колонку с сефадексом G-25 (2,2X38 см), собирают белковую фракцию и лиофилизируют. Полученна L-аспарагиназа представл ет собой белый порошок, хорошо растворимый в буферах, рН около 8. Удельна активность 130-150 ме/мг белка, обш.ий выход в расчете на биомассу около 40%. Пример 2. Препарат, полученный по примеру 1, до обессоливани и лиофилизации осаждают при комнатной температуре одним объемом спирта и став т на несколько дней в морозильник. При этом образуютс кристаллы L-аспарагиназы и сульфата аммони . Кристаллы отдел ют центрифугированием и далее обрабатывают как в примере 1 после спиртового осаждени . Удельна активность 180 ме/мг белка, выход . Чистоту полученного таким образом препарата аспарагиназы контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле, получают 1 полосу, что указывает на гомогенность белка. Активность определ ют инкубацией фермента с L-аспарагином в трис-буфере, рН 8,5 по освобождаюшемус аммиаку методом несслеризации . Дл освобождени фермента от стабилизаторов (сульфата аммони и L-acnaрагина ) раствор перед определением активности обессоливают на сефадексе G-25. Активность выражают в ме/мг белка (1 ме - соответствует 1 микромолю продукта, образовавшегос при инкубации в течение 1 мин при 37°С). Белок определ ют по Лоури, причем перед определением раствор очиш,ают полностью от сульфата аммони . Предмет изобретени 1.Способ очистки L-аспарагиназы по авт. св. № 436085, отличающийс тем, что, с целью получени более очиш,енной L-аспарагиназы , после фракционного осаждени L-аспарагиназы сульфатом аммони , полученный осадок раствор ют в буферном растворе в присутствии стабилизатора и осуществл ют многократное фракционирование органическим растворителем, преимущественно этанолом . 2.Способ по п. 1, отличающийс тем, что фракционирование органическим растворителем осущетвл ют при 20-30°С. 3.Способ по пп. 1-2, отличающийс тем, что в качестве буферного раствора используют трис-буфер при рП 8,5. 4.Способ по пп. 1-3, отличающийс тем, что при растворении осадка в качестве стабилизатора используют 0,01 М раствор L-аспарагина. 5.Способ по пп. 1-4, отличающийс тем, что после фракционировани органическим растворителем осадок раствор ют и пропускают через хроматографическую колонку , например сефадекс G - 25.