SU1250301A1

SU1250301A1 - Способ получени мономерного альбумина плазмы крови

Info

Publication number: SU1250301A1
Application number: SU843786525A
Authority: SU
Inventors: Александр Васильевич Ткаченко
Original assignee: Институт биологической физики
Priority date: 1984-09-03
Filing date: 1984-09-03
Publication date: 1986-08-15

Description

Изобретение относитс к экспери- ментальной биохимии и молекул рной биологии, может быть использовано дл химической неферментативной очистки препаратов альбумина плазмы крови в биотехнологии., экспериментальной и клинической медицине и ветеринарии при получении и применении белковьгх плазмозаменителей.

Целью изобретени вл етс повышение выхода целевого продукта за счет дополнительного введени в расвор , которым обрабатывают альбумин глютатиона и этилендиаминтетраацета та.

Способ заключаетс в растворении альбумина в смеси, содержащей цисте ин в концентрации (1-3) 10 М, восстановленный глютатион в концентрации (2-6)-10 М и ЭДТА в концентрации при этом, мол рное , соотношение альбумин: цистеин составл ет 1:500-1:200, полученный раствор подкисл ют до рН 2,0-2,5 и инкубируют в течение 15-20 мин при после чего довод т рН среды до 7,4-8,0 и инкубируют сначала при 36-38 С в течение 2-3 ч, а затем при 50-52 с в течение 10-15 мин.

П р и м е -р 1. 4 мг содержащего примесь жирных кислот человеческого альбумина плазмы крови (Reanal, ВНР растворили в 1 мл 0,03 М цистеина, содержащего 0,06 М восстановленного глютатиона и ЭДТА.Мол рное соотношение белка и цистеина составл . ет 1:500. С помощью 0,1 М НС1 полученный раствор подкислили до рН 2,0 и инкубировали при 4°С в течени 15 .мин. Затем в раствор добавл ли кристаллический трис-буфер до 7,4. Раствор инкубировали при 36°С в течние 2ч. Затем раствор вьщерживали при 50 С в течение 10 мин. После охлаждени инкубационной смеси до комнатной температуры ее разбавл ли в 2 раза трис-глициновым буфером (рН 8,3), используемым дл электро- дов при электрофорезе. Вертикальный электрофорез проводили в 10%-ном полиакриламидном геле, использу дл этого микроэлектрофоретическую камеру. Фиксацию и окраску фореграм производили спирт - ацетатным раствором кУмасси рко-синего G -250 на 7%-ном растворе уксусной кислоты

ВНИИПИ Заказ 4356/7

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

5

0

5

0

5

0

5

Количественную оценку результатов фореза производили с помощью микро- денситометра МК ЗС. Относительное содержание мономерного альбумина составило по результатам микроден- ситометрии 88+2,2%.

Пример2. 4мг лишенного примеси жирных кислот бычьего альбумина плазмы крови (Pentex, США) растворили в 1 мл 0,02 М цистеина, содержащего 0,04 М восстановленнбго глютатиона и ЭДТА. Мол рное соотношение белка и .цистеина 1:300, С помощью 0,1 М НС1 полученный раст-

5 вор подкислили до рН 2,3.Раствор инкубировали при в течение 17 мин. Затем в раствор добавили кристаллический трис-буфер до рН 7,6.Раств ор инкубировали при 37°С в течение 2,5 ч,

0 Затем раствор вьщерживали при в течение 12 мин. После охлаждени инкубированной смеси до комнатной температуры ее разбавл ли и подвергали электрофорезу так, как указано в примере 1. Содержание мрномерного альбумина составило 97+1,8%.

ПримерЗ. 4мг лишенного примеси жирных кислот бычьего аЛьбу- мина плазмы крови (Pentex, США) растворили в 1 мл 0,01 М цистеина, содержащего 0,02 М восстановленнного глютатиона и ЭДТА, Мол рное соотношение белка и цистеина 1:200. С помощью 0,1Н НС1 полученный раствор подкислили до рН 2,5 и инкубировали при 7 С в течение 20 мин. Затем в раствор добавл ли кристаллический трис-буфер до рН 8,0.Раствор инкубировали при в течение 3,0 ч. Затем раствор вьщерживали при 52 С в течение 15 мин. После охлаждени инкубированной смеси до комнатной температуры ее разбавл ли и подвергали электрофорезу, как указано в примере 1. Содержание мономерного альбумина составило 89+ +2,0%.

Исполльзование предлагаемого способа позвол ет повысить относительное содержание мономерного альбумина в конечном белковом препарате до 90-98%, относительное содержание мономерного альбумина в конечном продукте при сохранении нативных свойств альбумина, а также сократить врем эксперимента до 2-4 ч.

Тираж 660 Подписное

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОМЕРНОГО АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ путем обработки альбумина цистеином в растворе и последующей инкубации в кис лой среде, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в раствор дополнительно вводят восстановленный глютатион в концентрации (2-6)·10~²Μ и этилендиаминтатраацетат в концентрации 10~*-10~^лМ при молярном соотношении альбумина и цистеина 1:5001:200, pH доводят до 2,0-2,5, инкубируют 15-20 мин при 4-7 С, затем pH доводят до 7,4-8,0 и последовательно инкубируют 2-3 ч при 36-38°С и 10-15 мин при 50-52°С.

SU <„,1250301

1 1250: