JP2750738B2 - 分子量マーカー - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、分子量マーカー及びそれを用いる分子量測
定法に関し、更に詳細には電気泳動法を利用した蛋白質
の分子量測定に用いる分子量マーカー及びこれを用いた
分子量測定法に関する。

〔従来の技術〕

生化学研究において、生体試料中の蛋白質の分子量を
正確に測定することは極めて重要である。現在、最も実
用的な分子量測定方法としては、分子篩効果を有するポ
リアクリルアミドゲル等を用いて、試料蛋白質と分子量
既知の蛋白質、すなわち分子量マーカーとを並べて電気
泳動し、該試料蛋白質と分子量マーカーの泳動位置を比
較することにより試料蛋白質の分子量を測定する方法が
挙げられる。

この方法に用いる分子量マーカーとしては、通常、分
子量1,000〜1,000,000の種々の天然蛋白質を原料とし、
これより分子量マーカーとして必要な純度を持つ蛋白質
を測定分子量の範囲に応じて段階的に選択、混合して調
整したもの；または天然蛋白質にグルタルアルデヒド若
しくはジエチルピロカルボナートを反応せしめて、種々
の架橋した蛋白質の重合体を合成し、これらのうち、重
合度の異なるものを適宜選択、混合、調整したもの
〔「蛋白質・酵素の基礎実験法」（南江堂）328ペー
ジ〕等が用いられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記分子量マーカーを含め蛋白質の多くは複数のサブ
ユニットにより構成され、それぞれのサブユニット同士
はジスルフィド結合により結合している。従って、還元
剤により、ジスルフィド結合を開裂しその分子量を測定
すれば、複雑な三次構造を有する蛋白質の有用なデータ
が得られる。それ故、例えば２−メルカプトエタノール
またはジチオスレイトール等の還元剤により、ジスルフ
ィド結合を開裂し後、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、
「SDS」という）の存在下ポリアクリルアミドゲルを用
いる電気泳動法により分子量を測定する方法等が広く行
なわれており、複雑な三次構造を有する蛋白質の分子量
測定に役立っている。

しかしながら、還元剤によりジスルフィド結合が開裂
して生じたチオール基（−SH基）は、徐々にオチール基
同士ランダムに再結合する。また、還元剤の量により還
元不完全となることがある。このため、還元処理後に電
気泳動を行なうと本来のバンドの他に副生バンドを生じ
たり、テーリング現象を生じたりして、分子量に応じた
移動距離に鮮明な１本のバンドができることが必要とさ
れる分子量マーカーとしては好ましくない事態となる。
また分子量マーカーは、高度に精製された蛋白質を数種
類混合して調製されるため、高価であり、上記事態は経
済的にも極めて不利である。

従って、上記欠点がなく正確に分子量測定ができる分
子量マーカーが望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

上記実情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結
果、還元処理により形成されたチオール基をアルキル化
したＳ−アルキル蛋白質を用いれば、チオール基同士の
再結合を阻止でき、電気泳動時に副生バンドやテーリン
グ現象を生じることがなく、正確な分子量測定ができる
ことを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は還元処理によって形成されたチオ
ール基を有する分子量既知の蛋白質の該チオール基がア
ルキル化されたＳ−アルキル蛋白質よりなる分子量マー
カー及びこの分子量マーカーを用いることを特徴とする
電気泳動法による蛋白質の分子量測定法を提供するもの
である。

本発明分子量マーカーとなるＳ−アルキル蛋白質は、
例えば、常法により、蛋白質のジスルフィド結合を還元
剤により開裂せしめた後、生じたチオール基をアルキル
化することにより製造することができる。

すなわち、まず常法により、精製された分子量既知の
蛋白質を緩衝液に溶解せしめ、これに還元剤を添加し加
熱反応せしめ蛋白質のジスルフィド結合を開裂させる。

原料となる蛋白質としては、分子量が既知の蛋白質で
あれば特に限定されないが、精製された天然蛋白質、特
に通常分子量マーカーとして用いられる蛋白質が好まし
い。具体例としては、サイログロブリン、α_２マクログ
ロブリンミオシンＨ鎖、RNAポリメラーゼ、γグロブリ
ン、β−ガラクチシターゼ、ホスホリラーゼｂ、血清ア
ルブミン、カタラーゼ、フマラーゼ、アルドラーゼ、卵
白アルブミン、アルコール脱水素酵素、ピルビン酸キナ
ーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、グリ
セロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、カルボニック
アンヒドラーゼ、キモトリプシノーゲン、大豆トリプシ
ンインヒビター、α−ラクトアルブミン、ミオグロビ
ン、リゾチーム、チトクロームＣ、ヘモグロビン等が挙
げられる。

ジスルフィド結合の開裂反応においては、原料蛋白質
が有するジスルフィド結合のすべてを開裂する必要はな
く、通常の分子量測定における還元条件で開裂し得るジ
スルフィド結合を開裂せしめればよい。従って、反応条
件は、通常の分子量測定時に用いる還元剤、例えば２−
メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等を用い
て、SDSを含む緩衝液中で行なうのが好ましい。

次に、これにアルキル化試薬を加え、好ましくは室温
下で数時間反応せしめ、開裂によって形成されたチオー
ル基をアルキル化する。このアルキル化反応に用いるア
ルキル化試薬としては、例えば、Ｎ−エチルマレイミ
ド、Ｎ−（４−ジメチルアミノ−3,5−ジニトロフェニ
ル）マレイミド、Ｎ−2,4−ジニトロアニリノマレイミ
ド等のマレイミド誘導体；モノヨード酢酸、モノヨード
酢酸アミド、モノブロモ酢酸、モノブロモ酢酸アミド、
α−ヨードブロピオン酸、β−プロモエチルアミン、モ
ノクロロ酢酸、クロロアセトフェノン等が挙げられ、就
中、Ｎ−エチルマレイミド、モノヨード酢酸、モノヨー
ド酢酸アミドが好ましい。

このアルキル化反応により得られた反応物を、透析し
過剰の試薬を除去し、所望により適当な賦形剤、例え
ば、庶糖及び少量のSDS等を加え、凍結乾燥すれば本発
明分子量マーカーとなるＳ−アルキル蛋白質が得られ
る。

このようにして得られたＳ−アルキル蛋白質を分子量
マーカーとして用いて、蛋白質の分子量を測定するに
は、常法に従い電気泳動を行なえばよい。すなわち、還
元剤の存在下若しくは非存在下に本発明分子量マーカー
及び試料蛋白質を緩衝液に溶解せしめ、電気泳動に付す
ることにより試料蛋白質の分子量を測定することができ
る。具体的にはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法が挙げられ、発色検出方法は特に限定されないがクマ
シーブリリアントブルー染色、銀染色等を用いる方法が
好ましい。

〔発明の効果〕

本発明分子量マーカーは、従来の分子量マーカーの持
つ欠点、すなわち、チオール基の還元不完全、チオール
基同士の再結合が起こらず、電気泳動時に本来のバンド
の他に副生バンドを生じたり、テーリング現象を生じた
りする欠点がなく、還元剤の量の多少等の測定条件にも
左右されず常に一定の移動度を有する。しかも、電気泳
動による移動距離も従来公知の分子量マーカーと同等で
ある。従って、本発明分子量マーカーを用いれば、分子
量測定が正確に行なえる。

〔実施例〕

実施例１ 次の６種の蛋白質、すなわちホスホリラーゼｂ（分子
量97,400）、牛血清アルブミン（分子量66,250）、アル
ドラーゼ（分子量40,000）、カルボニックアンヒドラー
ゼ（分子量30,000）、トリプシンインヒビター（分子量
21,500）及びリゾチーム（分子量14,400）の各蛋白質1m
gを5mlの0.125Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）に加えて
溶解し、これにSDS4％及び２−メルカプトエタノール10
％を含む0.125Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）5mlを加え
て、沸騰水浴中で５分間加熱反応せしめる。この後、70
0mgのＮ−エチルマレイミドを加え充分混和後、室温で1
0分間反応せしめアルキル化した。

反応終了後、反応液を透析チューブに入れて１％SDS
溶液１を外液として２時間透析した。

透析液を合せて40mlとし、庶糖1gを加えて400μず
つバイアル柱に分注し、凍結乾燥し、本発明分子量マー
カーを得た。

実施例２ 実施例１で使用した６種の蛋白質各1mgをそれぞれ1ml
の0.125Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）に加えて溶解
し、これにSDS4％及び２−メルカプトエタノール10％を
含む0.125Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）1mlを加えて、
沸騰水浴中で５分間加熱反応せしめる。次いで、175mg
のＮ−エチルマレイミドを加え充分混和後、室温で10分
間反応せしめ、アルキル化した。

反応終了後、反応液を透析チューブに入れて200mlの
１％SDS溶液を外液として２時間透析した。

各蛋白質について以上の操作を行なって得た６種の透
析液を合せて40mlとし、庶糖1gを加えて400μずつバ
イアル柱に分注し、凍結乾燥し、本発明分子量マーカー
を得た。

実施例３ 実施例１で使用した６種の蛋白質各1mgを合せて0.125
Mトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）5mlに溶解し、これにSDS
4％及び２−メルカプトエタノール10％を含むトリス−
塩酸緩衝液（pH6.8）5mlを加えて、沸騰水溶中で５分間
加熱反応せしめる。次いで、1.17gのモノヨード酢酸ア
ミドを加えて充分混合し、温度４℃で10分間反応せしめ
アルキル化した。

反応終了後、反応液を透析チューブに入れて１の精
製水を外液として２時間透析した。液量を40mlとし、庶
糖1gを加えて400μずつバイアル柱に分注し、凍結乾
燥し、本発明分子量マーカーを得た。

試験例１ 以下に示す３種の分子量マーカーＩ〜IIIを下記方法
に従い電気泳動を行なった。

分子量マーカー： I.市販の分子量マーカー （ファルマシア社製、High molecular weight［HMW］
calibration kit） 含有蛋白：サイログロブリン、フエリチンカタラー
ゼ、乳酸脱水素酵素、アルブミン II.実施例１で使用した６種の原料蛋白質の混合物 III.実施例１で製造した本発明分子量マーカー方法： 上記の３種の蛋白質のそれぞれについて次の（Ａ）非
還元処理、（Ｂ）還元処理する。

（Ａ）．上記Ｉ〜IIIの蛋白質それぞれを４％SDS含有0.
125Mトリス−塩酸緩衝液に溶解し、沸騰水浴中５分間加
熱する。

（Ｂ）．上記Ｉ〜IIIの蛋白質それぞれをSDS4％及び２
−メルカプトエタノール10％を含有0.125Mトリス−塩酸
緩衝液に溶解し沸騰水浴中５分間加熱する。

（Ａ）または（Ｂ）の処理後、ただちに４−10％ポリ
アクリルアミドグラジエントを用いるSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行ない、クマシーブリリアント
ブルーＲ−250で染色した。

以上の結果を、第１図に示す。

図中の番号は次のものを示す。

分子量マーカーＩ （Ａ）非還元処理 分子量マーカーＩ （Ｂ）還元処理 分子量マーカーII （Ａ）非還元処理 分子量マーカーII （Ｂ）還元処理 分子量マーカーIII （Ａ）非還元処理 分子量マーカーIII （Ｂ）還元処理 なお、第１図中、 はバンドが明瞭であることを示し、 はバンドが不明瞭であるこを示し、 はテーリングを生じていることを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３種の分子量マーカーＩ〜IIIの還元又は非
還元状態の電気泳動の結果を示す図面である。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】還元処理によって形成されたチオール基を
   有する分子量既知の蛋白質の該チオール基がアルキル化
   されたＳ−アルキル蛋白質よりなる分子量マーカー。
2. 【請求項２】請求項１の分子量マーカーを用いることを
   特徴とする電気泳動法による分子量測定法。