DE4032127A1

DE4032127A1 - Verwendung von disulfidverbrueckten proteinen und peptiden

Info

Publication number: DE4032127A1
Application number: DE19904032127
Authority: DE
Inventors: Kurt Dr Lang; Thomas Dr Subkowski; Juergen Dr Schweden
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1990-10-10
Filing date: 1990-10-10
Publication date: 1992-04-16
Also published as: WO1992007254A3; WO1992007254A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Anwendungen von disulfidverbrück ten Proteinen und Peptiden.

Die meisten Proteine und viele Peptide enthalten Cystein-Reste, die über S-S-Brücken miteinander verbunden sein können. Diese S-S-Brücken können sowohl intra- als auch intermolekular vorliegen. Liegen sie intermolekular vor, so können zwei oder mehr Proteinmoleküle miteinander verbunden sein.

Es wurde nun gefunden, daß sich intermolekular über S-S-Brücken verknüpfte Proteine und Peptide sehr gut zur Herstellung von Antikörpern und als Eichsubstanzen zur Bestimmung von Molekulargewichten von höher molekularen Substanzen eignen.

Zur Herstellung von intermolekular über S-S-Brücken verknüpften Proteinen und Peptiden geht man von den SH-Proteinen bzw. SH-Peptiden aus, die z. B. in einem wäßrigen Puffer in bekannter Weise mit Oxidationsmitteln wie Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid zu S-S-Di- oder Polymeren oxidiert werden. Zur Herstellung von intermolekularen Disulfidbrücken sind auch insbesondere denaturierte und reduzierte Proteine und Peptide geeignet.

Der Grad der Polymerisation läßt sich durch Variation der Konzentration an SH-Protein und Oxidationsmittel im Oxidationsansatz einstellen. Mit stei gender Konzentration an Protein bzw. Peptid steigt der Polymerisations grad.

Für die Induktion von Antikörpern sollte ein möglichst hoher Polymerisa tionsgrad erzielt werden. Das Proteinpolymere sollte jedoch löslich blei ben. Für die Verwendung als Eichsubstanz sollte der Polymerisationsgrad so liegen, daß der Molekulargewichtsbereich der Polymerisate das Molekular gewicht der zu untersuchenden Substanz einschließt.

Die polymerisierten Proteine, insbesondere solche mit einem Molekularge wicht von über 10 kD, sind wesentlich besser als das nicht polymerisierte Protein oder Peptid dazu geeignet, in tierischen Körpern Antikörper auch gegen das nicht polymerisierte Protein und Peptid zu induzieren. Die sonst üblichen Methoden der Kopplung von Peptiden oder Proteinen an Trägerpro teine, z. B. BSA (bovines Serumalbumin) oder KLH (keyhole limpet hemo cyanine) haben den Nachteil, daß ein großer Anteil der gebildeten Anti körper gegen das Trägerprotein gerichtet ist. Dies wird durch die Verwen dung von disulfidverbrückten Proteinen vermieden. Die erhaltenen Antikör per sind wichtig zum Nachweis von Proteinen und Peptiden in Körperflüssig keiten bzw. zu therapeutischen und diagnostischen Zwecken.

Beispiel 1 Oxidation von reduziertem und denaturiertem Aprotinin

Aprotinin wurde zu einer Konzentration von 100 mg/ml in 6 M GdmCl, 0,2 M Tris/HCl, 0,4 M DDT, pH 8,5 gelöst und 2 h bei 37°C inkubiert. Die Oxida tion wurde durch die Zugabe von 20%igem H₂O₂ zu einer Konzentration von 1% in der Aprotininlösung unter stetem Rühren eingeleitet. Nach 30 min wurde die Oxidationslösung durch die Zugabe von 20 mM Tris/HCl, pH 8,6 10fach verdünnt und anschließend gegen denselben Puffer dialysiert.

Die Oxidationsprodukte sind durch intermolekulare Disulfidbrücken querver netzte Oligomere von denaturiertem Aprotinin.

Beispiel 2 Oxidation von denaturierter und reduzierter Ribonuklease A aus Rinder pankreas

Ribonuklease A wurde in 6 M GdmCl, 0,2 M Tris/HCl, 0,4 M DDT, pH 8,7 zu einer Konzentration von 100 mg/ml gelöst und 2 h inkubiert. Die Oxidation erfolgte durch Zugabe von 20%igem H₂O₂ bis zu einer Konzentration von 1% zur Ribonuklease-Lösung unter Rühren. Nach 30 min wurde die Oxidations lösung 1 : 10 mit 20 mM Tris/HCl verdünnt und gegen denselben Puffer dialy siert.

Die Oxidationsprodukte sind überwiegend über intermolekulare Disulfid brücken quervernetzte Ribonukleaseoligomere.

Beispiel 3 Oxidation von denaturiertem und reduziertem Desulfatohirudin

Gentechnisch hergestelltes Desulfatohirudin wurde zu 60 bzw. 90 mg/ml in 6 M GdmCl, 0,2 M Tris/HCl, 0,4 M DDT, pH 8,7 gelöst und 2 h bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die Oxidation durch die Zugabe von 20%igem H₂O₂ bis zu einer Konzentration von 1% in der Hirudinlösung, wobei gerührt wurde. Nach 30 min wurde der Oxidationsansatz 1 : 10 mit Wasser oder mit 20 mM Tris/HCl, pH 8,6 verdünnt und gegen Wasser oder letzteren Puffer dialysiert.

Das Oxidationsprodukt besteht aus überwiegend über intermolekulare Disulfidbrücken quervernetzten Oligomeren des denaturierten Hirudins.

Beispiel 4 Laufverhalten der Oxidationsprodukte von verschiedenen im denaturierten und reduzierten Zustand oxidierten Proteinen in der SDS-Gelelektrophorese

Die in den Beispielen 1, 2 und 3 hergestellten Oxidationsprodukte der denaturierten und reduzierten Proteine Aprotinin, Ribonuklease A und Desulfatohirudin wurden nach Verdünnung auf 10 mg Protein/ml in 20 mM Tris/HCl, pH 8,6 und Dialyse gegen denselben Puffer durch SDS-Gelelektro phorese aufgetrennt.

Die Oxidationsprodukte sind vor allem über Disulfidbrücken quervernetzte Oligomere, die sich in ihrem Molekulargewicht um das zwei- oder vielfache des Molekulargewichts des jeweiligen monomeren Proteins (Ribonuklease A: 13700 D; Hirudin: 6960 D; Aprotinin: 6150 D) unterscheiden. Die halbloga rithmische Auftragung der Molekulargewichte der verschiedenen Oligomeren in Abhängigkeit von der jeweils zurückgelegten Laufstrecke im Gel zeigt, daß über einen weiten Molekulargewichtsbereich eine lineare Abhängigkeit zwischen diesen Parametern besteht.

Beispiel 5 Induktion von Antikörpern durch im denaturierten und reduzierten Zustand oxidiertes Desulfatohirudin

Hirudin bzw. Desulfatohirudin ist aufgrund seiner geringen Immunogenität für eine therapeutische Verwendung als Blutgerinnungshemmstoff sehr geeig net. Für den empfindlichen Nachweis von Hirudin im Serum von behandelten Patienten mittels eines für Hirudin spezifischen ELISA sind jedoch Anti körper erforderlich. Die Induktion von Antikörpern gegen Hirudin war bisher aufgrund der geringen Immunogenität von Hirudin problematisch. So konnten von Spinner et al. (Thrombosis Research, 51, 617 (1988)) nur in 2 von 11 Schafen Antikörper gegen Hirudin erzeugt werden.

Zur Induktion von Antikörpern gegen Desulfatohirudin wurde das gemäß Bei spiel 3 hergestellte oxidierte Desulfatohirudin als Antigen verwendet. Es wurden Kaninchen wie folgt intramuskulär immunisiert:

Tag 0: 500 µg Antigen + 500 µl PBS + 500 µl CFA
Tag 14: 500 µg Antigen + 500 µl PBS + 500 µl IFA
Tag 31: 250 µg Antigen + 500 µl PBS + 500 µl IFA
Tag 45: 250 µg Antigen + 500 µl PBS

Am 53. Tag wurden den Kaninchen je 2 ml Blut entnommen und der Antikörper titer im Serum wie üblich bestimmt.

Dazu wurden Mikrotiterplatten (Fa. Falcon) zunächst mit dem Antigen (oxidiertes Desulfatohirudin oder natives Desulfatohirudin) beschichtet (2 h, 37°C, 5 µg/ml 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,0). Unspezifische Bindungsstellen der Mikrotiterplatte wurden durch anschließende Inkubation mit 3% BSA/PBS abgesättigt. Daraufhin wurde mit verschiedenen Verdünnungen des Antiserums für 2 h inkubiert und anschließend die gebundenen Antikör per mit einem "goat-anti-rabbit-Peroxidase"-Konjugat (Fa. Bio Rad) nachge wiesen.

Die induzierten Antikörper reagieren mit dem oxidierten und dem nativen Desulfatohirudin mit annähernd derselben Empfindlichkeit. Dies bedeutet, daß Antikörper gegen das oxidierte Desulfatohirudin ebenfalls das native Protein erkennen.

Claims

1. Verwendung von intermolekular über S-S-Brücken verknüpften Proteinen und Peptiden zur Herstellung von Antikörpern.

2. Verwendung von intermolekular über S-S-Brücken verknüpften Proteinen und Peptiden als Eichsubstanzen zur Bestimmung von Molekulargewichten.