JPH0315752A

JPH0315752A - 分子量マーカー

Info

Publication number: JPH0315752A
Application number: JP1150154A
Authority: JP
Inventors: Hiroko Tanaka; 裕子田中; Yoriyoshi Ehata; 順良江幡
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1989-06-13
Filing date: 1989-06-13
Publication date: 1991-01-24
Anticipated expiration: 2013-05-13
Also published as: JP2750738B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、分子量マーカー及びそれを用いる分子量測定
法に関し、更に詳細には電気泳勤法を利用した蛋白質の
分子量測定に用いる分子量マーカー及びこれを用いた分
子量測定法に関する。

〔従来の技術〕

生化学研究において、生体試料中の蛋白質の分子量を正
確に測定することは極めて重要である。

現在、最も実用的な分子量測定方法としては、分子篩効
果を有するポリアクリルアミドゲル等を用いて、試料蛋
白質と分子量既知の蛋白質、すなわち分子量マーカーと
を並べて電気泳動し、該試料蛋白質と分子量マーカーの
泳動位置を比較することにより試料蛋白質の分子量を測
定する方法が挙げられる。

この方法に用いる分子量マーカーとしては、通常、分子
量１，　０００〜１，　０００，　０００の種々の天然
蛋白質を原料とし、これより分子量マーカーとして必要
な純度を持つ蛋白質を測定分子量の範囲に応じて段階的
に選択、混合して調整したもの；または天然蛋白質にグ
ルタルアルデヒド若しくはジエチルビ口カルポナートを
反応せしめて、種々の架橋した蛋白質の重合体を合戊し
、これらのうち、重合度の異なるものを適宜選択、混合
、調整したもの〔「蛋白質・酵素の基礎実験法」　（南
江堂）３２８ページ〕等が用いられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記分子量マーカーを含め蛋白質の多くは複数のサブユ
ニットにより構或され、それぞれのサブユニット同士は
ジスルフィド結合により結合している。従って、還元剤
により、ジスルフィド結合を開裂しその分子量を測定す
れば、複雑な三次構造を有する蛋白質の有用なデータが
得られる。それ故、例えば２−メルカプトエタノールま
たはジチオスレイトール等の還元剤により、ジスルフィ
ド結合を開裂した後、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、
ｒｓＤｓＪという）の存在下ポリアクリルアミドゲルを
用いる電気泳動法により分子量を測定する方法等が広く
行なわれており、複雉な三次構造を有する蛋白質の分子
量測定に役立っている。

しかしながら、還元剤によりジスルフィド結合が開裂し
て生じたチ才一ル基（−ＳＨ基）は、徐々にチ才〜ル基
同士ランダムに再結合する。また、還元剤の量により還
元不完全となることがある。

このため、還元処理後に電気泳勤を行なうと本来のバン
ドの他に副生バンドを生じたり、テーリング現象を生じ
たりして、分子量に応じた移動距離に鮮明な１本のバン
ドができることが必要とされる分子量マーカーとしては
好ましくない事態となる。また分子量マーカーは、高度
に精製された蛋白質を数種類混合して調製されるため、
高価であり、上記事態は経済的にも極めて不利である。

従って、上記欠点がなく正確に分子量測定ができる分子
量マーカーが望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

上記実情に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、
還元処理により形或されたチオール基をアルキル化した
Ｓ−アルキル蛋白質を用いれば、チオール基同士の再結
合を阻止でき、電気泳動時に副生バンドやテーリング現
象を生じることがなく、正確な分子量測定ができること
を見出し本発明を完戊した。

すなわち、本発明は還元処理によって形威されたチオー
ル基を有する分子量既知の蛋白質の該チ才一ル基がアル
キル化されたＳ−アルキル蛋白質よりなる分子量マーカ
ー及びこの分子量マーカーを用いることを特徴とする電
気泳動法による蛋白質の分子量測定法を提供するもので
ある。

本発明分子量マーカーとなるＳ−アルキル蛋白質は、例
えば、常法により、蛋白質のジスルフィド結合を還元剤
により開裂せしめた後、生じたチオール基をアルキル化
することにより製造することができる。

すなわち、まず常法により、精製された分子量既知の蛋
白質を緩衝液に溶解せしめ、これに還元剤を添加し加熱
反応せしめ蛋白質のジスルフィド結合を開裂させる。

原料となる蛋白質としては、分子量が既知の蛋白質であ
れば特に限定されないが、精製された天然蛋白質、特に
通常分子量マーカーとして用いられる蛋白質が好ましい
。具体例としては、サイログロプリン、α，マクログロ
ブリンミオシンＨ鎮、ＲＮ＾ポリメラーゼ、γ−グロプ
リン、β−ガラクトシターゼ、ホスホリラーゼｂ１血清
アルブミン、カタラーゼ、フマラーゼ、アルドラーゼ、
卵白アルブミン、アルコール脱水素酵素、ピルビン酸キ
ナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、カルボニッ
クアンヒドラーゼ、キモトリプシノーゲン、大豆トリブ
シンインヒビター、α−ラクトアルブミン、ミ才グロビ
ン、リゾチーム、チトクロームＣ，ヘモグロビン等が挙
げられる。

ジスルフィド結合の開裂反応においては、原料蛋白質が
有するジスルフィド結合のすべてを開裂する必要はなく
、通常の分子量測定における還元条件で開裂し得るジス
ルフィド結合を開裂せしめればよい。従って、反応条件
は、通常の分子量測定時に用いる還元剤、例えば２−メ
ルカブトエタノール、ジチオスレイトール等を用いて、
ＳＯＳを含む緩衝液中で行なうのが好ましい。

次に、これにアルキル化試薬を加え、好ましくは室温下
で数時間反応せしめ、開裂によって形成されたチ才一ル
基をアルキル化する。このアルヰル化反応に用いるアル
キル化試薬としては、例えば、Ｎ−エチルマレイミド、
Ｎ　−　（４−ジメチルアミノー３．５−ジニトロフェ
ニル）マレイミド、Ｎ−２．４−ジニトロアニリノマレ
イミド等のマレイミド誘導体；モノヨード酢酸、モノヨ
ード酢酸アミド、モノブロモ酢酸、モノブロモ酢酸アミ
ド、α−ヨードプロピオン酸、β−ブロモエチルアミン
、モノクロロ酢酸、クロロアセトフエノン等が挙げられ
、就中、Ｎ一エチルマレイミド、モノヨード酢酸、モノ
ヨード酢酸アミドが好ましい。

このアルキル化反応により得られた反応物を、透析し過
剰の試薬を除去し、所望により適当な賦形剤、例えば、
庶糖及び少量のＳＯＳ等を加え、凍結乾燥すれば本発明
分子量マーカーとなるＳ−アルキル蛋白質が得られる。

このようにして得られたＳ−アルキル蛋白質を分子量マ
ーカーとして用いて、蛋白質の分子量を測定するには、
常法に従い電気泳勤を行なえばよい。すなわち、還元剤
の存在下若しくは非存在下に本発明分子量マーカー及び
試料蛋白質をｔｌｆｆｉ液に溶解せしめ、電気泳勤に付
することにより試料蛋白質の分子量を測定することがで
きる。具体的にはＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法が挙げられ、発色検出方法は特に限定されないが
クマシーブＩＪ　ＩＪアントブルー染色、銀染色等を用
いる方法が好ましい。

〔発明の効果〕

本発明分子量マーカーは、従来の分子量マーカーの持つ
欠点、すなわち、チオール基の還元不完全、チオール基
同士の再結合が起こらず、電気泳勤時に本来のバンドの
他に副生バンドを生じたり、テーリング現象を生じたり
する欠点がなく、還元剤の量の多少等の測定条件にも左
右されず常に一定の移動度を有する。しかも、電気泳動
による移動距離も従来公知の分子量マーカーと同等であ
る。

従って、本発明分子量マーカーを用いれば、分子量測定
が正確に行なえる。

〔実施例〕

実施例ｌ次の６種の蛋白質、すなわちホスホリラーゼｂ（分子量
９７．４（１０）　、牛血清アルブミン（分子量６６，
　２５０）、、アルドラーゼ（分子量４０，０００）　
、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量３０，０００）
　、｝リプシンインヒビター（分子量２１；５００）及
びリゾチーム（分子量１４，　４００）の各蛋白質１■
を５−の０．１２５　Ｍ　｝リスー塩Ｗｌ緩衡液（ｐＨ
６．８　）に加えて溶解し、これにＳ［］Ｓ　４％及び
２−メルカブトエタノール１０％を含む０．１２５　Ｍ
　｝リスー塩酸ｔＩ！衝液（ｐＨ６．８　）　５−を加
えて、沸騰水浴中で５分間加熱反応せしめる。この後、
７００ｍｇのＮ一エチルマレイミドを加え充分混和後、
室温で１０分間反応せしめアルキル化した。

反応終了後、反応液を透析チューブに入れてｌ％ＳＤＳ
溶液１１を外液として２時間透析した。

透析液を合せて４０ｍｊ！とし、庶糖１ｇを加えて４０
０μｌずつバイアル栓に分注し、凍結乾燥し、本発明分
子量マーカーを得た。

実施例２実施例１で使用した６種の蛋白質各１■をそれぞれ１−
の０．１２５　Ｍ　｝リスー塩酸緩衝液（ｐ｝１６．８
）に加えて溶解し、これにＳＯＳ　４％及び２−メルカ
プトエタノール１０％を含む０．１２５　Ｍ　｝リスー
塩酸緩衝液（ｐＨ６．８　）　　１　ｄを加えて、沸騰
水浴中で５分間加熱反応せしめる。次いで、１７５■の
Ｎ一エチルマレイミドを加え充分混和後、室温で１０分
間反応せしめ、アルキル化した。

反応終了後、反応液を透析チューブに入れて２００−の
１％ＳロＳ溶液を外液として２時間透析した。

各蛋白質について以上の操作を行なって得た６種の透析
液を合せて４０−とじ、庶Ｆｉｌｇを加えて４００μ１
ずつバイアル栓に分注し、凍結乾燥し、本発明分子量マ
ーカーを得た。

実施例３実施例１で使用した６種の蛋白質各１■を合せて０．１
２５　Ｍ　｝リスー塩酸ｔｊ！＃！液（ｐＨ６．８　）
　　５−に溶解し、これにＳＯＳ　４％及び２−メルカ
プトエタノール１０％を含むトリスー塩ｉｌ２緩衝液（
ｐｔ１６．　８）５ｒｎ１を加えて、沸騰水浴中で５分
間加熱反応せしめる。次いで、１．１７ｇのモノヨード
酢酸アミドを加えて充分混合し、温度４℃で１０分間反
応せしめアルキル化した。

反応終了後、反応液を透析チューブに入れてｌ１の精製
氷を外液として２時間透析した。液量を４０−とじ、庶
糖１ｇを加えて４００μｌずつバイアル栓に分注し、凍
結乾燥し、本発明分子量マ一カーを得た。

試験例ｌ以下に示す３種の分子量マーカーＩ〜■を下記方法に従
い電気泳動を行なった。

分子量マーカー：Ｉ．市販の分子量マーカー（ファルマシア社製、Ｉｌｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ　［ｆｌｌＷ］　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ
　ｋｉｔ）含有蛋白：サイログロプリン、フエリチンカ
タラーゼ、乳酸脱水素酵素、アルブミン■．実施例１で
使用した６種の原料蛋白質の混合物 ■．実施例１で製造した本発明分子量マーカー方法；上記の３種の蛋白質のそれぞれについて次の（＾）非還
元処理、（Ｂ）還元処理する。

（＾）．上記Ｉ〜■の蛋白質それぞれを４％ＳＯＳ含有
０．　１２５　Ｍ　｝　ＩＪスー塩酸緩衝液に溶解し、
沸騰水浴中５分間加熱する。

（Ｂ）．上記１〜■の蛋白質それぞれをＳＯＳ　４％及
び２−メルカブトエタノール１０％を含有０．１２５Ｍ
トリスー塩酸！１衝液に溶解し沸騰水浴中５分間加熱す
る。

（Ａ）または（Ｂ）の処理後、ただちに４−１０％ポリ
アクリルアミドグラジエントを用いるＳＯＳ　−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行ない、クマシーブリリア
ントブルーＲ−２５０で染色した。

以上の結果を、第１図に示す。

図中の番号は次のものを示す。

■　分子量マーカー１　　（Ａ）非還元処理■　分子量
マーカーＩ　　（Ｂ）還元処理■　分子量マーカーｆｆ
　　（Ａ）非還元処理■　分子量マーカーｎ　　（Ｂ）
還元処理■　分子量マーカー■　（＾）非還元処理■　
分子量マーカーｍ　　（Ｂ）還元処理なお、第１図中、
過棒圀はバンドが明瞭であることを示し、コ＝コはバン
ドが不明瞭であるこを示し、　一聴己はテーリングを生
じていることを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３種の分子量マーカーＩ〜ｍの還元又は非還
元状態の電気泳動の結果を示す図面である。以上第１図

Claims

【特許請求の範囲】１　還元処理によって形成されたチオール基を有する分
子量既知の蛋白質の該チオール基がアルキル化されたＳ
−アルキル蛋白質よりなる分子量マーカー。２　請求項１の分子量マーカーを用いることを特徴とす
る電気泳動法による分子量測定法。