SU436085A1

SU436085A1 - Способ очистки l-аспарагиназы

Info

Publication number: SU436085A1
Application number: SU1818995A
Authority: SU
Original assignee: В. М. Денисов, В. И. Максимов , Г. А. Молодова; Всесоюзный научно исследовательский институт биосинтеза белковых веществ; Фонд Знв Шрто
Priority date: 1972-08-07
Filing date: 1972-08-07
Publication date: 1974-07-15

Description

1

Изобретение относитс к ферментной области микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве ферментов из микроорганизмов. Оно решает задачу очистки ферментов, в частности L-acпарагиназы .

Известен способ очистки L-аспарагиназы, предусматривающий, приготовление экстракта , добавление стабилизатора, нагревание полученной смеси, удаление выпавших в осадок балластных белков, например, центрифугированием , и фракционное осаждение L-аспарагиназы , например, сульфатом аммони . В качестве стабилизируюш,их добавок, примен емых при очистке L-аспарагиназы в известных способах используют глицин, аланин или субстратаспарагин, а также полиэтиленгликоль . Этот способ характеризуетс низкой степенью очистки асиарагиназы, при проведении которой в качестве стабилизатора используетс вещество сложного состава (L-аспарагин); расход этого вещества особенно велик на первых стади х очистки, где примен ЕОт большие объемы жидкости.

Дл повышени стабильности L-аспарагиназы предлагаетс в процессе очистки перед добавлением стабилизатора экстракт подкисл ть , а в качестве стабилизатора использовать сульфат аммони . Целесообразно экстракт подкисл ть до значени рН 4,0-4,5, например, добавлением уксусной кислоты.

Обнаружено, что в присутствии сульфата аммони L-аспарагиназа в экстракте из ацетонового порошка клеток Е. соИ, подкислением до рН 4,5, выдерживает без существенной инактивации нагревание до 55°С в течение 15-60 мин, в то врем как часть балластных белковых примесей денатурирует, становитс нерастворимой и выпадает в осадок , который может быть отделен от раствора L-аспарагиназы центрифугированием. Таким образом, сульфат аммони вл етс стабилизатором L-аспарагиназы, так как без него фермент при этой обработке полностью инактивируетс .

Предлагаемый способ заключаетс в том, что биомассу Е. coli, полученную выращиванием на среде, содержащей белковый гидролизат или кукурузный экстракт, глицерин и минеральные соли, при 37°С обрабатывают

ацетоном, сушат и получают ацетоновый порошок Е. coli, из которого водной экстракцией извлекают фермент. Ферментный экстракт подкисл ют добавлением СНзСООН до рН 4,0-4,5 и отдел ют от биомассы любым способом , например центрифугированием. К супернатанту , представл ющему собой раствор L-аспарагиназы с примес ми, добавл ют сульфат аммони до 40-50% насыщени , смесь нагревают до 55°С в течение 15-60 мин

(предпочтительно 30 мин), выпавший осадок денатурированных белков отдел ют любым

способом (фильтрованием или центрифугированием ). Получают раствор L-аспарагиназы в полунасыщенном растворе сульфата аммони , очищенный от значительной части балластных белков. Дл извлечени из него L-аспарагиназы добавл ют сульфат аммони почти до полного насыщени (90-100%).

Предложенным способом получают L-acnaрагиназу с удельной активностью 15- 25 МЕ/мг с выходом 70-80% подкисленного экстракта.

Дл онределени удельной активности L-аспарагиназы, после очистки ее нагреванием в нолунасыщенном растворе сульфата аммони и осаждени ее из раствора, насыщенного той же солью, вещество нредварительно очищают от примеси сульфата аммони хроматографией через гель сефадекс G-25. Получают удельную активность 5 МЕ/мг белка с выходом 70% содержани L-аспарагиназы в исходном экстракте. Активность измер ют по количеству аммиака, освобождающегос при ферментативном гидролизе L-acnaрагина и определ емого несслеризацией. За единицу активности берут количество фермента , которое приводит к образованию 1 микромол аммиака за 1 мин при 37°С (международна единица). Активность определ ют в натрий-ацетатном буфере рН 5,0. Белок определ ют обычными методами: но Лоури и биуретовым .

В таблице приведены средние результаты, характеризующие вли ние нагревани растворов L-аспарагиназы на удельную активность и стабильность.

Таблица

Пример 1. 5 г ацетонового порошка Е. соИ смешивали со 100 мл воды и нагревали при 37°С 2 час периодически перемещива , добавл ли 6 мл 1,0 М СНзСООП. Осадок отдел ли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. К 90 мл супернатанта с удельной активностью 3,0 МЕ/мг при посто нном перемещивании добавл ли 28,8 г кристаллического сульфата аммони (50% насыщени ). Осадок отдел ли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. К супернатанту при посто нном перемещивании добавл ли 34,2 г кристаллического сульфата аммони (100% насыщени ). Осадок собирали центрифугированием и раствор ли в 10 мл воды. К 10 мл полученного раствора при посто нном перемешивании добавл ли 3,2 г сульфата аммони . Раствор ставили в вод ную баню при 55°С и выдерживали 30 мин, осадок отдел ли центрифугированием . К супернатанту добавл ли 3,8 г сульфата аммони . Осадок собирали центрифугированием и раствор ли в 10 мл воды. RacTBop имел удельную активность 15 МЕ/мг. Пример 2. 50 г ацетонового порошка Е. соИ смешивали с 1 л воды, нагревали до 37°С в течение 2 час периодически перемешива . После этого к раствору добавл ли концентрированную уксусную кислоту до рН 4,5. Осадок отдел ли центрифугированием при 5000 об/мии в течение 30 мин. К 0,84 л супернатанта с удельной активностью 6,0 МЕ/мг белка при посто нном перемешивании добавл ли 269 г кристаллического сульфата аммони (50% насыщени ), раствор нагревали до 55°С в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр. К раствору (0,95 л) при посто нном перемешивании добавл ли 285 г кристаллического сульфата аммони (90% насыщени ). Осадок собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин и раствор ли в подход щем буфере . Удельна активность полученного раствора 26,3 МЕ/мг, выход 75%. Предмет изобретени 1. Способ очистки L-аспарагиназы, предусматривающий приготовление экстракта, добавление стабилизатора, нагревание нолученной смеси, удаление выпавших в осадок бал5 ластных белков, например, центрифугированием , и фракционное осаждение L-аспарагиназы , например, сульфатом аммони , отличающийс тем, что, с целью повышени стабильности L-аспарагиназы, в процессе5 очистки перед добавлением стабилизатора 6 экстракт подкисл ют, а в качестве стабилизатора используют сульфат аммони , 2. Способ по п. 1, отличающийс тем, что экстракт подкисл ют до значени рН 4,0-4,5, например, добавлением уксусной кислоты.