PT105332A

PT105332A - Agentes para utilização com antimicrobianos

Info

Publication number: PT105332A
Application number: PT105332A
Authority: PT
Inventors: Ricardo Manuel De Seixas Boavida Ferreira; Alexandra Manuela Lourenco Carreira; Sara Alexandra Valadas Da Silva Monteiro
Original assignee: Cev Biotecnologia Das Plantas S A
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2012-04-12
Also published as: ZA201302933B; BR112013008869B1; PE20140590A1; US11154588B2; SMT201600433B; IL225497A0; UA113150C2; AU2011315527B2; US20220000970A1; MX2013004105A; MX341698B; WO2012049217A1; EP2627177B1; NZ610396A; PL2627177T3; CY1119574T1; ES2600970T3; CA2814565C; IL225497A; CN103347387A

Abstract

OS INVENTORES PROPORCIONAM A UTILIZAÇÃO DE UM AGENTE QUELANTE E UM AGENTE ANTIMICROBIANO QUE É EFICAZ CONTRA UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS, PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE, E/OU MATAR, UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS NUMA PLANTA; A UTILIZAÇÃO DE UM AGENTE QUELANTE PARA AUMENTAR A ACTIVIDADE DE UM ANTIMICROBIANO QUE É EFICAZ CONTRA UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS; UM MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE, E/OU MATAR, UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS COMPREENDENDO A ADMINISTRAÇÃO A UMA PLANTA DISSO NECESSITADA DE UM AGENTE QUELANTE E UM AGENTE ANTIMICROBIANO QUE É EFICAZ CONTRA UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS; E UM MÉTODO PARA AUMENTAR A ACTIVIDADE DE UM ANTIMICROBIANO QUE É EFICAZ CONTRA UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS COMPREENDENDO A UTILIZAÇÃO DO REFERIDO ANTIMICROBIANO COM UM AGENTE QUELANTE. É IGUALMENTE PROPORCIONADA UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM AGENTE QUELANTE E UM AGENTE ANTIMICROBIANO QUE É EFICAZ CONTRA UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS, A UTILIZAÇÃO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE, E/OU MATAR, UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS NUMA PLANTA, E UM MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE, E/OU MATAR, UM MICROORGANISMO PATOGÉNICO PARA PLANTAS, COMPREENDENDO A ADMINISTRAÇÃO, A UMA PLANTA DISSO NECESSITADA, DA REFERIDA COMPOSIÇÃO.

Description

1 DESCRIÇÃO "Agentes para utilização com antimicrobianos"

Campo da Invenção A invenção refere-se ao campo de agentes antimicrobianos que têm como alvo patogénios de plantas.

Introdução 0 controlo de patogénios de plantas e a protecção de colheitas constituem uma questão mundialmente séria que se está a tornar uma preocupação crescente com os recentes aumentos da população mundial e a escassez de alimentos associada. Em adição, as práticas modernas de agricultura em relação à colheita e armazenagem tendem a proporcionar boas condições para o crescimento de patogénios. A utilização de pesticidas químicos tem sido a abordagem padrão para o controlo de pragas. Contudo, muitos dos pesticidas actualmente utilizados apresentam várias desvantagens graves. Por exemplo, muitos têm um impacto ambiental adverso e muitos têm uma eficácia baixa ou decrescente. São particularmente preocupantes a baixa potência e/ou o estreito espectro de actividade de alguns compostos, juntamente com o desenvolvimento de resistência pelos patogénios.

Está entre os objectivos da presente invenção tentar uma solução para estes problemas, e especificamente, por exemplo, proporcionar um meio para melhorar a actividade de agentes antimicrobianos que são eficazes contra microorganismos patogénicos para plantas.

Sumário da Invenção

Os inventores verificaram surpreendentemente que um agente quelante pode potenciar sinergicamente a eficácia de agentes antimicrobianos que são eficazes contra um microorganismo patogénico para plantas. 2

Deste modo, os inventores proporcionam: (i) a utilização de um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas, para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas numa planta; e (ii) a utilização de um agente quelante para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas.

Em concretizações preferidas, o referido agente quelante e o referido antimicrobiano são aplicados a uma planta disso necessitada, preferivelmente em que o referido agente antimicrobiano e o referido agente quelante são administrados à referida planta: a) como parte da mesma composição; ou b) separadamente, seja sequencialmente ou simultaneamente.

Em concretizações preferidas, o agente antimicrobiano é eficaz contra uma bactéria ou um fungo patogénicos para plantas. Em concretizações preferidas o agente antimicrobiano compreende um polipéptido, preferivelmente em que o referido polipéptido compreende Blad ou uma sua variante activa. Em concretizações preferidas o agente quelante é um poliaminocarboxilato, preferivelmente EDTA.

Os inventores proporcionam também: - um método para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas, compreendendo a administração a uma planta disso necessitada de um agente quelante e de um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas; e - um método para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas compreendendo a utilização do referido antimicrobiano com um agente quelante.

Adicionalmente, os inventores proporcionam uma composição compreendendo um agente quelante e um agente antimicrobiano 3 que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas. Preferivelmente, o agente antimicrobiano é eficaz contra uma bactéria ou um fungo patogénicos para plantas, preferivelmente um fungo. Em concretizações preferidas, o agente antimicrobiano compreende um polipéptido, preferivelmente em que o referido polipéptido compreende Blad ou uma sua variante activa. Em concretizações preferidas, o agente quelante é um poliaminocarboxilato, preferivelmente EDTA.

Os inventores adicionalmente proporcionam a utilização de uma composição da invenção para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas numa planta, e um método para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas, compreendendo a administração a uma planta disso necessitada de uma composição da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a sequência de codificação do precursor de β-conglutina de Lupinus albus (SEQ ID N0:1); e A Figura 2 mostra o fragmento interno da sequência de codificação do precursor de β-conglutina que corresponde a Blad (SEQ ID NO:3).

Descrição Detalhada da Invenção

Os inventores verificaram que, quando utilizando uma combinação de um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas, a referida combinação é particularmente eficaz para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas. Num aspecto, portanto, os inventores proporcionam uma composição compreendendo, ou consistindo essencialmente em, um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas. Uma composição compreendendo um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas pode também ser uma formulação compreendendo outro(s) composto(s) adicionado(s) à composição pelo perito. 4

Agentes antimicrobianos 0 agente antimicrobiano é qualquer agente que reduz o crescimento de, ou mate, um microorganismo que é patogénico para uma planta. 0 referido microorganismo é preferivelmente uma bactéria (Gram-positiva ou Gram-negativa) ou um fungo, preferivelmente um fungo (que pode ser uma levedura ou um bolor). Preferivelmente, o agente antimicrobiano compreende (ou consiste essencialmente em) um polipéptido, tal como uma proteína antifúngica. Os exemplos adequados de proteínas antifúngicas incluem quitinases, proteínas de ligação a quitina, quitosanases, β-l, 3-glucanases e β-IV-acet il-D-glucosaminidases. Exemplos particulares de microorganismos que podem ser o alvo do agente antimicrobiano são dados adiante.

Polipéptido Blad

Em concretizações preferidas, onde o agente antimicrobiano compreende (ou consiste essencialmente em) um polipéptido, o polipéptido compreende (ou consiste essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa.

Blad ("banda de Lupinus albus doce") foi o nome dado a um produto de clivagem estável e intermediário da β-conglutina, a principal proteína de reserva presente em sementes do género Lupinus. Foi caracterizado como um polipéptido de 20 kD, composto por 173 resíduos de aminoácido, e codificado por um fragmento interno (519 nucleótidos, depositado no GenBank com o número de acesso ABB13526) do gene que codifica o precursor de β-conglutina de Lupinus (1791 nucleótidos, publicado no GenBank, com o número de acesso AAS97865). Quando são utilizados iniciadores que codificam as sequências terminais de Blad para amplificar uma sequência do ADN genómico de Lupinus, obtém-se um produto de -620 pb, indicando a presença de um intrão no fragmento génico que codifica Blad. O Blad de ocorrência natural é o principal componente de um glico-oligómero de 210 kD que se acumula exclusivamente (após intensiva proteólise limitada de β-conglutina) nos cotilédones de espécies de Lupinus, entre os 4o e 12° dias após o início da germinação. Enquanto o referido oligómero é glicosilado, o Blad de ocorrência natural não é glicosilado. O glico-oligómero contendo Blad é composto por vários polipéptidos, 5 sendo que os principais exibem massas moleculares de 14, 17, 20, 32, 36, 48 e 50 kD. O polipéptido de 20 kD, o Blad, é de longe o mais abundante polipéptido no interior do oligómero e parece ser o único com actividade de lectina. O Blad de ocorrência natural constitui aproximadamente 80% da proteína total cotiledonar em plântulas de 8 dias de idade. A sequência de codificação do precursor de β-conglutina de L. albus (SEQ ID NO:l) é dada na Figura 1. A sequência de codificação da subunidade progenitora da β-conglutina está localizada nos resíduos 70 a 1668. A subunidade progenitora de β-conglutina codificada, de 533 resíduos de aminoácido (SEQ ID NO:2) é:

MGKMRVRFPTLVLVLGIVFLMAVSIGIAYGEKDVLKSHERPEEREQEEWQPRRQRPQSRREE REQEQEQGSPSYPRRQSGYERRQYHERSEQREEREQEQQQGSPSYSRRQRNPYHFSSQRFQT LYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLILPKHSDADYVLVVLNGRATIT IVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSTSYILNPDDNQKLRVVKLAIPINNPGYFYDFYPSSTKD QQSYFSGFSRNTLEATFNTRYEEIQRIILGNEDEQEYEEQRRGQEQSDQDEGVIVIVSKKQI QKLTKHAQSSSGKDKPSDSGPFNLRSNEPIYSNKYGNFYEITPDRNPQVQDLNISLTYIKIN EGALLLPHYNSKAIYVVVVDEGEGNYELVGIRDQQRQQDEQEEKEEEVIRYSARLSEGDIFV IPAGYPISINASSNLRLLGFGINADENQRNFLAGSKDNVIRQLDRAVNELTFPGSAEDIERL IKNQQQSYFANGQPQQQQQQQSEKEGRRGRRGSSLPF O fragmento interno da sequência de codificação do precursor de β-conglutina que corresponde a Blad (SEQ ID NO:3) é dado na Figura 2. O polipéptido Blad (SEQ ID NO:4) é:

RRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLILPKHS DADYVLVVLNGRATITIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSTSYILNPDDNQKLRVVKLAIPI NNPGYFYDFYPSSTKDQQSYFSGFSRNTLEATFNTRYEEIQRIILGNED

Portanto, quando o agente antimicrobiano compreende (ou consiste essencialmente em) um polipéptido compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa, o referido agente compreende (ou consiste essencialmente em) uma sequência polipeptídica compreendendo (ou consistindo essencialmente em) a SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante activa.

Uma variante activa de Blad é uma variante de Blad que retém a capacidade de actuar como antimicrobiano (i.e. tem 6 actividade antimicrobiana - veja-se adiante para uma descrição do nível desta actividade e como medi-la). "Uma variante activa de Blad" inclui no seu âmbito um fragmento de SEQ ID NO: 4. Em concretizações preferidas, é seleccionado um fragmento de SEQ ID NO:4 que tem pelo menos 10% do comprimento de SEQ ID NO:4, preferivelmente pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90% e o mais preferivelmente pelo menos 95% do comprimento de SEQ ID NO:4. O Blad ou uma sua variante têm geralmente um comprimento de pelo menos 10 resíduos de aminoácido, tal como pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ou 173 resíduos de aminoácido. "Uma variante activa de Blad" inclui também no seu âmbito uma sequência polipeptídica que tem homologia com SEQ ID NO:4, tal como pelo menos 40% de identidade, preferivelmente pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 97%, e o mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade, por exemplo ao longo da totalidade da sequência ou ao longo de uma região de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30, preferivelmente pelo menos 40, preferivelmente pelo menos 50, preferivelmente pelo menos 60, preferivelmente pelo menos 80, preferivelmente pelo menos 100, preferivelmente pelo menos 120, preferivelmente pelo menos 140, e o mais preferivelmente pelo menos 160 ou mais resíduos de aminoácido contíguos. Os métodos para medir a homologia de proteínas são bem conhecidos na especialidade e os peritos na especialidade entenderão que no presente contexto, a homologia é calculada com base na identidade de aminoácidos (por vezes referida como "homologia rígida"). A variante activa de Blad homóloga difere tipicamente da sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 4 por substituição, inserção ou deleção, por exemplo de 1, 2, 3, 4, 5 a 8 ou mais substituições, deleções ou inserções. As substituições são preferivelmente yconservativas', ou seja, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido similar, onde aminoácidos 7 similares partilham um dos seguintes grupos: resíduos aromáticos (F/H/W/Y), resíduos alifáticos não polares (G/A/P/I/L/V), alifáticos polares não carregados (C/S/T/M/N/Q) e alifáticos polares carregados (D/E/K/R). Os subgrupos preferidos compreendem: G/A/P; I/L/V; C/S/T/M; N/Q; D/E; e K/R.

Um polipéptido compreendendo Blad ou uma sua variante activa (como descrito acima) pode consistir em Blad ou uma sua variante activa com qualquer número de resíduos de aminoácido adicionados ao terminal N e/ou ao terminal C desde que o polipéptido retenha a actividade antimicrobiana (novamente, veja-se adiante para uma descrição do nível desta actividade e de como medi-la). Preferivelmente, não mais de 300 resíduos de aminoácido são adicionados a cada uma ou a ambas as extremidades de Blad ou uma sua variante activa, mais preferivelmente não mais de 200 resíduos de aminoácido, preferivelmente não mais de 150 resíduos de aminoácido, preferivelmente não mais de 100 resíduos de aminoácido, preferivelmente não mais de O OD 6 0 ou 40 resíduos de aminoácido, o mais preferivelmente nao mais de 20 resíduos de aminoácido.

Um polipéptido compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa (como descrito acima) pode ser utilizado na invenção numa forma purificada (e.g. removida de uma fonte vegetal, animal ou microbiana) ou isolada e/ou pode ser recombinante. A produção de uma forma recombinante permite a produção de variantes activas de Blad.

Os métodos de purificação de Blad de ocorrência natural estão já descritos na especialidade (e.g. Ramos et al. (1997)

Planta 203 (1): 26-34 e Monteiro et al. (2010) PLoS ONE 5(1): e8542). Uma fonte adequada de Blad de ocorrência natural é uma planta do género Lupinus, tal como Lupinus albus, preferivelmente um cotilédone da referida planta, preferivelmente colhido entre cerca de 4 e cerca de 14 dias após o início da germinação, mais preferivelmente colhido 6 a 12 dias após o início da germinação (tal como 8 dias após o início da germinação). Estão divulgados na especialidade métodos para a extracção da proteína total que conduz a um extracto bruto compreendendo Blad, e para a purificação de uma proteína deste extracto que conduz a um extracto parcialmente purificado, e.g. compreendendo o glico-oligómero contendo Blad que compreende Blad.

Para isolar o Blad propriamente dito pode então utilizar-se SDS-PAGE e/ou, preferivelmente, HPLC de fase inversa (RP)-HPLC numa coluna C-18.

Uma maneira alternativa de obter um extracto parcialmente purificado compreendendo o glico-oligómero que compreende Blad consiste em utilizar a actividade de ligação a quitina do Blad. 0 glico-oligómero liga-se de uma maneira muito forte a uma coluna de quitina como parte de uma purificação por cromatografia de afinidade com quitina, sendo eluído com HC1 0,05 N. Os detalhes de um exemplo deste método de purificação são como se segue:

Cotilédones de tremoços com oito dias de idade foram colhidos e homogeneizados em água Milli-Q Plus (pH ajustado para 8,0), contendo CaCl2 10 mM e MgCl2 10 mM. O homogenato foi filtrado através de gaze e centrifugado a 30 000 g durante 1 h a 4°C. A pelete foi subsequentemente suspensa em tampão Tris-HC1 100 mM, pH 7,5, contendo NaCl a 10% (p/v) , EDTA 10 mM e EGTA 10 mM, agitou-se durante lha 4°C, e centrifugou-se a 30 000 g durante lha 4°C. A fracção total de globulina, contida no sobrenadante, foi precipitada com sulfato de amónio (561 g/1), deixada em agitação no frio durante lhe foi centrifugada a 30 000 g durante 30 min a 4°C. A pelete obtida foi dissolvida em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, dessalinizada em colunas PD-10 equilibradas com o mesmo tampão e passada através de uma coluna de cromatografia de afinidade com quitina pré-equilibrada com o mesmo tampão. A coluna foi lavada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e as proteínas ligadas foram eluídas com HC1 0,05 N. As fracções eluídas foram imediatamente neutralizadas com Tris 2 M e as fracções de pico foram reunidas, liofilizadas e analisadas por SDS-PAGE.

Para a preparação da coluna de quitina, obteve-se quitina bruta da Sigma e processou-se como se segue: lavou-se a amostra de quitina extensivamente com água Milli-Q Plus, 9 seguida de HC1 0,05 N. Lavou-se então com carbonato de sódio a 1% (p/v) e depois com etanol, até a absorvância da lavagem ser inferior a 0,05. A quitina foi então empacotada numa ponta de pipeta e equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5.

Os métodos de produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na especialidade. Esses métodos, como aqui aplicados, irão envolver a inserção do polinucleótido que codifica um polipéptido compreendendo Blad, ou uma sua variante activa, num vector de expressão adequado - permitindo a justaposição do referido polinucleótido com um ou mais promotores (e.g. um promotor indutível, tal como T71ac) e com outros polinucleótidos ou genes de interesse - a introdução do vector de expressão numa célula ou organismo adequados (e.g. Escherichia coli), a expressão do polipéptido na célula ou organismo transformados e a remoção do polipéptido recombinante expresso dessa célula ou organismo. Para auxiliar nesta purificação o vector de expressão pode ser construído de maneira a que o polinucleótido adicionalmente codifique, por exemplo, um marcador terminal que possa auxiliar a purificação: e.g., um marcador de resíduos de histidina para purificação por afinidade. Uma vez purificado o polipéptido recombinante, o marcador de purificação pode ser removido do polipéptido, e.g., por clivagem proteolítica.

Numa composição da invenção que compreende um agente antimicrobiano que compreende (ou consiste essencialmente em) um polipéptido, o referido polipéptido está preferivelmente numa forma parcialmente purificada, mais preferivelmente numa forma purificada. O referido polipéptido está parcialmente purificado quando está presente num ambiente a que faltam um ou mais outros polipéptidos com os quais está naturalmente associado e/ou está representado por pelo menos cerca de 10% da proteína total presente. O referido polipéptido é purificado quando está presente num ambiente a que faltam todos, ou a maioria, dos outros polipéptidos com os quais está naturalmente associado. Por exemplo, Blad purificado significa que o Blad representa pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca 10 de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da proteína total numa composição.

Numa composição da invenção que compreende um agente antimicrobiano, o conteúdo de proteína de Lupinus pode consistir essencialmente no glico-oligómero contendo Blad que compreende um polipéptido que compreende (ou consiste essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa.

Microorganismos patogénicos para plantas 0 microorganismo patogénico para plantas contra o qual o agente antimicrobiano é eficaz é qualquer microorganismo capaz de causar doença em, ou de, uma planta. Os alvos bacterianos particularmente preferidos incluem espécies patogénicas de Pseudomonas, tais como Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolaasii e Pseudomonas agarici (preferivelmente P. syringae); espécies patogénicas de Erwinia, tais como Erwinia persicina, Pectobacterium carotovorum, Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia psidii e Erwinia tracheiphila, e espécies patogénicas de Streptomyces tais como Streptomyces griseus.

Os alvos fúngicos particularmente preferidos incluem espécies patogénicas de Alternaria, tais como Alternaria alternata, Alternaria arborescens, Alternaria arbusti, Alternaria brassicae, carotiincultae,

Alternaria Alternaria dauci,

Alternaria brassicicola,

Alternaria conjuncta,

Alternaria

Alternaria euphorbiicola, Alternaria gaisen, infectoria, Alternaria japonica, Alternaria petroselini,

Alternaria selini, Alternaria solani e Alternaria smyrnii, espécies patogénicas de Fusarium, tais como Fusarium oxysporum e Fusarium graminearum (preferivelmente F. oxysporum); espécies patogénicas de Botrytis, tais como Botrytis cinerea; e espécies patogénicas de Colletotrichum, tais como

Colletotrichum Colletotrichum Colletotrichum Colletotrichum Colletotrichum actuatum, Colletotrichum coccodes, capsici, Colletotrichum crassipes, gloeosporioides, Colletotrichum graminicola, kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum pisi e Colletotrichum sublineolum. 11

Agentes quelantes 0 agente quelante (também conhecido como quelante, quelador ou agente sequestrante) é qualquer composto que se liga a um ião metálico para formar um complexo não covalente e reduz a actividade do ião. Os agentes quelantes adequados incluem poliaminocarboxilatos, tais como EDTA (ácido etilenodiaminotetra-acético) e EGTA (ácido etilenoglicol-bis ( β-aminoetiléter) -AT, N, Ν', Ν'-tetra-acético) . Preferivelmente utiliza-se o EDTA como agente quelante, preferivelmente numa concentração de pelo menos 10 pg/ml, pelo menos 50 pg/ml, ou pelo menos 100 pg/ml, e até 500 pg/ml, até 1 mg/ml, até 5 mg/ml, até 10 mg/ml, ou até 20 mg/ml. Preferivelmente, utiliza-se o EDTA numa concentração entre 0,1 mg/ml e 20 mg/ml, mais preferivelmente entre 1 mg/ml e 20 mg/ml.

Verificações O agente antimicrobiano, em combinação com o agente quelante, pode ser utilizado para inibir o crescimento de um microorganismo patogénico para plantas (significando que tem actividade microbistática) e/ou para matar o referido microorganismo (significando que tem actividade microbicida). Os peritos na especialidade serão capazes de identificar, através de métodos de rotina, uma dose e/ou concentração adequadas do agente antimicrobiano, a uma concentração particular do agente quelante seleccionado, para obter uma inibição do crescimento ou morte particularmente desejadas do microorganismo. Preferivelmente, a combinação do agente antimicrobiano e do agente quelante não é tóxica para seres humanos ou animais.

Preferivelmente, quando se utiliza uma combinação do agente antimicrobiano e do agente quelante (e.g. uma composição da invenção) como microbistático, a combinação reduz a taxa de crescimento em 10%, mais preferivelmente em 50%, mais preferivelmente em 75%, mais preferivelmente em 90%, mais preferivelmente em 95%, mais preferivelmente em 98%, mais preferivelmente em 99%, e ainda mais preferivelmente em 99,9%, em comparação com condições equivalentes onde a combinação não está presente. 0 mais preferivelmente, a combinação previne qualquer crescimento do microorganismo. 12

Preferivelmente, quando se utiliza uma combinação do agente antimicrobiano e do agente quelante (e.g. uma composição da invenção) como microbicida, a combinação mata 10% da população do microorganismo, mais preferivelmente 50% da referida população, mais preferivelmente 75% da referida população, mais preferivelmente 90% da referida população, mais preferivelmente 95% da referida população, mais preferivelmente 98% da referida população, mais preferivelmente 99% da referida população, e ainda mais preferivelmente 99,9% da referida população, em comparação com condições equivalentes onde a combinação não está presente. O mais preferivelmente, a combinação mata toda a população do microorganismo.

Quando utilizada para prevenir ou inibir uma infecção de uma planta por um microorganismo, a referida combinação é preferivelmente utilizada numa quantidade eficaz, ou seja, uma quantidade que proporciona um nível de inibição do crescimento e/ou morte de um microorganismo tal que seja atingido um nível detectável de prevenção ou inibição da infecção (e.g. seja conseguido um nível detectável de prevenção ou inibição de danos nos tecidos da planta), preferivelmente em comparação com condições equivalentes onde a combinação não está presente.

Se o antimicrobiano escolhido compreende um polipéptido compreendendo Blad ou uma sua variante activa, então, em combinação com um agente quelante (e.g. EDTA em qualquer das concentrações acima descritas), as concentrações adequadas com que se utiliza o referido polipéptido incluem pelo menos 5 pg/ml, pelo menos 10 pg/ml, pelo menos 20 pg/ml, pelo menos 50 pg/ml, pelo menos 100 yg/ml ou pelo menos 500 pg/ml, e até 1 mg/ml, até 2,5 mg/ml, até 5 mg/ml ou até 10 mg/ml. Preferivelmente, a concentração do referido polipéptido está entre 50 yg/ml e 10 mg/ml, mais preferivelmente entre 500 pg/ml e 5 mg/ml, e ainda mais preferivelmente entre 1 mg/ml e 5 mg/ml (tal como cerca de 2,5 mg/ml).

Por exemplo, a 50 mM (i.e. cerca de 15,8 mg/ml) o EDTA numa concentração de Blad de 1 mg/ml ou 2,5 mg/ml pode ser utilizado e.g. para inibir o crescimento de B. cinerea ou 13 F. oxysporum, respectivamente. Esta é uma verificação surpreendente dado que o Blad, por si só, precisa de ser utilizado em cerca de 5 mg/ml ou 10 mg/ml (respectivamente) para inibir o crescimento destes patogénios. As verificações dos inventores permitem a) a utilização eficaz de agentes antimicrobianos (que são eficazes contra patogénios de plantas) em menores concentrações através da utilização de um agente quelante ou b) uma eficácia aumentada de agentes antimicrobianos (que são eficazes contra patogénios de plantas) em concentrações padrão através da utilização de um agente quelante. Isto permite uma utilização mais económica/eficaz destes antimicrobianos para prevenir ou tratar a infecção de uma planta (ou uma sua parte) por um microorganismo.

Utilizações e métodos

Os inventores proporcionam também a utilização de uma composição da invenção para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas numa planta. Para este fim, proporcionam também um método para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas compreendendo a administração a uma planta disso necessitada de uma composição da invenção (e.g. uma quantidade eficaz da referida composição).

Os inventores proporcionam também a utilização de um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas, para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas numa planta. Proporcionam também a utilização de um agente quelante para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas. Para este fim proporcionam também: a) um método para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas compreendendo a administração, a uma planta disso necessitada, de um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas (e.g. uma quantidade eficaz de uma combinação dos referidos agentes); e b) um método para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para 14 plantas, compreendendo a utilização do referido antimicrobiano com um agente quelante.

Nestas concretizações o referido agente antimicrobiano e o referido agente quelante podem ser administrados à referida planta como parte da mesma composição ou separadamente. Se estes dois agentes são administrados separadamente, então a administração pode ser sequencial (com qualquer dos agentes administrado primeiro) ou simultânea. A administração a uma planta pode ser conseguida, por exemplo, aplicando (e.g. pulverizando) os agentes (ou a composição compreendendo os referidos agentes) sobre uma planta (ou uma qualquer sua parte) ou imergindo a planta ou uma sua parte {e.g. semente) numa solução ou soluções apropriada(s).

Quando um agente quelante é utilizado para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas, o referido agente quelante (e a sua concentração) é preferivelmente seleccionado de modo tal que a combinação do referido agente antimicrobiano e do referido agente quelante proporciona um nível acrescido de inibição do crescimento e/ou morte de um microorganismo patogénico para plantas (e.g. tal que seja conseguido um nível acrescido de prevenção ou inibição de infecção da planta e.g. seja conseguido um nível acrescido de prevenção ou inibição de danos nos tecidos da planta), preferivelmente em comparação com condições equivalentes onde o agente quelante não está presente.

Nas concretizações da utilização/método da invenção o agente antimicrobiano e o agente quelante são como descrito em detalhe acima. A planta necessitada de uma combinação de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas e um agente quelante pode ser qualquer planta que esteja em risco de contrair uma infecção ou que tenha uma infecção, em que a referida infecção é causada por um microorganismo patogénico para plantas. Preferivelmente, a planta é uma planta agrícola (e.g. qualquer planta que é criada para ser colhida para proporcionar alimento, forragem, combustível, fibra, ou qualquer outro produto com valor 15 comercial). Preferivelmente, a referida planta agrícola é uma planta agrícola alimentar, tal como uma planta gue proporciona um açúcar (e.g. beterraba sacarina, cana-de-açúcar) , um fruto (incluindo um fruto seco), um vegetal ou uma semente. As plantas particulares gue proporcionam sementes incluem cereais (e.g. milho, trigo, cevada, sorgo, painço, arroz, aveias e centeio) e legumes (e.g. feijões, ervilhas e lentilhas).

Exemplos

Nos Exemplos seguintes BLAD significa o glico-oligómero contendo Blad de ocorrência natural compreendendo o polipéptido Blad de 20 kD, purificado segundo Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 26-34: vejam-se as partes "Plant material and growth conditions" e "Purification of proteins" da secção de Materiais e Métodos desse documento.

Definições: MIC - Concentração Inibitória Mínima: a menor concentração de um antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um microorganismo. MFC/MBC - Concentração Fungicida/Bactericida Mínima (ou Concentração Letal Mínima): a menor concentração de um agente antimicrobiano necessária para matar 99,9% do inoculo inicial após 24 h num cenário normalizado de condições.

Exemplo 1 - Efeito sinérgico de EDTA em relação à actividade bactericida de BLAD. A. Verificou-se que o BLAD é bacteriostático a 100 pg/ml e bactericida a 250 pg/ml contra P. aeruginosa. Contra P. aeruginosa, o BLAD a 50 pg/ml ou o EDTA a 1 mg/ml inibem o crescimento (i.e. ambos são bacteriostáticos) mas uma combinação dos dois é bactericida. B. Contra Erwinia pirsicina, o BLAD tem uma MIC de 32 pg/ml e o EDTA tem uma MIC de 15 mM. Contudo, na presença de quantidades sub-inibitórias de EDTA (0,75 mM) a MIC para o BLAD é diminuída para 16 pg/ml. 16 C. Contra Streptomyces griseus, o BLAD tem uma MIC de 1024 pg/ml e o EDTA tem uma MIC de 16 mM. Contudo, na presença de quantidades sub-inibitórias de EDTA (8 mM) a MIC para o BLAD é diminuída para 256 pg/ml.

Exemplo 2 - Efeito sinérgico de EDTA em relação à actividade fungicida de BLAD.

Dados de inibição de halos para BLAD com e sem EDTA, contra Botrytis cinerea em Ágar de Dextrose de Batata (PDA) a 1,2% p/v de ágar (incubação de 3 dias a 25°C):

Agente(s) Diâmetro do de inibição halo (mm) Diâmetro médio do halo de inibição (mm) Blad (200 pg) 21 21 22 21 Blad (100 pg) 16 16 15 16 Blad (50 pg) 0 0 0 0 Blad (20 pg) 0 0 0 0 EDTA (5 0 mM) 0 0 0 0 Blad (200 pg) + EDTA (50 mM) 23 24 25 24 Blad (100 pg) + EDTA (50 mM) 19 19 18 19 Blad (50 pg) + EDTA (50 mM) 13 15 14 14 Blad (20 pg) + EDTA (50 mM) 10 12 12 11 0 crescimento de B. cinera foi inibido com 200 pg e 100 pg de BLAD. Esta inibição foi potenciada com a adição de 50 mM (aproximadamente 15,8 mg/ml) de EDTA. Não se observou inibição do crescimento utilizando BLAD sozinho a 20 pg ou a 50 pg ou utilizando EDTA sozinho a 50 mM. Contudo, observou-se inibição quando o BLAD em ambas estas concentrações foi combinado com EDTA 50 mM. 17

Dados de halos de inibição para BLAD com e sem EDTA, contra Fusarium oxysporum em Ágar de Dextrose de Batata (PDA) a 1,2% p/v de ágar (incubação de 3 dias a 25°C):

Agente(s) Diâmetro do de inibição halo (mm) Diâmetro médio do halo de inibição (mm) Blad (200 pg) 25 22 22 23 Blad (100 pg) 0 0 0 0 Blad (50 pg) 0 0 0 0 Blad (20 pg) 0 0 0 0 EDTA (50 mM) 0 0 0 0 Blad (200 pg) + EDTA (50 mM) 28 27 30 28 Blad (100 pg) + EDTA (50 mM) 22 21 26 23 Blad (50 pg) + EDTA (50 mM) 24 20 15 20 Blad (10 pg) + EDTA (50 mM) 0 0 0 0 0 crescimento de F. oxysprum foi inibido com 200 pg de BLAD. Esta inibição foi potenciada com a adição de 50 mM de EDTA. Não se observou inibição de crescimento utilizando BLAD sozinho a 20 pg, 50 pg ou 100 pg, ou utilizando EDTA sozinho a 50 mM. Contudo, observou-se inibição quando 50 pg ou 100 pg de BLAD foram combinados com EDTA 50 mM.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> CEV Biotecnologia das Plantas, S.A. <120> Agentes para utilização com antimicrobianos <140> <141> <160> 4 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1791

<212> ADN <213> Lupinus albus 18 <400> 1 gatggcgatg aatgaacact gcgtttgctg gctttgatga aaatcgagtg caacctaata 60 taatcaaata tgggtaagat gagagtgagg tttccaacgt tagtgttggt actaggaata 120 gtattcctca tggcagtgtc aattggtatt gcttatggag aaaaagatgt gctaaagagt 180 catgagaggc ctgaggaaag agaacaagag gagtggcaac ctaggagaca acgacctcaa 240 agtagaaggg aagagagaga gcaagagcaa gagcagggtt ctccctcata cccacgcagg 300 cagagtggtt atgagaggag acaataccat gagaggagtg agcagaggga agagagagag 360 caagaacaac aacaaggttc tccctcatac tcacgtagac aaaggaaccc ttatcacttc 420 agctctcaaa gattccaaac tctttacaaa aataggaatg gcaaaatccg tgtgctcgag 480 aggtttgacc aaagaaccaa tagacttgag aatctccaaa actaccgcat tgttgagttc 540 caatcaaaac ctaacactct cattctccct aaacactctg atgctgacta cgtcctcgtt 600 gtactcaatg gtagagccac aatcacgata gtaaaccctg atagaagaca agcatataac 660 cttgagtatg gcgatgctct cagaatccca gctggctcaa cttcatatat ccttaacccg 720 gatgacaacc agaagcttag agtagtcaag ctcgcaatac ccatcaacaa tcctggctac 780 ttttatgatt tctatccatc gagtactaaa gaccaacaat cctacttcag tggcttcagc 840 aggaacactt tagaggccac cttcaatact cgttatgaag agatacaaag gattatttta 900 gggaatgagg atgagcaaga atatgaggaa caaaggcgtg ggcaagagca gagcgaccaa 960 gacgaggggg tgatagtgat agtttcaaag aaacagatcc aaaaattgac aaaacacgct 1020 caatcttcat caggaaaaga caaaccctct gattctggcc ccttcaactt gagaagcaat 1080 gagcccatat attcaaacaa gtatgggaac ttctatgaaa tcactccaga tagaaaccct 1140 caagttcagg atttgaatat ctctctcacc tatataaaaa ttaacgaggg agctttgttg 1200 ttgccacact ataactcaaa ggccatatat gtagtcgtgg ttgatgaagg agaaggaaat 1260 tatgaactgg taggtattcg agatcaacaa cgacaacaag atgagcaaga agagaaagag 1320 gaagaagtga taaggtatag tgctagatta tcagaaggtg acatttttgt aattccagca 1380 ggttatccaa tttccatcaa tgcttcctca aatcttcgct tgcttggatt tggcatcaat 1440 gctgatgaaa accagaggaa tttcctcgca ggttctaaag acaatgtgat aaggcagtta 1500 gatagagcag tgaatgagct cacattccct ggttctgctg aagatattga gagattaatc 1560 aaaaaccaac aacagtctta ctttgcaaat ggtcagcctc aacaacaaca acaacaacaa 1620 agtgagaagg agggaaggcg tggaagaagg ggttcatctc ttccattttg agcacttttt 1680 actaagctgt tttaaaagct actatcatgt aagagctcat agtgagctac tgagagaata 1740 ataaaactaa agttggacct ttgtactaat aatgttaata aaaaaaaaaa a 1791 19 <210> 2 <211> 533

<212> PRT <213> Lupinus albus <400> 2

Met Gly Lys Met Arg Vai Arg Phe Pro Thr Leu Vai Leu Vai Leu Gly 15 10 15

Ile Vai Phe Leu Met Ala Vai Ser Ile Gly Ile Ala Tyr Gly Glu Lys 20 25 30

Asp Vai Leu Lys Ser His Glu Arg Pro Glu Glu Arg Glu Gin Glu Glu 35 40 45

Trp Gin Pro Arg Arg Gin Arg Pro Gin Ser Arg Arg Glu Glu Arg Glu 50 55 60

Gin Glu Gin Glu Gin Gly Ser Pro Ser Tyr Pro Arg Arg Gin Ser Gly 65 70 75 80

Tyr Glu Arg Arg Gin Tyr His Glu Arg Ser Glu Gin Arg Glu Glu Arg 85 90 95

Glu Gin Glu Gin Gin Gin Gly Ser Pro Ser Tyr Ser Arg Arg Gin Arg 100 105 110

Asn Pro Tyr His Phe Ser Ser Gin Arg Phe Gin Thr Leu Tyr Lys Asn 115 120 125

Arg Asn Gly Lys Ile Arg Vai Leu Glu Arg Phe Asp Gin Arg Thr Asn 130 135 140

Arg Leu Glu Asn Leu Gin Asn Tyr Arg Ile Vai Glu Phe Gin Ser Lys 145 150 155 160

Pro Asn Thr Leu Ile Leu Pro Lys His Ser Asp Ala Asp Tyr Vai Leu 165 170 175

Vai Vai Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ile Vai Asn Pro Asp Arg 180 185 190

Arg Gin Ala Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Ala Leu Arg Ile Pro Ala 195 200 205 20 Phe Vai Ile Pro Ala 435

Gly Ser Thr Ser Tyr 210 Vai Vai Lys Leu Ala 225 Phe Tyr Pro Ser Ser 245 Ser Arg Asn Thr Leu 260 Gin Arg Ile Ile Leu 275 Arg Arg Gly Gin Glu 290 Vai Ser Lys Lys Gin 305 Ser Gly Lys Asp Lys 325 Asn Glu Pro Ile Tyr 340 Pro Asp Arg Asn Pro 355 Ile Lys Ile Asn Glu 370 Ala Ile Tyr Vai Vai 385 Vai Gly Ile Arg Asp 405 Glu Glu Glu Vai Ile 420 lie Leu Asn Pro Asp Asp 215 lie Pro Ile Asn Asn Pro 230 235 Thr Lys Asp Gin Gin Ser 250 Glu Ala Thr Phe Asn Thr 265 Gly Asn Glu Asp Glu Gin 280 Gin Ser Asp Gin Asp Glu 295 Ile Gin Lys Leu Thr Lys 310 315 Pro Ser Asp Ser Gly Pro 330 Ser Asn Lys Tyr Gly Asn 345 Gin Vai Gin Asp Leu Asn 360 Gly Ala Leu Leu Leu Pro 375 Vai Vai Asp Glu Gly Glu 390 395 Gin Gin Arg Gin Gin Asp 410 Arg Tyr Ser Ala Arg Leu 425 Gly Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Gin Lys Leu Arg 220 Gly Tyr Phe Tyr Asp 240 Tyr Phe Ser Gly Phe 255 Arg Tyr Glu Glu Ile 270 Glu Tyr Glu Glu Gin 285 Gly Vai Ile Vai Ile 300 His Ala Gin Ser Ser 320 Phe Asn Leu Arg Ser 335 Phe Tyr Glu Ile Thr 350 Ile Ser Leu Thr Tyr 365 His Tyr Asn Ser Lys 380 Gly Asn Tyr Glu Leu 400 Glu Gin Glu Glu Lys 415 Ser Glu Gly Asp Ile 430

Asn Ala Ser Ser Asn 445 440 21 Leu Arg Leu 450

Leu Gly Phe Gly 455

Ile Asn Ala Asp Glu Asn Gin Arg Asn 460

Phe Leu Ala 465

Gly Ser Lys Asp Asn Vai 470

Ile Arg Gin Leu 475

Asp Arg Ala 480

Vai Asn Glu Leu Thr Phe Pro 485

Gly Ser Ala Glu Asp Ile 490

Glu Arg Leu 495

Ile Lys Asn Gin Gin Gin Ser 500

Tyr Phe Ala Asn Gly Gin 505

Pro Gin Gin 510

Gin Gin Gin Gin Gin 515

Ser Glu Lys Glu 520

Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly 525

Ser Ser Leu Pro Phe 530 <210> 3 <211> 519

<212> ADN <213> Lupinus albus <400> 3 cgtagacaaa ggaaccctta tcacttcagc tctcaaagat tccaaactct ttacaaaaat 60 aggaatggca aaatccgtgt gctcgagagg tttgaccaaa gaaccaatag acttgagaat 120 ctccaaaact accgcattgt tgagttccaa tcaaaaccta acactctcat tctccctaaa 180 cactctgatg ctgactacgt cctcgttgta ctcaatggta gagccacaat cacgatagta 240 aaccctgata gaagacaagc atataacctt gagtatggcg atgctctcag aatcccagct 300 ggctcaactt catatatcct taacccggat gacaaccaga agcttagagt agtcaagctc 360 gcaataccca tcaacaatcc tggctacttt tatgatttct atccatcgag tactaaagac 420 caacaatcct acttcagtgg cttcagcagg aacactttag aggccacctt caatactcgt 480 tatgaagaga tacaaaggat tattttaggg aatgaggat 519 <210> 4 <211> 173

<212> PRT <213> Lupinus albus <400> 4

Arg Arg Gin Arg Asn Pro Tyr His Phe Ser Ser Gin Arg Phe Gin Thr 15 10 15 22

Leu Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Lys Ile Arg Vai Leu Glu Arg Phe Asp 20 25 30

Gin Arg Thr Asn Arg Leu Glu Asn Leu Gin Asn Tyr Arg Ile Vai Glu 35 40 45

Phe Gin Ser Lys Pro Asn Thr Leu Ile Leu Pro Lys His Ser Asp Ala 50 55 60

Asp Tyr Vai Leu Vai Vai Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ile Vai 65 70 75 80

Asn Pro Asp Arg Arg Gin Ala Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Ala Leu 85 90 95

Arg Ile Pro Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Leu Asn Pro Asp Asp Asn 100 105 110

Gin Lys Leu Arg Vai Vai Lys Leu Ala Ile Pro Ile Asn Asn Pro Gly 115 120 125

Tyr Phe Tyr Asp Phe Tyr Pro Ser Ser Thr Lys Asp Gin Gin Ser Tyr 130 135 140

Phe Ser Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Thr Phe Asn Thr Arg 145 150 155 160

Tyr Glu Glu Ile Gin Arg Ile Ile Leu Gly Asn Glu Asp 165 170

Lisboa, 2010-10-12

Claims

1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização caracterizada por se utilizarem um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas, para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas numa planta.

2. Utilização caracterizada por se utilizar um agente quelante para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizada por o referido agente quelante e o referido antimicrobiano serem aplicados a uma planta disso necessitada.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 3 caracterizada por o referido agente antimicrobiano e o referido agente quelante serem administrados à referida planta: a) como parte da mesma composição; ou b) separadamente, seja sequencialmente ou simultaneamente.

5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por o agente antimicrobiano ser eficaz contra uma bactéria ou um fungo patogénicos para plantas.

6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por o agente antimicrobiano compreender um polipéptido.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 6 caracterizada por o referido polipéptido compreender Blad ou uma sua variante activa.

8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizada por o agente quelante ser um poliaminocarboxilato, preferivelmente EDTA.

9. Método para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas, caracterizado por compreender a administração, a uma planta disso necessitada, 2/2 de um agente quelante e de um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas.

10. Método para aumentar a actividade de um antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas caracterizado por compreender a utilização do referido antimicrobiano com um agente quelante.

11. Composição caracterizada por compreender um agente quelante e um agente antimicrobiano que é eficaz contra um microorganismo patogénico para plantas.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por o agente antimicrobiano ser eficaz contra uma bactéria ou um fungo patogénicos para plantas, preferivelmente um fungo.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11 ou a reivindicação 12 caracterizada por o agente antimicrobiano compreender um polipéptido.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13 caracterizada por o referido polipéptido compreender Blad ou uma sua variante activa.

15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14 caracterizada por o agente quelante ser um poliaminocarboxilato, preferivelmente EDTA.

16. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15 caracterizada por a utilização ser para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas numa planta.

17. Método para inibir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico para plantas, caracterizado por compreender a administração a uma planta disso necessitada de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15. Lisboa, 2011-01-21