CN103347387B - 螯合剂和肽类抗菌剂化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的应用，以抑制植物中植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物；一种螯合物在增加对植物病原微生物有效的抗菌剂的活性中的应用；一种抑制植物中植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物的方法，包括给有需要的植物使用螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂；以及一种增加对植物病原微生物有效的抗菌剂的活性的方法，包括和螯合剂一起使用所述抗菌剂。本发明还提供了一种含螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的组合物，该组合物在抑制植物中植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物中的应用，以及一种抑制植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物的方法，包括给有需要的植物使用所述组合物。本发明进一步提供了含抗菌多肽组合物的应用，以杀死，或抑制植物中植物病原菌的生长，所述抗菌多肽含Blad或其活性变体，所述方法包括给所述植物使用含有效剂量抗菌多肽的组合物，该抗菌多肽包含Blad或其活性变体。

Description

螯合剂和肽类抗菌剂化合物的应用

技术领域

本发明涉及作用于植物病原体的抗菌剂领域。

背景技术

植物病原体的控制和农作物保护是全球范围的危急问题，随最近全球人口数量的增加和伴随的食品短缺成为越来越令人担忧的问题。此外，现代农业操作涉及收获和储存，这更易于给病原体的生长提供了良好的条件。

化学农药的使用已经成为虫害控制的标准方法。但是，现在使用的杀虫剂表现出许多严重的缺点。如，许多杀虫剂对环境有负面影响和许多杀虫剂具有低效力或逐渐降低的效力。其中尤其令人担忧的是其中许多化合物的低效和/或窄谱活性，以及伴随的病原体抗性的增加。

本发明目的在于试图提供以上问题的解决方法，以及尤其的比如，提供一种改进对植物病原微生物有效的抗菌剂活性的方法。

发明内容

本发明人惊讶的发现螯合剂可以协同性的加强对植物病原微生物有效的抗菌剂的效力。因此，本发明提供了：

i)螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的应用，以抑制植物中植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物；和

ii)螯合剂在增加对植物病原微生物有效的抗菌剂活性中的应用。

在优选的具体实施方式中，所述螯合剂和所述抗菌剂为应用于有需要的植物，优选的其中所述的抗菌剂和所述的螯合剂施用于所述植物：

a)作为同一组合物的一部分；或

b)分别地，或相继地或同时地。

在优选的具体实施例中，所述抗菌剂为对植物病原细菌或真菌是有效的。在优选的具体实施例中所述抗菌剂包含一个抗菌多肽，优选的其中所述多肽包含Blad或其活性变体。在优选的具体实施例中所述螯合剂为聚氨羧酸盐，优选的为EDTA。

本发明还提供了：

一种抑制植物病原微生物生长和/或杀死该微生物的方法，包括给有需要的植物使用螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂；以及

一种增加对植物病原微生物有效的抗菌剂活性的方法，包括和螯合剂一起使用所述抗菌剂。

进一步的，本发明提供了一种包含螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的组合物。优选的，所述抗菌剂对植物病原细菌或真菌有效，优选的为对真菌有效。在优选的具体实施方式中，所述抗菌剂包含一个多肽，优选的其中所述多肽包含Blad或其活性变体。在优选的具体实施方式中所述螯合剂为聚氨羧酸盐，优选的为EDTA。

本发明还提供了一种本发明中组合物的应用，用来抑制植物中病原微生物的生长和/或杀死该微生物，以及一种抑制植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物的方法，包括给有需要的植物使用本发明的组合物。

本发明人惊讶的发现源自羽扇豆(Lupinus)的Blad多肽表现出对许多各种对植物致病的细菌微生物具有有效的抗菌活性。

因此，本发明提供了一种含抗菌多肽的组合物在抑制植物中病原微生物的生长和/或杀死该微生物中的应用，所述抗菌多肽包含Blad或其活性变体。优选的所述组合物进一步包括螯合剂。在优选的具体实施例中，所述微生物是选自以下种属的病原种类：假单胞菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)和链霉菌(Streptomyces)。在优选的具体实施方式中，所述组合物用于有需要的植物中。

本发明还提供了一种杀死、或抑制植物中植物病原菌生长的方法，所述方法包括给所述植物使用包含有效剂量抗菌多肽的组合物，所述抗菌多肽包含Blad或其活性变体。

附图说明

图1显示白花羽扇豆(Lupinus albus)β球蛋白前体编码序列(SEQ ID NO：1)；以及

图2显示对应于Blad的β-球蛋白前体的内部片段的编码序列，(SEQ ID NO：3)。

具体实施方式

本发明人发现，当将螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂联合使用时，该联合使用对抑制植物病原微生物的生长和/或杀死该病原微生物尤其有效。因此，本发明一个方面提供了一种包括，或主要包括，螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的组合物。一种包含螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的组合物其也可以是包含由本领域技术人员添加了其他化合物的配方。

抗菌剂

所述抗菌剂为能减少对植物致病的微生物的生长或杀死该微生物的任意试剂。所述微生物优选的为细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)或真菌，优选的为真菌(可以是酵母或霉菌)。优选的，所述抗菌剂包含(或主要包含)一多肽，如抗真菌蛋白。该抗真菌蛋白合适的例子包括甲壳质酶、甲壳质绑定蛋白、壳聚糖酶、β-1，3-葡聚糖酶和β-N-乙酰-D-葡糖胺糖苷酶。优选的可以作为所述抗菌剂目标的微生物的例子会在下文描述。

Blad多肽

在优选的具体实施例中，所述抗菌剂包括(或主要包括)一多肽，所述多肽包括(或主要包括)Blad或其活性变体。

Blad(″banda de Lupinus albus doce″-band from sweet L.albus，名称源自白花羽扇豆)是以β-球蛋白的稳定的中间的分解产物命名的，是羽扇豆属(Lupinus)的种子中主要的储存蛋白。Blad为一个20kD的多肽，由173个氨基酸残基组成，并由羽扇豆中的β-球蛋白前体的编码基因(1791个核苷酸，GenBank中储存的收录编号为AAS97865)的内部片段(519个核苷酸，GenBank中储存的收录编号为ABB13526)所编码。当编码Blad末端序列的引物用于扩增羽扇豆DNA基因组序列时，可以得到一个大约620bp的产物，表明在编码Blad的基因片段中有一个内含子存在。天然形成的Blad是210kD的低聚糖的主要成分，该低聚糖在开始发芽之后的4-12天，特异的聚集于羽扇豆的子叶中(随后β-羽扇豆球蛋白发生密集的限制性蛋白水解)。同时，所述低聚物被糖基化，天然形成的Blad是非糖基化的。含Blad的寡聚糖由多个多肽组成，其中主要的几个分子量分别为14、17、20、32、36、48和50kD。该20kD的多肽Blad，是至今为止低聚物中最丰富的多肽，并且可能是唯一一个具有凝集素活性的多肽。天然形成的Blad在8天龄植物子叶总蛋白中占大约80％。

图13显示所述白花羽扇豆(L.albus)β-球蛋白前体的编码序列(SEQ ID NO：1)。β-球蛋白母亚基编码序列位于70-1668位残基。编码的533氨基酸残基β-球蛋白母亚基(SEQ ID NO：2)为：

MGKMRVRFPTLVLVLGIVFLMAVSIGIAYGEKDVLKSHERPEEREQEEWQPRRQRPQSRREEREQEQEQGSPSYPRRQSGYERRQYHERSEQREEREQEQQQGSPSYSRRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNLILPKHSDADYVLVVLNGRATIIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSSYILNPDDNQKLRWKLAIPINNPGYFYDFYPSSKDQQSYFSGFSRNTLEAFNTRYEEIQRIILGNEDEQEYEEQRRGQEQSDQDEGVIVIVSKKQIQKLTKHAQSSSGKDKPSDSGPFNLRSNEPIYSNKYGNFYEIPDRNPQVQDLNISLTYIKINEGALLLPHYNSKAIYWWDEGEGNYELVGIRDQQRQQDEQEEKEEEVIRYSARLSEGDIFVIPAGYPISINASSNLRLLGFGINADENQRNFLAGSKDNVIRQLDRAVNELTFPGSAEDIERLIKNQQQSYFANGQPQQQQQQQSEKEGRRGRRGSSLPF

图14显示了对应Blad的β-球蛋白前体内部片段的编码序列(SEQ ID NO：3)。该Blad多肽(SEQ ID NO：4)为：

RRQRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLILPKHSDADYVLVVLNGRATIIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGSSYILNPDDNQKLRWKLAIPINNPGYFYDFYPSSKDQQSYFSGFSRNTLEAFNTRYEEIQRIILGNED

因此当抗菌剂包含(或主要包含)抗菌多肽，所述抗菌多肽含(或主要包含)blad或其活性变体，所述抗菌剂包含(或主要包含)一多肽序列，该序列包含(或主要包含)SEQ ID NO：4的多肽序列或其活性变体。

Blad的活性变体是指保持了作为抗菌剂的能力(即具有抗菌活性-参照以下关于该活性水平和如何测量的说明)的Blad变体。“blad的活性变体”包括在其范围内的一个SEQ ID NO：4片段。在优选的具体实施例中，SEQ ID NO：4片段为选自为SEQ ID NO：4序列长度的至少10％，优选的为至少其长度的20％，优选的为至少其长度的30％，优选的为至少其长度的40％，优选的为至少其长度的50％，优选的为至少其长度的60％，优选的为至少其长度的70％，优选的为至少其长度的80％，优选的为至少其长度的90％，以及最优选的为至少SEQ ID NO：4序列长度的95％。Blad或其变体通常具有至少10个氨基酸残基的长度，如至少20个、25个、30个、40个、50个、60个、80个、100个、120个、140个、160个或173个氨基酸残基的长度。

“Blad的活性变体”还包括在其范围内的一个与SEQ ID NO：4同源的多肽序列，比如至少40％相同，优选的至少60％相同，优选的至少70％相同，优选的至少80％相同，优选的至少85％相同，优选的至少90％相同，优选的至少95％相同，优选的至少97％相同，以及最优选的至少99％相同，例如，超过全序列或超过至少20个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少30个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少40个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少50个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少60个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少80个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少100个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少120个连续氨基酸残基区域，优选的超过至少140个连续氨基酸残基区域，以及最优选的超过至少160或更多的连续氨基酸残基的区域。测量蛋白同源性的方法是本领域公知常识，而且在本文内容中本领域技术人员可以理解同源性是基于相同氨基酸而计算的(有时也称为“硬同源”)。

具有同源活性的Blad变体典型的是通过取代，插入或缺失从而与SEQ ID NO：4多肽序列区别开来的，例如，通过1、2、3、4、5到8或更多位取代，缺失或插入的方式。该取代更多为“保守的”，也即，一个氨基酸可能被另一个相似氨基酸取代，相似氨基酸可以借由为以下组的其中一个：芳香残基(F/H/W/Y)，非极性脂肪族残基(G/A/P/I/L/V)，极性不带电脂肪族残基(C/S/T/M/N/Q)和极性带电脂肪族残基(D/E/K/R)。优选的亚族包括：G/A/P；I/L/V；C/S/T/M；N/Q；D/E；和K/R。

一种含Blad或其活性变体的抗菌多肽(如上所述)可能由在N末端和/或C末端添加了任意数量的氨基酸的Blad或其活性变体组成，并且该抗菌多肽保持了抗菌活性(再次参照以下关于所述活性水平和如何测量的说明)。优选的，不超过300个氨基酸残基添加至Blad或其活性变体的一个末端或者两个末端，更优选的，不超过200个氨基酸残基添加至Blad或其活性变体的一个末端或者两个末端，更优选的，不超过150个氨基酸残基添加至Blad或其活性变体的一个末端或者两个末端，更优选的，不超过100个氨基酸残基添加至Blad或其活性变体的一个末端或者两个末端，更优选的，不超过80、60、或40个氨基酸残基添加至Blad或其活性变体的一个末端或者两个末端，最优选的，不超过20氨基酸残基添加至Blad或其活性变体的一个末端或者两个末端。

一种包括(或主要包括)Blad或其活性变体的抗菌多肽(如上所述)可以以纯化的形式(例如，从植物、动物或微生物来源中提取)和/或重组蛋白形式。重组形式的产品使得能够产生Blad的活性变体。

本领域已经公开了纯化天然形成的Blad的方法(如，Ramos et al.(1997)Planta 203(1)：26-34和Monteiro et al.(2010)PLoS ONE 5(1)：e8542)。天然形成的Blad的一个合适的来源为一种羽扇豆属植物，如白色羽扇豆(Lupinus albus)，优选的，所述为所述植物的子叶，优选的，取在发芽开始后大约4到14天收获，更优选的，取在发芽开始后大约6到12天收获(如，发芽开始后的8天收获)。本领域已经公开了获得含Blad的粗提的全蛋白提取物的方法，以及对上述提取物纯化从而获得部分纯化提取物的蛋白纯化方法，如包含Blad的低聚糖构成的Blad。

可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和/或，优选的，采用C-18柱反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分离Blad本身。

另一种获得含Blad的低聚糖的部分纯化提取物的方法是利用了Blad的甲壳素绑定活性。所述低聚糖与甲壳素柱以强有力的形式结合，作为甲壳素亲和色谱纯化的一部分，以0.05N HCl洗脱。所述纯化方法的实施例详细说明如下：

收获8天龄的羽扇豆植物的子叶并在含10mM CaCl₂和10mM MgCl₂的Milli-Q plus中加水匀浆(pH调至8.0)。匀浆通过粗棉布过滤并30,000转，4℃离心1小时。随后取沉淀物并悬浮于pH7.5的100Mm三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液中，该缓冲液含重量体积比为10％(w/v)的NaCl，10mM EDTA和10mM EGTA，4℃搅拌1小时，并在4℃，3000转离心1小时。上清中的总球蛋白片段用硫酸铵(561g/L)沉淀，低温搅拌1小时并在4℃，3000转离心30分钟。所得的颗粒沉淀物溶解在pH 7.5，50mM的Tris-HCl缓冲液中，在用相同缓冲液平衡过的PD-10柱中脱盐并通过在相同缓冲液中预平衡了的甲壳素亲和层析柱。该柱用pH7.5，50mMTris-HCl缓冲液冲洗，并且将该结合蛋白用0.05NHCl洗脱。该洗脱物片段立即用2M Tris中和，并用SDS-PAGE收集其峰值区的洗脱物片段，冻干并分析。

甲壳素柱的制备，从Sigma公司购买粗甲壳素并做以下处理：甲壳素样品用Milli-Qplus加水充分洗涤，然后用0.05NHCl充分洗涤。然后用重量体积比为1％(w/v)的碳酸钠洗涤，之后用乙醇洗涤，直至洗到光吸收度小于0.05。将甲壳素装入移液管端部并用pH7.5，50mMTris-HCl平衡。

生产重组蛋白的方法为本领域公知常识。其在本发明中使用的方法涉及将编码含Blad或其活性变体的多肽的多核苷酸插入到合适的表达载体上，使得所述多核苷酸与一个或多个启动子(如诱导性启动子，如T7lac)以及其他目的多核苷酸或目的基因并置，将表达受体引入到合适的细胞或者组织中(比如，大肠杆菌E.Coli)，在转化细胞或组织中表达该多肽，并将表达的重组多肽从细胞或组织中提取。表达载体可以包含多核苷酸额外编码的构建以辅助纯化，例如，一个末端标签可以辅助纯化：例如，用于亲和纯化的一个组氨酸残基标签。一旦该重组多肽被纯化，纯化标签可以从多肽中去除。比如，通过溶蛋白性裂解。

在一个包含含有(或主要含有)Blad或其活性变体的抗菌多肽的组合物中，所述多肽优选的为以部分纯化的形式，更优选的以纯化的形式。当在缺少一种或多种天然与之相连的多肽的环境中和/或为至少10％总蛋白的多肽代表时，所述多肽为部分纯化形式。当在一个缺少全部，或多数与之天然相连的其他多肽的环境中时，所述多肽为纯化的形式。例如，纯化的Blad是指组合物中Blad代表了至少50％的总蛋白，至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的总蛋白。

在一个包含含有(或主要含有)Blad或其活性变体的抗菌多肽的组合物中，所述羽扇豆蛋白含量可能主要由含多肽的Blad-低聚糖组成，该多肽含(或主要包含)Blad或其变体。

植物病原微生物

抗菌剂对之有效的植物病原微生物是能在植物中或植物内引起疾病的任何微生物。尤其优选的目标细菌包括病原假单胞菌类(Pseudomonas)如铜绿假单胞(Pseudomonasaeruginosa)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、托拉斯假单胞菌(Pseudomonastolaasii)以及蘑菇假单胞菌(Pseudomonas agarici)(优选的为丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae))；病原欧文氏菌类(Erwinia)如桃色欧文氏菌(Erwiniapersicina)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、菊欧文氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)、番石榴欧文氏菌(Erwinia psidii)和嗜管欧文氏菌(Erwinia tracheiphila)，以及致病链霉菌类(Streptomyces)如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。

尤其优选的目标真菌包括病原链格孢菌类(Altemaria)如互隔交链孢霉(Altemariaalternata)、乔木链格孢(Alternaria arborescens)、果园链格孢菌(Alternariaarbusti)、芸苔链格孢菌(Alternaria brassicae)、橄榄链格孢菌(Alternariabrassicicola)、Alternaria carotiincultae、刺蛾链格孢菌(Alternaria conjuncta)、胡萝卜链格孢菌(Alternaria dauci)、大戟生链格孢菌(Alternaria euphorbiicola)、梨黑斑链格孢菌(Alternaria gaisen)、感染链格孢菌(Alternaria infectoria)、日本链格孢菌(Alternaria japonica)、洋芫荽链格孢菌(Alternaria petroselini)、Alternaria selini、索兰尼链格孢菌(Alternaria solani)和Alternaria smyrnii，以及病原镰刀霉类(Fusarium)如尖孢镰刀霉(Fusarium oxysporum)和禾谷镰刀霉(Fusarium graminearum)(优选的为尖孢镰刀霉(Fusarium oxysporum))；病原葡萄孢菌类(Botrytis)如灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)以及病原炭疽菌类(Colletotrichum)如尖孢炭疽菌(Colletotrichumactuatum)、马铃薯炭疽菌(Colletotrichum coccodes)、辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)、壳皮炭疽菌(Colletotrichum crassipes)、荔枝炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、卡哈瓦刺盘孢菌(Colletotrichum kahawae)、菜豆炭疽菌(Colletotrichum lindemuthianum)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、黑刺盘孢炭疽菌(Colletotrichum nigrum)、西瓜炭疽菌(Colletotrichum orbicular)、豌豆炭疽菌(Colletotrichum pisi)和亚线孢炭疽菌(Colletotrichum sublineolum)。

螯合剂

所述螯合剂(也称螯合剂，络合剂或多价螯合剂)可以是与金属离子结合的以形成非共价复合物以及减少离子活性的任意化合物。合适的螯合剂包括多胺羧酸盐，如EDTA(乙二胺四乙酸)和EGTA(乙二醇-双-(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸)。优选的，螯合剂为EDTA，优选的EDTA浓度至少为10μg/ml，至少为50μg/ml，至少为100μg/ml，至少为500μg/ml，直到浓度为1mg/ml，直到浓度为5mg/ml，直到浓度为10mg/ml，直到浓度为20mg/ml。优选的，EDTA使用浓度为在0.1mg/ml和20mg/ml之间，更优选的为在1mg/ml和20mg/ml之间。

结果

该抗菌剂与螯合剂联合，可以用于抑制植物病原微生物的生长(即其具有抑菌活性)和/或杀死所述微生物(即其具有杀菌活性)。本领域技术人员能够通过常规方法确定一个该抗菌剂合适的剂量和/或浓度，和所选螯合剂特定浓度，以实现生长抑制或杀死该微生物的特定的需要。优选的，所述抗菌剂和螯合剂的联合使用对人或动物是无毒的。

优选的，当该抗菌剂和螯合剂(如本发明的组合物)作为抑菌剂联合使用时，与相同条件下但无联合使用时相比，所述联合使用降低了10％的生长率，更优选的降低了50％的生长率，更优选的降低了75％的生长率，更优选的降低了90％的生长率，更优选的降低了95％的生长率，更优选的降低了98％的生长率，更优选的降低了99％的生长率，以及更优选的降低了99.9％的生长率。最优选的，该联合使用能防止任何微生物的生长。

优选的，当该抗菌剂和螯合剂(如本发明的组合物)作为杀菌剂联合使用时，与相同条件下无联合使用时相比，所述联合使用能杀死微生物总数的10％，更优选的，能杀死微生物总数的50％，更优选的，能杀死微生物总数的75％，更优选的，能杀死微生物总数的90％，更优选的，能杀死微生物总数的95％，更优选的，能杀死微生物总数的98％，更优选的，能杀死微生物总数的99％，以及更优选的，能杀死微生物总数的99.9％。最优选的，杀死所有数量的微生物。

当用于防止或抑制微生物引起的植物感染时，所述联合优选的使用有效剂量，也即，该剂量水平是指能够杀死和/或抑制微生物生长，能达到防止或抑制感染的可检测水平(如达到防止或抑制植物组织损伤的可检测水平)，优选的是同与相同条件的无联合使用时相比。

如果选择含多肽的抗菌剂，与螯合剂(如，上文所述任意浓度的EDTA)联合使用，该多肽含Blad及其活性变体，那么使用该多肽的合适的浓度包括至少5μg/ml，至少10μg/ml，至少20μg/ml，至少50μg/ml，至少100μg/ml或至少500μg/ml，以及直到1mg/ml，指导2.5mg/ml，指导5mg/ml或指导10mg/ml。优选的所述多肽的浓度为在50μg/ml和10mg/ml之间，更优选的为在500μg/ml和5mg/ml之间，以及更优选的在1mg/ml和5mg/ml之间(如大约2.5mg/ml)。例如，50mM(如大约15.8mg/ml)EDTA，Blad浓度1mg/ml或2.5mg/ml可以用来如抑制灰葡萄孢菌(B.cinerea)和尖孢镰刀霉(F.oxysporum)的各自的生长。这是个令人惊讶的发现，说明Blad本身需要在大约5mg/ml或10mg/ml(分别)抑制这些病原体的生长。该发现能够a)通过使用螯合剂从而能有效使用低浓度的(对植物病原体有效的)抗菌剂或b)通过使用螯合剂增加在标准浓度下的(对植物病原体有效的)抗菌剂的效力。这是能更经济/有效的使用该抗菌剂来防止或处理微生物引起的植物(或植物的一部分)感染。

应用和方法

本发明提供了一种本发明所述组合物在抑制植物中植物病原微生物生长和/或杀死该微生物中的应用。为此，本发明还提供了一种抑制植物病原微生物生长和/或杀死该微生物的方法，包括给有需要的植物使用本发明的组合物(如有效剂量的组合物)。

本发明还提供了螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂在抑制植物中植物病原微生物生长和/或杀死该微生物中的应用。本发明还提供了螯合剂在增加对植物病原微生物有效的抗菌剂的活性中的应用。为此，本发明还提供了：

a)一种抑制植物病原微生物生长和/或杀死该微生物的方法，包括给有需要的植物使用螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂(如所述试剂的联合使用的有效剂量)；和

b)一种增加对植物病原微生物有效的抗菌剂活性的方法，包括将所述抗菌剂和螯合剂一起使用。

在具体实施例中，所述抗菌剂和螯合剂可以作为同一组合物的一部分对植物使用或单独使用，如果该两种试剂单独使用，则可以连续相继使用(可以先使用任意一种试剂)或同时使用。给植物使用例如可以通过使用(如喷洒)所述试剂(或含该试剂的组合物)于植物上(或其任意部分)，或将植物或其一部分(如种子)浸入合适的溶液中。

当螯合剂用来增加对植物病原微生物有效的抗菌剂的活性时，所述螯合剂(及其浓度)优选的选择为，联合使用该抗菌剂和螯合剂能够达到抑制植物病原微生物生长和/或杀死该微生物的一个增强的水平(如，达到防止或抑制植物感染的增强的水平，如达到防止或抑制植物组织损伤的增强的水平)，优选是与相同条件的无联合使用时相比。

在本发明的应用具体实施例/方法具体实施例中，该抗菌剂和螯合剂如上文详细描述。

有需要联合使用对植物病原微生物有效的抗菌剂和螯合剂的植物可是有风险获得感染的任何植物或被感染的任何植物，其中所述感染由植物病原微生物引起。优选的，该植物是农作物(如其生长收获用来提供食品、家畜饲料、燃料、纤维、或任意其他商业价值的产品的任意植物)。优选的，所述植物体为粮食作物植物，如提供糖的植物(如甜菜，甘蔗)，水果(包括坚果)，蔬菜或种子。提供种子的特殊植物包括谷物(如玉米、小麦、大麦、高粱、小米、大米、燕麦和黑麦)以及豆类(如黄豆、豌豆和扁豆)。

本发明还提供了含(或主要包含)抗菌多肽组合物的应用，该抗菌多肽含(或主要包含)Blad及其活性变体，用来杀死，或抑制植物中植物病原菌的生长。为此，本发明进一步提供了一种杀死，或抑制植物中植物病原菌的生长的方法，所述方法包括给该植物使用含(或主要包含)有效剂量抗菌多肽的组合物，该抗菌多肽包含(或主要包含)Blad或其活性变体。优选的该包含(或主要包含)Blad或其活性变体的抗菌多肽可以以单独的方式使用。

在优选的具体实施例中，所述组合物用于有需要的植物。该有需要所述组合物的植物可以是有货的感染的风险或已经有被感染的任意植物，其中所述感染时由植物病原菌引起的。优选的植物如上文所述。“杀死/抑制细菌生长”和“有效剂量”的意思如上文关于抗菌剂和螯合剂联合使用时所述。

实施例

在以下的例子中，BLAD是指天然形成的含Blad的低聚糖，其包含20kD的Blad多肽，按“per Ramos et al.(1997)Planta 203(1)：26-34”中的方法纯化，参照该文献中材料和方法部分的“植物材料和生长条件”以及“蛋白纯化”的内容。

定义：

MIC-最小抑制浓度：抑制微生物可见生长的抗菌剂的最低浓度

MFC/MBC-最低杀真菌浓度/最低杀细菌浓度(或最小致死浓度)：在标准化条件下24小时后，杀死99.9％初始接种菌数所需的最低杀菌剂浓度。

实施例1-BLAD的杀菌活性和与EDTA联合使用的协同作用

A.BLAD在浓度为100μg/ml时对铜绿假单胞菌具有抑菌效果，在浓度为250μg/ml时对铜绿假单胞菌具有杀菌效果，BLAD在浓度为50μg/ml时，或EDTA在浓度为1mg/ml时均抑制抗铜绿假单胞菌的生长(即，都具有抑菌效果)，但两者联合具有杀菌效果。

B.对于桃色欧文氏菌，BLAD的MIC为32μg/ml以及EDTA的MIC为15mM。但有亚抑制剂量(0.75mM)EDTA存在时，BLAD的MIC低至16μg/ml。

C.针对灰色链霉菌，BLAD的MIC为1024μg/ml以及EDTA的MIC为16mM。但有亚抑制剂量(8mM)EDTA存在时，BLAD的MIC低至256μg/ml。

实施例2-BLAD的杀真菌活性和与EDTA联合使用的协同作用

BLAD含EDTA和不含EDTA时对灰葡萄孢菌的抑菌圈数据，1.2％(w/v)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(25℃培养3天)：

BLAD为200μg和100μg时，灰葡萄孢菌的生长被抑制。当添加50mM的EDTA(大约15.8mg/ml)时该抑制效果加强。

单独使用20μg和50μg的BLAD时，或单独使用50mM的EDTA时，没有发现生长抑制作用，但是当任意浓度的BLAD与50mM的EDTA联合使用时，显示具有生长抑制效果。

BLAD含EDTA和不含EDTA时对尖孢镰刀霉的抑菌圈数据，1.2％(w/v)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(25℃培养3天)：

BLAD为200μg时，尖孢镰刀霉的生长被抑制。当添加50mM的EDTA时该抑制效果加强。

单独使用20μg、50μg或100μg的BLAD时，或单独使用50mM的EDTA时，没有发现生长抑制作用，但是当50μg或100μg的BLAD与50mM的EDTA联合使用时，显示具有抑制效果。

Claims (12)

1.一种螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂的应用，用以抑制植物中植物病原微生物的生长和/或杀死该微生物，其中，所述抗菌剂包含一多肽序列，所述多肽序列包含SEQ ID NO:4的Blad多肽序列或其活性变体，所述活性变体具有抗菌活性并包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4片段有至少70％同源的多肽序列，Blad多肽序列或其活性变体具有至少60个氨基酸残基长度。

2.一种螯合剂在增加对植物病原微生物有效的抗菌剂的活性中的应用，其中所述抗菌剂如权利要求1所述。

3.根据权利要求l或2所述的应用，其特征在于所述螯合剂和所述抗菌剂应用于有需要的植物。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述抗菌剂和所述螯合剂施用于所述植物：

a)作为同一组合物的一部分；或

b)分别地，或连续相继地或同时地。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述抗菌剂为对植物病原细菌或真菌有效。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述螯合剂为聚氨羧酸盐。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述螯合剂为EDTA。

8.一种抑制植物病原微生物生长和/或杀死该病原微生物的方法，包括向有需要的植物施用螯合剂和对植物病原微生物有效的抗菌剂，其中，所述抗菌剂如权利要求1所述。

9.一种增加对植物病原微生物有效的抗菌剂的活性的方法，包括将所述抗菌剂与一螯合剂联合使用，其中，所述抗菌剂如权利要求1所述。

10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述微生物为植物病原细菌。

11.根据权利要求10所述的应用，其中所述细菌为选自以下种属的一种病原菌种类：假单胞菌、欧文氏菌和链霉菌。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述微生物为植物病原细菌。