CN101365793A - 从羽扇豆属植物提取的或以重组形式表达的蛋白质，编码它的核苷酸序列和它用于动物营养、作为植物生长促进剂及用于抗病原性真菌的用途 - Google Patents

从羽扇豆属植物提取的或以重组形式表达的蛋白质，编码它的核苷酸序列和它用于动物营养、作为植物生长促进剂及用于抗病原性真菌的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从羽扇豆属的种子、子叶或小植株提取蛋白质，还涉及以重组形式表达该蛋白质，以及在遗传修饰植物中表达该蛋白质的方式。该蛋白质表现下述不寻常的特性：(1)强的抗真菌和抗卵菌活性，使其具有作为杀真菌剂的巨大潜力；(2)强的植物生长促进剂活性，对非健康或天然弱化的植物尤为显著；(3)对变性的极端抗性，使其可用于田间条件；(4)对蛋白酶解的极高敏感性，使其对环境无害，并对人类和动物无毒；和(5)比例均匀的氨基酸组成。并要求所述蛋白质、或保持所述蛋白质生物活性的任一修饰形式，或者通过在遗传修饰生物中表达的形式，作为人或动物饮食中的补充剂、和杀真菌剂、杀虫剂、植物生产促进剂或肥料的用途。

Description

从羽扇豆属植物提取的或以重组形式表达的蛋白质，编码它的核苷酸序列和它用于动物营养、作为植物生长促进剂及用于抗病原性真菌的用途
技术领域
本发明属于生物学领域，实际可应用为属于农艺科学和农业领域的杀真菌剂、杀虫剂、生长促进剂或肥料，并且可应用为属于人类和动物营养领域的动物饮食补充剂。
背景技术
本发明涉及一种从羽扇豆属(Lupinus)的种子、子叶或小植株提取的、具有抗真菌、抗卵菌和植物生产促进剂性质的蛋白质，并涉及它在针对攻击植物的病原媒介的控制，以及作为植物生物刺激素(bio-stimulant)的应用。这种蛋白质可以直接施用到植物上，或者可以将植物遗传修饰使其在其组织中表达该蛋白质。此外，由于该蛋白质不同寻常的固有特性，它可以用于制备蛋白质浓缩物，该浓缩物可用作人和其它动物饮食中的补充剂。
本发明还描述对应于编码所述羽扇豆属蛋白质的基因片段的核苷酸DNA序列，以及它的氨基酸残基序列，用编码所述羽扇豆属蛋白质的基因片段转化的微生物，以及应用它作为杀真菌剂、杀虫剂、植物生产促进剂或肥料或作为人类和动物营养中的补充剂的方法。
本发明的另一个目的是以上述氨基酸残基的序列为特征的蛋白质，其中一个或多个氨基酸残基缺失、已被取代或添加，或者在经受化学修饰例如糖基化之后仍保持其生物学活性。
对于最重要的作物而言，病原媒介的控制在全世界范围内都构成严重的问题。在有关农产品贮存的方面病原性真菌尤其重要。目前，对真菌生长的控制一般通过大规模使用化学杀真菌剂来实现。目前市场上可得的植物药物(phytopharmaceutical)产品表现若干严重的缺陷。一方面，它们产生高昂的经济和环境代价；另一方面，许多真菌物种已经针对某些最好的杀真菌剂形成了抗性机制，往往使得它们在上市数年之后便遭废弃。
虽然植物并不拥有象动物那样的免疫系统，它们已经进化出一种针对病原性真菌的固有抗性。然而，现代农业中使用的植物种植、收获和贮存技术往往有助于产生对病原体发生而言良好或最优的条件。
另外，可能影响或危害植物作物的微生物病原体的数目相当大。例如，可涉及下列属：链格孢属(Alternaria)、壳二孢属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢菌属(Cercospora)、炭疽菌属(Colletotrichum)、色二孢属(Diplodia)、白粉菌属(Erysiphe)、镰孢属(Fusarium)、顶囊壳属(Gaeumanomyces)、壳球孢属(Macrophomina)、丛赤壳属(Nectria)、茎点霉属(Phoma)、拟茎点霉属(Phomopsis)、瘤梗孢属(Phymatotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、霜霉属(Plasmopara)、柄锈菌属(Puccinia)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、钩丝壳属(Uncinula)和轮枝孢属(Verticillium)。目前市场上可得的杀真菌剂的应用局限于这些属中的某一些，不是植物感染控制的有效解决方案。
抗击微生物病原体的另一可选策略是鉴定和纯化生物来源的、具有强抗真菌活性的物质。此类化合物的鉴定涉及从多种生物例如植物和微生物中搜索物质，然后将这些物质在抗真菌测定中进行测试，最后加以纯化和表征。
通过这种方式，已经分离了多类抗真菌蛋白，包括几丁质酶、强结合几丁质的富半胱氨酸蛋白，β-1，3-葡聚糖酶、permeatins、硫堇和脂质转移蛋白。这些蛋白被认为在植物针对病原体攻击的自然防御中起根本性作用。
现有文献中描述了关于利用从植物或微生物提取的抗真菌蛋白的数种方法学，或是用于直接施用于病原媒介上，或是在表达这些蛋白质的转基因植物中。最常用于这些方法学的抗真菌蛋白包括几丁质酶、葡聚糖酶、渗透蛋白(osmotin)型蛋白和溶菌酶。各项研究已经证明，过表达这些蛋白质的遗传修饰植物对多种病原体显示增强的抗性(欧洲专利0392 225)。
现代分子生物学技术为重组DNA技术的发展创造了条件，从而为使用编码抗真菌蛋白的基因转化植物提供了可能。该方法通常涉及将编码目的蛋白的基因插入植物组织，然后从遗传修饰的植物组织再生整个植株。
然而，离子，尤其是钾、钠或钙的存在，会降低这些蛋白质中的某一些的活性。由于这个原因，虽然这些蛋白质可能在体外测定中表现强抗真菌活性，但它们在体内由于转化植物组织中可能天然存在高生理浓度的离子而可能没有效力。
总之，在针对影响植物的病原体的对抗中，越来越急需鉴定和纯化生物来源的、表现抗病原体性质的新化合物。尤其必须将重点放在对广谱病原体有效、且在体内条件下保持生物学活性的那些化合物上。
人们已经对农业实践进行了长期的优化，以促进植物生长和发育并增加作物产量。另一方面，可以预计在未来中至长期，全球的许多地方将出现食物短缺。在受控环境条件下控制植物生长的现有技术昂贵并需要复杂的设备。由于这些原因，许多研究者已经寻找并报道了对作物生长发育表现促进作用的天然或合成生理活性物质。但是，这些物质中只有少数已经在真实农业条件下得到了实际应用。因此，发现或开发环保的、对人类、动物和环境无毒性的植物生长促进剂，也日益具有重要性。
植物豆类(legumes)，或者具体地说，它们的种子，被认为是供人类和动物营养的世界性主要蛋白质来源。就此方面而言，大豆充当着突出的角色，这不但是由于其种子的高蛋白含量和质量，还由于其富含油。但是，从农业观点看，大豆需要肥沃的土壤和充足的水供应。与大豆相比，属于羽扇豆属的植物在近数十年来已经占据了强有力并富有潜力的位置。如果，一方面，它们的种子具有与大豆相近的蛋白质和油水平，另一方面，它们这些物种对贫瘠土壤和缺水条件适应良好。因此，有些时候人们把羽扇豆类看作大豆的“穷表亲”。
常规野生型羽扇豆种子中天然存在的、对动物有毒的高水平生物碱，长期阻碍了羽扇豆属物种的普遍种植和它们的种子供人类和动物消费的用途。这是羽扇豆种植远远滞后于大豆的主要原因。例如，在葡萄牙，传统的羽扇豆种子消费长期与啤酒的摄取相关联。首先将这些种子在水中煮沸(100℃加热破坏种子发芽的能力但并不阻断吸涨的过程)，然后在流水中浸没数天以去除有毒的生物碱。但是，近来育种技术的应用，为所谓甜羽扇豆品种的开发提供了可能；这些品种的特征是，相对于常规苦味品种(生物碱含量>0.004％w/w)，它们含有低的种子生物碱含量(<0.004％w/w)。因此，甜羽扇豆种子可以安全地用作人类和动物饲料。
因此，可以预计，用于人类和动物营养的、源自羽扇豆的食物产品将得到越来越大的发展，正如数十年前在大豆身上所发生过的那样。在羽扇豆植物蛋白质——或是白蛋白，或是球蛋白——的情况下，这是尤其重要的。
发明内容
本发明期待解决鉴定和纯化生物来源的化合物的相关技术问题，其中所述化合物能够控制多种影响植物作物的病原媒介，并且在体内条件下维持它们生物学活性的同时起植物生长促进剂的作用。
本解决方案是基于本发明者对一种存在于属于羽扇豆属的植物中的蛋白质的发现和鉴定，该蛋白质表现下述不寻常的特性：(i)强的抗真菌和抗卵菌活性，使其具有作为杀真菌剂的巨大潜力；(ii)强的植物生长促进剂活性，对非健康或天然弱化的植物尤为显著；(iii)对变性的极端抗性，使其可用于田间条件；(iv)对蛋白酶解的极高敏感性，使其对环境无害，并对人类和动物无毒；和(v)比例均匀的氨基酸组成。
因此，本发明的第一个方面涉及权利要求1中定义的蛋白质。本发明的第二个方面涉及编码该蛋白质的DNA片段(权利要求3)。本发明还涉及所述蛋白质或者任何含有它的制备物作为杀真菌剂、杀虫剂、生长促进剂或肥料的用途，或者通过直接施用，或者以重组形式，或者通过在遗传修饰生物中表达。最后，本发明考虑所述蛋白质或者任何含有它的制备物作为人类或动物营养中的补充剂的用途。
附图说明
图1-对严重感染了白粉病的葡萄藤叶子，用水(右边的叶)或从羽扇豆提取的蛋白(左边的叶)喷洒。(A)喷洒后24小时；(B)喷洒后2个月。
图2-导致葡萄藤中白粉病的真菌的孢子萌发的光学显微镜观察结果。小心地将真菌孢子从年幼的染病葡萄藤叶子表面移出，接种到水琼脂0.6(w/v)中。(A)、(B)和(C)-对照；(D)和(E)加入来自成熟葡萄的总蛋白级分200μg，其含有发病相关(PR)蛋白；(F)和(G)-加入从羽扇豆属提取的蛋白质200μg。每个测定均在24和48h后进行观察。使用相差显微术，所用的放大率是125X。
图3-葡萄藤叶的金相显微镜观察结果。(A)健康的叶；(B)感染白粉病的叶；(C)感染白粉病的叶，用从羽扇豆属提取的蛋白质喷洒后经12小时。所用的放大率在每张照片中示出。
图4-大肠杆菌中以重组形式表达的来自羽扇豆属的蛋白质对于白粉病致病媒介——葡萄白粉病菌(Uncinula necator)孢子的萌发和发育的影响。
图5-对处于相同发育阶段的玫瑰植株，用水(右边的玫瑰植株)或含有从羽扇豆属提取的蛋白质的溶液(200μg蛋白/ml；左边的玫瑰植株)喷洒。该照片显示两株植株在喷洒后经过3周的发育阶段。
图6-苗圃中生产的西瓜植株。萌发开始6周后，用水(对照；A)、含100μg蛋白/ml的羽扇豆属粗提取物(B)、一种市场上可商购的植物生长促进剂(制造商推荐的浓度)(C)和含200μg蛋白/ml的羽扇豆属粗提取物(D)喷洒。在2周时间内对实验进行监测，并对植株拍照。
图7
-来自羽扇豆属植物的球蛋白的不溶性作为钙和镁浓度的函数的典型曲线。该曲线用来例示这些阳离子对从羽扇豆属提取的蛋白质(■)和来自羽扇豆属的β-羽扇豆球蛋白(○)的自聚集的影响。β-羽扇豆球蛋白(0.5mg.ml-1；○)和从羽扇豆属提取的蛋白质(0.5mg.ml-1；■)分别自干种子而纯化，或自从萌发并生长了8天的小植株上分离的子叶而纯化。
具体实施方式
本发明涉及一种具有强抗真菌性质的新蛋白质，其对来自植物真菌和卵菌病原体的孢子的萌发和发育表现强有力的活性，并且具有植物生长促进剂活性，对于非健康或天然弱化的植物尤为显著。本发明还考虑所述蛋白质或任何含有它的制备物作为人类或动物营养的补充剂的用途。编码所述来自羽扇豆属的蛋白质的基因片段的DNA核苷酸序列不与任何其它已自植物分离的抗真菌蛋白共有任何显著的同源性。所述来自羽扇豆属的蛋白质构成植物中已描述的抗真菌蛋白中的一个新类型。
本发明涉及的蛋白质是从子叶中纯化的，所述子叶是从羽扇豆属萌发的幼苗提取的。本发明包括从植物组织分离蛋白质使用的方法学的描述，编码它的基因片段(A)的DNA核苷酸序列，和相应的氨基酸残基序列(B)。
(A)
5′CGTAGACAAAGGAACCCTTATCACTTCAGCTCTCAAAGATTCCAAACTCTTTACAAAAATAGGAATGGCAAAATCCGTGTGCTCGAGAGGTTTGAC-CAAAGAACCAATAGACTTGAGAATCTCCAAAACTACCGCATTGTTGAGTTCCAATCAAAACCTAACACTCTCATTCTCCCTAAACACTCTGATGCTGAC-TACGTCCTCGTTGTACTCAATGGTAGAGCCACAATCACGATAGTAAACCCTGATAGAAGACAAGCATATAACCTTGAGTATGGCGATGCTCTCAGAATCCCAGCTGGCTCAACTTCATATATCCTTAACCCGGATGACAACCAGAAGCTTA-GAGTAGTCAAGCTCGCAATACCCATCAACAATCCTGGCTACTTTTATGATTTCTATCCATCGAGTACTAAAGACCAACAATCCTACTTCAGTG-GCTTCAGCAGGAACACTTTAGAGGCCACCTTCAATACTCGTTATGAAGAGA T ACAAAGGATTATTTTAGGGAATGAGGAT3′
(B)
5′RRQRNPYHFS SQRFQTLYKN RNGKIRVLER FDQRTNRLENLQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVV LNGRA TITIVNPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRVVKLAIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILGNED 3′
这种蛋白似乎仅仅天然出现于羽扇豆属小植株的生存期中非常短的一段时期。本发明人已经证实，β羽扇豆球蛋白——来自羽扇豆属的主要种子贮藏蛋白——是所述来自羽扇豆属的蛋白质的生物合成前体。事实上，所述羽扇豆属蛋白质是一种高度加工的蛋白质，接受了数个水平的化学修饰。这大大增加了对它研究的困难性，包括对氨基酸残基和相应核苷酸的测序的难度。在种子形成过程中，编码β羽扇豆球蛋白的基因被转录为相应的mRNA，mRNA的翻译导致β羽扇豆球蛋白的生物合成前体的合成。然后该前体受到大量加工，包括糖基化，从而产生构成β羽扇豆球蛋白的数十种不同类型的亚基。在接下来的营养生长循环中，在萌发开始后数天，β羽扇豆球蛋白分解代谢的最初步骤涉及对其全部或大部分组成亚基的蛋白酶切割，导致本发明中描述的蛋白质的积累。由于它固有的抗真菌性质(该性质被宿主植物天然地利用)，这种蛋白质在植物对真菌和昆虫攻击最为敏感的生命阶段中，在发育中的植物的子叶中维持很高的浓度。数天以后，这种蛋白质被降解，它的氨基酸被用于幼植物的生长。
本发明描述的羽扇豆属蛋白质表现某些将其与文献中描述的其它抗真菌蛋白区分开来的性质。这使它成为一种有前景的靶标，具有开发控制影响植物和/或动物的真菌的高效方法的巨大潜力：
(i)强的抗真菌和抗卵菌活性，使其具有作为杀真菌剂的巨大潜力；
(ii)强的植物生长促进剂活性，对非健康或天然弱化的植物尤为显著；
(iii)对变性的极端抗性，使其可用于田间条件；
(iv)对蛋白酶解的极高敏感性，使其对环境无害，并对人类和动物无毒；
和
(v)比例均匀的氨基酸组成。
该蛋白质也可以用作杀虫剂、生长促进剂或肥料，以及作为人类或动物营养中的食物补充剂。
当今农业中的两个实际问题是可见于非健康或天然弱化的植物中的生长降低或抑制，以及通常与现有生物刺激剂相关的毒性。所述从羽扇豆属植物组织提取的蛋白质对植物的生长和发育表现出强的生长促进剂活性。事实上，含有所述蛋白质的羽扇豆属制备物或提取物对所有被测的植物，包括例如葡萄藤、玫瑰、西瓜和西红柿，均具有强的生物刺激活性。对等于或高于200μg/ml的蛋白质浓度而言，该效应是显著的。所述羽扇豆属蛋白质的非纯提取物中存在的其它组分增加了制备物的价值，因为它们起叶面肥料的作用。该羽扇豆属蛋白质对人类、动物和环境没有毒性，提示它在农业中的应用对环境没有任何破坏性影响。
本发明的另一个方面涉及在细菌中重组产生所述羽扇豆属蛋白质所用的方法学，目标在于在遗传修饰的植物中组成性地表达它。最终，这些植物将会表现对病原性真菌的高水平抗性，其中病原性真菌是指难以控制的(所谓木材疾病的致病真菌即是如此)、外源施用的传统杀真菌剂对其完全无效的真菌。
所述蛋白质是从8日龄的白羽扇豆LeBlanc品种(Lupinus albus cv.LeBlanc)小植株提取的。将种子置于恒温室内(日间25℃，夜间20℃)，光周期为16h光/8h暗。
收获之后，将子叶冷冻在液氮中。蛋白质提取在含有10％(w/v)NaCl、10 mM EDTA(乙二胺四乙酸)和10 mM EGTA(乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸)的100 mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5中进行。在4℃ 30分钟的温育期之后，将提取物在30,000g 4℃离心1h。将上清液脱盐，然后通过FPLC(快速蛋白和肽液相色谱，Fast Protein and Peptide LiquidChromatography)-阴离子交换色谱对从羽扇豆属提取的蛋白质进行纯化。
从羽扇豆属提取的蛋白质的N末端测序通过Edman降解来完成。使用所得的氨基酸残基序列设计简并引物。在发生最大p羽扇豆球蛋白前体合成的阶段，从发育中的白羽扇豆种子提取总mRNA。使用从植物材料纯化mRNA的规程/试剂盒来进行mRNA提取。使用先前设计的简并引物，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增编码所述从羽扇豆属提取的蛋白质的基因片段的相应cDNA。使用所得的核苷酸序列作为模板，设计新的引物，通过3’和5’RACE(cDNA末端快速扩增)技术获得编码所述从羽扇豆属提取的蛋白质的基因片段的完整核苷酸序列。
在细菌大肠杆菌中，以重组形式产生所述来自羽扇豆属的蛋白质。将编码所述来自羽扇豆属的蛋白质的基因片段克隆到合适的载体中，使目的基因与启动子T7lac关联。该启动子是诱导性的，因此，与之相关联的基因的表达仅在糖类异丙基硫代-β-半乳糖苷存在时发生。最后，转化感受态大肠杆菌细胞。
如上文所述，所述来自羽扇豆属的蛋白质是以重组形式从细菌中获得的。但是，为测试其抗真菌活性，必须将所述来自羽扇豆属的重组蛋白从其它所有细菌蛋白中分离出来。为此目的，先以带有组氨酸残基标签(His-Tag)的重组形式产生所述来自羽扇豆属的蛋白质。其纯化所使用的方法学是基于His-Tag对镍离子的高亲和力。在此方式下，镍离子结合琼脂糖基质，已知细菌总提取物中存在的所有蛋白质中，只有所述来自羽扇豆属的蛋白质与琼脂糖基质结合，从而实现重组蛋白的纯化。然后，经过一组合适的冲洗和洗脱之后，回收所述来自羽扇豆属的蛋白质，并在用合适的蛋白水解酶处理之后去除His-Tag。
仔细地选择合适的启动子是植物遗传修饰的先决条件。文献中描述了数种可供相关基因表达的启动子。为了表达编码本发明所述蛋白质的基因片段，所选的启动子可以是诱导性或组成性的，取决于需要的表达类型。启动子的选择对于将合成后的蛋白质导向所选择的组织或细胞区室也是重要的(翻译后修饰)。
植物转化可以通过不同的方法学来实现，例如，通过土壤杆菌(Agrobacterium)的植物转化，原生质体转化，针对花粉粒的基因转移，向生殖器官或未成熟胚胎中的直接注射，以及粒子轰击。这些方法中的每一种都具有其独特的优点和缺点。但是，它们都已被用于不同类型的植物中。
为了用编码所述来自羽扇豆属的蛋白质的基因片段转化植物，所选择的方法是通过土壤杆菌进行转化，使用含有目的基因的编码区域及与之关联的合适标记基因的合适表达载体(Fraley等，1983)。植物再生、植物发育和植物从单个原生质体向培养基的转移可以根据文献中已有的数种方法学来实现。该过程包括选择转化细胞和通过胚发生培养物的发育所用的常规方法培养这些细胞的数个步骤。最终将再生的小植株培养在合适的培养基质，通常是土壤中。
本发明的另一个目的是包含根据权利要求1或2的蛋白质，或根据权利要求9获得的该蛋白质的重组形式作为活性成分的任何农用制剂，特征在于用于防止、控制或对抗病原性真菌或卵菌或昆虫引起的疫病，或作为生长促进剂或肥料。
本发明的另一个方法涉及人类和动物饮食中经常降低的植物蛋白水平以及，在某些情况下，涉及低下的蛋白质可消化性和不平衡的氨基酸组成。事实上，含有所述羽扇豆属蛋白质的粗制备物不但含有主要的球蛋白(所述本发明的目的的羽扇豆属蛋白质)，还含有蛋白质提取中所用的植物材料中天然存在的多种白蛋白。因此，这些所述羽扇豆属蛋白质的粗制备物尤其富含蛋白质，可以在豆腐(用钙和镁沉淀球蛋白后)或乳清干酪(热沉淀白蛋白后)等动物或人类营养中用作蛋白质补充剂。
所述羽扇豆属蛋白质的氨基酸组成分析及其对所有被测蛋白酶(包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K和链霉蛋白酶)的分析结果，提示该蛋白质对动物具有较高的营养价值。但是，本发明中考虑的蛋白质是球蛋白。由于这个原因，该羽扇豆属蛋白质在水和稀盐溶液中不溶，但易溶于高离子强度的溶液。但是，豆类球蛋白仅在钙、镁和其它碱土金属阳离子存在下不可溶(Ferreira et al.，1999)。这些二价阳离子在中性pH值带正电，在带负电的球蛋白分子之间充当静电桥，促进或者诱使它们自聚集成复合物，这些复合物是如此巨大，以至于不可溶解(Ferreira等，1999；Ferreira等，2003)。例如，豆腐，是一种类似于乳酪或松软干酪(cottage cheese)的凝结物，它是通过向经过加热的大豆提取物中加入钙和镁离子而制备的。这两种阳离子均是在豆腐的制备中常规使用的，并且可以Nigari的形式商购。这样，在羽扇豆属球蛋白浓缩物的制备中，在使用钙和/或镁将它们沉淀后，可以使用同时含有球蛋白和白蛋白的所述羽扇豆属蛋白粗制备物。例如，图7显示了所述羽扇豆属蛋白(■)的沉淀特征曲线，作为所加的钙和镁浓度的函数。为了比较的目的，还给出了它的前体蛋白——β-羽扇豆球蛋白(羽扇豆属种子中存在的主要贮藏蛋白；○)的沉淀曲线。对于所得乳清(serum)中保留的白蛋白，也利用例如热沉淀，通过与乳清干酪制备中所用的类似的工艺(对乳酪制备中去除酪蛋白后对保留在乳清中的乳白蛋白进行热沉淀)来加以回收。这样，含有所述羽扇豆属蛋白质的制备物可以用作人类或动物饮食中的蛋白质补充剂。
为了理解本发明的潜力，下面是数个实施例。但是，在利用所述来自羽扇豆属的蛋白质作为控制真菌和卵菌剂、作为杀虫剂、作为生长促进剂、作为肥料或作为人类或动物饮食中的蛋白质补充剂的过程中，可以使用其它方法学。在此意义上，这些实施例不是限制性的。
实施例
实施例1和2-向感染了真菌葡萄白粉病菌(葡萄白粉病的致病媒介)的葡萄藤叶表面上喷洒所述来自羽扇豆属的蛋白质的效果
向葡萄藤叶表面喷洒含有200mg纯蛋白/ml的溶液之后，评估所述来自羽扇豆属的蛋白质的抗真菌活性。作为对照，在同样条件下对相似的叶喷洒水。所得结果示于图1中，其显示，喷洒该蛋白质两个月后，葡萄藤叶保持健康，没有真菌存在的迹象，即使被喷洒的葡萄藤叶一直且长期保持与重度感染的叶密切接触。
另一试验根据相同的方法学进行，但是对接受处理的葡萄藤叶表面的观察是使用金相显微镜(图3)。
实施例3-所述来自羽扇豆属的蛋白质对来自葡萄白粉病菌的孢子的萌发和发育的影响
将来自真菌葡萄白粉病菌的孢子从感染的葡萄藤叶表面移出，并接种在0.6％(w/v)的水琼脂中，其中该水琼脂每ml含有200mg来自羽扇豆属的纯蛋白，或者每ml含有200mg来自成熟葡萄的总蛋白级分(含PR蛋白)。在24和48小时内，通过使用相差透镜系统的光学显微术对芽管的孢子萌发和发育进行跟踪监测。所得的结果示于图2，其显示，在含有所述来自羽扇豆属的蛋白质的基质的存在下，不但萌发孢子的数目发生了显著的减少，芽管的长度也明显降低。与存在PR蛋白质时观察到的结果相比，该影响是显著的。
实施例4-所述来自羽扇豆属的蛋白质对于来自葡萄拟茎点霉(Phomopsisviticola)(葡萄藤excoriosis的致病媒介)的孢子的萌发和发育的影响
将来自真菌葡萄拟茎点霉的孢子接种在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基中。15分钟后，移出孢子，并与含所述来自羽扇豆属的蛋白质的溶液混合，终体积为25ml。将这些小滴置于培养皿中，上面覆以盖玻片，然后密封，形成湿盒。通过光学显微镜观察对孢子发育进行跟踪监测。明显可见，孢子萌发受到了清楚的抑制。发育24h后菌丝分解。
实施例5-所述来自羽扇豆属的重组蛋白对来自真菌葡萄白粉病菌的孢子萌发的影响
对在细菌中表达的来自羽扇豆属的重组蛋白纯化后，测试其抗真菌活性。这些测定按照前面实施例2和3所述进行。所得的结果如图4所示，显示该重组蛋白表现与从羽扇豆属植物提取的所述蛋白观察到的相同的抗真菌性质。在所述来自羽扇豆属的重组蛋白的存在下温育48h后，观察到孢子细胞壁的破坏。
实施例6-所述来自羽扇豆属的重组蛋白对来自卵菌葡萄霜霉(Plasmoparaviticola)(霜霉病的致病媒介)的孢子萌发的影响。
将来自卵菌葡萄霜霉的孢子从葡萄藤的感染叶表面移出，并置于0.6％(w/v)水琼脂中，其中该水琼脂每ml含有200mg来自羽扇豆属的重组纯蛋白。在48h内通过光学显微镜观察跟踪监测孢子萌发。使用水琼脂中的孢子萌发作为对照。24h后，孢子细胞壁被破坏，伴随着细胞内容物的释放。
实施例7-喷洒所述从羽扇豆属提取的蛋白质对玫瑰植株的影响
用含有200μg蛋白质/ml的羽扇豆属粗提取物喷洒玫瑰植株叶表面之后，对所述羽扇豆属蛋白的生物刺激活性进行评估。作为对照，用水喷洒处于相同发育阶段并在相同环境条件下温育的玫瑰植株。所得结果(照片摄于喷洒后3周)示于图5，显示用所述羽扇豆属蛋白喷洒的植株生长更好，明显可见最先的花蕾提前出现。
实施例8-喷洒所述从羽扇豆属提取的蛋白质对苗圃西瓜植株的影响
用含200μg蛋白质/ml的羽扇豆属粗提取物喷洒六周龄苗圃西瓜植株叶表面之后，对所述羽扇豆属蛋白质的生物刺激剂活性进行了评估。测定在温室条件下进行，用水(对照；A)、含100μg蛋白质/ml的羽扇豆属粗提取物(B)、一种市场上可商购的植物生长促进剂(制造商推荐的浓度)(C)；和含200μg蛋白质/ml的羽扇豆属粗提取物(D)喷洒植株。每次测定使用24株植株。在接下来的两周中对测定进行跟踪监测，所得的结果示于图6。与用水或用市场可商购的植物生长促进剂处理的植株相比，用最高浓度(200μg蛋白质/ml；D)的所述羽扇豆属蛋白质喷洒的植株显示最大程度的发育和更好的叶生长。用最低浓度的所述羽扇豆属蛋白(100μg蛋白质/ml；B)喷洒的植株表现的发育水平较低，但仍高于仅喷洒水的植株观察到的发育水平。因此，推荐的施用水平是：以含200μg蛋白质/ml的所述羽扇豆属粗制备物喷洒植株。
实施例9-用所述从羽扇豆属提取的蛋白质喷洒感染了葡萄白粉病菌(白粉病——世界范围内经济上最重要的葡萄藤疾病——的真菌致病媒介)的葡萄藤植株的作用
制备了每ml含有200μg所述羽扇豆属蛋白质的羽扇豆属粗制备物。将感染了葡萄白粉病菌的葡萄藤植株保持在温室条件下，并对其喷洒所述提取物或水(对照)。施用24小时后，观察被喷洒的植株—相对于对照，喷洒了所述羽扇豆属蛋白质的植株表现更高的活力，并出现新枝条。这种状态维持了至少一周，在这之后，这些先前由于真菌的存在而被弱化的植株枝繁叶茂，长出了许多新叶，并没有任何该疾病的症状。
实施例10-制备豆腐型羽扇豆属蛋白浓缩物所需的最优钙和镁浓度的确定
用5mM钙+镁沉淀所述羽扇豆属蛋白质粗制备物中的球蛋白后制得的羽扇豆属蛋白质浓缩物(见图7)具有很高的营养潜力，突出表现为所述羽扇豆属蛋白的比例均匀的氨基酸组成及其优良的可消化性(在人消化道蛋白酶的作用下，该蛋白质被容易地消化为其组成氨基酸)。
参考文献
Fraley，R.T.，Rogers，S.G.，Horsch，R.B.，Sanders，P.R.，Rick，J.S.，Adams，S.P.，Bittner，M.L.，Brand，L.A.，Fink，C.L.，Fry，J.S.，Galluppi，G.R.，Goldberg，S.B.，Hoffman，N.L.& Woo，S.C.(1983).Expression of bacterial genes in plantcells.Proceedings of the National Academy of Sciences USA，80，4801-4807.
Ferreira，R.B.，Franco，E.& Teixeira，A.R.(1999).Calcium-andmagnesium-dependent aggregation of legume seed storage proteins.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，47，3009-3015.
Ferreira，R.B.，Freitas，R.L.& Teixeira，A.R.(2003).Self-aggregation oflegume seed storage proteins inside the protein storage vacuoles is electrostaticin nature，rather than lectin-mediated.FEBS Letters，534，106-110.
Figure A200680034618E00181
Figure A200680034618E00182
Figure A200680034618E00191
Figure A200680034618E00201
权利要求书(按照条约第19条的修改)1．一种从羽扇豆属植物中提取的，具有N末端序列[5’RRQRNPYHFSSQIFQTLYKN RNG 3’]的多肽，其特征在于：(a)(B)中所示的氨基酸残基序列；5’RRQRNPYHFS SQRFQTLYKN RNGKIRVLER FDQRTNRLENLQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVV LNGRATITIV NPDRRQAYNLEYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRVVKI。AIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILGNED 3’(b)(B)中所示的氨基酸残基序列，其中一个或多个氨基酸残基缺失、已被取代、添加或修饰，且该多肽表现抗真菌和抗卵菌活性、植物生长促进剂活性和/或维持其生物学性质。
2．权利要求1的从羽扇豆属植物中提取的多肽，其特征在于其是糖基化、磷酸化、烷基化和/或异戊二烯化的。
3．一种编码权利要求1的多肽的DNA片段，其特征在于：(a)(A)中所示的核苷酸序列；(A)5＇CGTAGACAAAGGAACCCTTATCACTTCAGCTCTCAAAGATTCCAAACTCTTTACAAAAATAGGAATGGCAAAATCCGTGTGCTCGAGAGGTTTGACCAAAGAACCAArAGACTTGAGAATCTCCAAAACTACCGCATTGTTGAGTTCCAATCAAAACCTAACACTCTCATTCTCCCTAAACACTCTGATGCTGACTACGTCCTCGTTGTACTCAATGGTAGAGCCACAATCACGAIAGTAAACCCTGATAGAAGACAAGCATATAACCTTGAGTATGGCGATGCTCTCAGAATCCCAGCTGGCTCAACTTCATATATCCTTAACCCGGATGACAACCAGAAGCTTAGAGTAGTCAAGCTCGCAATACCCATCAACAATCCTGGCTACTTTTATGATTTCTATCCATCGAGTACTAAAGACCAACAATCCTACTTCAGTGGCTTCAGCAGGAACACTTTAGAGGCCACCTTCAATACTCGTTATGAAGAGATACAAAGGATTATTTTAGGGAATGAGGAT 3’(b)(A)中所示的核苷酸序列，其中一个或多个核苷酸缺失，已被取代、添加或修饰，并且编码具有抗真菌和抗卵菌活性、植物生长促进剂活性，和/或维持其生物学性质的多肽。
4．一种重组载体，其特征在于其含有权利要求3的DNA片段。
5．一种转化细胞，其特征在于其是用权利要求4的重组载体转化的。
6．根据权利要求5转化的细胞，其特征在于其源自大肠杆菌。
7．根据权利要求5转化的细胞，其特征在于其源自植物、动物或微生物。
8．一种转基因植物，其特征在于其含有权利要求5的转化细胞并且表现针对病原性真菌、卵菌或昆虫所致疫病的抗性，它是通过所述转化细胞的再生而获得的。
9．一种产生权利要求1的多肽的方法，其特征是包括培养权利要求5、6、7的转化细胞，以及从细胞培养物或细胞提取物中回收具有抗真菌活性的多肽。
10．一种多肽制剂或粗制备物，其特征是包括权利要求1或2的多肽或者根据权利要求9获得的它的重组形式作为活性成分。
11．权利要求10的多肽制剂或粗制备物，其特征是用于预防、控制或对抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆虫所致的疫病，作为植物生长促进剂和肥料。
12．权利要求1或2的多肽或者根据权利要求9获得的它的重组形式在制备制剂中的用途，其特征是以预防、控制或对抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆虫，作为植物生长促进剂和肥料为目的。
13．权利要求1或2的多肽或者根据权利要求9获得的它的重组形式用于预防、控制或对抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆虫所致的疫病，用作植物生长促进剂和肥料的用途，其特征是通过向植物施用全部或部分羽扇豆属提取物，所述提取物含有权利要求1或2的多肽或者根据权利要求9获得的它的重组形式。
14．根据权利要求1或2的多肽、或根据权利要求9获得的它的重组形式、或含有它的粗制备物的用途，其特征是作为生物刺激剂或植物生长发育的促进剂来施用，在对天然被弱化或感染了病原媒介的植株的叶进行喷洒后尤其可观察到这种生物刺激剂活性。
15．根据权利要求1或2的多肽、或根据权利要求9获得的它的重组形式、或含有它的粗制备物的用途，其特征是供人类或动物营养的高营养价值蛋白质浓缩物的制备中应用，在用钙盐和镁盐沉淀球蛋白之后，或者有或没有物理处理，例如加热沉淀白蛋白。
从羽扇豆属植物提取的或以重组形式表达的蛋白质，编码它的核苷酸序列和它用于动物营养、作为植物生长促进剂及用于抗病原性真菌的用途
根据PCT条约第19条的声明
依照有关本发明缺乏新颖性的书面意见，我们在此根据PCT条约第19条提交针对国际检索报告和书面意见的如下意见陈述。本意见陈述是关于申请人对为了克服审查员提出的障碍所作的改写权利要求的修改。
随附一套修改的权利要求(1—14)。
1．本发明描述了一种从羽扇豆属植物及其部分中提取的多肽(SEQ ID No：B)、编码该多肽的DNA片段(SEQ ID N0：A)，含有所述DNA片段的重组载体，带有该载体的转化宿主细胞，和含有所述宿主细胞的转基因植物。本发明还描述了该多肽的维持相同生物学活性的任何修饰形式，或者编码它的DNA片段的维持相同生物学活性的任何修饰形式。
2．另外，本发明还描述了该多肽的天然分离形式或者重组形式，或者它的相应DNA编码片段，用于动物营养、作物保护的用途，即作为抗真菌剂或者植物生长促进剂的用途。
3．对比文件D1描述了一种20kDa多肽的分离和纯化，该多肽是β-羽扇豆球蛋白分解代谢中的中问降解产物，β-羽扇豆球蛋白是类豌豆球蛋白贮藏蛋白，与多种糖蛋白相互作用，并且具有凝集素型活性。在该文件的表1中描述了几种N末端氨基酸序列，包括所述分离自白羽扇豆种子的20kDa多肽的N末端氨基酸序列。
4．但是，D1的表1中所示的N末端序列仅仅包括了第5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、20和23号残基的身份。这相当于构成本发明权利要求1的序列(B)的173个氨基酸残基中的总共15个残基。
5．事实上，对比文件D1的N末端序列并不负责与本发明多肽相关的生物学性质。
6．而且，对比文件D1中所述的N末端序列是被意图用来构建合适的引物，然后可将它们用于分子生物学，作为基因和蛋白测序这一漫长而不确定的过程的第一步。
7．因此，一旦该N末端序列不构成本发明——其主要目的是公开一种表现数种生物学性质的多肽——的核心，我们提出将权利要求1修改成如下所述：“一种从羽扇豆属植物提取的、具有N末端序列[5’RRQRNPYHFS SQRFQTLYKNRNG 3’]的多肽，其特征是：a)(B)中所示的氨基酸残基序列；(B)5’KIRVLER FDQRTNRLEN LQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVVLNGRATITIV NPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD  DNQKLRVVKLAIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILG NED3’和b)(B)中所示的氨基酸残基序列，其中一个或多个氨基酸残基缺失、已被取代、添加或修饰，且该多肽表现抗真菌和抗卵菌活性、植物生长促进剂活性和/或维持其生物学性质。”
8．由于将权利要求1中的表述“蛋白质”改成了“多肽”，考虑到这种分子仅具有有限数目的氨基酸残基，因此为了保持文本的一致对从属权利要求2、3、9-14也作了修改。
望接受并考虑上述关于本专利申请权利要求1的意见陈述和提出的修改，并确收。

Claims (15)

1.一种从羽扇豆属植物中提取的蛋白质，其特征在于：
(a)(B)中所示的氨基酸残基序列；
5′RRQRNPYHFS SQRFQTL YKN RNGKIRVLER FDQRTNRLEN
LQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVV LNGRATITIV
NPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRVVKL
AIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQR∏LG
NED 3′
(b)(B)中所示的氨基酸残基序列，其中一个或多个氨基酸残基缺失、已被取代、添加或修饰，且该蛋白质表现抗真菌和抗卵菌活性、植物生长促进剂活性和/或维持其生物学性质。
2.权利要求1的从羽扇豆属植物中提取的蛋白质，其特征在于其是糖基化、磷酸化、烷基化和/或异戊二烯化的。
3.一种编码权利要求1的蛋白质的DNA片段，其特征在于：
(a)(A)中所示的核苷酸序列；
(A)
5′CGTAGACAAAGGAACCCTTATCACTTCAGCTCTCAAAGATTCCAAA
CTCTTTACAAAAATAGGAATGGCAAAATCCGTG
TGCTCGAGAGGTTTGACCAAAGAACCAATAGACTTGAGAATCTCCAA
AACTACCGCATTGTTGAGTTCCAATCAAAACCT
AACACTCTCATTCTCCCTAAACACTCTGATGCTGACTACGTCCTCGTT
GTACTCAATGGTAGAGCCACAATCACGATAGT
AAACCCTGATAGAAGACAAGCATATAACCTTGAGTATGGCGATGCTC
TCAGAATCCCAGCTGGCTCAACTTCATATATC
CTTAACCCGGATGACAACCAGAAGCTTAGAGTAGTCAAGCTCGCAAT
ACCCATCAACAATCCTGGCTACTTTTATGATTT
CTATCCATCGAGTACTAAAGACCAACAATCCTACTTCAGTGGCTTCAG
CAGGAACACTTTAGAGGCCACCTTCAATACTC
GTTATGAAGAGATACAAAGGATTATTTTAGGGAATGAGGAT3′
(b)(A)中所示的核苷酸序列，其中一个或多个核苷酸缺失，已被取代、添加或修饰，并且编码具有抗真菌和抗卵菌活性、植物生长促进剂活性，和/或维持其生物学性质的蛋白质。
4.一种重组载体，其特征在于其含有权利要求3的DNA片段。
5.一种转化细胞，其特征在于其是用权利要求4的重组载体转化的。
6.根据权利要求5转化的细胞，其特征在于其源自大肠杆菌。
7.根据权利要求5转化的细胞，其特征在于其源自植物、动物或微生物。
8.一种转基因植物，其特征在于其含有权利要求5的转化细胞并且表现针对病原性真菌、卵菌或昆虫所致疫病的抗性，它是通过所述转化细胞的再生而获得的。
9.一种产生权利要求1的蛋白质的方法，其特征是包括培养权利要求5、6、7的转化细胞，以及从细胞培养物或细胞提取物中回收具有抗真菌活性的蛋白质。
10.一种蛋白质制剂或粗制备物，其特征是包括权利要求1或2的蛋白质或者根据权利要求9获得的它的重组形式作为活性成分。
11.权利要求10的蛋白质制剂或粗制备物，其特征是用于预防、控制或对抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆虫所致的疫病，作为植物生长促进剂和肥料。
12.权利要求1或2的蛋白质或者根据权利要求9获得的它的重组形式在制备制剂中的用途，其特征是以预防、控制或对抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆虫，作为植物生长促进剂和肥料为目的。
13.权利要求1或2的蛋白质或者根据权利要求9获得的它的重组形式用于预防、控制或对抗病原性或非病原性真菌和卵菌、昆虫所致的疫病，用作植物生长促进剂和肥料的用途，其特征是通过向植物施用全部或部分羽扇豆属提取物，所述提取物含有权利要求1或2的蛋白质或者根据权利要求9获得的它的重组形式。
14.根据权利要求1或2的蛋白质、或根据权利要求9获得的它的重组形式、或含有它的粗制备物的用途，其特征是作为生物刺激剂或植物生长发育的促进剂来施用，在对天然被弱化或感染了病原媒介的植株的叶进行喷洒后尤其可观察到这种生物刺激剂活性。
15.根据权利要求1或2的蛋白质、或根据权利要求9获得的它的重组形式、或含有它的粗制备物的用途，其特征是供人类或动物营养的高营养价值蛋白质浓缩物的制备中应用，在用钙盐和镁盐沉淀球蛋白之后，或者有或没有物理处理，例如加热沉淀白蛋白。
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