JP2009505637A - ルピナス属の植物から抽出され又は形質転換型で製造されるタンパク質、及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(B)
(A)
(A)
ルピナス由来の前記タンパク質の抗真菌活性を、1ml中に前記タンパク質を含む純粋な天然タンパク質を200mg含む溶液を前記ブドウの葉の表面に噴霧した後に評価した。対照群として、前記同様の条件の葉に水を噴霧した。その結果、図1に示すように、前記タンパク質を含む天然タンパク質が噴霧された葉は、うどんこ病に重度に感染した葉と、常時かつ長期間近接していたとしても、前記真菌の痕跡なしで該噴霧2ヵ月後まで健康が維持されたことが明らかである。
真菌Uncinula necatorの胞子を、前記感染した葉の表面から回収し、1ml中にルピナス由来の前記タンパク質を含む純粋な天然タンパク質を200mg、又は、1ml中に成熟したブドウの総タンパク質分画(PRタンパク質を含む)200mgを含む0.6%(w/v)素寒天に植え付けた。胞子の発芽及び発芽管の成長は、前記植え付けから24時間及び48時間後に、位相差レンズ系を用いた光学顕微鏡で観察した。結果を図2に示す。図2によると、ルピナス由来の前記タンパク質を含む培地の存在下では、発芽胞子の数だけでなく、前記発芽管の長さも顕著な低下が見られた。この効果は、前記PRタンパク質の存在下で観察された結果と比較しても明らかな差が見られた。
前記真菌Phomopsis viticolaの胞子は、PDA培地(バイレイショ‐ブドウ糖寒天培地)に植え付けられ、15分後に、該胞子は回収された。前記回収された胞子は、ルピナス由来のタンパク質を含む天然タンパク質と混合され、最終体積25mlとされた。前記混合された溶液は、シャーレ上に滴下され、スライドガラスで覆われた後、密閉されて、湿式チャンバが作られた。胞子の成長は、光学顕微鏡によって観察された。この結果、胞子の成長が抑制されたことは明らかであった。24時間後、成長していた菌糸は崩壊した。
細菌中で発現されたルピナス由来の前記組み換えタンパク質は、精製され、その抗真菌活性が検証された。これは、ルピナス由来の前記組み換えタンパク質を用いた以外は、実施例2及び実施例3と全く同一にして行われた。結果を図4に示す。図4によると、前記組み換えタンパク質は、ルピナス植物体から抽出された前記タンパク質で観察されたものと同一の抗真菌活性を示す。ルピナス由来の前記組み換えタンパク質の存在下での48時間培養の後、前記胞子の細胞壁の破壊が観察された。
真菌Plasmopara viticolaの胞子は、前記感染した葉の表面から回収され、1ml中にルピナス由来の前記組み換え純粋タンパク質200mgを含む0.6%(w/v)素寒天に入れた。次に、48時間後、胞子発芽を、光学顕微鏡を用いて観察した。素寒天中における胞子発芽を、対照群として用いた。24時間後、前記胞子の細胞壁は破壊され、これに伴い、細胞内含有物が放出された。
前記タンパク質を含むルピナス天然タンパク質のバイオ刺激活性を、1ml中に前記タンパク質を含む天然タンパク質200μgを含む粗ルピナス抽出物をバラの葉の表面に噴霧した後に評価した。対照群として、同様の発育段階であり、同一環境条件で培養したバラに水を噴霧したものを用いた。前記噴霧の3週間後に撮影した写真を図5に示す。図5によると、最初の花芽が早く見られたことから、前記ルピナスタンパク質を噴霧された植物体がより優れた成長を示すことが明らかである。
前記ルピナスタンパク質のバイオ刺激活性を、1ml中に前記タンパク質を含む天然タンパク質200μgを含む粗ルピナス抽出物を6週齢のスイカの苗の葉の表面に噴霧した後に評価した。前記評価のための分析は、温室条件の下で行われ、前記スイカの苗は、水が噴霧されたもの(対照群;A群)、1ml中に前記タンパク質を含む天然タンパク質100μgを含む粗ルピナス抽出物が噴霧されたもの(B群)、市販されている植物成長促進剤が噴霧されたもの(C群)、及び1ml中に前記タンパク質を含む天然タンパク質200μgを含む粗ルピナス抽出物が噴霧されたもの(D群)を用いた。前記分析には、各群24本ずつのスイカの苗が用いられた。前記分析は、前記噴霧後2週間後に行われ、結果を図6に示す。最も高濃度の前記ルピナスタンパク質が噴霧されたスイカの苗(D群)は、水又は前記市販の植物成長促進剤で処理されたスイカの苗に比較して、最もよい成熟度及び優れた葉の成長を示した。最も低濃度の前記ルピナスタンパク質が噴霧されたスイカの苗(B群)は、低い水準の成長度を示すが、水のみが噴霧されたものよりは高い成長度が観察された。従って、推奨使用水準は、前記スイカの苗に対して、1ml中に前記タンパク質を含む天然タンパク質200μgを含む前記ルピナスタンパク質の粗製造物の噴霧である。
粗ルピナス抽出物は、1ml中に前記タンパク質を含む前記ルピナス天然タンパク質200μgを含むように製造された。Uncinula necatorに感染し、温室条件下で維持されたブドウは、前記粗ルピナス抽出物又は水(対照群)が噴霧された。前記噴霧の24時間後、前記ブドウは、対照群と比較して観察された結果、前記ルピナスタンパク質が噴霧されたブドウは、高い活力を示し、新芽の出現が明らかとなった。この状況は少なくても一週間維持され、その後、前記ブドウ(以前は前記真菌の存在により衰弱されていたが)は、生き生きとし、病気の症状を全く示さずに多くの葉を有していた。
前記ルピナスタンパク質濃縮物の優れた栄養の潜在力を強調する優れた消化率と同様に、前記タンパク質を含む前記ルピナス天然タンパク質の構成要素であるよくバランスの取れたアミノ酸は、前記タンパク質を含む前記ルピナス天然タンパク質の粗調製物に存在するグロブリンの、5mMのカルシウム及びマグネシウムによる沈殿により製造される。
Claims (15)
- ルピナス属の植物から抽出されたタンパク質において
(a)下記(B)で表わされるアミノ酸残基の配列を備え、
(B)
(b)(B)で表わされるアミノ酸残基の配列中、一つ以上のアミノ酸残基が欠損、置換、付加、又は修飾されており、該タンパク質が抗真菌性及び抗卵菌活性、植物成長促進活性、又は生物活性維持特性を示すことを特徴とするタンパク質。 - 前記ルピナス属の植物から抽出されたタンパク質は、糖鎖形成、リン酸化、アルキル化又はプレニル化されていることを特徴とする請求項1記載のタンパク質。
- 前記タンパク質をコードするDNAフラグメントにおいて、
(a)下記(A)で表されるヌクレオチド配列を備え、
(A)
(b)(A)で表わされるヌクレオチド配列中、一つ以上のヌクレオチドが欠損、置換、付加、又は修飾されており、抗真菌活性及び抗卵菌活性、植物成長促進活性、又は生物活性維持特性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするDNAフラグメント。 - 請求項3記載のDNAフラグメントを含むことを特徴とする組み替えベクター。
- 請求項4記載の組み替えベクターを用いて形質転換されたことを特徴とする形質転換細胞。
- 大腸菌(Escherichia coli)から派生したことを特徴とする請求項5記載の形質転換細胞。
- 植物、動物、又は微生物から派生したことを特徴とする請求項5記載の形質転換細胞。
- 請求項5記載の形質転換細胞を含み、
該形質転換細胞の再生により獲得される、病原菌、卵菌又は昆虫によって引き起こされる疫病に対する耐性を示すことを特徴とする遺伝子組み換え植物。 - 請求項5乃至請求項7記載の形質転換細胞を培養する工程と、
細胞培養又は細胞抽出物から、抗真菌活性を有する前記タンパク質を回収する工程とを含むことを特徴とする請求項1記載のタンパク質の製造方法。 - 活性材料として、請求項1若しくは請求項2記載のタンパク質、又は請求項9の方法により得られるタンパク質の組み替え型を含むことを特徴とするタンパク質の製剤又は粗調製物。
- 植物成長促進剤及び肥料として、病原体又はそれ以外の真菌類及び卵菌類、昆虫によって引き起こされる疾病に対する予防、制御又は戦いに用いられることを特徴とする請求項10記載のタンパク質の製剤又は粗調製物。
- 植物成長促進剤及び肥料として、病原体又はそれ以外の真菌類及び卵菌類、昆虫に対する予防、制御又は戦いを目的とすることを特徴とする、製剤の調製時に、請求項1又は請求項2記載のタンパク質又は請求項9で得られたタンパク質の組み替え型の使用方法。
- 植物成長促進剤及び肥料として、病原体又はそれ以外の真菌類及び卵菌類、昆虫によって引き起こされる疾病に対する予防、制御又は戦い時における、請求項1又は請求項2記載のタンパク質又は請求項9で得られたタンパク質の組み替え型の使用方法において、
請求項1又は請求項2記載のタンパク質又は請求項9記載で得られたタンパク質の組み替え型を少なくとも一部に含むルピナス抽出物を植物に用いることを特徴とする使用方法。 - 自然衰弱又は病原体に感染した植物の葉に噴霧した後に特に観察可能なバイオ刺激活性のような、バイオ刺激薬又は植物の成長及び成熟の促進物質として使用されることを特徴とする請求項1若しくは請求項2記載のタンパク質、請求項9の方法により得られたタンパク質の組み替え型、又は該タンパク質を含む粗調製物の使用方法。
- カルシウム塩及びマグネシウム塩を用いて、又は、アルブミン沈殿のための熱処理のような物理的処理を用いて若しくはこれを用いずにグロブリンを沈殿させた後、高い栄養価を有するヒト又は動物の栄養のためのタンパク質濃縮物の調製物を使用することを特徴とする請求項1又は請求項2記載のタンパク質、請求項9の方法により得られたタンパク質の組み換え型、又は該タンパク質を含む粗調製物の使用方法。
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