JP2020503060A - 治療用タンパク質 - Google Patents

治療用タンパク質 Download PDF

Info

Publication number
JP2020503060A
JP2020503060A JP2019538725A JP2019538725A JP2020503060A JP 2020503060 A JP2020503060 A JP 2020503060A JP 2019538725 A JP2019538725 A JP 2019538725A JP 2019538725 A JP2019538725 A JP 2019538725A JP 2020503060 A JP2020503060 A JP 2020503060A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
deflamin
mmp
defuramin
protein
conglutin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2019538725A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7510255B2 (ja
Inventor
イサベル グスマオ リマ アナ
イサベル グスマオ リマ アナ
パトリシア モタ ゲレイロ ジョアナ
パトリシア モタ ゲレイロ ジョアナ
マヌエル デ セイシャス ボアヴィダ フェレイラ リカルド
マヌエル デ セイシャス ボアヴィダ フェレイラ リカルド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Instituto Superior de Agronomia
Original Assignee
Instituto Superior de Agronomia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PT109645A external-priority patent/PT109645A/pt
Priority claimed from GBGB1616715.7A external-priority patent/GB201616715D0/en
Application filed by Instituto Superior de Agronomia filed Critical Instituto Superior de Agronomia
Publication of JP2020503060A publication Critical patent/JP2020503060A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7510255B2 publication Critical patent/JP7510255B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/31—Extraction of the material involving untreated material, e.g. fruit juice or sap obtained from fresh plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するためのデフラミンポリペプチド組成物であって、ここで療法は、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである。

Description

本発明は、治療用タンパク質およびその製造方法に関する。
過去数十年の間に、予防的かつ治療的な新規抗がん剤を開発するための集中的研究が行われてきた。しかしながら、診断、スクリーニングおよび治療における著しい進歩にもかかわらず、患者の全体的な長期転帰は過去数十年で大きく変化してはいない。この状況の下で、この疾患に対抗し、予防、化学療法の補助、または再発の予防に使用できる新規抗がん剤を開発するための様々な生物学的供給源についての集中的研究が行われてきた。さらに、現在、慢性炎症を特異的に標的とする処方薬はない（もちろん、軽度の一時的な炎症とそれに伴う損傷や手術などの手技による痛みを治療する市販薬はある。しかしながら、これらは慢性炎症を治療するための手段ではない）。ヒドロキシクロロキンなどの、かつてはマラリアに対抗するために使用されていたいくつかの薬は、何人かの狼瘡患者を治療するのに有用であるが、それらは疾患を治さない。アスピリンおよびスタチンは一部の人々の炎症を軽減するのに有望であることを示したが、研究者らはそのような薬がその役割にどれほど広く役立つか確信がない。プレドニゾン、多数の副作用をもたらすコルチコステロイドなど、完璧とは言い難い抗炎症薬以外に、科学者らは依然として炎症を抑える最良の方法を研究している。
本発明者らは、抗がん特性および抗炎症特性を有する新規ポリペプチドを含む新規組成物である「デフラミン」を発見した。さらにデフラミンは栄養補助食品の特性を有する。したがって、本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するためのデフラミンポリペプチド組成物を提供し、ここで前記療法は、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである。
デフラミンは、一実施形態では、（全てではないが）多くの種子（ルピナス属の植物の場合はβ−およびδ−コングルチン）に存在する貯蔵タンパク質由来のフラグメントの混合物であるとみなすことができ、典型的には、特定の手順によって精製され、多数の独特な生物学的／生物活性特性、すなわち抗炎症活性および抗がん活性、ならびにそれらに由来する他の生物活性を示す。
デフラミンは、ルーピン種子および他の種の種子からなどの多くの種子種から得ることができる。本明細書に記載されるように、スケールアップを受けるのに適した種子（ルーピンおよびその他のもの）からデフラミンを抽出および精製するための特定の方法論が開発され、産業施設でのその大量生産を可能にした。本発明はデフラミンの組み換え生産も含む。
本発明は、炎症の直接的または間接的（すなわち、所与の治療によって生じる炎症）結果として発症する疾患、および／またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性を伴う全ての疾患におけるデフラミンの予防的および治療的使用を含む。
（デフラミンの定義）
デフラミンは、その起源、生物活性、それがどのように生成されるか、および、場合によっては構造的に定義することができる。デフラミンは多くの種の種子に含まれているが、全ての種に含まれているわけではない。本発明において製造または使用されるデフラミンは、本明細書に記載の１つ以上の物理的または治療的特性を有することができる。そのような特性には、本明細書に記載のアッセイ（動物モデルを含む）のいずれかにおいて測定されるような１つ以上の生物活性、ならびに本明細書に記載の電気泳動ベースの技術、ＨＰＬＣおよび質量分析アッセイによって測定される物理的特性が挙げられる。デフラミンは、天然に存在する配列（単数もしくは複数）または関連する人工（相同のまたは再配列された）配列（単数もしくは複数）を含み得る。
（デフラミンの性質）
デフラミンは、好ましくは可溶性ポリペプチド／低分子タンパク質の混合物の形態であるか、または個々のポリペプチド／低分子タンパク質の形態であり得る。それは通常、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：ａ）それは容易に食べることができる（ヒトに無毒）；ｂ）それは種子の中で発生する；ｃ）それは水溶性である；ｄ）それは低分子量ポリペプチド／低分子タンパク質の混合物の１つまたは任意の組み合わせによって構成されている；ｅ）その生物活性は、煮沸に対して、広範囲のｐＨ値に対して、エタノールおよび／または消化プロテアーゼに対して耐性がある（すなわち、それらは消化過程に抵抗する）；ｆ）それはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−９および／またはＭＭＰ−２を強く阻害する、すなわちそれは低濃度のＭＭＰ阻害剤（ＭＭＰＩ）である；ｇ）それは有意な細胞毒性を誘発することなく、ヒト結腸腺癌細胞株ＨＴ２９の遊走能を低下させる；ｈ）それは少なくとも以下の重要な生物活性を示す：（ｉ）強力な抗炎症性；（ｉｉ）強力な抗腫瘍性（抗遊走および抗転移）；（iii）著しい細胞毒性がない。
経口投与した場合、デフラミンは有意な免疫原性（すなわち、ＩｇＧ）またはアレルギー性（すなわち、ＩｇＥ）応答を引き起こさない。さらに、それは低濃度で生物活性がある。
一実施形態では、デフラミンを含むポリペプチドは、β−コングルチンおよびδ−コングルチン大鎖のフラグメント（例えば、ルピナス種子からのデフラミン）として同定されている。配列番号１９２および配列番号１９３を参照。
以下に詳細に記載されるように、デフラミンは、動物モデルにおいて経口投与、腹腔内投与、静脈内投与または局所投与された場合に生物活性を示す。特にデフラミンは以下の特性を有する：ａ）以下の経路のいずれか１つにより投与された場合に、疾患の動物モデル（すなわちマウス）において測定される抗炎症活性：経口、腹腔内、静脈内および局所；ｂ）マトリックスメタロプロテイナーゼ（すなわちＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２）活性の強力な阻害、がん細胞抗増殖活性および細胞腫瘍浸潤の阻害によって研究された通りの、抗腫瘍活性。
（他の植物タンパク質との関係）
Ｂｌａｄは既知生物活性植物ポリペプチドである。Ｂｌａｄ、ならびにＢｌａｄ含有オリゴマー（ＢＣＯ）は、β−コングルチンのフラグメントを含む。しかしながら、それらは、典型的には他のβ−コングルチンのフラグメントおよび／またはδ−コングルチン大鎖のフラグメントを含むデフラミンとは無関係である。
機能的にこの２つは非常に異なり、デフラミンは抗菌活性を全く持たない（細菌および真菌に関する限り）のに対して、Ｂｌａｄ含有オリゴマーはゼラチナーゼを阻害しない。Ｂｌａｄは、β−コングルチンの固定フラグメントに相当し、すなわち、Ｂｌａｄは、β−コングルチンの前駆体（すなわち、プロ−β−コングルチン）の残基１０９〜２８１を含む。δ−コングルチン大鎖に加えて、デフラミンは、典型的には、β−コングルチンの他のフラグメントに相当し、例えばそれは全ポリペプチドにまたがる。
（マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびがんに対する活性）
デフラミンは、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓの種子で発見され、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘなどの他の種子にも存在する、新規タイプのＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−２阻害剤である。ある種のがんの患者の死亡は、例えば結腸直腸がん患者では、原発性腫瘍自体ではなく、むしろ転移性疾患によって通常引き起こされることが一般に確立されている。転移は、原発腫瘍からのがん細胞の放出および別の組織または器官への付着を伴う。したがって、がん細胞浸潤は転移における重要な要素であり、接着／脱接着のためのインテグリンと、限局性タンパク質分解のためのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）とを必要とする。
限局性タンパク質分解は、がん細胞が移動するための細胞外マトリックスにおける経路を開くために必要とされる。創傷治癒アッセイは、細胞が持つ細胞浸潤についての能力の推定を提供する。通常、ＭＭＰ−９活性はがん細胞の浸潤と非常に関連しているため、ＭＭＰ−９活性の低下は細胞浸潤を阻害し、２つの活性は通常対になっている。これがＭＭＰ−９阻害が非常に望ましい理由であり、なぜならそれが細胞浸潤を直接遮断／制限し、それ故に転移による死を阻害するためである。
一方、細胞は、インテグリンと呼ばれる特定のタンパク質であって、細胞−細胞相互作用と細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用の橋渡しである膜貫通受容体を介して基質に接着する。組織培養中の細胞に対するインテグリンの１つの重要な機能は、細胞遊走におけるそれらの役割である。インテグリンは腫瘍の進行と転移とによって調節され、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の両方の活性と密接に関係している。細胞が腫瘍から放出された際、それらは別の組織に付着する能力を欠くため、がん細胞膜中のインテグリンを標的として無効にすることも望ましい。これは転移も抑制することになり、原発腫瘍の分解さえも補助することができる。
多くの研究での別の標的は、がん細胞に対する特異的細胞毒性である。フェノール化合物などの多くの生物活性化合物は、細胞増殖を強力に抑制し、代謝を損なわせ、中程度の高用量で毒性レベルに達する。生物活性化合物の存在下での細胞増殖および細胞代謝の測定は、細胞に対するその毒性の直接的尺度である。ＭＴＴアッセイは、生細胞に吸収され、次いでそれらによって対応するホルマザンに代謝される必要がある特定の着色剤を使用する。
簡単に言えば、ＭＴＴアッセイは、ミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼによる可溶性で黄色のＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］の還元を測定する比色アッセイである。ＭＴＴは細胞に入り、ミトコンドリアに移行し、そこで不溶性で着色された（濃い紫色の）ホルマザン生成物［（Ｅ、Ｚ）−５−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−１，３−］−ジフェニルホルマザン］に還元される。次いで細胞を有機溶媒（例えばイソプロパノール）で可溶化し、放出され可溶化されたホルマザン試薬を分光光度的に定量する。ＭＴＴの還元は代謝的に活性な細胞においてのみ起こり得るため、活性のレベルは細胞の生存率の尺度である。そのため、細胞が死んでいる、または代謝障害を受けている場合、着色剤を産生しない。したがって、より濃い色は、より多くの代謝活性のある生細胞を示す。化合物が細胞増殖を抑制したり、細胞を死滅させると、色が薄くなる。
がん細胞を標的とし死滅させることは、理論的には、良い方法である。しかしながら、それはがん細胞に対して高い特異性があり、健康で正常な（すなわちがんでない）細胞に対して特異性がない場合にのみうまくいくことができる。がん細胞を破壊するほとんどの化合物は、所与の用量で正常で健康な細胞も破壊することになり、多くの研究はがん細胞の増殖を抑える代謝産物（例えば、フェノール化合物）の能力にのみ焦点を当てているが、対照の健康な細胞に対するそれらの影響をあまり考慮に入れていない。これがかなり一般的である理由の１つは、正常で健康な細胞とは異なり、実験室条件下でがん細胞を培養することが比較的簡単であるという事実に関連している。結果として、後になって、前臨床のレベルにおいてまたは臨床アッセイのレベルにおいてでさえ、これらの化合物の使用は、用量制限毒性、不十分な臨床的有効性および極めて有害な副作用によって頻繁に妨げられる。そのため、細胞浸潤を減少させるが細胞の正常な代謝には影響を及ぼさない生物活性剤（デフラミンの場合のように）は、それが通常の細胞に対して細胞毒性を及ぼさないため、副作用が少なく（または無視でき）、予防的な長期投与に使用するのにより安全である。
本発明の特定の実施形態は、治療的および／または予防的手順および／またはアプローチを想定している。例えば、デフラミンは、病気を予防するために健康な個体に投与され得る。本発明の特定の実施形態は、以下のうちの１つ以上を含む特定の投与経路を想定する：経口、肛門、注射および局所。
（他のＭＭＰ阻害剤の性質）
植物に由来する他の植物ＭＭＰ阻害剤は、以下の欠点のうちの１つ以上を有する：ａ）毒性；ｂ）消化過程中の化学的不活性化（例えば、変性）または分解／破壊（例えば、タンパク質分解）；ｃ）血流への吸収、免疫原性（すなわち、ＩｇＧ）またはアレルギー性（すなわち、ＩｇＥ）応答を誘発するか否かにかかわらず；ｄ）煮沸中（例えば調理中）の破壊；ｅ）全てまたは個々のゼラチナーゼに対して特異性がない；ｆ）高用量要求；ｇ）適切で効果的かつ低コストの単離手順がない。
これは、大部分の場合、なぜＭＭＰＩ阻害のレベルでヒトの健康および栄養学の分野において成功裏の適用を見出した単一の植物由来の生物学的化合物がまだないのかを説明する。
（コングルチン）
典型的には、デフラミンポリペプチドは、コングルチン配列のフラグメントと同一であるか、またはコングルチン配列のフラグメントと強い相同性を有する配列を有する。一実施形態では、そのようなコングルチン配列は、本明細書に記載の特定のコングルチン由来のものであるか、またはそれらの特定のコングルチンの天然に存在する相同体由来のものである。
ルーピンでは、コングルチンは４つのファミリーに分類されてきた：α、β、γおよびδコングルチン。ルーピンの主な種子グロブリンであるβコングルチンは、種子貯蔵タンパク質のビシリンすなわち７Ｓメンバーであるのに対して、α−コングルチンは、種子貯蔵タンパク質のレグミンすなわち１１Ｓメンバーである。細葉ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）では、合計３つのα−コングルチン、７つのβ−コングルチン、２つのγ−コングルチンおよび４つのδ−コングルチンをコードする遺伝子が以前に同定された。これらの遺伝子は、それぞれコングルチンアルファ１、２および３、コングルチンベータ１、２、３、４、５、６および７、コングルチンガンマ１および２、ならびにコングルチンデルタ１、２、３および４と呼ばれている。
δコングルチンは、２Ｓ硫黄リッチアルブミンファミリーに属する。δコングルチンとも呼ばれるルピナス種子２Ｓアルブミンは、２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結された以下の２つの低分子ポリペプチド鎖を含む単量体タンパク質である：４．４ｋＤａの分子量となる３７アミノ酸残基からなるより小さなポリペプチド鎖、および８．８ｋＤａの分子量を有する７５アミノ酸残基を含むより大きなポリペプチド鎖。Ｌ．ａｌｂｕｓδコングルチンの唯一のアミノ酸配列は、遺伝子配列から推測された。より大きなポリペプチド鎖は、２つの鎖内ジスルフィド架橋および１つの遊離スルフヒドリル基を含む。このタンパク質は、Ｌ．ａｌｂｕｓ由来のタンパク質の中でも、以下の特定の固有の特徴を示す：その高いシステイン含有量に加えて、それは２８０ｎｍでの低い吸光度を示す。
δ−コングルチンの生理学的役割に関する限り、このクラスのタンパク質について貯蔵機能が提案されている。二官能性トリプシン／アルファ−アミラーゼ阻害剤が挙げられる植物穀物阻害剤ファミリーとの構造的類似性は、その貯蔵役割に加えて、このタンパク質に対する防御機能を示唆し得る。Ｌ． ａｌｂｕｓ種子中のその存在は約１０〜１２％であると評価されたが、より最近のデータは約３〜４％の低い含有量を示唆している。ルピナス種子２Ｓアルブミンは、典型的にはアルブミン画分とグロブリン画分の両方に存在する。
（炎症）
デフラミンを使用して、炎症を予防または治療することができる。炎症は、病原体、化学物質などの有害な刺激、または身体的損傷による組織および細胞への損傷に対する体の即時反応である。急性炎症は短期的反応であり、通常は治癒をもたらす：白血球が損傷領域に浸潤し、刺激を取り除き、組織を修復する。対照的に、慢性炎症は、活発な炎症、組織の破壊および組織修復の試みを伴う、長期にわたる無秩序で不適応な反応である。デフラミンを使用して、急性炎症もしくは慢性炎症を予防または治療することができる。
デフラミンを使用して、皮膚炎、黒色腫、歯周炎および歯肉炎などの皮膚もしくは粘膜の炎症過程を予防または治療することができる。それを使用して、全身性および慢性消化性炎症を治療することができる。
以下のような多数の一般的で多くの場合致命的な疾患に慢性炎症が関与していることは、現在広く受け入れられている：ａ）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、心疾患、脳卒中、がん、慢性呼吸器疾患、神経疾患、肥満、および糖尿病；ｂ）アテローム性動脈硬化症、関節炎、糖尿病、ヒト免疫ウイルスによって媒介される後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、喘息、新生物、変性疾患および心血管疾患；ｃ）アレルギーおよび自己免疫疾患；ｄ）肥満および代謝性疾患；ｅ）アルツハイマー病および他の神経変性疾患；ｆ）うつ病。
デフラミンを使用して、これらの症状のいずれかを予防または治療することができる。
（がん）
がんとは、異常な細胞が制御されずに分裂し、同じ生物の近くの組織に浸潤する可能性がある疾患を表す用語である。がん細胞は、血液やリンパ系を通して体の他の部分に広がることもある。がんにはいくつかの主なタイプがある：ａ）がん腫は、皮膚または内臓を裏打ちするもしくは覆う組織から発生するがんである；ｂ）肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織から発生するがんである；ｃ）白血病は、骨髄などの造血組織から発生し、異常血球を大量に産生させて血液を浸すがんである；ｄ）リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞から発生するがんである；e）中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織から発生するがんである；ｆ）黒色腫は、悪性（がん）細胞がメラニン形成細胞（皮膚を着色する細胞）中に形成する疾患である。
がん関連症状：乳管上皮内がん、男性乳がん、乳がん、膵臓がん、膵外分泌がん、前立腺がん、大腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、皮膚の黒色腫、がん腫、基底細胞がん、皮膚がん、扁平上皮がん、精巣がん、甲状腺がん、卵巣がん、卵巣胚細胞腫瘍、肺がん、膀胱がん、食道がん、胃がん、子宮がん、子宮内膜がん、肝細胞がん、肝がん、口腔咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、鼻咽頭がん、咽頭がん、口腔がん、脳腫瘍、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、腎臓がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、尿道がん、小細胞肺がん、骨肉腫、肉腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド症候群、慢性リンパ性白血病、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、下垂体腫瘍、有毛細胞白血病、陰茎がん、白血病、膣がん、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、悪性線維性組織球腫、乳頭のページェット病、胆嚢がん、急性リンパ芽球性白血病、眼のリンパ腫、副腎皮質がん、腺がん、副甲状腺がん、膵神経内分泌腫瘍、ガストリン産生腫瘍、メルケル細胞がん、唾液腺がん、外陰がん、消化管間質腫瘍、肛門がん。
本発明は、上記もしくは本明細書に記載の任意のタイプのがんもしくは特定のがんを予防または治療するためのデフラミンを提供する。デフラミンは、腫瘍形成の初期段階において有効であり、化学療法における治療の一部として転移形成を阻害し、手術後のがんの再発を回避する。
（デフラミンの製造方法）
本発明の治療的態様における使用のためのデフラミンは、本明細書に記載の任意の方法などの任意の適切な方法によって製造することができる。それは好ましくは、組み換え発現によりまたは植物原料からの抽出により製造される。デフラミンは、デフラミンまたはデフラミン前駆体を発現する任意の植物原料、典型的には成熟種子などの種子、例えば本明細書に記載の任意の適切な植物属または種から得ることができる。
（種子などの植物原料から）
典型的には、デフラミンは、逐次沈殿スキームに従う方法によって得られる。この方法は、デフラミンの高温、低ｐＨ、および高エタノール濃度に対する耐性に基づき得る。粉がこの方法の出発点として使用される場合、それは適切な種子を製粉することによって得ることができる。
（方法１）
一実施形態では、方法は、適切な種子からのデフラミンの抽出を含み、以下を含む：
− 高温、好ましくは少なくとも８０℃での、または煮沸させる少なくとも１つの工程；および
− 低ｐＨ、好ましくはｐＨ４以下での少なくとも１つの工程；
− 抽出物を高エタノール濃度、好ましくは少なくとも７０％（ｖ／ｖ）のエタノールまたは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）のエタノールと接触させる少なくとも１つの工程；
（方法２）
別の実施形態では、方法は以下の工程を含む：
（ａ）無傷の種子を水中で煮沸した後、水中もしくは緩衝液中で抽出し、脂肪を除去する工程、または無傷の種子を粉にし、水中もしくは緩衝液中で抽出した後、脂肪を除去して煮沸させる工程、または粉から脂肪を除去した後、水中もしくは緩衝液中で抽出して煮沸させる工程；
（ｂ）可溶性画分を十分に低いｐＨ値（例えばｐＨ４．０以下）にさらし、残渣タンパク質／ポリペプチドの大部分を沈殿させる工程；
（ｃ）沈殿画分を約４０％（ｖ／ｖ）のエタノールに再懸濁し、その溶液も必要に応じて０．４ＭのＮａＣｌを含有している工程。上清にデフラミンが含まれている；
必要に応じて以下の工程も実施され得る：
（ｄ）可溶性画分を９０％（ｖ／ｖ）エタノールにしてデフラミンを沈殿させ、−２０℃で保存する工程、またはデフラミン沈殿を、例えば凍結乾燥などの他の手段によって達成してもよい工程；
（ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返すことにより、沈殿デフラミンを最終混入物質から除去してもよい工程；
（ｆ）沈殿デフラミンを、次いで、例えば水に溶解させ、任意の適切な技術によって脱塩して低分子量混入物質を除去してもよい工程、および／または必要になるまで凍結（液体または乾燥）保存してもよい工程。
（方法３）
一実施形態では、方法は以下の工程を含む：
（ａ）適切な種子からの粉を提供する工程；（ｂ）前記粉を脱脂する工程；（ｃ）前記脱脂工程からの残渣試料を一定期間煮沸する工程；（ｄ）前記試料を一定期間遠心分離する工程；（ｅ）その後、得られたペレットを廃棄し、得られた上清をさらに処理して、そのｐＨを下げながらポリペプチドを沈殿させる工程；（ｆ）さらに遠心分離してさらなるペレットを得て；前記上清を捨てる工程；ならびに（ｇ）前記さらなるペレットをエタノールでさらに処理し、遠心分離してさらなるペレットを得て、それを廃棄する工程；その残渣上清はデフラミンを含む。
工程（ａ）〜（ｇ）のいずれも方法４および５について列挙したより具体的な同等の工程と置き換えることができる。
（方法４）
一実施形態では、方法は以下の工程を含む：
（a）種子からの粉を脱脂する。有機溶媒で脱脂した後、撹拌しながら、通常１〜６時間、例えば室温で、水に懸濁する（通常１：１０〜１：５０ｗ／ｖ；ｐＨは通常８．０〜８．５に調整）または、撹拌しながら通常１〜６時間、室温で粉を水に懸濁した後（通常１：１０〜１：５０ｗ／ｖ；ｐＨは通常８．０〜８．５に調整）、スラリーの上部から脂肪を単に除去する。水の代わりに、典型的には実験室規模で、粉は典型的には３０〜７０ｍＭの、典型的にはｐＨ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁され得る。
（ｂ）少なくとも２〜６時間、例えば約４時間または一晩、典型的には４℃で撹拌した後、典型的には１０，０００〜２０，０００ｇ、例えば１３，５００ｇ、１０〜９０分間、例えば３０分間、典型的には４℃での遠心分離により、可溶性タンパク質を得る。ペレットを捨てる。
（ｃ）タンパク質溶液を、典型的には１００℃で５〜２０分間、例えば１０分間煮沸し、１０、０００〜２０，０００ｇで、例えば１３，５００ｇで、典型的には２０分間４℃で遠心分離する。ペレットを捨てる。上清を収集し、熱処理抽出物（ＨＴ）を提供する。
（ｄ）希ＨＣｌを添加して約ｐＨ４．０にし、上清中のポリペプチド／タンパク質を沈殿させる。１０，０００〜２０，０００ｇ、例えば１３，５００ｇで、典型的には２０分間４℃での遠心分離の際に、上清を捨てる。
（ｅ）ペレットを、０．２〜０．６ＭのＮａＣｌ、例えば０．４ＭのＮａＣｌを含有する３０〜５０％、例えば４０％（ｖ／ｖ）のエタノールに再懸濁し、典型的には室温で１時間撹拌し、１０，０００〜２０，０００ｇ、例えば１３，５００ｇで３０分間４℃で遠心分離した。大部分の種子貯蔵タンパク質とは異なり、この処置はデフラミンを溶液にする。ペレットを捨てる。
（ｆ）上清を８０〜９５％、例えば９０％（ｖ／ｖ）エタノールにし、−１０℃未満、例えば−２０℃で、少なくとも４時間、例えば一晩保存し、デフラミンを沈殿させ、続いて１０，０００〜２０，０００ｇ、例えば１３，５００ｇで、典型的には３０分間４℃で遠心分離する。上清を捨てる。
場合によっては、４０〜９０％（ｖ／ｖ）のエタノール分別沈殿を繰り返す必要がある。したがって、以下の追加の工程を実施してもよい：
（ｇ）ペレット中に存在するデフラミンを、もう一度０．４Ｍ ＮａＣｌを含有する４０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解させ、１時間室温で撹拌し、１３，５００ｇで３０分間４℃で遠心分離する。この２回目の洗浄は、最終混入物質からデフラミンを取り除く。ペレットを再び捨てる。
（ｈ）上清をもう一度９０％（ｖ／ｖ）エタノールにし、−２０℃で一晩保存し、デフラミンを沈殿させ、続いて１３，５００ｇで３０分間４℃で遠心分離する。上清を捨てる。
（ｉ）最終ペレットは純粋なデフラミンを含有し、これを続いて可能な限り少量のミリＱ水に溶解させる。デフラミン溶液を最後にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（例えばＮＡＰ−１０カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で水中に脱塩させ、低分子量の混入物質を除去する。
（ｊ）得られた抽出物は、必要に応じて−２０℃で保存してもよい。
（方法５）
一実施形態では、デフラミンは以下の方法を用いて得られる：
（a）適切な種子からの粉を
− ｎ−ヘキサンで脱脂した後、室温で２〜３時間撹拌しながら水に懸濁させる（１：２０ｗ／ｖ；ｐＨをｐＨ８．０〜８．５に調整）、または
− 室温で２〜３時間撹拌しながら粉を水に懸濁させた後（１：２０ｗ／ｖ；ｐＨをｐＨ８．０〜８．５に調整）、スラリーの上部から脂肪を単に取り除く。
− 水の代わりに、典型的には実験室規模で、粉を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁させてもよい。撹拌は４℃で４時間（または一晩）である。
（ｂ）可溶性タンパク質を、１３，５００ｇで４℃で３０分間遠心分離することによって得る。ペレットを捨てる。
（ｃ）タンパク質溶液を１００℃で１０分間煮沸し、１３，５００ｇで４℃で２０分間遠心分離する。ペレットを捨てる。上清を収集し、熱処理抽出物（ＨＴ）を提供する。
（ｄ）希ＨＣｌを添加して約ｐＨ４．０にし、上清中のポリペプチド／タンパク質を沈殿させる。４℃で２０分間、１３，５００ｇで遠心分離した際、上清を捨てる。
（ｅ）ペレットを０．４Ｍ ＮａＣｌを含有する４０％（ｖ／ｖ）エタノール中に再懸濁し、室温で１時間撹拌し、４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。大部分の種子貯蔵タンパク質とは異なり、この処置はデフラミンを溶液にする。ペレットを捨てる。
（ｆ）上清を９０％（ｖ／ｖ）エタノールにし、−２０℃で一晩保存し、デフラミンを沈殿させ、続いて４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。上清を捨てる。
場合によっては、４０〜９０％（ｖ／ｖ）のエタノール分別沈殿を繰り返す必要がある。したがって、以下の追加の工程を実施してもよい：
（ｇ）ペレット中に存在するデフラミンを、もう一度０．４Ｍ ＮａＣｌを含有する４０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解し、室温で１時間撹拌し、４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心する。この２回目の洗浄は、最終混入物質からデフラミンを取り除く。ペレットを再び捨てる。
（ｈ）上清をもう一度９０％（ｖ／ｖ）エタノールにし、−２０℃で一晩保存し、デフラミンを沈殿させ、続いて４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。上清を捨てる。
（ｉ）最終ペレットは純粋なデフラミンを含有し、これを続いて可能な限り少量のミリＱ水に溶解させる。実験室規模では、デフラミン溶液を最後にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（例えばＮＡＰ−１０カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で水中に脱塩させ、低分子量の混入物質を除去する。
（ｊ）得られた抽出物を、必要に応じて−２０℃で保存する。
上記方法のいずれかで使用される粉は、約１００ｇ±０．１ｇの乾燥種子（典型的には胚および外皮なしで）を製粉して粉を得るなど、種子を製粉することによって必要に応じて得られる。
（方法６）
組み換えタンパク質を産生する方法は、当該技術分野においてよく知られている。本明細で適用されるそのような方法は、以下を伴うことになる：デフラミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適切な発現ベクター−前記ポリヌクレオチドの、１つ以上のプロモーター（例えば、Ｔ７ｌａｃなどの誘導プロモーター）および他の目的とするポリヌクレオチドまたは遺伝子との並置を可能にする−に挿入すること、発現ベクターを適切な細胞または生物（例えば大腸菌）に導入すること、形質転換された細胞または生物においてポリペプチドを発現させること、ならびにその細胞または生物から発現された組み換えポリペプチドを除去すること。そのような精製を補助するために、ポリヌクレオチドが、例えば精製を補助することができる末端タグ：例えばアフィニティー精製用のヒスチジン残基のタグをさらにコードするように、発現ベクターを構築してもよい。いったん組み換えポリペプチドを精製すれば、精製タグを、例えば限定的タンパク質分解切断によって、ポリペプチドから除去してもよい。
（方法７）
より単純で経済的かつ迅速な方法論が可能であり、かなり純粋なデフラミンをもたらすが、上記の手順で達成されるほど多くはない。これらの方法論は必然的に抽出、煮沸、低ｐＨ値へのばく露およびエタノールでの処理を伴うことになる。
（デフラミンの物理的構造）
デフラミンは、１つ以上のポリペプチドを含む組成物である。それは典型的には、少なくとも１〜２００個の異なるポリペプチド、例えば２０〜１５０、３０〜１００または５０〜８０個の異なるポリペプチドを含み、これらは以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
（ａ）それらは、５〜２５０アミノ酸残基、例えば５〜２００、５０〜２００、７５〜１５０、もしくは好ましくは１００〜１８０もしくは１２０〜１７０アミノ酸残基などの長さを有し、ならびに／または
（ｂ）それらは、本明細書に記載の任意のコングルチンまたは配列番号８〜１９０のいずれかによって表される部分などの、コングルチン由来の配列の一部および／もしくは相同体である配列を含むか、もしくはそれからなり、ならびに／または
（ｃ）それらはそれぞれ以下の配列を含む：
（ｉ）コングルチンタンパク質の一部であって、前記一部が少なくとも５、１０、２０、３０もしくは５０アミノ酸残基長であるコングルチンタンパク質の一部、ならびに／または
（ｉｉ）好ましくは前記一部と少なくとも７０％の同一性を有する、（ｉ）で定義された一部の同族体、
ここで、前記コングルチンタンパク質は必要に応じてコングルチンベータ１、２、３、４、５、６もしくは７もしくはコングルチンデルタ２タンパク質である；
ならびに／または
（ｄ）少なくとも２０、３０もしくは５０個のポリペプチドは、コングルチン由来の配列の再配列である配列を含む。
デフラミンポリペプチドは微小不均一性を示し得る。したがって、ルーピンの場合、デフラミンポリペプチドは、大部分は重複するが様々な長さを示すコングルチンの配列に対応する。
再配列された配列を有するデフラミンポリペプチドは、典型的には、異なるコングルチン由来の、もしくは同じコングルチン分子の異なる部分由来の配列の部分；またはそのような部分の相同体を含む。そのような部分（部分の相同体を含む）は、少なくとも５、１０、２０、３０または５０アミノ酸残基長であり得る。同じコングルチンの異なる部分に由来する部分は、それらが存在する元のコングルチンにおいて、少なくとも１０、２０、５０または２００アミノ酸分だけ離れていてもよい。再配列された配列を有するデフラミンポリペプチドは、異なるコングルチン分子に由来するおよび／または同じコングルチン分子の異なる部分に由来するコングルチン配列の少なくとも２、３、４、５または６つの異なる部分を含み得る。そのような部分は、配列番号８〜１９０のいずれかを含む、本明細書に記載の任意の特定の配列と同じであり得る、その部分であり得る、および／またはその相同体であり得る。
一実施形態では、デフラミン組成物は、配列番号８〜５５および／または５６〜７５および／または７６〜１９０の配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、８０％または全てを、存在する全てのポリペプチドの一部として含む；またはこれらの特定の配列のいずれかの相同体、もしくは本明細書で特定される任意の他の配列の相同体を含む。
デフラミンは、典型的には、少なくとも１〜２００個の異なるポリペプチド、例えば２０〜１５０、３０〜１００または５０〜８０個の異なるポリペプチドを含み、これらは各々が下記の通りである配列を含む：
（ａ）配列番号８〜１９０のいずれか１つと同じか、または少なくとも５、１０、２０、３０または５０アミノ酸残基長である配列番号８〜１９０のいずれかの一部である、および／または
（ｂ）好ましくは（ａ）と少なくとも７０％の相同性を有する、（ａ）で定義された配列の相同体。
一実施形態では、デフラミン組成物は、この節で定義されたもの以外のポリペプチドを含まないか、またはそのような他のポリペプチドは、組成物中のポリペプチドの総質量３０％未満、例えば１０％未満などを表す。
配列番号として定義されるポリペプチドの群が本明細書で言及される場合、分類Ｉ（配列番号８〜５５）のポリペプチドが最も好ましく、次いで分類ＩＩ（配列番号５６〜７５）、分類ＩＩＩ（配列番号７６〜１９０）がそれに続く。
一実施形態では、デフラミン組成物は、そのコングルチンに「またがる」コングルチン（本明細書で言及される任意のコングルチンなど）由来の配列の部分を、全てのそのポリペプチド内に配列の形態で含む。典型的には、少なくとも３、４、５または６つの部分があり、そのうち少なくとも１、２または３つの部分がコングルチンポリペプチドの前半部分および後半部分に存在する（コングルチンのＮ末端が分子の始まりを表す）。好ましくは、この状況において、コングルチンポリペプチドが３つの等しい長さの切片に分割されると推測するならば、少なくとも一部分は、コングルチンポリペプチドの第一、第二および第三部分のそれぞれに由来する。
特定の実施形態では、デフラミンは、β−およびδ−コングルチンの両方に由来するポリペプチド、例えば、β−およびδ−コングルチン（好ましくは、Ｌ． ａｌｂｕｓ β−およびδ−コングルチン）の両方に由来する少なくとも１、２、３、５、または１０個のペプチドを含む。デフラミンは、１３ｋＤＡおよび１７ｋＤａの分子量に相当するそのようなペプチドの２群を含み得る。それらの長さは、少なくとも以下であり得るか、または以下のうちの任意の２つ以上によって定義される範囲であり得る：１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、もしくは１６０アミノ酸残基。特定の実施形態では、デフラミンは、ポリペプチドの２つのピーク（１３および１７ｋＤＡ）に由来するポリペプチドの混合物からなる。
（デフラミン：変異体、相同体および部分）
本明細書に記載のデフラミンの任意の実施形態では、デフラミンポリペプチドのうちの１つ以上を「変異体」で置き換えることができ、したがって典型的には、天然配列を相同配列または天然配列の１つ以上の部分で置き換えてもよい。好ましくは、そのような変異体は、相同体および／または配列番号８〜１９０によって示される配列の部分である。そのような相同体についての百分率同一性のレベルは、以下に記載される。配列の部分は、元の配列の少なくとも５０、８０、または９０％からなり、少なくとも５、１０、２０、または３０アミノ酸残基の長さであり得る。変異体は、例えば、本明細書に記載される任意のアッセイまたは試験を用いて測定されるように、好ましくは元のポリペプチド／配列の活性を保持することになる。
相同配列は、典型的には少なくとも４０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を、例えば全配列にわたって、または少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも５０、好ましくは少なくとも６０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、好ましくは少なくとも１２０、好ましくは少なくとも１４０、最も好ましくは少なくとも１６０以上の連続アミノ酸残基の領域にわたって有する。タンパク質相同性を測定する方法は、当該技術分野においてよく知られており、本文脈において、相同性は、アミノ酸同一性に基づいて計算されることが当業者には理解されよう（「ハード相同性」と呼ばれることもある）。
相同配列は、典型的には、置換、挿入または欠失、例えば１、２、３、４、５〜８、９〜１５もしくはそれ以上の置換、欠失または挿入によって元の配列と異なる。置換は、好ましくは「保存的」であり、すなわち、アミノ酸は類似のアミノ酸で置換されてもよく、それによって類似のアミノ酸は以下の基の１つを共有する（それらの側鎖Ｒに関するものにおいて）：芳香族残基（Ｆ／Ｈ／Ｗ／Ｙ）、非極性脂肪族残基（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）、極性非荷電脂肪族残基（Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｎ／Ｑ）および極性荷電脂肪族残基（Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｒ）。好ましいサブ基は以下を含む：Ｇ／Ａ／Ｐ；Ｉ／ＬＮ；Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ；Ｎ／Ｑ；Ｄ／Ｅ；およびＫ／Ｒ。
相同性（同一性）は、既知の利用可能な方法を用いて測定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばそのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を計算するかまたは配列を並べるために使用することができ（典型的にはそれらのデフォルト設定で）、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６， ２９０−３００、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５， ４０３−４１０に記載されている。
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴに一致するかそれを満たす問い合わせ配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接文字列スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接文字列ヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、文字列ヒットは各配列に沿って両方向に伸長される。各方向における文字列ヒットの拡張は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積により、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはどちらかの配列の終わりに達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の文字列長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９，： １０９１５−１０９１９を参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する。例えば、第１配列と第２配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列は別の配列と類似していると見なされる。
（デフラミンの形態）
デフラミンを含む、デフラミンからなる、またはデフラミンから本質的になる組成物は、典型的には単離または精製された形態（例えば植物もしくは細胞源から取り出された形態）にある。これは、典型的には、５０％未満、または２０％未満または１０％もしくは５％の非デフラミン乾燥質量を含む。
デフラミン組成物は、当業者によって組成物に添加された別の化合物（単数または複数）を含む製剤でもあり得る。好ましい実施形態では、そのような製剤は、デフラミンと薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬製剤である。当業者は、任意の特定の設定において、例えば治療において投与するときに使用するデフラミンの適切な濃度を、習慣的な方法によって同定することができるであろう。好ましくは、例えば、それは少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬ、および最大５００μｇ／ｍＬ、最大６００μｇ／ｍＬ、最大１ｍｇ／ｍＬ、最大２．５ｍｇ／ｍＬ、最大５ｍｇ／ｍＬ、もしくは最大１０ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される。好ましくは、濃度は、１０μｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１００μｇ／ｍＬ〜６００μｇ／ｍＬ（約２５０μｇ／ｍＬなど）である。
一実施形態では、デフラミン組成物は、例えば本明細書で示される特定の配列によって定義されるように、ルナシンもしくはＢｌａｄタンパク質を２０重量％未満、１０重量％未満、または１重量％未満で含むか、または全く含まない。別の実施形態では、デフラミンポリペプチドのいずれも、ルナシンまたはＢｌａｄ由来のいかなる配列も含まない、すなわち、それらは、ルナシンおよび／またはＢｌａｄ由来のいかなる配列部分も含まない。
（治療上の使用）
病状を予防または治療する療法において使用される場合、デフラミンは好ましくは治療有効量で使用される。好ましくは、治療有効量はヒトまたは動物の被験体に対して無毒である。
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するためのデフラミンポリペプチド組成物を提供し、ここで前記療法は、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである。この目的のために、本発明は、デフラミンを含む抗菌ポリペプチドの治療有効量を含む組成物か、または抗菌ポリペプチド（単数もしくは複数）に加えてデフラミンを含有する組成物を必要とする被験体に投与することを含む、ヒトまたは動物の治療方法も提供する。本発明は、炎症もしくはがんを治療もしくは予防する、または栄養補助食品を提供する医薬の製造におけるデフラミンの使用も提供する。
デフラミンを構成する個々のポリペプチドを別々に送達することができ、したがって本発明は、治療によるヒトまたは動物の身体の治療方法における同時、個別または逐次使用のためのデフラミン組成物を一緒に形成する多数の異なるポリペプチドを含む製品を提供し、ここで、前記療法は、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである。
デフラミンは、任意の適切な経路によって、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、および腹腔内、局所、経口または経粘膜（鼻、舌下、膣もしくは直腸など）経路によって投与され得る。
デフラミンは、好ましくは、担体、希釈剤および補助物質と一緒に投与される。薬学的に許容される担体には、水、食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩も、その中に含めることができる。必須ではないが、調製物が、安定化剤として作用する薬学的に許容される担体を含むことも好ましい。ポリペプチドの安定化剤としても作用する適切な担体の例としては、限定されないが、医薬品グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが挙げられる。他の適切な担体には、ここでも限定されないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
いったん製剤化されると、組成物は、様々な既知経路および技術を用いてｉｎ ｖｉｖｏで被験体に送達され得る。例えば、液体製剤は、注射溶液、懸濁液またはエマルジョンとして提供され得、従来の針および注射器を使用するか、または液体ジェット注射システムを使用する非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、骨内または腹腔内注射によって投与され得る。液体製剤はまた、眼、皮膚、毛髪または粘膜組織（例えば、鼻、舌下、膣もしくは直腸）に局所投与することができ、または呼吸もしくは肺投与に適した微粉化スプレーとして提供することもできる。他の投与形態としては、経口投与、坐剤、および能動的または受動的経皮送達技法が挙げられる。
治療を必要とする被験体は、任意のヒトまたは動物個体であってもよい。被験体は、典型的には、脊索動物、哺乳動物、農業用動物またはげっ歯類である。好ましい実施形態では、デフラミンは、炎症またはがんの特定の危険性がある被験体の治療に使用することができる。
デフラミンは、ｉｎ ｖｉｖｏでデフラミンを発現する核酸発現ベクターを用いて投与することができる。本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するためのデフラミン組成物を一緒にまたは個別に発現する１つ以上の核酸ベクターを提供し、ここで前記療法は、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである。核酸ベクターは、ウイルスベクターまたは核酸の送達を可能にする任意の他のタイプのベクターであり得る。
本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法における同時、個別または逐次使用のためのデフラミン組成物を一緒に発現する多数の核酸ベクターを含む製品も提供し、ここで前記療法は、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである。
（抗体）
本発明は、配列番号８〜１９０の配列に相当するポリペプチドのいずれか１つに特異的に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを提供する。
次に、添付の図面を参照しながら本発明を説明する：
Ｂｌａｄに相当するβ−コングルチン前駆体をコードする配列の内部フラグメントを示す図である； Ｂｌａｄの二次ポリペプチド構造を示す図である； Ｂｌａｄの三次ポリペプチド構造を示す図である； Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子からデフラミンを抽出および精製するために使用される方法論の概略図を示す； 最初に分析した８つのマメ科種子のそれぞれについてのアルブミンおよびグロブリンポリペプチドプロファイル間の比較を示す図である； 最初に分析した８つのマメ科種子のＭＭＰ−９阻害活性を示すグラフである； 最初に分析した８つのマメ科種子のそれぞれからのアルブミン画分とグロブリン画分間の細胞増殖アッセイを比較するグラフである； 以下の３つのマメ科種子に対する細胞遊走創傷アッセイの画像を示す図である：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ； 最初に分析した８つのマメ科種子のそれぞれからのアルブミン画分とグロブリン画分とで比較した細胞遊走創傷アッセイの結果を示すグラフである（図８に示すように実施する）； 最初に分析した８つのマメ科種子のそれぞれからのアルブミン画分とグロブリン画分とで比較したゼラチン分解活性を示すグラフである； 以下の３つのマメ科種子からのアルブミン画分とグロブリン画分とで比較したＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性のザイモグラフィープロファイルを示す図である：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ； 分析した６つのマメ科種子からの未調理画分と調理済み画分とで比較したフィチン濃度を示すグラフである； 分析した６つのマメ科種子からの未調理画分と調理済み画分とで比較したサポニン濃度を示すグラフである； 分析した６つのマメ科種子からの未調理画分と調理済み画分とで比較したフェノール化合物濃度を示すグラフである； 分析した６つのマメ科種子からの未調理画分と調理済み画分とで比較した可溶性タンパク質濃度を示すグラフである； 分析した６つのマメ科種子からの未調理画分と調理済み画分とで比較したＲ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたポリペプチドプロファイルを示す図である； 以下の３つのマメ科種子からのいくつかの調理済み画分と未調理画分とで比較した創傷治癒アッセイによって評価された細胞遊走の画像を示す：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ； 以下の３つのマメ科種子からのいくつかの調理済み画分と未調理画分とで比較した創傷治癒アッセイの相対遊走率を示すグラフである：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（図１７）； 以下の３つのマメ科種子からのいくつかの調理済み画分と未調理画分とで比較した細胞増殖を示すグラフである：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ； 以下の３つのマメ科種子からのいくつかの調理済み画分と未調理画分とで比較したゼラチン分解活性を示すグラフである：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ； 以下の３つのマメ科種子からのいくつかの調理済み画分と未調理画分とで比較したＭＭＰタンパク質分解活性に対する阻害効果を示すグラフである：Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ； ＦＰＬＣゲルろ過によって分画された、Ｌ．ａｌｂｕｓ種子からのデフラミン部分精製抽出物のタンパク質ピークを示すグラフである； トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した、図２２のポリペプチドピークの分離を示す図である； 図２２からのタンパク質画分のそれぞれのＭＭＰ−９阻害活性を示すグラフである； Ｌ．ａｌｂｕｓから単離したＭＭＰ阻害画分のＨＰＬＣ−逆相クロマトグラフィープロファイルを示すグラフである； Ｌ．ａｌｂｕｓから単離したＭＭＰ阻害画分の還元条件下での電気泳動プロファイルを示す図である（図２５）。 図２５に示した異なるピーク画分の、ＭＭＰ−９活性に対する効果を示すグラフである； 図２５に示すＨＰＬＣ実験から集めたピーク２のＬ．ａｌｂｕｓポリペプチド組成を示す図である； 図２８のＬ．ａｌｂｕｓ試料についての創傷閉鎖率をいくつかのＬ．ａｌｂｕｓタンパク質画分で比較している図である。 図２９に対応する創傷閉鎖アッセイの画像を示す図である； 図２９に対応するゼラチン分解活性プロファイルを示すグラフである； 図２９に対応する定量化ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性を示すグラフである； 細胞を「デフラミン」に４８時間ばく露した後の、ＨＴ２９細胞外培地におけるＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２およびそれらのチモーゲン酵素活性のザイモグラフィープロファイルを示す図である； 単純に緩衝液で（抽出緩衝液；ＢＥ）もしくは熱処理後（ＨＴ）に抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）または逆ゼラチンザイモグラフィー（右）によって視覚化したＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子のポリペプチド分布の代表的画像を示す図である； ゲルの上部に特定の、デフラミン精製プロトコルの各工程の後に得られたポリペプチドプロファイルの代表的画像を示す図である； デフラミン精製プロトコルに沿って様々な段階で収集した抽出物の存在下でのＭＭＰ−９タンパク質分解活性の総ゼラチン分解活性を示すグラフである； デフラミン精製プロトコルに沿って様々な段階で収集した抽出物の存在下でのＨＴ２９細胞遊走を示すグラフである； デフラミン精製プロトコル（図３７）に沿って様々な段階で収集した抽出物の存在下で得られた細胞遊走の例を示す図である； ゼラチン分解活性に対する異なる濃度のデフラミンの効果を示すグラフである； 細胞遊走に対する異なる濃度のデフラミンの効果を示すグラフである（図４１）； 異なる濃度のデフラミンについて得られた細胞遊走の例を示す図である； 細胞増殖に対する異なる濃度のデフラミンの効果を示す図である； 還元条件下および非還元条件下でのデフラミンのポリペプチドプロファイルを示す図である。標準の分子量はｋＤａで示されている； ２１４ｎｍ（ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー）でモニターしたデフラミンのその構成ポリペプチドへの分画の代表的画像を示す図である； ２８０ｎｍ（ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー）でモニターしたデフラミンのその構成ポリペプチドへの分画の代表的画像を示す図である； 図４４および４５の分画から収集した各ピークのポリペプチドプロファイルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化して示す図である； 図４４および４５のデフラミンの分画によって得られた画分１〜４の存在下でのＭＭＰ−９タンパク質分解活性を示すグラフである； 選択されたデフラミンピーク（図４４および４５におけるデフラミンの分画により得られた画分１〜４）の細胞遊走に対する効果を示すグラフである； 可溶性であるデフラミン画分と、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋による２つの画分におけるＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの分画後にＣａおよびＭｇで沈殿する画分との電気泳動プロファイルを示す図である； デフラミンと、ＣａおよびＭｇで沈殿させたまたは沈殿させていないその２つの部分画分によるＨＴ２９細胞への細胞浸潤の阻害を示す図であり、すなわち、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋での２つの画分におけるデフラミンの分離がその抗腫瘍活性に影響することを示す； 炎症および腫瘍浸潤に関連するＨＴ２９細胞中の特定の遺伝子の転写に対するＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの影響を示す図である； 食品中の、すなわち調理済み塩漬けビスケットの製造に使用したときの、Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンの（ＨＴ２９細胞浸潤阻害のレベルでの）生物活性を示す； ＨＰＬＣおよび電気泳動によるＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの分析を示す図である； ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる２つのＬ．ａｌｂｕｓデフラミンフラグメントの質量分光分析を示す図である； 大腸炎誘発マウスに対するデフラミンの抗大腸炎作用に関する予備結果を示す図である； 大腸炎誘発マウスからの結腸長に対するいくつかのデフラミン投与経路（および対応する対照）の効果を示すグラフである； 大腸炎誘発マウスにおける腸損傷の程度に対するいくつかのデフラミン投与経路（および対応する対照）の効果を示すグラフである； 大腸炎誘発マウスの異なる治療群（デフラミンおよび対照）から単離した結腸の肉眼観察を示す図である； 大腸炎誘発マウスの異なる治療群（デフラミンおよび対照）から単離した結腸の肉眼観察を示す図である； 大腸炎誘発マウスからの結腸炎症の組織学的特徴に対するデフラミン投与の効果を示す図である； 大腸炎誘発マウスにおけるＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの結腸組織発現に対するデフラミン投与の効果を示す図である； 大腸炎誘発マウス由来のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の結腸組織ゼラチナーゼ活性に対するデフラミン投与の効果を示すグラフである； 大腸炎誘発マウス由来のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の結腸組織ゼラチナーゼ活性に対するデフラミン投与の効果を示すザイモグラフィープロファイルを示す図である； ラット足浮腫発症に対するデフラミン投与の効果を示すグラフである； ラットの足浮腫に対する局所デフラミン投与の効果を示すグラフである； デフラミンで処置した大腸炎誘発マウスからの血液および糞便の逆ザイモグラフィーを示す図である； デフラミン（精製され調理された種子および未調理の種子）の細胞抗遊走効果を示す創傷閉鎖アッセイの代表的画像を示す図である； 異なる抽出物濃度のＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ種子の存在下で細胞遊走を評価する創傷治癒アッセイの代表的画像を示す図である； Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ種子から図４９に描かれた概略図によって単離されたデフラミンのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である； Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ種子からのデフラミンの抗ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２）活性の比較を示すグラフである； Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ種子からの異なる濃度のデフラミンの抗浸潤活性の比較を示すグラフである；ならびに Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＣｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ種子由来のデフラミンの存在下での細胞増殖の比較を示すグラフである； 他のルピナス種、マメ科植物の他の属および穀物などを含む他の非マメ科種の種子中のデフラミンの存在を検出するために、ゼラチンおよびＨＴ−２９培地を含有するポリアクリルアミドゲル上で行ったＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２での逆ザイモグラフィーを示す図である； Ｌｕｐｉｎｕｓ属の他の種の種子中のデフラミンの存在を検出するために、ゼラチンおよびＨＴ−２９培地を含有するポリアクリルアミドゲル上で行ったＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２での逆ザイモグラフィーを示す図である； 還元条件下および非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＬｕｐｉｎｕｓ ｍｕｔａｂｉｌｉｓデフラミンの代表的なポリペプチドプロファイルを示す図である； 還元条件下および非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＶｉｇｎａ ｍｕｎｇｏデフラミンの代表的なポリペプチドプロファイルを示す図である； コムギ属の種の種子中のデフラミンの存在を検出するために、ゼラチンおよびＨＴ−２９培地を含有するポリアクリルアミドゲル上で行ったＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２での逆ザイモグラフィーを示す図である； コムギ属の様々な種から単離されたデフラミンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ代表的ポリペプチドプロファイルを示す図である； ２Ｄ−ゲル電気泳動ＩＰＧ ｐＨ３〜６、７ｃｍおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ １７．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス−アクリルアミドを示す図である。ＩＥＦは、４，０００Ｖ、５０μＡ／ストリップの電流制限、１０，０００Ｖ−ｈで実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離、２００Ｖで６５分。
（技術情報）
炎症性疾患の発生率の増加に伴い、医療費および製薬費の必然的な引き上げが生じている。人間の健康の未来は、以下の２つの基本領域に頼るようになるとの見方が強まっている：治療のための従来の臨床療法、ならびに治療および予防の両方のための適切な食事療法（栄養補助食品および機能性食品の両方を含む）。炎症を軽減させる機能性食品および／または栄養補助食品の継続的な摂取は、今日の現代社会を襲う大多数の病気に対して最も効果的な人間の手段となると予測されている。ＭＭＰ阻害剤（ＭＭＰＩ）は、原発腫瘍および転移抑制剤に対する抗血管新生剤と考えられており、大腸炎および他の炎症性腸疾患などの前がん状態を効果的に抑制することも実証されている。過去１０年間で、かなりの量の研究が、新規植物性食品およびＭＭＰＩ活性を示す化合物の発見に向けられてきたが、特定の方法で個々のＭＭＰを標的とすることはそれ自体が困難であることがわかっている。
本発明の実施形態は、本質的にタンパク質性であり、消化過程を乗り切り、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与または局所投与され得る新規タイプのＭＭＰＩを記載しており、それらは炎症、腫瘍形成および細胞増殖、ならびにそれらに由来するあらゆる疾患の予防／治療における栄養補助食品または機能性食品として使用され得る。これらのＭＭＰＩは、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の強力な阻害剤であることが示されており、したがって強力な抗炎症活性、抗腫瘍活性および抗増殖活性を示す。本発明の実施形態は、非常に広範な疾患の予防または治療における有用な栄養補助食品としてのまたは機能性食品の組成物としてのデフラミンを示す。
（デフラミン発見に関する簡単な覚書）
デフラミンの実施形態は、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子から抽出され、他の種子、マメ科植物（例えば、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）と非マメ科植物の両方にも存在する新しいタイプのＭＭＰ−９ならびに／またはＭＭＰ−２阻害剤を含む。これらの知見は、一般的に食べられるマメ科植物、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓの食用種子から単離された水溶性ポリペプチド／低分子タンパク質のグループであるデフラミンの有望な発見につながり、それは培養結腸がん細胞においてはＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−２に対して非常に強力な阻害活性を示し、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与または局所投与した場合、明らかに有意な細胞毒性を示すことなく、動物モデルにおいて大腸炎を減少させる。デフラミンは、他の種子、例えばマメ科植物（例えば、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ならびに非マメ科植物からも得られることも発見された。Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓの場合、デフラミンは、特定の実施形態では、β−コングルチンおよびδ−コングルチン大鎖の両方からのポリペプチドフラグメントを含む。極端な値のｐＨおよび温度に対する高い安定性に加えて、予備的証拠はそれらが消化にも耐えることを示しており、これらのポリペプチド／低分子タンパク質を価値ある抗炎症性栄養補助食品になるための優れた候補としている。これらの新規ポリペプチド／低分子タンパク質は、特定の実施形態では抗がん剤または栄養補助食品として製造することができる。本発明の実施形態は、工業規模へのスケールアップに適したデフラミンを単離する効率的な方法も含む。他の種の種子における相同体の検索が行われており、今後さらに追求されるであろう。
（ＭＭＰおよびがん）
過去数十年の間に、予防的かつ治療的な新規抗がん剤を開発するための集中的研究が行われてきた。しかしながら、診断、スクリーニングおよび治療における著しい進歩にもかかわらず、患者の全体的な長期転帰は過去数十年で大きく変化してはいない（Ｈｅｒｓｚeｎｙｉら、２０１２）。この状況の下で、予防、化学療法の補助、または再発の予防に使用できる、この疾患に対抗する新規抗がん剤を開発するための様々な生物学的供給源についての集中的研究が行われてきており、特に植物性食品または生物活性植物化合物の場合、これらは予防および化学療法を補助するための栄養補助食品として使用することができる（Ｓｕら、２００６）。植物は、（がんを含む）医学療法用の化合物の重要な天然源であることが数年間で証明されている。過去２０年間で、米国市場に参入する新薬の２５〜３０％が植物から発見されたと推定されている。世界中で、これらの薬の店頭販売価格は年間４００億ドルを超えると推定されている。したがって、世界中の製薬会社や機関は、新薬を特定するための主要な手段として植物スクリーニングプログラムを実施している。
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、欧州連合（ＥＵ）において、がんによる死亡の２番目に多い原因であり、健康および経済に大きな負担をかけている。ヨーロッパでは、毎年約４３６，０００人の新たな患者と２１２，０００人の死亡が発生している。ＣＲＣ患者の死亡は、原発腫瘍自体によるのではなく、むしろ転移性疾患によって通常引き起こされる。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、結合組織のリモデリングに関与している亜鉛依存性エンドペプチダーゼのファミリーである（Ｍａｒｋｌｅら、２０１０）。ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）とも呼ばれるＭＭＰのサブグループは、動物モデルおよび患者におけるＣＲＣに大いに関係していることが示されている。それらの阻害剤（ＭＭＰＩ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび動物モデルにおいてがんの進行／転移を減少させるのに有効であることが実証され、がんの初期段階または手術後の未検出微小転移の発生の予防において大部分が有効であるように思われる（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２００２；Ｍｏｏｋら、２００４年；Ｚｕｃｋｅｒ＆Ｖａｃｉｒｃａ、２００４年；Ｓａｎｇら、２００６年；Ｈｅｒｓｚeｎｙｉら、２０１２年）。過去１０年間で、合成ＭＭＰＩの開発は学術的および産業的状況の両方において重要な研究部門となり、数多くのＭＭＰ阻害剤、特にＭＭＰ−２阻害剤が異なる臨床試験で試験されてきた（Ｈｉｄａｌｇｏ＆Ｅｃｋｈａｒｄｔ， ２００１）。このため、ならびに様々な疾患におけるＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の関与を考慮すると、特定のＭＭＰのアップレギュレーションの阻害は、患者の臨床症状を改善することができると考えられている。しかしながら、ＭＭＰは正常な発生および生理機能に偏在的に不可欠であり、がん患者の治療においてＭＭＰ活性を阻害するという以前の試みは重篤な有害副作用を伴う非常に不満足な結果をもたらしたという事実により、ＭＭＰを疾患治療において標的化することはそれ自体困難であることが証明されている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２００２年；Ｎｄｉｎｇｕｒｉら、２０１２年）。このため、ＭＭＰ構造に基づく合成ペプチド阻害剤はすぐに、特定の阻害剤に関する研究のホットスポットとなった。
ＭＭＰは最初にチモーゲンとして合成され（したがって不活性である）、酵素が活性化される前にプロペプチドドメインから除去されなければならないプロペプチドを有するため（Ｌｕら、２０１２；Ｎｉｎｇｕｒｉら、２０１２）、ペプチド薬は、細胞内ＭＭＰ発現に影響を与えることなく、細胞外ＭＭＰ活性化を直接阻害することができ、それゆえ全身性の有害副作用を回避することができる（Ｌｕら、２０１２）。
今日、薬物設計および創薬に関するペプチド研究は、新薬開発において最も有望な分野の１つである。小分子化合物と比較して、ペプチド薬物は、高い特異性および低い毒性などの様々な利点を提供する（Ｌｕら、２０１２）。過去１０年間で、かなりの量の研究が、様々なタイプのがん細胞に対して臨床的に活性な新規植物ＭＭＰＩに向けられてきた。しかしながら、はっきりしていない理由のために、そのような研究は多くの場合ペプチドおよび低分子タンパク質を無視していた。いくつかの植物種は、病原体攻撃に対する防御、またはタンパク質分解阻害などの機能を有する、特定の生物活性ペプチドおよび低分子タンパク質を提示することが知られている。例えば、マメ科種子の場合がそうである（Ｐａｒｋら、２００７）。これらの阻害剤の多くが植物性食品に由来するという事実は、それらを栄養補助食品としておよびがん予防食として、特に結腸がんの場合に使用するのに最適な候補にしている。化学療法または放射性治療などの従来のがん治療と比較して、がん細胞または腫瘍プロモーターに対して高い特異性を有するペプチドおよび低分子タンパク質は、正常細胞を保護し患者の迅速な回復を助ける一方でがん細胞を殺す方法を提示し得る（Ｐａｒｋら、２００７）。
本発明の知見は、いくつかの食用種子由来のペプチドおよび低分子タンパク質がＭＭＰ酵素に対して強い阻害活性を示すという発見につながった。有利には、特定の実施形態では、それらはヒト消化管を未変化で通過することができ、したがって結腸がん治療に使用することができる。
結腸の内側は実質的には「体外」と見なされ得、その中でＭＭＰＩは血流に吸収されない限り副作用を示さないため、ＣＲＣの管理および治療に関する研究での消化抵抗性ペプチドおよび低分子タンパク質ＭＭＰＩの使用は、特に適しているようである。
（ＭＭＰおよび炎症）
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の世界的な発生率および罹患率は、時代を経るにつれて劇的に増加しており、それが世界的な疾患として出現していることを証明している（Ｍｏｌｏｄｅｃｋｙら、２０１２；Ｂｕｒｉｓｃｈら、２０１４）。ＩＢＤの死亡率は低く（Ｄｕｒｉｃｏｖａら、２０１０；Ｂｕｒｉｓｃｈら、２０１４）、この疾患は若年者で最も頻繁に診断されるため（Ｌｏｆｔｕｓら、２００２；Ｂｕｒｉｓｃｈら、２０１４）、ＩＢＤの世界的な罹患率は今後数年間で実質的に上昇し続けると予測されている（Ａｂｒａｈａｍ＆Ｃｈｏ、２００９；Ｍｏｌｏｄｅｃｋｙら、２０１２）。ＩＢＤの病因は過去数十年間で広く研究されてきたが（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、２００２）、疾患の病因はまだ完全には理解されていない（Ｊｏｎｅｓら、２００８；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ＆Ｆｕｒｎｅｒ、２００９）。
ＩＢＤは、以下の３つのタイプの疾患を包含する：クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、および炎症性腸疾患未定義（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）（ＩＢＤＵ）。それらの全ては、主に、感受性のある個体における胃腸管の病理組織学における慢性粘膜炎症を特徴とする（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、２００２；Ｄａｎｅｓｅら、２００４；Ａｂｒａｈａｍ＆Ｃｈｏ、２００９；Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ＆Ｆｕｒｎｅｒ、２００９）。ＩＢＤは患者の生活の質を著しく低下させ、前がん状態に発展する可能性があるが（Ｘｉｅ＆Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ、２００８；Ｔｒｉａｎｔａｆｉｌｌｉｄｉｓら、２００９）、全体的なＩＢＤ臨床治療は副作用を引き起こしやすく、非特異的標的を提示し、非常に費用がかかり、それらの治療効果は満足のいくものではない（Ｄｙｓｏｎら、２０１２）。ＸｉｅおよびＩｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００８）によれば、長期にわたるＩＢＤ患者はＣＲＣを発症するリスクが高い。実際、散発性ＣＲＣの原因となる多くの分子変化は、大腸炎に関連した結腸発がんにも関与している（ＸｉｅおよびＩｔｚｋｏｗｉｔｚ、２００８）。
多数の研究が、動物モデル、細胞株、組織培養の変化および患者の生検における炎症過程におけるＭＭＰの関与を実証している（Ｂａｕｇｈら、１９９９；Ｐａｒｋｓら、２００４；Ｍｕｒｐｈｙ＆Ｎａｇａｓｅ、２００８；Ｌｅｅら、２０１３）。ゼラチナーゼＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２は、炎症における細胞動員の間の細胞外マトリックスタンパク質の代謝回転および分解（Ｍａｌｌａら、２００８年）ならびに腫瘍形成、細胞接着および転移などの他の病理学的に関連する腫瘍学的プロセス（Ｈｅｒｓｚeｎｙｉｅｔら、２０１２）において重要な役割を果たすと長い間認識されてきた。それらの基質選択性は類似しているが、ＭＭＰ−２は線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞において構成的に発現され、炎症性疾患に中程度に関与するのみであるが（Ｈｕｈｔａｌａら、１９９１）、ＭＭＰ−９発現は主に白血球において観察され（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら、２００２）、さまざまな炎症性病状に反応して高度に誘導され（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら、２００２）、潰瘍性大腸炎および他のＩＢＤの間に誘導される主要なゼラチナーゼである（Ｇａｒｇら、２００９； Ｍｏｏｒｅら、２０１１）。
これらの知見は、ＭＭＰ−９を、ＩＢＤの予防および治療、ならびに初期のがん段階および転移性遊走の予防における望ましい治療標的に変えた。しかしながら、ＭＭＰ−９阻害を前臨床的および臨床的ＩＢＤ減少に関連させた研究は非常に少なく、ＭＭＰを標的とすることはそれ自体困難であることが証明されている。これは、少なくとも部分的には、血清バイオアベイラブルではなく結腸アベイラブルである天然の食品由来の特異的ＭＭＰ−９阻害剤の長期摂取を通して達成することができた。ここ数年、いくつかの栄養機能を持つ食品は、特定の病気の予防および療に有益な健康効果をもたらすことが強調されており（Ｏｒｔｅｇａら、２００６；Ｓｉｒｔｏｒｉら、２００９）、過去１０年間で、かなりの量の研究が、ＭＭＰＩを提示する新規植物性食品に向けられてきた。
（植物種子からのＭＭＰＩ）
３０年以上にわたり、ＭＭＰは世界中の研究者によって魅力的ながんの標的として考えられてきた。その結果、多くの化学的ＭＭＰＩが潜在的な抗がん剤として開発された。よく知られている例は、テトラシリン、ゾレドロネート、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリン、２Ｓ、３Ｒ−３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−（４−ニトロフェニル）ブタノイル−Ｌ−ロイシン、およびネオバスタット（登録商標）（サメ軟骨から単離）によって提供されている。現在までに、無数のＭＭＰＩがすでに合成されており、そのうちのいくつかは腫瘍進行を制限する潜在的な治療薬として使用されてきた（Ｂｏｕｒｇｕｅｔら、２０１２）。しかしながら、臨床試験段階に入った低分子ＭＭＰＩはごく少数であり、そのほとんど（例えば、バチマスタット（登録商標）、マリマスタット（登録商標）、ソリマスタット（登録商標）、ガラルジン（登録商標）、トロケード（登録商標）、プリノマスタット（登録商標）、タノマスタット（登録商標）、レビマスタット（登録商標））は、有益性の欠如または強い有害副作用のいずれかのために、時期尚早に打ち切られた（Ｗａｎｇら、２０１２）。したがって、これまでのところ、がんの臨床試験の大部分は、やや期待外れであった。新規ＭＭＰＩを見出す試みで、低分子非天然ペプチドも合成されている。したがって、例えば、２つの非天然ドデカペプチドがＬｕらによってＭＭＰ−２阻害剤として同定され（２０１２）、一方、オクタデカペプチドはＭＭＰ−９阻害剤であることがわかった（Ｑｉｕら、２０１３）。
独特でより最近の戦略は、自然が我々に自由に使わせてくれている多数の天然物の中からＭＭＰＩを探すことである。
種子を含む植物器官および組織は、潜在的に有用な一連の生物活性を有する代謝産物、ペプチドおよびタンパク質を含むことが長い間知られており、それらの多くは発見されるのを待っている。そのような生物活性の１つは、ＭＭＰを阻害するそれらの能力に関連する。この点に関して、Ｃｙｒ（２００１）によって報告された研究からの表２および４は、その水性、エタノール性および有機抽出物がヒトＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９酵素それぞれに対して阻害活性を示す植物（ストレスおよび非ストレス）の膨大なリストを提供する。以下の追加の例に示すように、これらの抽出物は確実に二次代謝物を含む。ウィザフェリンＡは、Ａｃｎｉｓｔｕｓ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｗｉｔｈａｎｉａ ｓｏｍｎｉｆｅｒａおよび他のナス科ファミリーのメンバー、ならびにその安定な誘導体のいくつか（例えば、３−アジドウィザフェリンＡ；Ｒａｈら、２０１２）から誘導されるステロイド性ラクトンであり、分泌型ＭＭＰ−２の発現と活性を無効にした。フラボノイドクリシン、アピゲニン、ゲニステインおよびそれらのホモレプティック銅（II）錯体も、転移関連マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の発現および分泌を減弱させることが報告されている（Ｓｐｏｅｒｌｅｉｎら、２０１３）。
ブドウ由来のもの（Ｌａら、２００９）、ダイズ、ヒマワリ（Ｃｅｃｃｏｌｉら、２０１０）、および乾燥リュウガン（Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎａ Ｌａｍ．）（Ｐａｎｙａｔｈｅｐら、２０１３）などの多くの種子がＭＭＰＩを含むと報告されている。ブドウづるの場合、プロアントシアニジンはＭＭＰ阻害剤である（Ｖａｙａｌｉｌ＆Ｍｉｔｔａｌ、２００４）が、ダイズの場合、フラボノイドゲニステインおよびペプチドルナシン（下記参照）が有効成分であるように思われる。
さらに、種子、特にマメ科の種子は、トリプシン阻害剤およびＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤などの様々なタンパク質性酵素阻害剤を含有することで長い間認識されてきた。ダイズとヒヨコマメからのものは昆虫活性を示す。他方、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤は腫瘍形成を予防し、抗微生物活性に影響を及ぼすことが報告されている。結果として、Ｂｉｒｋ（１９９６）は、動物に対するプロテイナーゼ阻害剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果は、ヒトに関する場合には慎重に解釈されるべきであると結論付けた。しかしながら、これらのタンパク質性酵素阻害剤は全て、熱（調理を含む）処理によって不活性化されることに留意すべきである。これに関しては、ダイズ、米、エンドウマメまたはルーピン、およびＭＭＰを阻害することが知られている他の植物抽出物由来のタンパク質または糖タンパク質がある（Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ＆Ｊｏｐｐｅ、２０１３）。
（ルナシンについての特記）
ダイズからのルナシンは特記に値する。ルナシンは、最初はダイズで同定され、その後オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍおよびＡｍａｒａｎｔｈｕｓの種子にも存在すると主張されている、４３アミノ酸残基の化学予防ペプチドである（Ｊｅｏｎｇら、２００７）。４３アミノ酸残基のダイズルナシンに対して調製されたモノクローナル抗体を用いて、Ｈｅｒｒｅｒａ（２００９）は、総タンパク質抽出物中のこのペプチドならびにルピナスの栽培種および野生種の種子からの可溶性画分を検出するための詳細な研究を行った。出願人は、Ｌ．ａｌｂｕｓからのアルブミンまたはグロブリン画分中のルナシンを検出することができなかった。分析されたルピナス属の種では、ルナシンの陽性免疫学的シグナルは、種皮のあるＬ．ａｌｂｕｓの種子のプロラミン画分で、ならびに種皮のないＬ．ｍｏｎｔａｎｕｓおよびＬ．ｓｔｉｐｕｌａｔｅｓの種子のそれぞれアルブミン画分およびグルテリン画分で得られた。ルナシンは、種皮のないＬ．ａｌｂｕｓの種子ならびに種皮のあるおよび種皮のないＬ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓの種子のタンパク質抽出物中では検出されなかった。２５ｋＤａより大きいポリペプチドバンドについて免疫学的反応が得られ、結果はおそらく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画および膜へのブロッティングを受けた後にグリコシル化ＩｇＧを認識および結合することが知られているルーピン子葉におけるレクチン活性を示すレクチンまたは貯蔵タンパク質の存在に由来する。Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２０１３）は、ルナシンをコードする遺伝子（または遺伝子フラグメント）を穀物で見つけることができず、ダイズとラッカセイでその存在を確認した。
ルナシンは、より大きな子葉特異的２Ｓ種子アルブミン（Ｇｍ２Ｓ−１）複合体に由来し、抗がん活性と抗炎症活性の両方を有する低分子サブユニットペプチド（配列番号１９１）である。ルナシンのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を決定するための大規模動物研究およびヒト臨床試験は、合成ルナシンの費用、ならびに植物源からグラム量の高度に精製されたルナシンを得る方法の欠如がネックになっている（Ｓｅｂｅｒら、２０１２）。陰イオン交換クロマトグラフィー、限外ろ過、および逆相クロマトグラフィーの順次適用を利用するスケーラブルな方法が開発された。この方法により、純度０．９９％のルナシン調製物が収量４４２ｍｇ／ｋｇの脱脂ダイズ粉で生成される。Ｋｙｌｅら（２０１２）の図４の著者によって提示されたように、ルナシン作用の提案された様式は、ＭＭＰ阻害の役割を含まず、すなわち、ルナシンはＭＭＰと物理的に相互作用しないようである。むしろ、ルナシンとクロマチンおよびヒストンとの間で物理的相互作用が起こるようである（Ｊｉａｎｇら、２０１６）。
（ルピナス種子貯蔵タンパク質の簡単な解説）
コングルチンと呼ばれるルーピンの主な種子貯蔵タンパク質は、４つのファミリー：α−、β−、γ−およびδ−コングルチンに分類されている。ルーピンの主な種子グロブリンであるβ−コングルチンは、種子貯蔵タンパク質のビシリンすなわち７Ｓメンバーであるのに対して、α−コングルチンは、種子貯蔵タンパク質のレグミンすなわち１１Ｓメンバーである。細葉ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）では、合計３つのα−コングルチン、７つのβ−コングルチン、２つのγ−コングルチンおよび４つのδ−コングルチンをコードする遺伝子が以前に同定された（Ｆｏｌｅｙら、２０１１、２０１５）。これらの遺伝子は、それぞれコングルチンアルファ１、２および３、コングルチンベータ１、２、３、４、５、６および７、コングルチンガンマ１および２、ならびにコングルチンデルタ１、２、３および４と呼ばれている。さらに、得られたポリペプチドは、広範囲かつ複雑なプロセシングおよび組み立てプロセスを経て、これらのタンパク質を特徴付ける高度なミクロ不均一性をもたらす。
（δ−コングルチンと具体的に呼ばれるこの属のルピナス２Ｓタンパク質についての特記）
δ−コングルチンは、２Ｓ硫黄リッチアルブミンファミリーに属する。δ−コングルチンとも呼ばれるルピナス種子２Ｓアルブミン（Ｓｉｒｏｎｉら、２００５）は、２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結された以下の２つの低分子ポリペプチド鎖を含む単量体タンパク質である：４．４ｋＤａの分子量となる３７アミノ酸残基からなるより小さなポリペプチド鎖、および８．８ｋＤａの分子量を有する７５アミノ酸残基を含むより大きなポリペプチド鎖（Ｓａｌｍａｎｏｗｉｃｈ＆Ｗｅｄｅｒ、１９９７）。Ｌ．ａｌｂｕｓδ−コングルチンの唯一のアミノ酸配列は、遺伝子配列から推測された。より大きなポリペプチド鎖は、２つの鎖内ジスルフィド架橋および１つの遊離スルフヒドリル基を含む（Ｓａｌｍａｎｏｗｉｃｈ＆Ｗｅｄｅｒ、１９９７）。このタンパク質は、Ｌ．ａｌｂｕｓ由来のタンパク質の中でも、以下の特定の固有の特徴を示す：その高いシステイン含有量に加えて、それは２８０ｎｍでの低い吸光度を示す。
δ−コングルチンの生理学的役割に関する限り、このクラスのタンパク質について貯蔵機能が提案されている。二官能性トリプシン／アルファ−アミラーゼ阻害剤が挙げられる植物穀物阻害剤ファミリーとの構造的類似性は、その貯蔵役割に加えて、このタンパク質に対する防御機能を示唆し得る。Ｌ．ａｌｂｕｓ種子中のその存在は約１０〜１２％であると評価されたが、より最近のデータは約３〜４％の低い含有量を示唆している。ルピナス種子２Ｓアルブミンは、典型的にはアルブミン画分とグロブリン画分との両方に存在し（Ｓａｌｍａｎｏｗｉｃｈ＆Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋａ、１９９４）、したがって、２つのタンパク質画分におけるＭＭＰ阻害活性について以前に得られた本発明者らの結果を説明する（Ｌｉｍａら、２０１６）。
（Ｂｌａｄの簡潔な定義）
Ｂｌａｄは、２０，４０８．９５Ｄａ、１７３アミノ酸残基のポリペプチドであり、これはβ−コングルチンの前駆体（すなわちプロ−β−コングルチン）の残基１０９〜２８１個を含む。β−コングルチンは、ルピナス種子由来のグロブリンおよび主要貯蔵タンパク質である（図１、２および３；Ｍｏｎｔｅｉｒｏら、２００３、２００６）。自然条件下では、Ｂｌａｄは発芽開始後４日目〜１４日目の間にルピナスの苗の子葉に蓄積する。
（食品中に存在する抗がん活性、ダイズについての特記）
公開されている文献には、ほとんどの食用食品の抗がん作用に関する豊富な証拠がある。マメ科種子も例外ではなく、これらの研究は主にダイズに焦点を当ててきた。したがって、ダイズに含まれる化合物がさまざまな臓器系においてがんを予防できることを示唆する多くの証拠がある。これらには、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤、トリプシン阻害剤、フィチン酸、β−シトステロール、イソフラボン（例えばゲニステインおよびダイゼイン）ならびにサポニンが含まれる（Ｋｅｎｎｅｄｙ、１９９５）。マメ科種子タンパク質および特にダイズタンパク質（ＢＢＩを含む）は、様々な動物モデルにおいて抗がんおよび抗転移のレベルで役割を示すことが報告されている（Ｒｏｙら、２０１０）。Ｃｈａｍｐ（２００２）は、ダイズ由来のＢＢＩが、マウス、ラットおよびハムスターにおいて化学的に誘発された肝臓、肺、結腸、口および食道のがんの発生を抑制または予防することを報告した。Ｋｅｎｎｅｄｙ＆Ｗａｎ（２００２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで５０〜１００μｇダイズＢＢＩ／ｍＬが前立腺がん細胞の遊走を減少させることを観察した。ＢＢＩはＭＭＰを阻害し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞、動物モデル、およびヒト第ＩＩａ相臨床試験に対する有効性を実証する（Ｌｏｓｓｏ、２００８）。
現在、慢性炎症を特異的に標的とする処方薬はない。（もちろん、軽度の一時的な炎症とそれに伴う損傷や手術などの手技による痛みを治療する市販薬はある。しかしながら、これらは慢性炎症を治療するための手段ではない。）かつてマラリアと闘うために使用されていたヒドロキシクロロキンなどのいくつかの薬は、一部の狼瘡患者の治療には有用であるが、それらは病気を治癒することはない。アスピリンおよびスタチンは一部の人々の炎症を軽減するのに有望であることを示したが、研究者らはそのような薬がその役割にどれほど広く役立つか確信がない。プレドニゾン、多数の副作用をもたらすコルチコステロイドなど、完璧とは言い難い抗炎症薬以外に、科学者らは依然として炎症を抑える最良の方法を研究している。
（細胞浸潤およびインテグリン）
結腸直腸がん患者の死亡は、原発性腫瘍自体ではなく、むしろ転移性疾患によって通常引き起こされることが一般的に確立されている。転移は、原発腫瘍からのがん細胞の放出および他の組織または器官への付着を伴う。したがって、がん細胞浸潤は転移における重要な要素であり、ａ）接着／脱接着のためのインテグリンと、ｂ）限局性タンパク質分解のためのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）とを必要とする。
限局性タンパク質分解は、がん細胞が移動するための細胞外マトリックスにおける経路を開くために必要とされる。創傷治癒アッセイは、細胞が持つ細胞浸潤についての能力の推定を提供する。通常、ＭＭＰ−９活性はがん細胞の浸潤と非常に関連しているため、ＭＭＰ−９活性の低下は細胞浸潤を阻害し、２つの活性は通常対になっている。これがＭＭＰ−９阻害が非常に望ましい理由であり、なぜならそれが細胞浸潤を直接阻害し、それ故に転移による死を阻害するためである。
一方、細胞は、インテグリンと呼ばれる特定のタンパク質であって、細胞−細胞相互作用と細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用の橋渡しである膜貫通受容体を介して基質に接着する。組織培養中の細胞に対するインテグリンの１つの重要な機能は、細胞遊走におけるそれらの役割である。最近の研究は、インテグリンが腫瘍の進行と転移とによって調節され、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の両方の活性と密接に関係していることを証明している（Ｈｏｏｄ＆Ｃｈｅｒｅｓｈ、２００２）。細胞が腫瘍から放出されると、それらは別の組織に付着する能力を欠くため、がん細胞膜中のインテグリンを標的として無効にすることも望ましい。これは転移も抑制することになり、原発腫瘍の分解さえも補助することができる。
（細胞増殖および代謝）
多くの研究での別の標的は、がん細胞に対する特異的細胞毒性である。フェノール化合物などの多くの生物活性化合物は、細胞増殖を強力に抑制し、代謝を損なわせ、高用量で毒性レベルに達する。生物活性化合物の存在下での細胞増殖および細胞代謝の測定は、細胞に対するその毒性の直接的尺度である。ＭＴＴアッセイは、生細胞に吸収され、次いで紫色を生成するためにそれらによって代謝される必要がある特定の着色剤を使用し、それは次いで分光光度法によって定量化される。細胞が死滅している、または代謝障害を受けている場合、着色剤を産生しない。したがって、より濃い色は、より多くの代謝活性のある生細胞を示す。化合物が細胞増殖を抑制したり、細胞を死滅させたりすると、色が薄くなる。
がん細胞を標的とし死滅させることは、理論的には、良い方法である。しかしながら、それはがん細胞に対して高い特異性があり、健康で正常な（すなわちがんでない）細胞に対して特異性がない場合にのみうまくいくことができる。がん細胞を破壊するほとんどの化合物は、所与の用量で正常で健康な細胞も破壊することになり、多くの研究はがん細胞の増殖を抑える代謝産物（例えば、フェノール化合物）の能力にのみ焦点を当てているが、対照の健康な細胞に対するそれらの影響をあまり考慮に入れていない。これがかなり一般的である理由の１つは、正常で健康な細胞とは異なり、実験室条件下でがん細胞を培養することが比較的簡単であるという事実に関連している。結果として、後になって、前臨床のレベルにおいてまたは臨床アッセイのレベルにおいてでさえ、これらの化合物の使用は、用量制限毒性、不十分な臨床的有効性および極めて有害な副作用によって妨げられるようになる。
そのため、細胞浸潤を減少させるが細胞の正常な代謝には影響を及ぼさない生物活性剤（デフラミンの場合のように）は、通常の結腸細胞に対して細胞毒性を発揮しないため、ほとんどの場合副作用が少なく、予防的な長期投与に使用するのにより安全である。
約２０年前にはじめて、生物学が二次代謝に「目覚めた」。これには、より基本的な生化学および分子生物学、ならびに農業や人間の健康および栄養などの用途により近い分野が含まれる。過去２０年間で、米国市場に参入する新薬の２５〜３０％が植物から発見されたと推定されている。世界中で、これらの薬の店頭販売価格は年間４００億ドルを超えると推定されている。しかしながら、生物活性二次代謝産物と、本明細書で扱われているものなどの低分子タンパク質／ポリペプチドとの間には、用量依存性生物活性に大きな違いがある。
生物活性のある有益な二次代謝産物（例えば抗酸化ポリフェノール）は、典型的には低濃度で有効である。しかしながら、特定の閾値を超えると、それらは非常に有毒になる。それどころか、低分子タンパク質／ポリペプチドは、本来有益であるか（例えばデフラミン）、または毒性があるか（例えばリシンならびにヘビおよびサソリの毒に存在するタンパク質）のいずれかである。
（材料および方法）
（材料、溶媒および試薬）
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）５％（ｗ／ｖ）水溶液は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入した。ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）１０００）およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）２％）は、Ｂｉｏ２ Ｐｒｏｄｕｔｏｓ Ｖｅｔｅｒｉｎaｒｉｏｓ（リスボン、ポルトガル）から購入した。他の全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、アメリカ）から購入した。色素消光（ＤＱ）−ゼラチンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ）から購入した。
（抗菌活性の測定）
デフラミンの抗菌活性は、Ｂｏｕｈｄｉｄら（２０１０）に記載されているようにミクロ希釈法を用いて、滅菌９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ、ドイツ）中で評価した。簡単に説明すると、５０μＬのミュラー−ヒントン培地（Ｂｉｏｋａｒ、フランス）および５０μＬのデフラミン溶液（１００μｇ／ｍＬのデフラミン濃度を得る）を最初のウェルに添加し、各隣接ウェルに１：２で段階希釈し、１０希釈まで行った。続いて、濃度２×１０５ ＵＦＣ／ｍＬの細菌懸濁液５０μＬをウェルに添加した。陽性対照（５０μＬのミュラー−ヒントン培地＋５０μＬの細菌懸濁液）および陰性対照（１００μＬのミュラー−ヒントン培地）を実施した。プレートを２４時間３７℃でインキュベートし、接種の始めとアッセイの終わりに、吸光度を５４６ｎｍ（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ、Ｂｉｏｔｅｋ、アメリカ）で読み取った。
（抗真菌活性の測定）
培地としてＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）を含有するペトリ皿で増殖させた１週齢の真菌培養物に２０ｍＬの滅菌水を添加することによって胞子懸濁液を調製した。増殖条件は、暗所で２５℃±１℃であった。胞子懸濁液をろ過し、血球計を使用して１０５胞子／ｍＬの濃度に調整した。胞子懸濁液（１００μＬ）を、ＰＤＡ培地を含むペトリ皿に添加し、滅菌レーキで皿の表面に十分に広げた。無菌ろ紙（直径：６ｍｍ）製のディスクを６μＬのデフラミン溶液（１００μｇ／ｍＬ）に浸し、培地の表面に被着した。無菌ろ紙ディスクを６μＬの滅菌水に浸すことによって対照を作成した。次いでペトリ皿をインキュベーター（２５℃、暗所）に保存し、真菌の増殖を２週間の間モニターした。
（最小阻止濃度（ＭＩＣ））
最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、以前に記載したような微量希釈法を用いて、滅菌９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ、ドイツ）中で評価した（Ｂｏｕｄｉｄら、２０１０）。簡単に説明すると、５０μＬのＲＰＭＩ培地を各ウェルに添加した。次に、各試料５０μＬを最初のウェルに添加し、各隣接ウェルに１：２で段階希釈し、１０希釈まで行った。続いて、濃度２×１０５細胞／ｍＬのＨＴ２９細胞懸濁液５０μＬをウェルに添加した。陽性対照（５０μＬのＲＰＭＩ培地＋５０μＬの細胞懸濁液）および陰性対照（１００μＬのＲＰＭＩ培地）を実施した。プレートを２４時間３７℃でインキュベートし、細胞増殖を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイ（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら、１９８７）により測定した。ＭＭＰ−９ ＭＩＣ測定用に、各ウェルからの培地を集め、ゼラチン分解活性を下記のようにＤＱ−ゼラチンを用いて測定した。
（種子）
特定の実施形態では、以下のマメ科植物種の乾燥種子を使用した：白色ルーピン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ．）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ．）、およびダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．）。必要なときはいつでも、他のマメ科種子も使用した：レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ Ｍ．）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ Ｌ．）、およびササゲ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ Ｌ．）。
（調理済み種子）
マメ科種子は、他の多くの種子と同様に、消化酵素阻害剤、レクチン、高フィチン酸塩濃度、非タンパク質アミノ酸などの抗栄養因子を含むことがよく知られている。したがって、タンパク質性抗栄養因子の変性を確実にするために、それらは調理後に摂取されなければならない。これらの理由のために、およびデフラミンは煮沸に抵抗することが発見されたため、調理済み種子を用いて多数の初期実験が行われた。調理条件をシミュレートするために、乾燥種子を柔らかく食べるのに適した食感が得られるまで、蒸留水（ｗ／ｖ）で煮沸した（Ｘｕ＆Ｃｈａｎｇ、２００８）。
（タンパク質および非タンパク質化合物の抽出、総可溶性タンパク質の抽出）
（総可溶性タンパク質の抽出）
特定の実施形態では、ポリビニルポリピロリドン（生重量０．５ｇ当たりＰＶＰＰ０．５ｇ）を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５において、１：５（ｗ／ｖ）の割合で、室温で２〜３時間撹拌することによって、ならびに４℃で４時間撹拌することによって、種子由来の総可溶性タンパク質を抽出した。次いで、スラリーを４℃で６０分間、１２，０００ｇで遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１Ｍ／Ｅ、ローターＪＡ ２０．０００）。上清を保存し、冷凍庫に−２０℃で保存した。
（非タンパク質化合物の抽出）
総フェノール抽出用に、種子を粉に粉砕し、ｎ−ヘキサンで脱脂し、生重量１ｇ当たり水中アセトン１０ｍＬ（５０％、ｖ／ｖ）を添加することにより抽出した。試料を室温で４時間撹拌し、４℃で１０分間、１２，０００ｇで遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２-２１Ｍ／Ｅ、ローターＪＡ ２０．０００）。この手順を２回繰り返し、上清を収集し、プールさせ、さらなる分析のために凍結保存した。上清を乾燥するまで６０℃で蒸発させ、得られた抽出物を反応緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２および０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を１２％ｖ／ｖエタノールで含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６）に再懸濁した。
（種子からのデフラミンの抽出および単離）
Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ．（ルーピン）の乾燥成熟種子を、研究のこの部分で使用した。特定の実施形態では、他の種の種子についても同じ手順に従った。ＭＭＰＩタンパク質抽出物を、煮沸および酸変性に抵抗するその能力を用いて単離した。工業的規模へのスケールアップを受けるのに適した、デフラミンを種子から単離するための方法が開発された（図４）。
一実施形態では、デフラミンを精製する方法は、逐次沈殿スキームに従うクリーンな手順である。これは高温、低ｐＨおよび高エタノール濃度に対するデフラミン耐性に基づいており、以下の工程を含む：
−約１００ｇ±０．１ｇの乾燥ルーピン種子（胚および外皮なし）を製粉して粉にする。
−粉をｎ−ヘキサンで脱脂した後、室温で２〜３時間撹拌しながら水に懸濁させる（１：２０ｗ／ｖ；ｐＨをｐＨ８．０〜８．５に調整）。
−粉を水に懸濁させた後（１：２０ｗ／ｖ；ｐＨをｐＨ８．０〜８．５に調整）、室温で２〜３時間撹拌しながら、脂肪をスラリー上部から単純に取り除く。水の代わりに、実験室規模で、粉を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁させてもよい。４℃で４時間（または一晩）撹拌した後、４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離することにより可溶性タンパク質を得る。ペレットを捨てる。
−タンパク質溶液を１００℃で１０分間煮沸し、１３５００ｇで４℃で２０分間遠心分離する。ペレットを捨てる。上清を回収し、熱処理抽出物（ＨＴ）を得た。
− 希ＨＣｌを添加して約ｐＨ４．０にし、上清中のポリペプチド／タンパク質を沈殿させる。４℃で２０分間、１３，５００ｇで遠心分離した際、上清を捨てる。
−ペレットを０．４ＭのＮａＣｌを含有する４０％（ｖ／ｖ）エタノールに再懸濁させ、室温で１時間撹拌し、４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。大部分の種子貯蔵タンパク質とは異なり、この処置はデフラミンを溶液にする。ペレットを捨てる。
−上清を９０％（ｖ／ｖ）エタノールにし、−２０℃で一晩保存し、デフラミンを沈殿させ、続いて４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。上清を捨てる。
−最良の結果のため、およびより純粋でよりきれいなデフラミン画分を得るために、４０〜９０％（ｖ／ｖ）のエタノール分別沈殿を繰り返す必要がある。したがって、
−ペレット中に存在するデフラミンをもう一度、０．４ＭのＮａＣｌを含有する４０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解させ、室温で１時間撹拌し、４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。この２回目の洗浄は、最終混入物質からデフラミンを取り除く。ペレットを再び捨てる。
−上清をもう一度９０％（ｖ／ｖ）エタノールにし、−２０℃で一晩保存し、デフラミンを沈殿させ、続いて４℃で３０分間、１３，５００ｇで遠心分離する。上清を捨てる。
−最終ペレットは純粋なデフラミンを含有し、これを続いて可能な限り少量のミリＱ水に溶解させる。実験室規模では、デフラミン溶液を最後にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（例えばＮＡＰ−１０カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で水中に脱塩させ、低分子量の混入物質を除去する。
−得られた抽出物を、ファルコンチューブ中−２０℃で保存した。
この方法論はＬ．ａｌｂｕｓ、ＣｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘからデフラミンを単離するのに成功した。
（高速液体クロマトグラフィーによるデフラミン分画）
特定の実施形態では、デフラミン構成ポリペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ ２９９８フォトダイオードアレイ検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置（Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ）で分画した。タンパク質試料をＣ１８逆相カラム、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ ５μｍ、２５０ｍｍｘ４．６ｍｍで分離した。溶出液Ａ（０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）および溶媒Ｂ（０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ中アセトニトリル）で溶出を行った。ピーク検出は２１４ｎｍおよび２８０ｎｍの両方で行った。
（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））
特定の実施形態では、試料を、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１５％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび０．００６％（ｗ／ｖ）のｍ−クレゾールパープルを含む１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８で処置し、１００℃で５分間加熱した。一次元電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）によって記載された方法に従い、１２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド分割ゲルおよび５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドスタッキングゲル中で実施し、垂直電気泳動ユニット中で、ゲルあたり１００Ｖおよび２０ｍＡで行った。ゲルを１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ中で２０分間固定し、０．２５％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ Ｒ−２５０）、２５％（ｖ／ｖ）２−プロパノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸中で染色した。脱色を、２５％（ｖ／ｖ）の２−プロパノールおよび１０％（ｖ／ｖ）の酢酸の溶液中で行った。
（質量分析（ＭＳ）分析）
特定の実施形態において、選択された孤立ピークを、情報依存取得（ＩＤＡ）モードで５６００ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（ＡＢＳｃｉｅｘ（登録商標））上でのＬＣ／ＭＳによって分析した。ＭｉｃｒｏＬＣカラムＣｈｒｏｍＸＰＴＭ Ｃ１８ＣＬ逆相カラム（内径３００μｍｘ長さ１５ｃｍ、３μｍの粒子、孔径１２０A、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ（登録商標））上での５μＬ／分での液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＬＣ Ｕｌｔｒａ ２Ｄ、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ（登録商標））によって、ペプチドを分割した。多段階グラジエントによりペプチドを質量分析計に溶出した：０．１％のＦＡ中、アセトニトリルを、０〜２分では５〜１０％の直線勾配、２〜４５分では１０％〜３０％の直線勾配、および４５〜４６分では〜３５％。内径５０μｍ（１Ｄ）のステンレス鋼エミッター（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を備えたエレクトロスプレーイオン化源（ＤｕｏＳｐｒａｙ（商標）Ｓｏｕｒｃｅ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を使用して、ペプチドを質量分析計に溶出した。
情報依存取得（ＩＤＡ）実験では、質量分析計を、フルスペクトル（３５０〜１２５０ｍ／ｚ）で２５０ミリ秒スキャンし、続いて最大１００ＭＳ／ＭＳスキャンまでするように設定した（動的蓄積時間から１００〜１５００ｍ／ｚ−１０００の強度閾値を超える前駆体については最小３０ミリ秒−３．３秒のサイクル時間を維持するため）。＋２〜＋５の間の荷電状態および毎秒１０カウントの最小閾値を超えるカウントを有する候補イオンをフラグメンテーション用に単離し、１つのＭＳ／ＭＳスペクトルを、それらのイオンを除外リストに２５秒間加える前に集めた（Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ＴＦ １．６、ＡＢＳｃｉｅｘ（登録商標）により操作される質量分析計）。ローリング衝突を５の衝突エネルギー幅で使用した。各試料について２回のＩＤＡ実験を実施し、第２の分析を以前に同定したペプチドの除外リストを用いて実施した。
タンパク質同定は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｉｌｏｔ（商標）ソフトウェア（ｖ ５．０、ＡＢＳｃｉｅｘ（登録商標））を以下の検索パラメータと共に用いて得た：２０１６年３月のユニプロットデータベースからの同定、ペプチド試料のアルキル化または消化なし。タンパク質フィルタリングの基準として、本発明者らは、１．３個の未使用のスコア値および９５％ペプチド信頼性フィルタリングおよび＞０の寄与を使用した。
（細胞培養）
（生物材料）
４４歳の白人女性の腺がんから得たヒト結腸腺がん細胞株ＨＴ２９（ＥＣＡＣＣ ８５０６１１０９）を、この研究を通して使用した。ＨＴ２９細胞株を、１０％（ｗ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２００ｍＭグルタミン、２×１０４ＩＵ．ｍＬ−１ペニシリンおよび２０ｍｇ．ｍＬ−１ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の加湿雰囲気で維持した。細胞生存率についての日常的観察を、倒立顕微鏡によって行った。
（細胞増殖、接着および生存率アッセイ）
ＨＴ２９培養細胞を９６ウェルプレートに播種し（２×１０４／ウェル）、試料を必要な濃度（例えば１００μｇ／ｍＬ）で増殖培地に添加し、２４時間インキュベートした。各処置後、細胞外培地を回収し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、付着していない細胞を除去した。底に付着した細胞を、リン酸緩衝液中の０．１５％（ｗ／ｖ）トリプシンを用いて回収した。細胞増殖および生存率を、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら（１９８７）によって記載されているように、標準的な３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイを用いて測定した。細胞数は、トリパンブルー染色を用いて、ａ）細胞接着、ｂ）細胞毒性、およびｃ）細胞増殖を定量することを可能にする血球計を使用して測定した。全ての処置は、少なくとも３回の独立した実験において二連で行った。
（細胞遊走アッセイ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷アッセイ）
特定の実施形態では、細胞遊走分析のために、創傷治癒アッセイを実施した。ＨＴ２９細胞（５×１０５細胞／ウェル）を６ウェルプレートに播種し、８０％コンフルエントに達するようにした。「創傷」は、細胞単層を横切って傷をつけて開いた間隙を作り出し、それによって創傷を模倣することによって行った。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、浮遊破片を除去した。続いて各ウェルを、異なる濃度の潜在的阻害剤を含むまたは含まない新しい培地で、異なる濃度（例えば１００μｇ／ｍＬ）で満たし、４８時間まで増殖させた。処置の終わりに、各ウェルの浸潤領域または傷をつけた領域内の細胞数を測定し、０時間の初期領域と比較し、細胞を位相差顕微鏡下で写真撮影した。処置の開始時に露出領域に遊走した細胞によって覆われた面積を計算した。この比較により、ＨＴ２９細胞遊走能力に対して各タンパク質画分によって発揮された阻害作用（もしあれば）を評価することができた。細胞遊走の面積を各三連の処置からの３〜５の確率場で計数し、時間０に対するパーセンテージとして表した（処置の開始時に露出領域へ遊走した細胞が覆う面積）。
（酵素アッセイ：ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２触媒活性に対するデフラミンの効果）
（ＭＭＰ−９によるゼラチン分解活性の定量）
蛍光発生ゼラチンアッセイ用に、ＤＱ−ゼラチンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、アメリカ）から購入し、1ｍｇ／ｍＬで水に溶解させた。全ての溶液および希釈液をアッセイ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２および０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６）中で調製した。全ての実験において、ＤＱ−ゼラチンを２．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。
９６ウェルプレートのＭａｃｒｏ−ａｓｓａｙプレート（チムニー、９６ウェル、黒）に、０．１ｎＭ（最終容量２００μＬ）の酵素（ＭＭＰ−９、Ｓｉｇｍａ）を加えた。阻害剤試験用に、必要量の阻害剤（例えば１００μｇ／ｍＬ）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。続いて、最終濃度２．５μｇ／ｍＬのＤＱ−ゼラチンを添加し、再び１時間インキュベートした。次いで蛍光レベルを測定した（例：４８５ｎｍ／ｅｍ．５３０ｎｍ）。各実験において、陽性（阻害剤なし）および陰性（酵素なし）対照の両方を含め、タンパク質試料中に存在する潜在的なタンパク質分解活性を補正した。全てのデータを、それらのそれぞれの陰性対照を差し引くことにより補正した。
（細胞培地におけるゼラチン分解活性の定量）
細胞外ＨＴ２９培地を回収し、異なる阻害剤へのばく露後に存在するゼラチン分解活性を定量した。検出された活性は、酵素、ＭＭＰ−９およびＭＭ−２の存在によるものである。各処置からのＨＴ２９培地を各ウェル（１５０μＬ）に添加したことを除いて、アッセイは前述と同じ方法で実施した。
（結腸組織からの総ゼラチン分解活性）
Ｍｅｄｉｎａら（２００６）によって記載されているように、ほとんど変更なしで、合わせたＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性を、デフラミン抽出物処置にばく露したマウスの結腸において測定した。簡単に説明すると、結腸組織を、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６中で１／１００の比率（ｗ／ｖ）でホモジナイズした。試料を１分間隔で１０秒間ずつ３回超音波処置した。氷上で１０分後、タンパク質抽出物を１３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を保存し、タンパク質濃度をＬｏｗｒｙ法の修正により測定した（Ｌｏｗｒｙら、１９５１）。アッセイするまで、試料を−８０℃で保存した。上記のように、各結腸からのタンパク質抽出を用いてそれぞれのゼラチン分解活性を定量した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、アメリカ）から購入した蛍光発生基質色素消光（ＤＱ）−ゼラチンを用いてＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性を定量した。製造者の指示に従い、ＤＱゼラチンを１ｍｇ／ｍＬで水に溶解させた。全ての溶液および希釈液をアッセイ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２および０．０１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６）中で調製した。９６ウェルマイクロアッセイプレート（チムニー、９６ウェル、黒色）を使用した。各処置からの各結腸組織上清を各ウェルに入れた（１００μＬ）。その後、ＤＱ−ゼラチン（最終濃度２．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、プレートを１時間インキュベートした。蛍光レベルを測定した（例：４８５ｎｍ／ｅｍ、５３０ｎｍ）。全てのデータを、それらの対応する陰性対照を差し引くことによって補正した。
（ザイモグラフィー）
ザイモグラフィーアッセイにおいて、２つの酵素（一般的にゼラチナーゼとして知られるＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２）、ならびにそれらの対応するチモーゲンまたはプロ酵素（プロＭＭＰ−９およびプロＭＭＰ−２）を検出した。定義により、チモーゲンまたはプロ酵素は、典型的には活性部位へのアクセスを遮断するアミノ酸の短い配列（プロ配列と呼ぶ）の存在のために不活性である。現在の状況では、ＭＭＰ酵素はこの形態で合成され、例えば、それらがリボソームの分解を、それにまだ結合しているタンパク質合成中に始めることを防ぐ。このように、これらのタンパク質は不活性型で合成され、それらの作用部位においてそれらの成熟した天然型に変換される。本明細書に記載のザイモグラフィーアッセイでは、プロゼラチナーゼはまた、それらがＳＤＳによって変性され、したがって触媒部位を露出させるため活性になる−それ故に、それらは依然としてシステインスイッチの短いアミノ酸配列を維持するため、ザイモグラフィーゲル中にわずかに高い質量のプロ酵素を露出させる。
（ゼラチンザイモグラフィー）
ゼラチン−ザイモグラフィーを、以下の変更を加えた標準的な方法に従って行った：ＨＴ２９がん細胞株の培養上清中のメタロプロテイナーゼ活性を測定するため、１％（ｗ／ｖ）ゼラチンと共重合したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％ｗ／ｖアクリルアミド）を調製した。細胞培養上清を、６２．６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含有する非還元緩衝液で処置し、各ウェルに充填した。電気泳動を１００Ｖで２時間行った。電気泳動後、ゲルを再生緩衝液（２．５％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で６０分間ずつ３回洗浄し、ＳＤＳを除去した。次いでゲルを展開緩衝液（５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２および０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）と共に一晩インキュベートした。ゲルを０．５％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＧ−２５０で３０分間染色し、メタノール：酢酸：水（５０：１０：４０）の溶液で脱色した。タンパク質バンド強度は、画像処理ソフトウェアを使用してピーク面積を測定する濃度測定によって測定した。
（逆ゼラチンザイモグラフィー）
異なる試料中のＭＭＰＩタンパク質を検出および定量するために使用される逆ゼラチンザイモグラフィーを、Ｈａｗｋｅｓら（２０１０、２０１０）に記載のように行い、いくつかの修正を加えた。タンパク質試料をザイモグラフィー緩衝液（１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含有する３１３ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８）で処置し、ゼラチン（１％ｗ／ｖ）と共重合したＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１２．５％ｗ／ｖアクリルアミド）スラブゲルならびにＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９を発現する細胞株由来のまたは異なるＭＭＰ−９濃度（例えば１μｍｏｌ／ｍＬ）の馴化培地（１．０ｍＬ）に充填した。電気泳動を上記のように実施し、ゲルを２．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で３回（各６０分間）洗浄してＳＤＳを除去し、基質ザイモグラフィーについての上記のように一晩インキュベートした。ゲルを０．５％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＧ−２５０で染色した。暗い領域は、ゼラチン分解のＭＭＰＩ媒介阻害を示した。白い背景に対して見える暗いバンドは、ゼラチン分解のＭＭＰＩ媒介阻害を示した（Ｈａｗｋｅｓ、２００１）。
（結腸抽出物のゼラチンザイモグラフィー）
結腸抽出上清中の比メタロプロテイナーゼ活性を測定するために、ゼラチン−ザイモグラフィーを標準的な方法（Ｔｏｔｈら、２０１２）に従い、以下の変更を加えて実施した：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％ｗ／ｖアクリルアミド）を、１％（ｗ／ｖ）ゼラチンと共重合させた。結腸抽出上清を、６２．６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含有する非還元緩衝液で予め処置し、ＳＤＳゲルの各ウェルに入れた。電気泳動を、上記のように、１２．５％（ｗ／ｖ）のアクリルアミド分割ゲルおよび５％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドスタッキングゲル中で行い、ゲル当たり２００Ｖおよび２０ｍＡで垂直電気泳動ユニットにおいて実施した。電気泳動後、ゲルを２．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で６０分間ずつ３回洗浄し、ＳＤＳを除去した。次いで、ゲルを展開緩衝液（５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２および０．０１％ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４）と共に２日間インキュベートし、５０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）酢酸中で０．５％（ｗ／ｖ）のクマシーブリリアントブルーＧ−２５０で３０分間染色し、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸の溶液で脱色した。青い背景に対して見える白いバンドは、各プロテイナーゼのゼラチナーゼ活性を示した（Ｔｏｔｈら、２０１２）。
（実験的炎症性疾患の動物モデル）
（炎症の大腸炎モデル）
（動物）
体重２５〜３０ｇ、５〜６週齢の雄性ＣＤ−１マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａ、バルセロナ、スペイン）を、標準的なポリプロピレン製ケージに収容し、リスボン大学中央動物施設、薬学部において、１２時間の明期、１２時間の暗期のサイクルで２２℃±１℃に保たれた室内の管理された環境下で、食物と水に自由にアクセスさせた。
（Ｉｎ ｖｉｖｏ実験用動物の飼育および管理）
英国、ロンドンのハーマジェスティの事務局により発行されたｔｈｅ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ） Ａｃｔ １９８６、および米国国立衛生研究所により発行されたｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ出版番号８５−２３、１９９６年改訂）、ならびに現在採用されているＥＣ規制（指令２０１０／６３／ＥＵ）に従って実験を行った。最後に、実施された研究は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ３ｒｓ．ｏｒｇ．ｕｋに要約されているｔｈｅ ＡＲＲＩＶＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’に準拠している。この実験プロトコルはリスボン大学薬学部の倫理委員会によっても承認された。さらに、リスボン大学薬学部の共同研究者は、独立した動物研究を調整し実施することが、ポルトガル獣医総局によって認可されている。全ての試験は、体重１００〜１５０ｇの雄性５週齢のウィスターラット（Ｈａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａ、バルセロナ、スペイン）を用いて実施した。全ての動物は標準食および水を自由に摂取した。
（デフラミンの経口投与（ｐ．ｏ．）を用いた大腸炎モデル）
（実験的大腸炎の誘発）
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は、以前から説明されているように（Ｉｍｐｅｌｌｉｚｚｅｒｉら、２０１５）、結腸内単回投与として注入した。短期間、マウスを２４時間給餌しなかった。誘導日（０日目）に、マウスを１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンで麻酔した。次いで、結腸に４．５ｃｍまで慎重に挿入したカテーテルを通して１００μＬのＴＮＢＳ溶液を投与した。逆流を避けるために、マウスを１分間トレンデレンブルグ体位に保った。誘導の４日後、マウスに麻酔をかけ、血液試料を心臓穿刺により集めた。マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、剖検した。腹部を正中切開により開いた。結腸を取り出し、周囲組織から取り出し、下痢の重症度の観察および分類のために縦方向に開いた。その後、組織の肉眼的観察のために結腸をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、生化学的分析にかけるか、またはさらなる処理のために、その後パラホルムアルデヒド中に固定した。
（実験群）
記載のように、動物を無作為に４つの実験群に割り当てた：
１．擬似群（ｎ＝６）：結腸内投与を１００μＬの食塩水で行ったことを除いて、動物に上記の手順を施した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与した。
２．エタノール群（ｎ＝６）：結腸内投与を１００μＬの５０％（ｖ／ｖ）エタノール／水溶液で行ったことを除いて、動物に上記の手順を施した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与した。
３．ＴＮＢＳ群（ｎ＝１０）：動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与した。
４．ＴＮＢＳ＋抽出物（すなわちデフラミン）群（ｎ＝１０）：動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。プロトコルの４日間、動物に抽出物（すなわちデフラミン；１５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与（ｐ．ｏ．）した。
ＴＮＢＳの最初の投与の３時間後から開始して、胃管栄養法によって経口投与を毎日行った。
（大腸炎の重症度の肉眼的評価）
結腸を摘出した後、実験群に関して盲検化した観察者による内容物の観察および下痢の重症度の分類のために、縦切開を行った。その後、結腸を食塩水ですすぎ洗いし、より綿密な組織の観察および病変写真の捕捉のために、外科用顕微鏡を通して肉眼で観察した。その後、結腸および損傷の程度（存在する場合）を測定した。
（出血性損傷の評価）
出血性損傷の指標としての糞便中ヘモグロビンを、免疫比濁法による定量法（Ｋｒｏｍａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
（組織学および免疫組織化学の手順）
結腸を取り出し、ＰＢＳ中４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド中に室温で７２時間固定し、段階的エタノール系を通して脱水し、パラフィン中に包埋した（１群当たりｎ＝３）。ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を以前から説明されているように（Ｒｏｃｈａら、２０１５）実施し、明視野Ａｘｉｏｓｃｏｐ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ゲッティンゲン、ドイツ）を使用して画像を得た。
微視的断面上の炎症および結腸損傷の程度を、０〜３で半定量的に評価した：０、病変のない正常結腸、一様な厚さの粘膜、陰窩真っすぐ、正常陰窩構造、細胞浸潤、浮腫および滲出液なし、炎症の兆候がないことを意味する；１、軽度の病変がある結腸、わずかな陰窩損失および単核細胞浸潤を伴って、粘膜びらんおよび小さな表在性潰瘍が結腸の長さに沿って散在している；２、中等度の病変を伴う結腸、中等度の陰窩喪失および好中球浸潤を伴う広範囲のびらんおよび潰瘍がある腸；３、非常に重度の潰瘍がある結腸、陰窩喪失を伴う薄い粘膜、および好中球の浸潤の著しい増加、ならびに急性炎症性滲出液。
免疫染色のために、厚さ６μｍの切片を、暗所、室温で１５分間、１．５％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含む２０ｍＭクエン酸緩衝液中で抗原賦活化に供し、８４℃で１０分間Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中でインキュベートし、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で、室温で１時間ブロッキングした。一次抗体［ウサギ抗ＣＯＸ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃４８４２、１：１００）およびマウス抗ｉＮＯＳ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＃６１０３２８、１：１００）］を、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で一晩４℃で使用した。ＰＢＳ中で洗浄した後、切片を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：５０００）に結合した抗ウサギ抗体と共にＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で室温で１時間インキュベートし、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＤＡＢ中、Ｍｅｔａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と共に１０分間インキュベートし、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）で封入した。組織切片を、ＡｘｉｏＳｃｏｐｅ明視野顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ゲッティンゲン、ドイツ）で可視化した。
（デフラミンの腹腔内注射（ｉ．ｐ．）投与を用いた大腸炎モデル）
大腸炎に対する腹腔内投与したデフラミンの抗炎症効果も試験した。デフラミン抽出物を腹腔内注射により投与したことを除いて、マウスを正確に上記の通り処置した。以下の実験群を試験した：
１．擬似群（ｎ＝６）：結腸内投与を１００μＬの食塩水で行ったことを除いて、動物に上記の手順を施した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与するか、または同量の生理食塩水を腹腔内注射した。
２．エタノール群（ｎ＝６）：結腸内投与を１００μＬの５０％（ｖ／ｖ）エタノール／水溶液で行ったことを除いて、動物に上記の手順を施した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与し、同じ量の食塩水を腹腔内注射した。
３．ＴＮＢＳ群（ｎ＝１０）：動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与し、同じ量の食塩水を腹腔内注射した。
４．ＴＮＢＳ＋抽出物（すなわちデフラミン）群（ｎ＝１０）：動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。プロトコルの４日間、動物に抽出物（すなわちデフラミン；１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。
ＴＮＢＳの最初の投与の３時間後から開始して、前述の胃管栄養法によるように、腹腔内注射投与を毎日行い、経口投与について記載したのと同じ評価を行った。
（デフラミンの予防効果対治療効果）
デフラミンの予防効果をその治療効果と比較するために、マウスを上記のように管理および処置し、無作為に４つの実験群に割り当てた：
１．擬似群（ｎ＝６）：結腸内投与を１００μＬの食塩水で行ったことを除いて、動物に上記の手順を施した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与した。
２．ＴＮＢＳ群（ｎ＝１０）：動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。プロトコルの４日間、動物に１０ｍＬ／ｋｇの蒸留水を経口投与した。
３．ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．（ｎ＝９）：動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。プロトコルの４日間、動物にデフラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。
４．デフラミン予防処置＋ＴＮＢＳ（ｎ＝１０）：ＴＮＢＳ誘導の３日前に、動物にデフラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。次いで動物に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中２．５％（ｗ／ｖ）ＴＮＢＳ１００μＬを投与した。
プロトコルの４日間、動物にデフラミン（１５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。
４日間の実験後、大腸炎の重症度の肉眼的評価を上記のように実施した。
（炎症のカラギーナン誘発性足浮腫モデル）
（Ｉｎ ｖｉｖｏ実験用動物の飼育および管理）
英国、ロンドンのハーマジェスティの事務局により発行されたｔｈｅ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ） Ａｃｔ １９８６、および米国国立衛生研究所により発行されたｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ出版番号８５−２３、１９９６年改訂）、ならびに現在採用されているＥＣ規制に従って実験を行った。最後に、本研究は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃ３ｒｓ．ｏｒｇ．ｕｋに要約されているｔｈｅ ＡＲＲＩＶＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’に準拠している。それ故に、研究所の倫理委員会は、著者ＳｅｐｏｄｅｓおよびＲｏｃｈａが、独立した動物研究を調整し実施することをポルトガル獣医総局によって認可されていることを考慮して、動物研究プロトコルを承認した。全ての試験は、体重１００〜１５０ｇの雄性５週齢のウィスターラット（Ｈａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａ、バルセロナ、スペイン）を用いて実施した。全ての動物は標準食および水を自由に摂取した。
（デフラミンの経口投与を用いた炎症の足浮腫モデル）
実験的足浮腫の誘発および浮腫重症度の評価。ラット後足のカラギーナン誘発性足浮腫は、急性局所炎症を研究するのに適したモデルであり、抗炎症活性の評価において最も有用なモデルの１つであると広く考えられている。このモデルは、経口または局所投与されたデフラミンの抗炎症活性を試験するために使用された。
（足浮腫モデル）
足浮腫を、０．１ｍＬの１％（ｗ／ｖ）λ−カラギーナン滅菌生理食塩水溶液のラット左後足への単回足底下注射によって誘発した。足体積を、足体積測定装置（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ ＬＥ７５００；Ｌｅｔｉｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、レティツァ、スペイン）を使用して体積変位法により測定した。足体積を、カラギーナンの注射直後（Ｖ０または基礎体積）および６時間後（Ｖ６時間）に測定した。足体積の増加を浮腫体積とした。
（実験群）
記載のように、動物を無作為に以下の群に割り当てた：
１．対照群（ｎ＝６）：動物に、ラット左後足への０．１ｍＬの無菌食塩水の足底下注射を施し、食塩水（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。
２．カラギーナン群（ｎ＝６）：動物に足浮腫誘発を施し、食塩水（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。
３．デフラミン群（ｎ＝５）：動物に足浮腫誘発を施し、λ−カラギーナン注射の３０分前にデフラミン抽出物（１ｋｇあたり１５ｍｇのクルード抽出物、経口投与およびｉ．ｐ．）で前処置した。
４．インドメタシン群（ｎ＝６）：動物に足浮腫誘発を施し、λ−カラギーナン注射の３０分前にインドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で前処置した。
５．トロロックス群（ｎ＝６）：動物に足浮腫誘発を施し、λ−カラギーナン注射の３０分前にトロロックス（３０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）で前処置した。
（デフラミンの局所投与を用いた大腸炎モデル）
動物を原則的に前述のように処置し、以下に記載のような群に分けた：
１．対照群（ｎ＝６）：動物に、ラット左後足への０．１ｍＬの無菌食塩水の足底下注射を施し、食塩水（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。
２．カラギーナン群（ｎ＝６）：動物に足浮腫誘発を施し、食塩水（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。
３．デフラミン群（ｎ＝５）：動物に足浮腫誘発を施し、λ−カラギーナン注射後にデフラミン抽出物（水およびグリセロール３０：７０、ｖ／ｖに溶解）で局所的に処置した。
４．対照群（ｎ＝６）：動物に足浮腫誘発を施し、λ−カラギーナン注射後にグリセロール溶液（水およびグリセロール３０：７０、ｖ／ｖ）で局所的に処置した。
（統計分析）
動物の大腸炎モデルについては、全ての結果をｎ回の観察の平均±ＳＥＭとして表し、ここでｎは試験した動物の数を表す。１要因ＡＮＯＶＡ検定、それに続くＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いたボンフェローニの事後検定を用いて結果を比較した。ゼラチン分解活性については、全ての実験を三連で少なくとも独立して３回行い、データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア（バージョン１２．５）を、一元配置および二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、異なる処置を比較するために使用した。統計的に有意と見なされる場合、テューキー検定を使用して、群間の差と０．０５未満のＰ値での統計的差異とを比較した。
（結果）
（マメ科種の種子からの総抽出物中のＭＭＰＩ活性）
近年Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｌｉｍａら、２０１６）に公表され、デフラミンを発見する前の予備研究において、出願人は、多くの総種子抽出物を阻害性ＭＭＰ活性の存在についてスクリーニングした。研究中のこれらの種子は以下の通りであった：Ｃｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ．（ヒヨコマメ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．（ダイズ）、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ Ｍ．（レンズマメ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ Ｌ．（ルーピン）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．（インゲンマメ）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ（エンドウ）、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ Ｌ．（ソラマメ）、およびＶｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ Ｌ．（ササゲ）。本発明者らが研究を続けて本明細書で取り上げることになる最も有望なものは、ヒヨコマメ、ルーピンおよびダイズであった（図５および６〜１１；Ｌｉｍａら、２０１６）。
図５は、最初に分析した８つのマメ科種子のそれぞれについてのアルブミンおよびグロブリンポリペプチドプロファイルを比較する。図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された８種のマメ科種子由来のアルブミンとグロブリン間のポリペプチド分布の代表的画像を示している。Ｇ−グロブリン、Ａ−アルブミン。タンパク質抽出物（1レーンあたり４０μｇ）を、還元条件下で１２．５％（ｗ／ｖアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填した（Ｌｉｍａら、２０１６）。
総種子タンパク質、総アルブミンおよび総グロブリンの抽出は天然条件下で行われたことに留意すべきである。したがって、図６〜１１は、８種からの種子に存在するＭＭＰ活性に対する多数の種子細分画の影響を示している：
− 図６の総可溶性抽出物（したがってフラボノイドおよび他のポリフェノールなどの低分子量代謝産物、ならびにおそらくルナシンを含むペプチドおよびタンパク質を含む）；図６は、ＭＭＰ−９阻害活性に関する。８種類のマメ科種子（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ、Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）からの総可溶性抽出物の、ＭＭＰ−９のタンパク質分解活性に対する効果。総可溶性抽出物をＭＭＰ−９を含有する反応混合物に添加し、ゼラチン分解活性は、ＤＱ蛍光アッセイによるものであった。
−図７のＨＴ２９細胞増殖時のアルブミンおよびグロブリン（２４時間ばく露）；
図７は、ＨＴ２９細胞増殖アッセイに関する。ＨＴ２９細胞は、８つの種子種から予め抽出したアルブミンまたはグロブリン画分の存在下で２４時間増殖させた。
−図８および９におけるＨＴ２９細胞遊走時のアルブミンおよびグロブリン（２４時間ばく露）；図８は、ＨＴ２９細胞遊走創傷アッセイに関する。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０日目）。細胞遊走を、８つの種子種からのアルブミンまたはグロブリン画分へのＨＴ２９細胞の４８時間のばく露後に測定した。最も高い阻害性種子抽出物について得られた細胞遊走の例：Ｌ． ａｌｂｕｓ、Ｃ．ａｌｉｅｔｉｎｕｍおよびＧ．ｍａｘ。
図９は、ＨＴ２９細胞遊走創傷アッセイに関する。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０日目）。細胞遊走を、８つの種子種からのアルブミンまたはグロブリン画分へのＨＴ２９細胞の４８時間のばく露後に測定した。相対遊走率（Ｄ）、
−図１０のＨＴ２９細胞外培地中に存在するゼラチナーゼのタンパク質分解活性に対するアルブミンおよびグロブリン（４８時間ばく露）。
図１０は、ＤＱ蛍光発生法によって定量した、８つの種子種から単離したアルブミンまたはグロブリン画分への４８時間のばく露後のＨＴ２９細胞外培地中に存在するゼラチナーゼのタンパク質分解活性に関する。
−図１１のアルブミンまたはグロブリンへの４８時間のばく露後にＨＴ２９細胞の細胞外培地中に存在するＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性のザイモグラフィープロファイル。
図１１は、細胞をアルブミンまたはグロブリンタンパク質画分に４８時間ばく露した後の、ＨＴ２９細胞外培地中に存在するＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性のザイモグラフィープロファイルに関する。最も顕著な阻害をもたらす種子抽出物（すなわちＬ． ａｌｂｕｓ、Ｃ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧ．ｍａｘ）のみを示している。ポリアクリルアミドゲル（１２．５％ｗ／ｖアクリルアミド）を１％（ｗ／ｖ）ゼラチンと共重合させた。ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２バンドの相対活性を、対照の％として計算した。Ｇ、Ｇｌｏｂ−１００μｇタンパク質／ｍＬを含む総グロブリン画分；Ａ、Ａｌｂ−１００μｇタンパク質／ｍＬを含む総アルブミン画分。示された全ての値は、少なくとも３回の反復実験の平均値±ＳＤであり、対応する対照の百分率として表される。縦線はＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
これらの研究／抽出物のいずれも、調理済み種子、煮沸抽出物、低ｐＨ値にばく露された抽出物、および／または消化過程を施された抽出物を含まなかったことを言及することは重要である。得られた結果は、ルーピン、ダイズおよびヒヨコマメにおいて、研究された８つの種子からの種子におけるＭＭＰ阻害活性または複数の活性の存在を明らかに示し、１桁減少するにつれてより顕著になる。そのようなＭＭＰ阻害活性は、文献に広く報告されている二次代謝産物（例えば、ダイズ由来のゲニステイン）および低分子量タンパク質（すなわち、ルナシン）の両方に起因していた。
青花ルーピン種子の消費は世界中で増加しており、食品業界では数多くの用途があるが、野生の（すなわち、苦いまたはアルカロイド含有）種子は古代から人間の食べ物として利用されており、地中海の国々では、それらを煮詰めて、アルカロイドを流水に浸すことによって洗い流すという条件で、スナックとして利用され続けている。興味深いことに、野生型種子を毒性にするまさにそのアルカロイドが、真性糖尿病に有益な効果を発揮するようである。それにもかかわらず、我々の日常の西洋の生活様式では、ヒヨコマメやダイズなどの他のマメ科の種子が、ルーピンよりも頻繁にそして大量に食べられている。本発明の実施形態はこれらの最後の３つの種に焦点を合わせ、いくつかのさらなる結果はいくつかの非マメ科種子にも焦点を合わせる。
（生物活性代謝物における調理および種子の豊富さ）
上記の材料および方法の節で述べたように、穀物とマメ科植物のものを含む乾燥種子は、いくつかの理由でそのまま摂取されない。第一に、それらは我々にとって噛むのがかなり大変である。第二に、および最も重要なことに、マメ科種子は、他の多くの種子と同様に、消化酵素の阻害剤、レクチン、高フィチン酸塩濃度、非タンパク質アミノ酸などのような抗栄養因子を含むことがよく知られている。したがって、それらは、タンパク質性抗栄養因子の変性、ならびにいくつかの非タンパク質成分の破壊または浸出を確実にするために、調理後に摂取されなければならない。これらの理由のために、およびデフラミンが煮沸に抵抗することが見出されたため、調理済み種子を用いた多数の初期実験が行われた。
タンパク質に加えて、植物種子は広範囲の生物活性二次代謝産物を含み、それらのほとんどは調理後のその生物活性の大部分を保持する。
フィチン、サポニン、フェノール化合物およびタンパク質に関する以下の例は、いくつかのマメ科種由来の生および調理済み種子の両方におけるそれらの濃度を例示する。上述のように、調理により誘発される特定の化合物の減少（単位乾燥重量当たりで表す）、フィチンからタンパク質へは、典型的には、分子破壊と周囲の水への浸出の両方によるものであることを考慮に入れるべきである。それ故に、野菜を調理した水がスープを作るのに使用されるべきであるという一般的な知識。
次の実験ブロックでは、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍおよびＶｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａを、ＭＭＰ阻害に関する結果が悪いために放棄した（上記を参照）。したがって、実施形態は、６つの種、すなわち、Ｃｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＶｉｃｉａ ｆａｂａのみに関する。
（フィチン）
フィチン（フィチン酸塩、ＰＡ、イノシトールヘキサホスフェートおよびＩＰ６とも呼ばれる）は、例えば、過剰に存在すると消化酵素（例えば、トリプシン、ペプシン、α−アミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ）を阻害し、特定のミネラル（最も顕著には亜鉛、より少ない程度でカルシウムおよびクロム）に結合し、その結果それらのバイオアベイラビリティを妨害するため、両方とも抗栄養素と見なされる（インターネットサイト１）。
図１２は、研究中のいくつかの種のフィチン種子含有量を示す。種子フィチン含有量は、研究された種の間でかなり一定しているようであり、いかなる著しい方法でも調理によって影響されない。
図１２は、Ｇａｏら（２００７）によって記載された方法によって定量化された、いくつかのマメ科植物の種子中のフィチン濃度を示す。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。
（サポニン）
サポニンは、天然または合成形態の医薬品および／または栄養補助剤としてかなりの可能性を秘めている。それらは、とりわけ、抗発がん作用、神経保護作用、抗炎症作用および抗酸化作用を示すことが示されている（Ｒａｏ＆Ｇｕｒｆｉｎｋｅｌ、２０００）。
図１３は、研究中のいくつかの種のサポニン種子含有量を示す。フィチンのものとは異なり、サポニン含有量は分析された種の間で著しく異なり、最高値はダイズとヒヨコマメで得られ、最低値はルーピンで得られる。煮沸は一貫して存在するサポニンの量を減らし、損失はおよそ７％（レンズマメ）〜９０％超（ヒヨコマメ）に及んだ。図１３は、Ｈｉａｉら（１９７６）によって記載された方法によって定量化された、いくつかのマメ科植物の種子中のサポニン濃度を示す。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。
（フェノール化合物）
フェノール化合物は植物中に普遍的に存在し、高い抗酸化能力およびフリーラジカル捕捉能力を示すことが知られている。したがって、それらは一般に、心血管疾患、がん、加齢、真性糖尿病および神経変性疾患などの多くの酸化ストレス関連疾患を予防および治療するための潜在的薬剤とみなされ、大部分はそれらの心臓保護、抗がん、抗炎症および抗微生物生物活性に起因する（Ｌｉら、２０１４年）。しかしながら、主な懸念は、それらのバイオアベイラビリティおよび潜在的な毒性を含み、大多数の研究はそれらの調理および消化過程に対する耐性を考慮していない。さらに、生物活性タンパク質とは異なり、それらの有益な／有害な生物学的効果は、通常用量依存的である。
フェノール化合物の種子濃度はルーピンで高く、次にダイズ、インゲンマメおよびレンズマメが続いた（図１４）。おそらく、ポリフェノールの種子濃度が高いほど、その抗がん性生物活性は高いと考えられる。調理は種子フェノール類の量を劇的に（種によって６０〜９０％）減少させた。図１４は、フォリン−チオカルト法（Ａｔｔａｒｄ、２０１３）によって定量化された、いくつかのマメ科植物由来の種子中のフェノール化合物の濃度を示している。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。
（総可溶性タンパク質）
タンパク質は驚くほどの種類の生体分子を構成し、他のどの種類の分子にも類を見ず、膨大な種類の生物活性を満たしている。これまで知られていなかったタンパク質を選択し、その生物学的機能を決定することは、困難であるだけでなく、生物学および化学研究者の最も挑戦的で興味深い仕事の１つでもある。それらが進化した生物学的役割を実行することに加えて、タンパク質は、広範囲の有益な活性に起因して、人類の利益のためにも使用され得る。したがって、例えば、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、食品ラベルおよび食品表示において、ダイズタンパク質と冠状動脈性心臓病のリスクの低下との関連性に関する健康強調表示の使用を承認した（ＦＤＡ、１９９９）。
ダイズ種子は、予想どおり、最大量の総可溶性タンパク質（２９７．４ｍｇ／ｇ乾燥重量）を含み、タンパク質濃度を減少させることにより、ルーピン（１９０．４ｍｇ／ｇ乾燥重量）、ヒヨコマメ（１３８．２ｍｇ／ｇ乾燥重量）、ソラマメ（１１４．５ｍｇ／ｇ乾燥重量）、レンズマメ（７９．０ｍｇ／ｇ乾燥重量）およびインゲンマメ（７２０．０ｍｇ／ｇ乾燥重量）がそれに続く；図１５）。調理時に、これらの値は、全ての場合において、レンズマメ、ルーピン、ヒヨコマメおよびダイズについて得られた最高タンパク質濃度で、２０ｍｇ／ｇ乾燥重量未満の値に減少した。図１５は可溶性タンパク質を示しており、調理済み種子は確かにそれらのタンパク質のほとんどを変性した不溶性形態で含んでいることに留意することが重要である。
図１５は、ブラッドフォード法（Ｎｏｂｅｌ、２０００）により定量された、いくつかのマメ科植物由来の種子中の総可溶性タンパク質濃度を示す。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。
図１６に提示されたデータは、各種についての、無傷の種子由来の可溶性タンパク質のポリペプチドプロファイルと、対応する調理済み種子由来のものとの間の比較を可能にする。予想されたように、プロファイルは、レーンＣに存在するそれぞれの場合に調理を乗り切ったポリペプチドとは完全に異なる。図１６のレーンは、同量のタンパク質を含まないことに留意。むしろ、それらは一定量の種子乾燥重量に一致する。したがって、直接の定量的および定性的比較を、それぞれの種について行うことができる。
図１６は、生（ＮＣ）および調理済み（Ｃ）種子から抽出した可溶性タンパク質画分のＲ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７．５％ｗ／ｖアクリルアミド添加コム１０％ｖ／ｖグリセロール；還元条件）によって得られた代表的なポリペプチドプロファイルを示す。定量的および定性的比較分析の両方を可能にするために、画分ＮＣおよびＣを再懸濁し、等容量でゲルに充填した。
本発明の実施形態は、主に、すなわち、Ｃｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓに関する。
（細胞遊走）
図１７および図１８に提示されたデータは、Ｃ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｇ．ｍａｘおよびＬ． ａｌｂｕｓから調製した可溶性抽出物がＨＴ２９細胞の遊走を阻害することを示す。しかしながら、種子の抽出物、種および状態（すなわち調理の有無）の間でかなりの相違が見いだされた。したがって、調べた全ての非タンパク質抽出物は、細胞遊走時に著しい阻害を示した。生種子から調製した可溶性タンパク質抽出物の中で、細胞遊走阻害活性は、ダイズについてはほとんど無視でき、ルーピンについては中程度であり、ヒヨコマメについてはわずかに高かった。しかしながら、驚異的で驚くべき結果が達成されたのは、調理済み種子から調製した可溶性タンパク質抽出物にあった：ヒヨコマメおよびダイズとは異なり、ルーピン種子を調理すると、得られる可溶性タンパク質抽出物の細胞遊走阻害活性を高めるのに劇的な効果がある。奇妙なことに、ならびにヒヨコマメおよびダイズとは異なり、全く同じ効果が、調理済みルーピン種子から調製した非タンパク質抽出物に関しても達成される。これらのデータは、ルーピン種子がＨＴ２９細胞遊走活性を示すタンパク質および低分子量非タンパク質化合物の両方を含み、その効果が、種子を前もって調理することによって著しく増強されることを示唆しており、それらを人間の栄養が関係しているものに特に適切にするものである。
この研究は、がん細胞の遊走能力に対する、マメ科種子の調理の効果（人間の健康および栄養に関して最も重要な話題）を考慮した最初ものであり得る。
生種子に対して調理済みルーピン種子から調製した非タンパク質およびタンパク質可溶性抽出物の両方の細胞遊走阻害活性の増加を説明することを試みるために、いくつかの仮説が進められ得る。
１．濃度効果。本発明者らは、ほとんどのルーピン種子タンパク質が調理中に変性して周囲の水に浸出することを知っている。（ほとんどではないにしても）多くの低分子量代謝産物が破壊されるかまたは煮沸水中に浸出するかのいずれかであることも知られている。図１７および図１８に示す創傷治癒アッセイでは、１００μｇ可溶性タンパク質／ｍＬまたは１０ｍｇ可溶性非タンパク質生体分子／ｍＬを使用した。生種子から調製した抽出物と比較した場合、これは調理過程を乗り切ったそれらの代謝産物およびタンパク質に対する大きな濃度効果を意味する。
２．オリゴマータンパク質に関して、個々のサブユニットもしくは元のオリゴマーの残りの部分が可溶性であり増強された生物活性を示す場合の熱誘導性および不可逆的解離効果。
３．デフラミンが、可溶性タンパク質画分と可溶性低分子量非タンパク質画分との両方に生じることも可能である。
それにもかかわらず、同じ効果はヒヨコマメまたはダイズのどちらにも観察されず、ルーピンをやや「特別」にするものである。
図１７は、創傷治癒アッセイによって評価されたＨＴ２９細胞遊走の代表的画像を示す（Ａ）。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０日目）。ＨＴ２９細胞を、緩衝液（対照）、研究中の３つの種子種からの非タンパク質抽出物（１０ｍｇ／ｍＬ）、またはタンパク質抽出物（１００μｇ／ｍＬ）に４８時間さらした後、細胞遊走を測定した。図１８は、相対遊走率を（Ｂ）にプロットしたものである。ＮＰ：生種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；ＮＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；Ｐ：生種子から調製した可溶性タンパク質抽出物；ＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性タンパク質抽出物。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５。
可溶性低分子量非タンパク質化合物とは異なり、生種子から調製した可溶性ダイズタンパク質画分は、ＨＴ２９細胞の遊走に対して有意な阻害活性を示さなかった。Ｇ．ｍａｘ種子ではＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（ＢＢＩ）の存在がよく知られているため、これは驚くべきことかもしれない。１つの考えられる説明は、Ｆｅｒｅｉｄｕｎｉａｎおよびその共同研究者ら（Ｆｅｒｅｉｄｕｎｉａｎら、２０１４）が、ダイズ種子１ｇあたり１２ｍｇのＢＢＩを精製し、これはダイズ総可溶性タンパク質の約９％に相当する値であったという事実に基づき得る。簡単な外挿法は、アッセイに使用した生ダイズ種子から調製した可溶性タンパク質抽出物に約９μｇのダイズＢＢＩが含まれていたことを示しており（図１７および１８）、これはＦｅｒｅｉｄｕｎｉａｎおよびその共同研究者らによって使用された量よりはるかに少ない量である。
（細胞生存率および増殖）
図１９に示す結果は、種子の異なる抽出物、種および状態（すなわち調理の有無）の、ＨＴ２９細胞増殖に対する影響を示す。ヒヨコマメの種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物は例外かもかれないが、これらの細胞は２４時間ばく露後も生存可能であるため、全ての抽出物がＨＴ２９細胞に対して低い毒性を示すと結論付けるのが妥当と思われる。さらに、それらは細胞増殖を阻害しないようである。Ｇｉｒｏｎとその共同研究者ら（Ｇｉｒｏｎ−Ｃａｌｌｅら、２００４）は、ヒヨコマメ種子から抽出したアセトン可溶性代謝物の存在下でのＣａｃｏ−２細胞増殖の強力な阻害を検出した。図１９は細胞増殖アッセイを示す。ＨＴ２９細胞を、緩衝液（対照）、研究中の３つの種子種からの非タンパク質抽出物（１０ｍｇ／ｍＬ）またはタンパク質抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で２４時間増殖させた。ＮＰ：生種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；ＮＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；Ｐ：生種子から調製した可溶性タンパク質抽出物；ＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性タンパク質抽出物。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５。
図１９に示される結果とは対照的に、マメ科種子タンパク質について公表されたデータは、細胞増殖のレベルでの阻害的役割を示している。Ｆｅｒｅｉｄｕｎｉａｎとその共同研究者ら（Ｆｅｒｅｉｄｕｎｉａｎら、２０１４）は、２００μｇのＢＢＩ／ｍＬの存在下でのＨＴ２９細胞増殖の５０％を超える減少を観察した。この値は、４００μｇ／ｍＬのＢＢＩ濃度で８０％超に増加した。ヒヨコマメ由来のＢＢＩはｉｎ ｖｉｔｒｏで乳がん細胞増殖を抑制することが報告されているが、インゲンマメ、ダイズおよびヒヨコマメ由来のＢＢＩもｉｎ ｖｉｔｒｏで前立腺がん細胞増殖を減少させた（Ｍａｇｅｅら、２０１２）。
Ｂａｗａｄｉとその共同研究者ら（Ｂａｗａｄｉら、２００５）は、前立腺がん細胞増殖および細胞遊走と、水溶性クロマメ濃縮タンニンによるＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の分泌との阻害を報告した。Ｐａｒｋら（２０１３）は、Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａのメタノール抽出物から得られたフィセチンが、ＭＭＰ、線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞の増殖および浸潤を阻害することを報告し、Ａｐａｒｉｃｉｏ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（２００６）は、ヒト腺がんＨｅＬａ細胞およびヒト前がんケラチノサイト（ＨａＣａＴ）を使用して、クロインゲンマメの種皮からの１００％メタノールクルード抽出物はＨｅＬａがん細胞の増殖に対して抑制効果を示すが、ＨａＣａＴ前がん細胞に対してそれほど攻撃的でないことを発見した。Ｚｈｏｕら（１９９９）は、ダイズイソフラボン（ゲニステインもしくはダイゼイン）またはダイズ植物化学物質濃縮物がｉｎ ｖｉｔｒｏで前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ、ＤＵ １４５およびＰＣ−３の増殖を阻害することを示した。
（ＨＴ２９細胞外培地におけるゼラチン分解活性）
通常の条件下で（例えば、阻害剤なしで）、がん細胞は、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２を外部環境に分泌してマトリックスタンパク質を分解し、こうして細胞を遊走させる。ゼラチナーゼを阻害するどの状態でも、転移形成を阻害することになる。したがって、ＭＭＰの天然の阻害剤を発見することが潜在的な目的である。
前節で実証したように、ルーピン、ヒヨコマメおよびダイズ種子から調製したタンパク質および低分子量代謝産物を含有するいくつかの可溶性抽出物は、ＨＴ２９細胞遊走に対して強い阻害効果を示すが、ＨＴ２９細胞増殖に対しては示さない。この違いは、それらの作用機序によって説明され得る。がん細胞の浸潤性に関連する主な要因の１つは、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２酵素の活性である。したがって、これらの活性を、ＤＱ蛍光発生法によって定量化するように、ＨＴ２９細胞外培地においていくつかの抽出物への４８時間のばく露後に測定した（図２０）。
図２０は、ＤＱ蛍光発生法により定量したＨＴ２９細胞外培地中の総ＭＭＰ活性のタンパク質分解活性を示す。ＨＴ２９細胞を、緩衝液（対照）、研究中の３つの種子種からの非タンパク質抽出物（１０ｍｇ／ｍＬ）またはタンパク質抽出物（１００μｇ／ｍＬ）の存在下で４８時間増殖させた。ＮＰ：生種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；ＮＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；Ｐ：生種子から調製した可溶性タンパク質抽出物；ＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性タンパク質抽出物。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５。
図２０に示した結果は、試験した全ての抽出物が、ＨＴ２９細胞外培地上に存在するゼラチナーゼ活性のレベルに対してある程度の阻害を示したことを示している。しかしながら、対照と比較すると、全ての可溶性タンパク質抽出物（生または調理済み種子から調製したもの）およびダイズ生種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物について非常に強い阻害（８０〜９０％）が見られた。
概して、ＨＴ２９細胞遊走が主に可溶性非タンパク質代謝産物の影響を受けていたことに注目することは興味深いが（図１７および１８）、一方ＨＴ２９細胞外培地中の総ＭＭＰ阻害能力は本質的に可溶性タンパク質により調整された（図２０）。これらの結果は、マメ科タンパク質はＭＭＰ活性の阻害においてより効率的であり、一方可溶性非タンパク質代謝産物は他の作用メカニズム（単数または複数）を用いて細胞遊走を阻害するように思われることを示唆している。
図２０に示されるアッセイは、総ゼラチン分解活性、すなわちＭＭＰ−９（９２ｋＤａ）およびＭＭＰ−２（７２ｋＤａ）のゼラチン分解活性を合わせたものを測定する。これら２つの活性を分けるには、ザイモグラフィーまたは逆ザイモグラフィーなどの異なるアプローチを使用する必要がある。そのような実験の結果（データは示さず）は、ＭＭＰ−９が主要な標的であることを示している。実際、ＨＴ２９細胞を図２０で使用した４つの抽出物のそれぞれと４８時間インキュベートした後に収集した細胞外培地のザイモグラフィーは、本質的にＭＭＰ−９およびプロＭＭＰ−９（８３ｋＤａ）を標的とする阻害活性を示した。
この実験ブロックは、ルーピン、ヒヨコマメおよびダイズ由来の可溶性タンパク質が、本質的にＭＭＰ−９阻害を介してＨＴ２９細胞遊走を阻害することを示すように思われる。しかしながら、ゼラチナーゼ阻害活性についての異なる報告は、この全く同じ研究の中でさえ矛盾する結果を生じることに留意すべきである。したがって、直前に記載した実験は、ルーピン、ヒヨコマメおよびダイズ由来のタンパク質画分および代謝産物画分の両方がＭＭＰ−９をかなり阻害するが、ＭＭＰ−２は阻害しないことを示す。対照的に、図３２に示される実験は、ルーピンからの総タンパク質画分が両方のゼラチナーゼを強く阻害することを示す。
同一の結果が入手可能な文献に提示されている。ダイズＢＢＩは、２００ｅ ４００μｇ／ｍＬの濃度でＭＭＰ−９とＭＭＰ−２の両方を阻害する（本研究で使用されたものよりはるかに高い濃度；Ｆｅｒｅｉｄｕｎｉａｎら、２０１４）。Ｂａｗａｄｉら（２００５）は、Ｃａｃｏ−２結腸がん、ＭＣＦ−７およびＨｓ５７８Ｔ乳がん、ならびにＤＵ １４５前立腺がん細胞を水溶性クロマメ濃縮タンニンと２４時間インキュベートすると、培地中に分泌された活性型ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のレベルが、１２μＭを超えるタンニン濃度では急激に減少したことを報告した。１５μＭでは、フィセチンは５０％のＭＭＰ−９および他のＭＭＰを阻害するが、ＭＭＰ−２は阻害しないようである（Ｐａｒｋら、２０１３）。フィチン２．５ｍＭは、ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激された結腸がんＣａｃｏ−２細胞におけるＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２および他のＭＭＰの発現を阻害した；Ｋａｐｒａｌら、２０１２）。線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞をダイズサポニンで処置すると、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のｍＲＮＡ発現が抑制され、その分泌量が減少した（Ｋａｎｇら、２００８）。
１つの驚くべき観察は明らかである：プロテアーゼ阻害剤（例えば、トリプシン阻害剤およびＢＢＩ）を除いて、ＭＭＰ活性に対するタンパク質の潜在的な阻害効果を評価するために行われた実験はほとんどない。
図２１は、市販のＭＭＰ−９に対するヒヨコマメ、ダイズおよびルーピン種子抽出物の阻害活性を、全ての場合において同じ種子量を用いて評価し、したがって直接比較を可能にし、これらの種子の摂取を模倣する１つの他の実験を示す。図２１は、ＭＭＰ−９のタンパク質分解活性に対する可溶性種子抽出物の阻害効果を示す。抽出物を市販のＭＭＰ−９を含有する反応混合液に添加し、ゼラチン分解活性をＤＱ蛍光アッセイにより測定した。各反応混合液に添加された抽出物の体積（１００μＬ）は、同じ種子質量に対応した。ＮＰ：生種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物。ＮＰ：生種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；ＮＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性非タンパク質抽出物；Ｐ：生種子から調製した可溶性タンパク質抽出物；ＰＣ：調理済み種子から調製した可溶性タンパク質抽出物。縦線は、少なくとも３つの生物学的複製での平均値±ＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５。
全体として、この実験は、タンパク質画分と非タンパク質画分の両方がＭＭＰ−９活性を阻害することを示している。この阻害作用は、非タンパク質画分の方が高く、ヒヨコマメやダイズよりもルーピンのほうが強いようである。予想通り、種子を調理する効果は減少したが、全画分の阻害力の減少はごくわずかであった。これらの結果は、図１７および１８において観察された効果を説明しており、生種子と比較した場合、調理済みルーピン種子からの非タンパク質画分およびタンパク質画分について得られたより高いＨＴ２９細胞遊走（創傷治癒アッセイによる評価）は、調理抵抗性の活性成分の濃縮効果に起因し得ることを説明している。
（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子からの潜在的に新規なＭＭＰ−9およびＭＭＰ−２阻害剤の単離）
（デフラミンの発見）
ＭＭＰ−９阻害に関与することが判明したタンパク質画分を単離するために、Ｌ．ａｌｂｕｓのタンパク質をそれらの天然サイズに従って分離し、それらのＭＭＰ−９に対する阻害活性を試験した。図２２〜２４は、Ｌ．ａｌｂｕｓの総タンパク質抽出物について得られたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、収集した画分Ｆ１〜Ｆ６の対応する電気泳動タンパク質プロファイル、および各画分のＭＭＰ−９阻害活性を示す。
材料および方法の節に記載されているように、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をＬ．ａｌｂｕｓ種子から抽出した。総タンパク質抽出物を含む脱塩抽出物を、Ａｋｔａシステムを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。タンパク質ピークを、画分Ｆ１〜Ｆ６として集めた（図２２に示すように）。
タンパク質／ポリペプチドを、特定の実施形態では、尿素およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有緩衝液を使用してそれらの分子サイズに従って分離し、それによって異なる低分子量画分の分離が可能になった。このサイズ範囲のＬ．ａｌｂｕｓタンパク質／ポリペプチドの効果的な分離を可能にすることができなかった他の緩衝液を試験し、これは本発明者らの研究室で得られた以前の結果と一致した。次いで各画分を、ＤＱゼラチンアッセイを用いてＭＭＰ−９阻害活性について試験した。図２４は、各画分（Ｆ１〜Ｆ６）のＭＭＰ−９活性における効果を示す。
図２４は、画分４がＭＭＰの触媒活性を１００％阻害することを明らかに示している。この画分はその後、デフラミンを含有することが確認された。
図２２〜２４は、材料および方法の節に記載されているように、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をＬ．ａｌｂｕｓ種子から抽出したことを示す。総タンパク質抽出物を含む脱塩抽出物を、Ａｋｔａシステムを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。タンパク質ピークを画分Ｆ１〜Ｆ６として集め（２２）、還元条件下でトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（２３）。（２４）各画分を、ＤＱゼラチンアッセイを用いてＭＭＰ−９阻害活性について試験した。結果は蛍光の任意単位で表され、３回の平均値±ＳＤを表す。図２２〜２４で観察されるように、画分４のみが非常に高レベルのＭＭＰ−９阻害を示した。この活性を担う特定のペプチドを分析するために、この試料を逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣによってさらに分画した。図２５〜２７は、画分４について得られたＨＰＬＣプロファイルを示す。基本的に４つのピークを得て、それらのそれぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そのＭＭＰ−９阻害活性をＤＱゼラチンアッセイによって評価した。ピーク２は最も高いＭＭＰ−９阻害活性を示し、より少ない程度でピーク３も示した（図２７）。この段階で、ピーク２が少なくとも２つ、おそらくそれ以上のポリペプチドで構成されていると本発明者らが結論づけたのは注目に値する（図２５のボックス２）。
図２８〜３２で利用された全てのタンパク質画分は、消化過程および単離手順の一部を同時にシミュレートしながら、変性に対するその耐性を決定するために、前もって煮沸および低ｐＨ値を受けており、その後、ＨＴ２９細胞創傷閉鎖およびゼラチン分解アッセイ、ならびにザイモグラフィー分析に使用されたことに留意されたい。これは、デフラミンの煮沸および低ｐＨ値に対する耐性を明らかに示している。
図３１は、同じタンパク質画分の存在下でのＨＴ２９細胞培地のゼラチン分解活性を示すのに対し、図３２は、ザイモグラフィー分離におけるＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の両方の活性を評価する。結果は、図２５に示されるＨＰＬＣクロマトグラムから収集されたピーク２を含むポリペプチドが、特に熱処理後において確かに強力なＭＭＰ阻害剤であり、それらがＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２触媒活性の両方を阻害することができることを証明する。
ＨＴ２９細胞外培地の、ピーク２タンパク質（１００μｇタンパク質／ｍＬ）と共に細胞を４８時間インキュベートした後の分析は、ＤＱ−ゼラチン蛍光発生法（図３２）およびザイモグラフィー（図３３）によって示されるように、「デフラミン」がＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性の両方を阻害することを明らかにした。図３３で見られる黒色（カラーで見ると青色）の背景は、アクリルアミドと共重合してゲルマトリックスを形成するクマシーブリリアントブルーによるゼラチンの濃い染色によるものである。バンド状の活性ＭＭＰ酵素またはプロＭＭＰプロ酵素の存在は、マトリックス包埋ゼラチンを局所的に分解し、その結果白色バンドが生じる。阻害剤（例えば「デフラミン」）の存在は、ＭＭＰのタンパク質分解作用を遮断し、未改変ゼラチンの染色を可能にする。したがって、図３３のレーン「デフラミン」に白いバンドがないことは、１００μｇ／ｍＬの「デフラミン」がＨＴ２９細胞外培地に存在する全てのＭＭＰ型の活性を完全に阻害したことを明らかにしており、この阻害がザイモグラフィーアッセイ中に元に戻らなかったことを示す。
図３３に描かれているゲルに充填された画分は、正確にはデフラミンではないことを考慮に入れるべきである − それ故、表記「デフラミン」。実際、特定の実施形態では、デフラミンは、図４に詳述されている単離方法論に従って種子から得られるタンパク質画分である − 特定の実施形態では、これはその定義の一部である。図３３で利用された生物活性画分は、異なる手順を用いて精製されていた。
図３３は、細胞を「デフラミン」（１００μｇタンパク質／ｍＬ）に４８時間ばく露した後のＨＴ２９細胞外培地中のＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２酵素活性のザイモグラフィープロファイルの代表的画像を示す。対照：「デフラミン」なしで４８時間インキュベートしたＨＴ２９細胞。
細胞浸潤を阻害することはできるが（図３０）、同じ濃度の「デフラミン」は細胞増殖に影響を及ぼさず、細胞毒性がないことを示唆している。
（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓからのデフラミンの精製および特性評価−Ｉ）
本発明の方法論の実施形態を、スケールアップを受けるのに適した種子からデフラミンを抽出および精製するために開発し（図４参照）、工業施設におけるその大量生産を可能にした。手順は、方法の節に詳細に記載している。
方法の節で言及したＨＰＬＣ工程はデフラミン構成ポリペプチドを分画するために利用され、デフラミンを単離するために利用されるのではないことに留意すべきである。
逐次抽出は、総抽出物よりも高いＭＭＰＩ活性を示すＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの単離を可能にする。
図３４は、単純に緩衝液で（緩衝液抽出；ＢＥ）もしくは熱処理後（ＨＴ）に抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左）または逆ゼラチンザイモグラフィー（右）によって視覚化したＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子間のポリペプチド分布の代表的画像を示す。
逆ザイモグラフィーの場合、タンパク質抽出物（５０μｇ／ｍＬ）を１７．５％（ｗ／ｖアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填し、ゼラチンおよびＭＭＰ−９と共重合させた。
２０ｋＤａ未満の分子量を有する、レーンＢＥおよびＨＴの両方で目視できるポリペプチドバンドは、デフラミンに相当する。図３４に示すように、デフラミンは熱処理後もその生物活性を維持する。
予備結果は、Ｌ．ａｌｂｕｓからのＭＭＰＩタンパク質画分（すなわちデフラミン）が、水に非常に溶けやすく、熱変性に対する耐性を示すことを示唆した。したがって、（将来の工業規模へのスケールアップに適した）逐次沈殿による単離方法が確立された。
ＭＭＰＩ活性タンパク質画分を単離するためのいくつかの逐次抽出後に得られた電気泳動プロファイルの代表的画像を図３５に示す。
図３５は、ゲルの上部に特定の、精製方法の各工程の後に得られたポリペプチドプロファイルの代表的画像を示す。タンパク質試料（２５μｇ）を１７．５％（ｗ／ｖアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填した。ＭＷ−分子量マーカー；ＢＥ−緩衝液抽出；ＨＴｓ−熱処理、上清；ＨＴｐ−熱処理、ペレット；ｐＨ４ｓ−酸沈殿、上清；ｐＨ４ｐ−酸沈殿、ペレット；４０％ｓ−０．４ＭのＮａＣｌを含む４０％ｖ／ｖエタノール、上清；４０％ｐ−０．４ＭのＮａＣｌを含む４０％ｖ／ｖエタノール、ペレット；９０％−−２０℃で一晩の９０％ｖ／ｖエタノール、ペレット；およびＤ−デフラミン。
図４に示す単離方法の各工程後のポリペプチドプロファイルの分析は、２０ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質画分の段階的精製を明らかにし、これをデフラミンと名付けた。得られた主要タンパク質画分、すなわち総タンパク質／緩衝液抽出物（ＢＥ）、熱処理抽出物（ＨＴ）および単離デフラミン画分を、ＤＱゼラチンアッセイを用いてそれらのＭＭＰＩ活性について比較した。得られた結果を図３６に示す。
試験したタンパク質濃度（50μｇ／ｍＬ）で、図３６は、全ての試料がＭＭＰ−９タンパク質分解活性を有意に阻害することができたことを示している。しかしながら、分析した試料間で有意差（Ｐ＜０．０５）が観察され、デフラミンで最も高い阻害（Ｐ＜０．０５）が検出され、それはＭＭＰ−９活性の８０％を超える減少を誘導した。
言い換えれば、図３６において、緩衝液抽出（ＢＥ）、熱処理（ＨＴ）およびデフラミン（Ｄ）タンパク質画分をＬ．ａｌｂｕｓ種子から得て、ＤＱゼラチンでのＭＭＰ−９のタンパク質分解活性に対するそれらの阻害活性を評価するために使用した。陰性対照（Ｃ）はＭＭＰ−９を阻害せず、このプロテアーゼに対して１００％のタンパク質分解活性をもたらす。タンパク質試料を５０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ゼラチン分解活性をＤＱ蛍光アッセイにより測定した。ＭＭＰ活性は、対照の％としての相対蛍光として表され、少なくとも３回（ｎ＝３）の反復実験の平均値±ＳＤを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
要約すると、デフラミンが段階的に精製されるにつれて、ＭＭＰＩとしてのその阻害効果が増大する。
（Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンは、結腸がん細胞浸潤および増殖の阻害により効果的である）
注：本標題の「より」という言葉は、二重の意味で使われている：
１−単離方法論が最初の総タンパク質抽出物から精製デフラミンに進行するにつれて、その生物活性は段階的に増加し、単離デフラミンで最大に達する。各精製工程後に行われる比較試験は各試料からのタンパク質の同一タンパク質量を使用するため、デフラミン精製度が増加するにつれて、各画分中の総タンパク質に対するデフラミン量も増加し、純度が低いものから純度がより高いデフラミン画分へ移ったときのデフラミン生物活性の増加を正当付ける。
２−デフラミンは細胞増殖の貧弱な阻害剤（低い細胞毒性を意味する；下記参照；図３９〜４２を比較）であるが、結腸がん細胞浸潤および増殖の強力な阻害剤である。
ＨＴ２９細胞における単離デフラミン活性を、それをＬ．ａｌｂｕｓの総抽出物および熱処理抽出物と比較しながら特性評価した。図３７〜３８は、総抽出物、熱処理抽出物および単離デフラミン（５０μｇタンパク質／ｍＬ）への４８時間のばく露後のＨＴ２９細胞遊走に対するこれらのタンパク質画分のそれぞれの効果を示す。
図３７および３８は、創傷治癒アッセイによって測定される、緩衝液抽出（ＢＥ）、熱処理（ＨＴ）および単離デフラミン（Ｄ）へのばく露後のＨＴ２９細胞遊走を示す。（図３７）−相対遊走率。値は、少なくとも３回の反復実験の平均値±ＳＤであり、０日目に対する％創傷閉鎖として表される。（図３８）−最高阻害タンパク質画分、すなわちデフラミンについて得られた細胞遊走の例。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０日目）。次いで、細胞を５０μｇタンパク質／ｍｌ抽出物にばく露し、４８時間後に細胞遊走を記録した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。
これらの結果は、デフラミンが他のタンパク質試料研究と比較して遊走率の最も高い阻害を示し（ｐ＜０．０５）、細胞遊走率の６０％の減少を誘導することを示している。さらに、用いた濃度では、ＨＴおよびデフラミンは対照と統計的に差異があった（Ｐ＜０．０５）が、ＢＥ試料は対照と統計的に類似したままであった（Ｐ＞０．０５）。この結果は、少なくともある程度、デフラミンが以前に発見されなかった理由を説明し得る。
（Ｌ． ａｌｂｕｓデフラミン活性は用量依存的である）
デフラミンを単離するために開発された方法論（図４に示され、方法の節に詳細に記載される）は、Ｌ． ａｌｂｕｓのＭＭＰＩ活性に関与するＭＭＰＩ画分を単離することにおいて非常に効率的であることを実証した。この画分（すなわちデフラミン）の効果をさらに試験し、それが用量依存的であるかどうかを確かめた。ＨＴ２９結腸がん細胞におけるＤＱゼラチン法および創傷浸潤アッセイを用いて、４つの異なるデフラミン濃度（１００、５０、１０および５μｇ／ｍＬ）のセットを試験し、その結果を図３９および４０〜４１にそれぞれ示す。
図３９は、ゼラチナーゼ活性に対する異なる濃度のデフラミン（１００、５０、１０および５μｇ／ｍＬ）の効果を示す。４つの異なる濃度のデフラミンをＬ．ａｌｂｕｓ種子から得て、ＤＱ−ゼラチンに対するＭＭＰ−９のタンパク質分解活性に対するそれらの阻害活性を評価するために使用した。陰性対照（Ｃ）はＭＭＰ−９を阻害せず、このプロテアーゼに対して１００％のタンパク質分解活性をもたらす。デフラミンを１００、５０、１０および５μｇ・ｍＬ−１の濃度で添加し、ゼラチン分解活性をＤＱ蛍光アッセイにより測定した。ゼラチナーゼ活性は、対照の％としての相対蛍光として表され、少なくとも３回（ｎ＝３）の反復実験の平均値±ＳＤを表す。
図４０〜４１は、創傷治癒アッセイによって測定した、異なる濃度のデフラミンへのばく露後のＨＴ２９細胞遊走を示す。（図４０）−相対遊走率。値は、少なくとも３回の反復実験の平均値±ＳＤであり、時間０に対する％創傷閉鎖として表される。（図４１）−試験した４つのデフラミン濃度プラス対照について得られた細胞遊走の例。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０日目）。次いで、細胞を１００、５０、１０および５μｇ／ｍＬのデフラミンにばく露し、細胞遊走を４８時間後に記録した。対照と比較して、＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊はＰ＜０．０５を表す。
図４０は、試験した全ての濃度（１００、５０、１０および５μｇ／ｍＬ）が、対照と比較して、ゼラチナーゼタンパク質分解活性を有意に阻害することができた（Ｐ＜００．１）ことを示す。しかしながら、各濃度での阻害レベルは用量依存的に異なり、デフラミン１００μｇ／ｍＬで最も高い阻害が検出され、これはゼラチン分解活性の９０％を超える減少を誘導した。図４０および４１は、デフラミンの結腸がん細胞浸潤を阻害する能力を示す。
図４０および４１は、ＨＴ２９細胞遊走を阻害するデフラミンの能力が、５〜５０μｇデフラミン／ｍＬのデフラミン濃度と共に徐々に増加することを示す。しかしながら、試験した最高デフラミン濃度（１００μｇ／ｍＬ）について、異なる興味深い結果が得られた：ＨＴ２９細胞は１００μｇデフラミン／ｍＬで完全に剥離し（図４０および４１を参照）、図４０のグラフでこの濃度が存在しないことを正当付けた。Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンは結腸がん細胞における細胞増殖および代謝を低下させない。
デフラミンがＨＴ２９細胞に対して細胞毒性であるかどうかを試験するために、およびそれが細胞増殖に影響する場合、本発明者らは標準的な細胞増殖アッセイを用いて同じ濃度を試験した。
図４２は、ＭＴＴ（生細胞によってのみ代謝され得る）で染色した後に測定した、異なるデフラミン濃度（１００、５０、１０および５μｇ／ｍＬ）の存在下での増殖後のＨＴ２９生細胞の数を示す。結果は、デフラミンへの２日間のばく露は、対照と比較した場合、細胞増殖または生細胞数の有意な減少（Ｐ＞０．００１）を誘発しなかったことを示す。さらに、目視できる細胞毒性作用はなかった。この結果は、デフラミンが１００μｇデフラミン／ｍＬでさえもＨＴ２９細胞に対して比較的非細胞毒性であることを示している。
図４２は、異なる濃度のデフラミンへの２４時間のばく露後のＨＴ２９細胞増殖を示す。細胞を１００、５０、１０および５μｇタンパク質／ｍＬ抽出物の存在下で２４時間増殖させ、ＭＴＴで染色した。示された値は、少なくとも３回（ｎ＝３）の反復実験の平均値±ＳＤであり、対照の百分率として表される。
細胞増殖はデフラミンによって損なわれなかったため、最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、細胞浸潤、細胞剥離、ＭＭＰ阻害および細胞増殖について測定した。
図４２に示される結果は、デフラミンへの２日間のばく露が、対照と比較して、細胞増殖または生細胞数の有意な減少（Ｐ＞０．００１）を誘発しなかったことを示す。さらに、目視できる細胞毒性作用はなかった（データは示さず）。この結果は、デフラミンが、ＨＴ２９細胞に対して１００μｇデフラミン／ｍＬであっても比較的非細胞毒性であり、それが正常な細胞代謝を妨害しないことを示している。
しかしながら、最高デフラミン用量では、ＨＴ２９細胞は剥離し（図４０〜４１）、これがいかなる程度の細胞毒性にも関連しない場合、おそらくこれは細胞接着に関連する可能性がある。細胞は、それらのインテグリン、すなわち細胞−細胞相互作用と細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用の橋渡しである膜貫通受容体を介して基質に接着することが知られている。組織培養中の細胞に対するインテグリンの１つの重要な機能は、細胞遊走におけるそれらの役割である。最近の研究は、インテグリンが腫瘍の進行と転移とによって調節され、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の両方の活性と密接に関係していることを証明している。それにもかかわらず、ＭＭＰＩの存在下で細胞剥離効果を示した研究はほとんどない。これらの結果は、デフラミンの作用機序が、ゼラチナーゼ阻害以上のものを引き起こすよりも広いメカニズムを含み得ることを示唆している。試験された最高デフラミン用量（すなわち１００μｇ／ｍＬ）が明らかな細胞毒性効果を引き起こさないという観察は、それが消化器系に有害ではなく、それ故にいかなる副次的影響もなしに予防食に使用され得ることを示唆する。
細胞増殖はデフラミンによって損なわれなかったため、本発明者らは、異なる試験：細胞増殖、細胞浸潤、細胞剥離およびＭＭＰ阻害において、最小阻害濃度（ＭＩＣ）およびデフラミンの５０％効果を誘導するのに必要な濃度（ＥＣ５０）を測定することに着手した。結果を表１に示す。
試験条件下で、細胞浸潤およびＭＭＰ阻害についてのＭＩＣ値は、試験した他のパラメータについて見出されたＭＩＣよりも低かった。１０μｇ．ｍＬ−１デフラミン濃度は、細胞浸潤の５０％を有意に阻害するのに十分であることが見出され（ｐ＜０．０５）、それを細胞浸潤のＥＣ５０値とした。ＭＭＰ阻害については、ＥＣ５０も１０μｇデフラミン／ｍＬである。これは、ＭＭＰ−９活性と細胞浸潤間の高い関連性と一致しており、ＭＭＰ阻害がデフラミンの主要な作用様式の少なくとも１つであることを裏付けている。それにもかかわらず、細胞浸潤について測定されたＭＩＣレベルは１０μｇ／ｍＬ未満であったが、５μｇ／ｍＬでは統計的に有意ではなく（Ｐ＜０．０５）、一方で５μｇ／ｍＬの存在下でＭＭＰはすでに非常に有意に阻害され、ＭＩＣ値がこの濃度より低いのはこのためである。細胞浸潤に対するよりもＭＭＰ阻害に対してＭＩＣ値が低いと、ＭＭＰ阻害はある程度の阻害の後に顕著な細胞浸潤の減少を誘発するだけであると予想される。一方、細胞剥離のＭＩＣは、試験した最高デフラミン濃度である＞１００μｇ／ｍＬで達成されただけで、有意な細胞毒性は検出されなかった。
明らかに、非常に低い程度でしか影響されなかった細胞増殖障害または細胞毒性と比較した場合、ＭＭＰ阻害および細胞浸潤の減少がデフラミンの最も強い活性である。これは非常に重要となり得る。高い特異性と低い副作用を持つＭＭＰＩを見つけることは非常に困難であり、ほとんどの臨床試験は満足できない結果をもたらした。一方、がん予防食では、ＭＭＰ−９および−２活性を少量で減少させることが望ましいが、高用量でも結腸細胞に対して毒性レベルが低いことが非常に重要な要件である。ポリフェノールなどの低分子量化合物と比較して、ポリペプチドＭＭＰＩは、高特異性および低毒性などの様々な利点を提供する。化学療法または放射性治療などの従来のがん治療と比較して、同時に低い毒性を示すＭＭＰなどの腫瘍プロモーターに対して高い特異性を有するペプチドおよび低分子タンパク質は、がん治療／予防における将来を表し得る。
（Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンは低分子量のβ−コングルチンとδ−コングルチンフラグメントの複合体）
図３５で分析されたデフラミン画分は２つ以上のポリペプチドバンドにより構成されているように思われたため、同じ試料（すなわち単離されたデフラミン）を還元および非還元条件下で電気泳動により分画し、そのポリペプチド組成を検出し、ならびにジスルフィド結合の存在可能性を決定した。得られた結果を図４３に示す。
図４３は、還元条件下および非還元条件下でのデフラミンポリペプチドプロファイルを示す。還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子から単離されたデフラミンのポリペプチド分布の代表的画像。デフラミン（５０μｇ／ｍＬ）を、還元緩衝液（１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．００６％（ｗ／ｖ）ｍ−クレゾールパープルを含有する１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８）および非還元緩衝液（２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．００６％（ｗ／ｖ）ｍ−クレゾールパープルを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８）を含む１７．５％（ｗ／ｖのアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填した。
デフラミンを、その異なるポリペプチド成分を分離するために、逆相ＨＰＬＣによってさらに分析した。図４４〜４６は、２８０および２１４ｎｍで得られたクロマトグラフィープロファイル、およびそれぞれの電気泳動パターンを示す。結果は、ピーク２〜４に散在するデフラミン標準バンドの存在を示す。
４５〜５０分でＨＰＬＣ逆相カラムから溶出する２８０ｎｍピークは、タンパク質も生物活性も含まない。このため、その研究を中止した。
より高い活性を有するピーク画分を決定するために、本発明者らは、ＤＱゼラチンおよび細胞浸潤アッセイを用いて、４つのピークのＭＭＰＩ活性をさらに測定した（図４７および４８）。結果をそれぞれ図４７および４８に示す。
結果は、選択された全てのピークがある程度のＭＭＰ阻害を示し、浸潤も阻害したことを示唆しているようであるが、ピーク３が最も高い活性が観察されたピークであった。同定のために、４つの選択されたピークを質量分析によってさらに分析した。
（デフラミンは、費用対効果が高くかつスケーラブルな手順によって精製することができる最初のタンパク質性ＭＭＰＩである）
マメ科種子は、トリプシン阻害剤およびＢＢＩなどの様々なタンパク質性酵素阻害剤を含有することによって長い間認識されてきた。しかしながら、天然に存在するＭＭＰＩの存在は植物組織中に偏在すると考えられ得るが、それらの全ては臨床的および／または栄養学的目的でのそれらの製造を考慮するときにいくつかの欠点を示す：高濃度または長期ばく露での毒性；調理時および／または消化過程による化学的不活性化（たとえば変性）または破壊（たとえばタンパク質分解）；特定のものの欠如；概してＭＭＰＩが工業レベルへの効率的なスケールアップを受けるのを妨げる、高コストで非効率的な分離方法。この研究で報告されている単離デフラミンは、煮沸に耐性があり、酵素阻害剤であるため、これらの制約の全てを超えている；他方、開発された逐次沈殿法は単純であり、費用効果が高く、工業的状況において容易に適用される。ルーピン種子に天然に存在する食用ポリペプチドの混合物として、ほとんどのフェノール化合物や他の生物活性二次代謝物がそうであるように、それは高用量での毒性の問題を提起せず、酸およびエタノール沈殿の使用は、考えられる有毒混入物質ならびに高分子量タンパク質の除去を確実にする。
抽出手順の収率を表２に示す。結果は、乾燥種子１００ｇ当たり１００ｍｇのデフラミンが得られることを示し、これは種子の総タンパク質含有量の約０．５％に相当する。
これらの結果は、デフラミンが実際に種子中に非常に低濃度で存在すること、したがってＢＥ画分において観察されるより低い活性があることを裏付ける。それはまた、ルーピン単独の消費が、その単離形態が提供できるのと同じ効果を誘発するのに十分なデフラミンを提供し得ないことを示唆する。
抽出手順の低収率は、方法自体によるものではなく、むしろ種子中の低量のデフラミンによるものであることに留意することが重要である。それでも、手順の相対的な容易さ、ならびにろ過および流動遠心分離およびエタノールなどの安価な試薬を使用する、費用効果が高く簡単な方法でのより大きな量へのスケールアップの可能性は、工業生産への高い可能性を示唆する。
さらに、デフラミンの可能性を考えると、本発明者らの開発した手順は、その同一性、用量反応効果およびＥＣ５０、ならびに臨床および前臨床試験など、このタンパク質性画分のより徹底的な特性評価を追求するためにも特に重要である。ルーピンの他の品種や種、他のマメ科種からの種子、および他の植物科からの種子に関する研究、ならびにそれらの成長条件の変化は、種子中のデフラミンの量を増加させ得る。単離されたデフラミンがＭＭＰ−９を阻害し、がん細胞浸潤を減少させるのに有効であるという事実は、その広範な臨床用途への高い可能性を示唆する。ＭＭＰ−９は炎症および腫瘍学的過程に密接に関与しているため、ＭＭＰＩデフラミンは、抗がん治療と抗炎症治療、特に大腸がん（ＣＲＣ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの消化管に関連した治療の両方に使用される可能性がある。
（質量分析によるＬ．ａｌｂｕｓデフラミンを含むポリペプチドの同定−Ｉ）
デフラミンを、図４の実施形態に詳述した方法論に従ってＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子から単離した。デフラミンをその後、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、以下に示される４つのピークに分画した。図４６に示されるように、これらのピークのそれぞれを含むポリペプチドを質量分析によって同定した。得られた結果は、以下の（ピーク１）、（ピーク２）、（ピーク３）および（ピーク４）に示されており、以下のピークの存在を示している：
−ピーク１：コングルチンベータ１、２、３、４、５および７のフラグメント。分子全体に及ぶβ−コングルチンフラグメントが検出されたことに留意されたい。ピーク１ではδ−コングルチンフラグメントは検出されなかった。
−ピーク２：コングルチンベータ１、２および６、ならびにコングルチンデルタ２大鎖のフラグメント。それらの前駆体の全分子にわたるβ−コングルチンおよびδ−コングルチンフラグメントが検出されたことに留意されたい。
−ピーク３：コングルチンベータ１およびコングルチンデルタ２大鎖のフラグメント。それらの前駆体の全分子にわたるβ−コングルチンおよびδ−コングルチンフラグメントが検出されたことに留意されたい。
− ピーク４：コングルチンベータ１、２、３、６および７のフラグメント。全分子にわたるβ−コングルチンフラグメントが検出されたことに留意されたい。ピーク１ではδ−コングルチンフラグメントは検出されなかった。
言い換えれば、図４４〜４６は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるデフラミン分画の、その構成ポリペプチドへの代表的画像を示す。デフラミンを、開発され図４に図示された方法論によってＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子から抽出し、精製した。（図４４）および（図４５）−２１４ｎｍ（図４４）および２８０ｎｍ（図４５）でモニターしたデフラミンの逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣクロマトグラフィー。（図４６）還元条件下で実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７．５％ｗ／ｖアクリルアミド）（Ｒ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって可視化した、ＨＰＬＣ実行から集めた各ピークのポリペプチドプロファイル。タンパク質ピーク（５０μｇ）を１７．５％（ｗ／ｖアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填した。総ポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した。
図４７は、デフラミンのＨＰＬＣ分画によって得られた画分１〜４のＭＭＰ−９タンパク質分解活性を示す。タンパク質試料を２５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、ゼラチン分解活性をＤＱ蛍光アッセイにより測定した。結果は蛍光の任意単位で表され、少なくとも３回の反復実験（ｎ＝３）の平均値±ＳＤを表す。対照と比較して、＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊はＰ＜０．０５を表す。
図４８は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分画後に収集された選択されたデフラミンピークのそれぞれへのばく露後のＨＴ２９細胞遊走 − 相対遊走率を示す。値は少なくとも３回の反復実験の平均値±ＳＤであり、０日目に対する％創傷閉鎖として表される。細胞を８０％コンフルエンスに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０日目）。次いで、細胞を２５μｇタンパク質／ｍｌ抽出物にばく露し、４８時間後に細胞遊走を記録した。＊＊はＰ＜０．０５を表す。
これら全ての結果から、２つの主な結論が導き出され得る：
− Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンは、β−コングルチンとδ−コングルチンフラグメントとの複雑な混合物からなる；
− β−コングルチンおよびδ−コングルチンは、両方ともＬ．ａｌｂｕｓ デフラミンの前駆体である。
Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンのピーク成分（図４４〜４６および配列番号１９４〜１９７参照）の質量分析分析。デフラミンのＲＰ−ＨＰＬＣによるＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの分画は４つのピークを生じ、そのそれぞれは、質量分析によって同定されたポリペプチドを含有する。
カラーコードは、ペプチドの信頼度を示す：
・緑残基は９５％の信頼度のペプチドに対応する；
・５０〜９５％の間の信頼度のペプチドについては黄色；
・５０％未満の信頼度のペプチドについては赤；
・灰色は未同定残基に対応する。
（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の２つの画分におけるＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの分割）
Ｌ．ａｌｂｕｓから単離されたデフラミンは２つの画分（一方はβ−コングルチン由来、他方はδ−コングルチン由来）を含み、それらはＨＰＬＣでは分離されないが、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の添加によって、β−コングルチンがこれらの陽イオンに結合し、自己凝集し、不溶性になるため、実際には分離することができる。
（方法論）
ＨＰＬＣにより単離したデフラミン画分を凍結乾燥し、水に溶解させ、撹拌した。デフラミン溶液に、ストック溶液からのＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を１０ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのＭｇＣｌ２に達するまで添加し、続いて４時間または一晩撹拌した。懸濁液を３０，０００ｇで１時間遠心分離した。上清およびペレットを、予め水中で平衡化したＮＡＰ−１０カラムで脱塩し、将来の分析のために凍結乾燥した。全ての操作を４℃で行った。
両方の凍結乾燥画分を電気泳動分離に使用し、それらのＭＭＰ−９阻害活性を、前述のように蛍光発生ＤＱ−ゼラチンアッセイ、ＨＴ２９細胞における創傷治癒アッセイおよび基質ザイモグラフィーを使用して測定した。
（結果）
図４９は、Ｃａ／Ｍｇ可溶性および不溶性デフラミン画分の両方の電気泳動プロファイルを示す。図は、Ｃａ／Ｍｇ可溶性および不溶性デフラミン画分の電気泳動プロファイルを示す；Ｄ−ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離したデフラミン；Ｄｓ−陽イオンの存在下で沈殿しなかったデフラミン画分（上清）；Ｄｐ−陽イオンの存在下で沈殿したデフラミン画分（ペレット）。
（Ｌ． ａｌｂｕｓデフラミンを２つの画分に分割することは、その抗がん活性に影響する）
２つの画分に分割されると、Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンはその細胞浸潤阻害活性を失う。しかし、これらの画分が再び合わされると、最初の活動の一部が回復する。図５０に示されるこれらの結果は、２つの画分がデフラミン生物活性の発現に必須であることを示唆する。
図５０は、１０ｍＭのＣａＣｌ２および１０ｍＭのＭｇＣｌ２の溶液で沈殿したまたは沈殿しなかった、デフラミンおよびデフラミンサブ画分によるＨＴ２９細胞における細胞浸潤の阻害を示す。Ｃ−対照；Ｄ−デフラミン；Ｄｓ−陽イオンの存在下で沈殿しなかったデフラミン画分（上清）；Ｄｐ−陽イオンの存在下で沈殿したデフラミン画分（ペレット）；ならびにＤｓ＋ｐ−両画分、ＤｐおよびＤｓ、等分量で合わせた。
（炎症および腫瘍浸潤に関連する遺伝子の発現に対するＬ．ａｌｂｕｓデフラミンの影響）
特定の疾患の自然史および疫学研究に基づいて、特定の慢性炎症状態と最終的な腫瘍の出現との間に強い関連性が確立されている。特定の遺伝子はこれらの病状の間により高度に発現され、それらが発現するタンパク質は通常、炎症および腫瘍形成のバイオマーカーとして認識されている。そのような例は、以下である：ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２などの数種類のＭＭＰ、ならびにまた、全身性炎症に関与する細胞シグナル伝達タンパク質（サイトカイン）である腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＤＮＡの転写を制御するタンパク質複合体である核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）、およびメタロプロテイナーゼの内因性組織阻害剤であるＴＩＭＰ１、ならびに炎症メディエーターであるｉＮＯおよびＣＯＸ２。これらのうちのいくつかを図５１で試験した。
（方法）
ＨＴ２９細胞を５０μＬ／ｇのデフラミンにばく露し、２４時間増殖させた。ＮＺＹトータルＲＮＡ単離キット（Ｎｚｙｔｅｃｈ）を若干改変したものを用いてＨＴ２９細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量化を、Ｔａｋｅ３マルチボリュームプレート（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ウィヌースキー、アメリカ）を用いて、Ｇｅｎｅ ５ソフトウェアを備えたＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴマルチプレートリーダーで実施した。逆転写には、ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのＲｅｖｅｒｔＡｉｄ逆転写酵素プライミングを、製造元の推奨に従って使用した。
炎症およびがんの浸潤に関連する特定の遺伝子に対する一組のプライマーを使用した。増幅により発現が確認されたら、２μｇのＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、０．５μＭの遺伝子特異的プライマー（表３）、およびＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）からなる２０μＬの反応容量で実施したリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、ｉＱ５リアルタイム熱サイクラー（ＢｉｏＲａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用して、転写物を定量した。サイクル用の反応条件は、９５℃で３分間、続いて９５℃で１０秒間、６１℃で２５秒間、および７２℃で３０秒間の４０サイクルであった。それぞれの場合において融解曲線を作成し、単一産物の増幅とプライマー二量体化の非存在とを確認した。各分析を、それぞれ３回の生物学的複製で３回の反応で行った（ｎ＝９、各複製は３回の技術的測定の平均である）。ｉＱ５光学システムソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）によって得られた対応する定量サイクル（Ｃｑ）を、定量用のＭＳ Ｅｘｃｅｌスプレッドシート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）にエクスポートした。目的の各遺伝子のＣｑ値を、アクチン（Ａｃｔ）に関して正規化した。デフラミンばく露における相対的遺伝子発現値を、対照条件に対する倍数変化値として下記の図５１に示す。
（結果）
図５１に示す結果は、デフラミンが炎症および腫瘍形成に関連する特定の遺伝子の発現を有意には変えず、ＭＭＰ−９とも無関係であることを示唆し、デフラミンは遺伝子発現に対して有意な直接的活性を有さず、むしろＭＭＰ−９との直接的相互作用を介して作用するという仮説を裏付ける。注目すべきは、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−７に関連する遺伝子の発現のわずかな阻害であり、これらは通常進行した転移性疾患の間に増強された発現を示す。
図５１は、換言すれば、ＨＴ２９細胞におけるデフラミンに対する転写応答を示す。
（食品中のデフラミン活性）
Ｌ． ａｌｂｕｓデフラミンを、塩味の調理済みクッキーの製造に使用した。この過程の間に、温度を１８０℃まで上げたことに留意することは重要である。それにもかかわらず、図５２で得られた結果は、デフラミンが塩味の調理済みクッキーにおいてそのがん細胞浸潤阻害活性を維持したことを示している。
図５２は、デフラミンを含有するクッキー（Ｄ）または含有しないクッキー（Ｃ）から調製したタンパク質抽出物によるＨＴ２９細胞における細胞浸潤の阻害を示す。Ｃ−対照；ＣＦ−未調理の対照クッキー；ＣＳ−調理済みクッキー；ＤＦ−デフラミン含有未調理クッキー；ＤＳ−デフラミン含有調理済みクッキー。
（Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンの単離および特性評価−ＩＩ）
（ＲＰ−ＨＰＬＣおよび電気泳動によるデフラミン分析）
図５３は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離液はアセトニトリルおよびＴＦＡである）によるＬ．ａｌｂｕｓデフラミン分画ならびに対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥの代表的画像を示す。デフラミンは、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子から抽出および精製した。
図５３はＨＰＬＣおよび電気泳動プロファイルを示す。Ａ−２８０ｎｍでモニターした逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣクロマトグラフィー。デフラミンピークは矢印で識別される。Ｂ−還元条件下で実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７．５％ｗ／ｖアクリルアミド）によって可視化した、ＨＰＬＣ実行から集めたデフラミンピークのポリペプチドプロファイル。３０分（５０μｇ）で溶出するタンパク質ピークを１７．５％（ｗ／ｖアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填し、クマシーブリリアントブルーで染色した。
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるデフラミンの２つのフラグメントの質量分析−ＩＩ）
（方法）
機器は、ＬＩＦＴセルおよびＮ２レーザーを備えたＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＴＯＦ Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓで構成されていた。
イオン化：ＭＡＬＤＩ
動作モード：質量分析計を線形モードで正極性で動作させ、スペクトルをｍ／ｚ５０００〜２００００の範囲で取得した。各スポット位置で５０Ｈｚのレーザー周波数で、合計１０００個のスペクトルを得た。外部較正：Ｂｒｕｋｅｒからのタンパク質較正標準Ｉ（インスリン（５７３４．５１ｍ／ｚ）；ユビキチンＩ（８５６５．７６ｍ／ｚ）、チトクロームｃ（１２３６０．９７ｍ／ｚ）、ミオグロビン（１６９５２．３０ｍ／ｚ）の［Ｍ＋Ｈ］＋；シトクロムｃ（６１８０．９９ｍ／ｚ）およびミオグロビン（８４７６．６５ｍ／ｚ）の［Ｍ＋２Ｈ］２＋）。
（結果）
Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、わずかに異なる長さの互いに相同ないくつかのフラグメントからなる、１３および１７ｋＤａの質量を有する２ブロックのポリペプチドフラグメントの存在を明らかに示している（図５４）。
図５４は、換言すれば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析されたＬ．ａｌｂｕｓからのデフラミンを示す。
（デフラミン抗菌活性）
デフラミンの抗菌活性を以下の微生物に対して試験し、無効であることがわかった：
グラム陽性細菌：
−リステリア菌（ＮＣＴＣ １１９９４）
−セレウス菌（ＮＣＴＣ ７４６４）
−黄色ブドウ球菌（ＮＣＴＣ １０７８８）
グラム陰性細菌：
−大腸菌（ＮＣＴＣ ９００１）
−サルモネラ・ゴールドコースト（ＮＣＴＣ １３１７５）。
真菌：
−アルテルナリア・アルテルナータ
−ボトリチス・シネレア
−ファエオアクレモニウム・アレオフィルム
−アルテルナリア種
−ペニシリウム種
（大腸炎の動物モデル）
（デフラミンの抗大腸炎作用に関する予備結果）
大腸炎に対するデフラミンの生物活性に関する予備結果を図５５に示す。デフラミンの抗大腸炎作用に関する予備結果：マウスモデルにおける対照およびデフラミン処置での比較の大腸炎誘発性病変の代表的画像。このアッセイを、大腸炎の誘発後にそれらの食餌に導入した１つの濃度のデフラミンのみでの予備試験として行った。
デフラミン投与は、大腸炎損傷の肉眼的および機能的徴候を減少させる。
デフラミンの抗炎症効果を確かめるために、その効果を、２つのタイプの投与、経口投与（ｐ．ｏ．）および腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を用いて、ＴＮＢＳ誘発性大腸炎のマウスで試験した。デフラミンを、大腸炎誘発の３時間後に投与した。図５６および５７は、それぞれ結腸の長さ（ｃｍ）および腸損傷の程度（ｃｍ）に対するデフラミンの効果を示す。
図５６は、結腸の長さ（ｃｍ）に対するデフラミン投与の効果を示す。擬似群（ｎ＝６）、ＥｔＯＨ群（ｎ＝６）、ＴＮＢＳ群（ｎ＝１０）、ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．群（ｎ＝９）およびＴＮＢＳ＋デフラミンｉ．ｐ．群（ｎ＝１０）。＃Ｐ＜０．００１対擬似群、＊Ｐ＜０．００１対ＴＮＢＳ群。
図５７は、腸損傷の程度（ｃｍ）に対するデフラミン投与の効果を示す。擬似群（ｎ＝６）、ＥｔＯＨ群（ｎ＝６）、ＴＮＢＳ群（ｎ＝１０）、ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．群（ｎ＝９）、ＴＮＢＳ＋デフラミンｉ．ｐ．群（ｎ＝１０）。＃Ｐ＜０．００１対擬似群、＊Ｐ＜０．０１対ＴＮＢＳ群。
図５８は、結腸の肉眼的観察に対するデフラミン投与の効果を示す。（Ａ）擬似群（ｎ＝６）、（Ｂ）ＥｔＯＨ群（ｎ＝６）、（Ｃ）ＴＮＢＳ群（ｎ＝８）、（Ｄ）ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．群（ｎ＝９）。＃Ｐ＜０．００１対擬似群、＊Ｐ＜０．０１対ＴＮＢＳ群。
図５９は、結腸の肉眼的観察に対するデフラミン投与の効果を示す。（Ａ）擬似群（ｎ＝６）、（Ｂ）ＥｔＯＨ群（ｎ＝６）、（Ｃ）ＴＮＢＳ群（ｎ＝８）、（Ｄ）ＴＮＢＳ＋デフラミンｉ．ｐ．群（ｎ＝１０）。＃Ｐ＜０．００１対擬似群、＊Ｐ＜０．０１対ＴＮＢＳ群。
擬似群およびエタノール群の動物は、結腸損傷の肉眼的徴候を示さず、死亡を示さず、一方ＴＮＢＳ／ＥｔＯＨの結腸内注射は、結腸長の非常に有意な（ｐ＜０．０５）減少と、目視できる損傷の程度（潰瘍形成）の増加とをもたらした。デフラミン処置群（ｐ．ｏ．およびｉ．ｐ．の両方）において、結腸損傷の全ての肉眼的徴候は、ＴＮＢＳ群と比較して有意に減少した（図５６および５７）。
結果はデフラミンの投与（ｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．の両方）が結腸炎症の全体的な減少をもたらし、ｐ．ｏ．の場合には結腸長の減少の有意な（ｐ＜０．０５）軽減と、目視できる損傷（潰瘍形成）の程度の有意な（ｐ＜０．０５）減少とをもたらした。これらの違いは、実験終了時の結腸採取直後の、新鮮で洗浄された結腸の顕微鏡観察によって容易に認識することができる。図５８および５９は、異なる処置群から単離された結腸のベンチ外科用顕微鏡によって得られたこれらの顕微鏡観察の代表的写真を示す。ＴＮＢＳの結腸内投与の４日後、結腸は弛緩したに見え、液体便で満たされていた。画像の観察は、ＴＮＢＳ誘発性大腸炎と比較した場合、デフラミンで処置した動物における結腸損傷の明らかな軽減を示す（図４２および４３）。
投与の種類に関しては、２つの種類の投与の間にいくつかの違いが観察され、大腸炎の形態学的徴候と結腸損傷の程度とを比較すると、ｉ．ｐ．投与でより高かった（表１および図５９；Ｐ＜０．０５）。肉眼的観察も、２つの処置を比較した場合（すなわち、ｐ．ｏ．対ｉ．ｐ．；図５８および５９）、この傾向を裏付ける。
デフラミンは、大腸炎損傷の組織学的特徴と炎症性マーカーを軽減する。
デフラミンの効果に関与するメカニズムを教示するために、本発明者らは組織学的損傷の重症度を分析し、炎症およびがんの進行の特定のマーカーであるＣＯＸ２およびｉＮＯＳの存在も決定した。
実験的に誘発された大腸炎の結腸組織におけるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）および一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の発現低下（Ｄ’Ａｃｑｕｉｓｔｏら、２００２）は、大腸炎の重症度の低下と、疾患の巨視的および微視的徴候の軽減とに関連している。特に腸において、誘導性ｉＮＯＳの発現を介したＮＯ産生のアップレギュレーションは、迅速な腸内抗菌反応の一部を表す；しかしながら、ＮＯはヒトＩＢＤにおける炎症の開始および維持とも関連しており（Ｋｏｌｉｏｓら、２００４）、研究は、ｉＮＯＳ由来ＮＯのレベルが潰瘍性大腸炎における疾患活動性とよく相関することを示した（Ｃｒｏｓｓ＆Ｗｉｌｓｏｎ、２００３）。一酸化窒素は、炎症を起こしていない腸よりも炎症を起こした腸ではるかに大量に局所的に産生および放出され、実際にはＩＢＤ患者の診断およびモニタリング用の新規臨床バイオマーカーとして示唆さえされた（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００５）。ＣＯＸ−２と同様に、実験的大腸炎研究における免疫染色アッセイは、大腸炎誘発を受けた動物において実際にｉＮＯＳの発現の増加があることを示した。
組織学的評価を図６０に示す。
図６０は、大腸炎の組織学的特徴に対するデフラミン投与の効果を示す。（Ａ）擬似群（ｎ＝６）、（Ｂ）ＥｔＯＨ群（ｎ＝６）、（Ｃ）ＴＮＢＳ群（ｎ＝８）、（Ｄ）ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．群（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９）、（Ｅ）ＴＮＢＳ＋デフラミンｉ．ｐ．群（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）。
対照試料は、損傷のない正常な結腸、均一な厚さの粘膜、正常な陰窩構造および炎症の徴候を示さなかったが、ＴＮＢＳ処置において、結腸は、スコア３に相当する、陰窩喪失を伴う重度の潰瘍と顕著な好中球浸潤とを伴うより薄い粘膜を示した。
比較すると、デフラミンを投与した動物からの試料は、部分的に無傷の陰窩といくらかの好中球浸潤とを伴うより穏やかな病変を示し、特にｐ．ｏ．投与においてより低い損傷スコア２を示した。
図６１は、ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの結腸組織発現に対するデフラミン投与の効果を示す。（Ａ）−ＣＯＸ−２発現：（１）擬似群、（２）ＴＮＢＳ群、（３）ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．群、（４）ＴＮＢＳ＋デフラミンｉ．ｐ．群；（Ｂ）−ｉＮＯＳ発現：（１）擬似群、（２）ＴＮＢＳ群、（３）ＴＮＢＳ＋デフラミンｐ．ｏ．群、（４）ＴＮＢＳ＋デフラミンｉ．ｐ．群。
図６１は、結腸組織におけるＣＯＸ−２およびｉＮＯＳ発現を示す。結果は、ＴＮＢＳ処置が、残りの陰窩に沿ってＣＯＸ−２およびｉＮＯＳ発現の顕著な増加を誘導したことを示し、これは、対照試料と比較した場合、茶色で示されている。組織学的観察に一致して、デフラミンで処置した動物は、ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの両方について弱い染色を示し、結腸、特にｐ．ｏ．群で炎症過程の減少を示している。
（デフラミン効果は予防的ならびに治療的処置において誘発される）
より良い結果をｐ．ｏ．投与がもたらしたため、本発明者らはさらに、単なる治療的アプローチではなくデフラミンの経口食餌補給による予防的アプローチが同様の効果を示すかどうかを試験した。
表４は、治療（Ｄ−ＴＮＢＳ誘発の３時間後のデフラミンのｐ．ｏ．投与）および予防（Ｄｐ−ＴＮＢＳ投与の３日前のデフラミンのｏ．ｐ．投与）の両方の処置における大腸炎の形態学的および機能的徴候を示す。
疑似およびエタノール群の動物は結腸損傷の肉眼的徴候を示さず、死亡率を示さず、一方ＴＮＢＳ／ＥｔＯＨの結腸内注射は結腸長の非常に有意な（ｐ＜０．０５）減少と、目視できる損傷（潰瘍形成）の程度および下痢の重症度の増加とをもたらし、５０％の死亡率を示した。
結果は、治療的および予防的の両方のデフラミンの投与が、結腸炎症の全体的な軽減をもたらし、結腸の長さの減少を有意に（Ｐ＜０．０５）軽減させ、目視できる損傷（潰瘍形成）の程度を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させたことを示している。また、ＴＮＢＳ群と比較した場合、下痢の重症度、死亡率の有意（Ｐ＜０．０５）な減少および結腸炎症の全般的な組織学的特徴の軽減が観察された。さらに、予防的アプローチと治療的アプローチの間、およびデフラミン治療と対照の両方の間に、有意差（Ｐ＞０．０５）は観察されなかった。
（デフラミンは新鮮結腸組織においてＭＭＰ−9活性を低下させる）
デフラミン処置において観察された抗炎症効果がＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−２阻害によるものであるかどうかを試験するために、異なる実験動物群（治療的および予防的）由来の新鮮な結腸組織におけるこれらの酵素のゼラチン分解活性を、ＤＱ−ゼラチンキットおよびザイモグラフィーアッセイを用いて試験した。図６２は、クエンチ色素ＤＱ−ゼラチン法によって定量された、結腸試料中に存在する総ゼラチン分解活性を示す。
図６２は、大腸炎誘発マウス由来のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の結腸組織ゼラチナーゼ活性に対するデフラミン投与の効果を示す。結腸内に存在するゼラチナーゼのタンパク質分解活性を、ＤＱ蛍光発生法によって定量した。結果は、対照の％としての相対蛍光として表され、少なくとも３回（ｎ＝３）の反復実験の平均値±ＳＤを表す。ＴＮＢＳ群＝Ｃ＋；擬似群＝Ｃ−；Ｄ＝デフラミンでの治療的処置（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９、ｐ．ｏ．）；Ｄｐ＝デフラミンでの予防的処置（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６、ｐ．ｏ．）。＊ｐ＜０．００１対擬似群；＃ｐ＜０．０５対ＴＮＢＳ群；φｐ＜０．０５Ｄ群対Ｄｐ群。
図６２は、対照と比較した場合、ＴＮＢＳがゼラチン分解活性の非常に有意な増加を誘導した（Ｐ＜０．００１）のに対し、ＴＮＢＳ治療と比較した場合、治療的および予防的デフラミン投与の両方が総ＭＭＰ−９＋ＭＭＰ−２活性を有意に低下させた（Ｐ＜０．０５）が、治療的投与と予防的投与との間に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）ことを示す。
結腸組織における総ゼラチン分解活性（すなわちＭＭＰ−９＋ＭＭＰ−２）についての証拠を、２つのゼラチナーゼを区別することなくＤＱ−ゼラチンアッセイが提供することを考慮して、本発明者らはさらに、基質ザイモグラフィーによりそれらの特異性を試験し、ここでＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２は、それらの天然型およびチモーゲン型において、電気泳動によって容易に分割することができる。図６３は、異なる実験群の結腸組織から得られたタンパク質抽出物のザイモグラフィープロファイルの例を示す。白バンドは特定バンドのゼラチン分解活性を示す。
図６３は、大腸炎誘発マウス由来のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の結腸組織ゼラチナーゼ活性に対するデフラミン投与の効果を示す。結腸のＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性のザイモグラフィープロファイルの代表的画像。結腸のタンパク質抽出物を、１％（ｗ／ｖ）ゼラチンと共重合した１２．５％（ｗ／ｖアクリルアミド）ポリアクリルアミドゲルに充填した。ＴＮＢＳ群（ｎ＝１０）；擬似群（ｎ＝６）；Ｄ＝治療的処置においてデフラミンで処置した動物からの結腸（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９、ｐ．ｏ．）およびＤｐ＝予防的処置においてデフラミンで処置した動物からの結腸（１５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９、ｐ．ｏ．）。
ザイモグラフィープロファイルは、活性型のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の活性が低い対照と比較して、ＴＮＢＳが、酵素の天然型およびチモーゲン型の両方において、ＭＭＰ−９活性だけでなくＭＭＰ−２活性もどう増大させたかを示す。しかしながら、デフラミン処置では、ＴＮＢＳ群と比較して、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性（天然型およびチモーゲン型）の明らかな低下があった。
しかしながら、ＭＭＰ阻害の特異性および強度は処置間で異なった。治療的処置ではＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の両方が同様の方法で（そして両方の酵素型で）低下したが、この傾向は予防的アプローチにおいては同じではなく、ＭＭＰ−９はプロＭＭＰ−９よりも明らかにそして視覚的により強く阻害された、それに対してプロＭＭＰ−２は阻害されたが、ＭＭＰ−２は阻害されなかった（図６３）。
（デフラミンは他の急性炎症モデルにも生物活性がある）
図６４は、カラギーナンによって誘発したラット足浮腫発症に対する、浮腫誘発の６時間後のデフラミン投与の効果を示す。カラギーナン（１ｍＬ／ｋｇ；ｎ＝６；ｉ．ｐ．）、インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇ；ｐ．ｏ．；ｎ＝６）、テンポール（３０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝８；ｐ．ｏ．）、またはトロロックス（３０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝８；ｐ．ｏ．）の単回投与の効果と比較した、デフラミン抽出物の単回投与（１５ｍｇ／ｋｇ；ｎ=５；ｐ．ｏ．）の効果。ＳＦ：０．１ｍＬ無菌食塩水（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｎ＝６）の足底下注射、食塩水と共に投与される。データはそれらの標準誤差と共に平均値として提示されている。＊ｐ＜０．００１対ＳＦ群；＃ｐ＜０．００１対カラギーナン群。
図６５は、カラギーナンによる浮腫誘発の６時間後のラットにおける足浮腫に対する局所デフラミン投与の効果を示す。カラギーナンの単回投与（１ｍＬ／ｋｇ；ｎ＝６；ｉ．ｐ．）の効果と比較した、デフラミン抽出物の単回投与（１５ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝３；ｐ．ｏ．）の効果。ＳＦ：０．１ｍＬ無菌食塩水の足底下注射、食塩水と共に投与される（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｎ＝６）。データはそれらの標準誤差と共に平均値として提示されている。＊ｐ＜０．００１対ＳＦ群；＃ｐ＜０．０５対カラギーナン群；φｐ＜０．０１対ＳＦ群。
デフラミンを、それが別の炎症の動物モデルにおいて炎症を軽減させることができるかどうかを確かめるために試験した：カラギーナン誘発性足浮腫、異なる投与も用いて：ｐ．ｏ．、ｉ．ｐ．または局所的に投与される。図６４は、ｐ．ｏ．およびｉ．ｐ．投与条件下の足浮腫に対するデフラミンの効果を示し、図６５は、足体積の増加率％で表される局所投与の結果を示す。カラギーナン群では、両図において足体積％の非常に有意な増加（Ｐ＜０．００１）が観察されたが、抗炎症対照での処置はそれを有意に減少させた（Ｐ＜０．０５）。
結果は、デフラミン処置が、カラギーナン投与後の足体積の増加百分率を減少させたが、局所投与については有意であるのみ（Ｐ＜０．０５）であったことを示しており（図６５）、一方でｉ．ｐ．およびｐ．ｏ．投与（図５８）では、効果はカラギーナン群と有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
（デフラミン消化性）
図６６は、マウスの血液および糞便の逆ザイモグラフィーを示している（それぞれ分画の内および外）。デフラミンを０日（対照）、４日（Ｔ４）および７日（Ｔ７）の間に、ラットに経口投与した。Ｍ：分子量マーカー。
逆ザイモグラフィー（図６６）は、マウスの糞便中にプロテイナーゼ阻害剤（すなわちデフラミン）が存在するが、マウスの血液中には存在しないことを示す。この結果は、図３４に示されるデータによって裏付けられる。図６６でははっきりとは見えないが、この活性は、より長い期間（すなわち７日間）デフラミンを摂取した動物においてより強いことが見出された。
これらの結果は、デフラミンが結腸を通過した後もその生物活性を維持するため、マウスの消化過程を乗り切ったことを示唆している。マウス血中に阻害剤活性は検出されず、デフラミンは血流に入らない可能性があることを示唆している。あるいは、従った方法は、血液試料中のその検出を正当付けるのに十分には感度が高くなかった可能性がある。
マウスによるデフラミンの摂取は、外画分（すなわち結腸）におけるその検出をもたらした。薄弱な証拠は、経口投与されたデフラミンが血流に入らない可能性があることを示唆している。これは、その生物活性を発揮した後、デフラミンがマウスの糞便に排泄されることを意味すると解釈することができる。デフラミンの不在が、それを給餌される動物の血流中に確認されれば、合成ＭＭＰＩについて広く記載されている身体ＭＭＰ全体の非特異的阻害から生じる既知の二次的側面効果を回避するという意味で、これは非常に有利であり得る。デフラミンはマウスの全消化管を通過した後でさえもその生物学的抗ゼラチン分解活性を維持するように思われるという観察によって開かれた見解を強調することは重要であり、これはヒトの健康および栄養におけるその潜在的用途に密接に関連する。
（ＨＴ２９細胞遊走を阻害するＬ． ａｌｂｕｓの能力に及ぼす種子調理の影響）
種子中の多くの熱不安定性生物活性化合物が説明されてきた。しかしながら、大部分の種子は、例えば毒性の熱不安定性ペプチド、タンパク質（例えばレクチン、酵素阻害剤、およびシアン発生植物に存在するグリコシダーゼなどの毒性化合物を放出する酵素）ならびに他の化合物の存在を含む様々な理由で、調理後に摂取される。これらの条件下では、機能性種子中に存在する生物活性化合物は、消化過程を乗り切ることに加えて、多くの場合調理に耐える必要がある。
図６７は、デフラミンのＨＴ２９細胞抗遊走効果を示す。デフラミンまたは調理済み種子および未調理種子由来の可溶性タンパク質抽出物で処置した後のＨＴ２９細胞における創傷閉鎖アッセイの代表的画像。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、細胞をピペットチップで引っ掻くことによって創傷を作った（０時間）。次いで細胞を１００μｇのタンパク質抽出物／ｍＬにばく露し、４８時間後に創傷治癒をモニターした。
図６７は、ＨＴ２９細胞遊走を阻害するＬ．ａｌｂｕｓ種子能力に対する種子調理の効果を、創傷治癒アッセイによって分析する。単離されたデフラミンは、１００μｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＨＴ２９細胞の遊走を完全に阻害した。実際には、このデフラミン濃度は細胞遊走を阻止するだけでなく、さらに固体支持体から細胞を剥離した。総種子タンパク質の抽出物は、細胞遊走も抑制し、この効果は調理済み種子の場合に特に強いことが見出された。この明らかに驚くべき結果は、煮沸によって発揮されるデフラミンおよび他の耐熱性タンパク質に対する濃縮効果によって説明され得る。言い換えれば、種子総可溶性タンパク質１００μｇ中に存在するデフラミンの量は、未調理種子よりも調理済み種子の方が多く、それは単に加熱処理によって多くの種子タンパク質が変性した（したがって不溶性になった）という理由だけである。
デフラミンは、有意なように結腸細胞増殖に影響を及ぼすことなく、低濃度で細胞浸潤ならびにＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性を阻害する強力な能力を示すと結論付けることが可能である。それゆえ、デフラミンは、ＣＲＣにおける抗炎症剤および抗腫瘍剤としての高い可能性を示す。消化過程、煮沸、および低ｐＨ値に対するその高い耐性は、デフラミンを、ヒトの健康および栄養における栄養補助食品として使用するための優れた候補にする。その生物活性は、調理済み総種子抽出物においても同様に強力であり、ルーピンを優れた機能性食品にする観察は、定評のある地中海料理のまた別の大きな恩恵として、世界中で導入される予定であり−２０１０年１１月１６日にユネスコの政府間委員会によって人類の無形文化遺産の代表的一覧に含まれた。
（ルナシンのアミノ酸残基配列およびそれらのデフラミン前駆体）
上記に提示されたデータは、デフラミン調製物中のβ−コングルチンおよびδ−コングルチン−２大鎖フラグメントの両方の存在を示す。したがって、β−コングルチンおよびδ−コングルチン−２大鎖は、デフラミン前駆体と見なすことができる。
ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）ツールを使用して、ダイズの４３アミノ酸残基ルナシンと、そのポリペプチドがデフラミンの成分として同定されたタンパク質、すなわちβ−コングルチンのフラグメントおよびδ−コングルチンの重鎖間のアミノ酸残基配列における可能性のある類似性をチェックした。
適切な場合には、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｍｐ／１ｗｅｅｋ／ｂｌａｓｔｆ２９７２０．ｈｔｍｌで入手可能なＥｘＰＡＳｙ ＢＬＡＳＴツールも使用した。
デフラミンはβ−コングルチンとδ−コングルチンの混合物＜１０ｋＤａフラグメントを含むようであるという上記の観察に基づいて、ＢＬＡＳＴ分析において利用される問い合わせ配列および主題配列は、ルナシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（配列番号１９１）、β−コングルチン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）（配列番号１９２）、δ−コングルチン−２大鎖（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ）（配列番号１９３）およびδ−コングルチン（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）（配列番号１９４）に示される通りであった。
タンパク質データベースに存在する全てのエントリーと比較すると、ルナシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）アミノ酸残基配列は、Ｇ．ｍａｘ ２Ｓアルブミンに対して非常に強い相同性（９５％超）を示す。これは、適切なＢＬＡＳＴ分析によって明確に例示された。
ルナシンのアミノ酸残基配列とデフラミン前駆体のアミノ酸残基配列との比較も行った。ルナシンとＬ． ａｌｂｕｓからのコングルチンベータ前駆体との間、ならびにルナシン対コングルチンデルタ−２大鎖間にアミノ酸残基配列相同性は見られなかった。
ルナシンのアミノ酸配列とＬ．ａｌｂｕｓ由来のδ−コングルチンの軽鎖に対応するフラグメントとの間にはかなりの相同性があった。
４３アミノ酸残基のルナシンに沿って、残基２１〜４５を含むＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ δ−コングルチンの領域に対して４８％の相同性（２５のうち１２の残基）を示す２５アミノ酸のストレッチがある。
ルナシンのアミノ酸配列は、デフラミン前駆体、すなわちβ−コングルチンおよびδ−コングルチン−２大鎖のアミノ酸配列と相同性を示さないと結論付けることが可能である。
配列番号１９５は、ルナシンが、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓδ−コングルチン小鎖内の対応する領域に対して４８％の相同性を示すが、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓコングルチンデルタ−２大鎖に対しては示さないアミノ酸配列である２５の長い領域を含むことを確認する。しかしながら、この観察はＨｅｒｒｅｒａ（２００９）によって報告された結果と矛盾している。
配列番号１９５は、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓδ−コングルチン（受入番号Ｑ３３３Ｋ７；黒、橙色および赤）と、２つのポリペプチド：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘルナシン（受入番号ＡＦ００５０３０；緑）およびＬｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓコングルチンデルタ−２大鎖（受入番号Ｐ０９９３１；青）との配列の一致を示す。
異なるアミノ酸残基配列に加えて、ルナシンとデフラミンとの間のもう１つの大きな違いは、それらが消化タンパク質分解を受けやすいことに関係している。デフラミンは消化過程に抵抗するが、ルナシンはそうではない（Ｃｒｕｚ−Ｈｕｅｒｔａら、２０１５）。さらに、デフラミンとは異なり、ルナシンの抽出および精製はスケールアッププロセスを経るのに不適切であり、この生物活性ペプチドを大量生産には不適切にする。
（Ｌ． ａｌｂｕｓ以外の種子からのデフラミン−Ｉ）
デフラミンはルピナス以外の種子に存在することがわかった。図６８は、Ｌ．ａｌｂｕｓ、Ｃ．ａｌｉｅｔｉｎｕｍおよびＧ．ｍａｘからのいくつかの濃度の総可溶性タンパク質抽出物によってＨＴ２９細胞遊走に及ぼされる阻害効果を示す。結果は、分析した種子における細胞遊走阻害活性の存在を示している。
図６８は、創傷治癒アッセイによって評価されたＨＴ２９細胞遊走の代表的画像を示す。細胞を８０％コンフルエントに達するまで増殖させ、単層をピペットチップで引っ掻いた（０時間）。ＨＴ２９細胞を緩衝液（対照）に４８時間ばく露した後に細胞遊走を測定し、いくつかの濃度の総可溶性タンパク質をＬ．ａｌｂｕｓ、Ｃ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧ．ｍａｘの種子から抽出した。
続いて、デフラミンを、Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンについて図４に記載した手順に従い、Ｌ．ａｌｂｕｓ、Ｃ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧ．ｍａｘの種子から精製および単離した。Ｌ．ａｌｂｕｓ（デフラミンＬａと呼ぶ）、Ｇ．ｍａｘ（デフラミンＧｍと呼ぶ）およびＣ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（デフラミンＣａと呼ぶ）由来のデフラミンのポリペプチドプロファイルを図６９に示す。
図７０、７１および７２に示される結果は、Ｌ．ａｌｂｕｓ（デフラミンＬａ）、Ｇ．ｍａｘ（デフラミンＧｍ）およびＣ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（デフラミンＣａ）からそれぞれ単離されたデフラミンの、ＤＱゼラチンアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した抗ゼラチン分解活性、創傷治癒アッセイにより測定したＨＴ２９細胞遊走に対する阻害活性、およびＭＭＴ法によりアッセイしたＨＴ２９細胞増殖を比較する。
図７０〜７２に示されるデータは、ダイズおよびヒヨコマメからのデフラミンもｉｎ ｖｉｔｒｏのＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２ゼラチナーゼならびにＨＴ２９細胞遊走を阻害するが、ＨＴ２９細胞増殖に有意な程度には影響を及ぼさないことを明らかにしており、ルーピンからのデフラミンについて得られた結果と一致している。しかしながら、ルーピンからのデフラミンは、ダイズまたはヒヨコマメからのものよりも強力なようである。人々は通常、食事あたりにルーピンよりも多量のヒヨコマメまたはダイズを摂取するため、この最後の観察は上記の地中海料理が関心としていることには関係がないかもしれない。
（提示された結果の選択された局所に関する簡単な説明）
デフラミンは経口補給を介して大腸炎損傷を軽減する、新規消化抵抗性ゼラチナーゼ阻害剤である。ＭＭＰ−９阻害剤（ＭＭＰＩ）は、主に原発腫瘍および転移抑制剤のための抗血管新生剤と見なされているが、それらはまた、大腸炎および他の炎症性腸疾患などの前がん状態を効果的に阻害することが実証されている。３０年以上に渡り、ＭＭＰは世界中の研究者によって、炎症と同様にがんに対する魅力的な治療標的と考えられてきた。結果として、無数のＭＭＰＩがすでに合成されており、そのうちのいくつかは潜在的な治療薬として使用されてきた（Ｂｏｕｒｇｕｅｔら、２０１２）。しかしながら、臨床試験段階に入った低分子ＭＭＰＩはごく少数であり、そのほとんどは、有益性の欠如または強い有害副作用のいずれかのために、時期尚早に終了した（Ｗａｎｇら、２０１２）。理想的には、特定のＭＭＰ−９阻害剤を栄養補助食品として炎症性腸疾患（ＩＢＤ）治療にうまく利用するためには、それは血清バイオアベイラビリティではなく結腸アベイラブルであり、消化過程に対して抵抗性があり、結腸細胞にも無毒である必要がある。本明細書に提示された結果は、デフラミンが消化過程を乗り切り、ＴＮＢＳ誘発性大腸炎によって引き起こされる病変を軽減することができ、結腸炎症のいくつかの機能的および組織学的マーカーの減少、すなわち：結腸長減少の軽減、目に見える損傷（潰瘍形成）の程度の減少、下痢の重症度の減少、死亡率の減少、粘膜出血の減少、および結腸炎症の全体的な組織学的特徴の減少をもたらすことを明確に示す。さらに、この効果はｉ．ｐ．治療と同様にｐ．ｏ．治療で明白であり、食事療法のその潜在的な使用を裏付ける。実際、経口投与で得られた全体的な結果は、デフラミンが消化に対して抵抗性であるだけでなく、おそらくｉｎ ｓｉｔｕでより効果的に作用することにより、それがｉ．ｐ．治療よりも大腸炎損傷の軽減に効果的であることを示唆している。興味深いことに、より長期にわたるデフラミンの食事投与による予防的アプローチでは、治療的アプローチと著しくは異ならず、デフラミンをＴＮＢＳ誘発の３時間後にのみ投与した。これは、それが効果的かつ迅速な方法で炎症抑制剤として作用することができることを示唆しており、急性の状況ならびに慢性炎症の両方における栄養補助食品としての潜在的な使用を示唆している。
デフラミンの経口投与は、炎症性シグナル伝達カスケードに関与する炎症性マーカーの発現を減少させる。
組織学的分析およびいくつかの重要な炎症マーカーの発現も、デフラミンの抗炎症効果を裏付けていた。実験的大腸炎研究の動物からの結腸において行われた本発明者らの免疫染色アッセイは、疑似炎症動物と比較して、結腸炎症の誘導がＣＯＸ−２の発現の増加をもたらしたことを示し、これは、ＩＢＤ患者の腸炎の進行におけるＣＯＸ−２およびプロスタグランジンの重要な役割を実証した臨床的および疫学的研究に一致している（Ｏｇａｓａｗａｒａら、２００７；Ｃｈｅｎら、２０１４）。デフラミンの投与はＣＯＸ−２の染色の低減をもたらし、これは損傷腸組織におけるＣＯＸ−２の発現を損なったことを示している。
また、特に腸において、一酸化窒素の産生のアップレギュレーションが観察された。この化合物は、炎症を起こしていない腸よりも炎症を起こした腸ではるかに大量に局所的に産生および放出されると報告されており、ＩＢＤ患者の診断およびモニタリング用の新規臨床バイオマーカーとして示唆されている（Ｌｅｅら、２０１３）。ＣＯＸ−２と同様に、実験的大腸炎研究における免疫染色アッセイは、大腸炎誘発を受けた動物において実際にｉＮＯＳの発現の増加があることを示した。また、特にｐ．ｏ．によるデフラミン投与は、ｉＮＯＳ発現を減少させることができ、それ故、結腸における炎症過程の軽減に寄与する。
（デフラミンはｉｎ ｖｉｖｏでＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２を阻害する）
現在、デフラミンはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて結腸細胞中のＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２を阻害し、それは熱および酸変性に対して抵抗性であることが実証されており、ＩＢＤおよび結腸がん用の栄養補助食品になるための良い候補とされている。しかしながら、消化後の有効性をさらに測定し、栄養補助食品としてのその可能性を裏付けるために、ｉｎ ｖｉｖｏ試験が必要とされた。この点において、全体的な生理学的および形態学的結果は、デフラミンがＴＮＢＳ群で観察されたＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２活性の大腸炎誘発性上昇を実際に抑制し、それらを対照で観察されたものに近い活性強度に平準化できることを裏付けることができた。
興味深いことに、予防的処置と治療的処置との間に形態学的および機能的な差は観察されなかったが、ザイモグラフィーアッセイでは、両方の酵素における特異的阻害の間に有意な差があった。治療的処置では、デフラミンはＴＮＢＳによって強く誘導された２つのゼラチナーゼに直接作用するようである一方で、予防的処置では、ＭＭＰ−９の活性型およびプロＭＭＰ−２の特異的阻害が観察されたが、プロＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−２の活性型の阻害は観察されなかった。ＭＭＰは通常、チモーゲン（プロＭＭＰ）として合成され、それらの触媒活性はシステインスイッチによって阻害され、限定されたタンパク質分解によるその除去によってのみ活性化される。ザイモグラフィーアッセイでは、プロゼラチナーゼもまたＳＤＳにより変性されているため活性になり、したがって触媒部位（したがって、それらはシステインスイッチの短いアミノ酸配列を依然として維持するため、ザイモグラフィーゲル中のわずかに高い質量のプロ酵素）を露出させる。ＭＭＰ−９の活性型のみがデフラミンによって阻害されるという事実は、それがこの型に対して、おそらく活性型でのみ露出される触媒部位に対して、ある程度の特異性を示すことを示唆する。
一方、プロＭＭＰ２は阻害されるが、ＭＭＰ２は阻害されないようである。ＭＭＰ−２はＭＭＰ−９を活性化するプロテアーゼの１つであるため、より長期にわたるデフラミンへのばく露において、ＭＭＰ−９の高い阻害は、フィードバックを通して、ＭＭＰ−２のより高い活性化を誘導してＭＭＰ−９を活性化することがもっともらしく思われる。
デフラミンへのより長期間のばく露は、ゼラチナーゼの合成および活性化におけるより重大な効果を示唆するように思われるが、結果は、治療的アプローチにおけるその投与が予防的投与様式と同じくらい効果的に大腸炎損傷を減らすことにおいて有効であることを示唆する。臨床試験で使用されている広範囲のＭＭＰＩの大部分とは対照的に、ＭＭＰ−９に対するより高い特異性は、それが低い副作用を保証するため、それでもなお重要である。
（デフラミンは他のモデルの炎症も減らす）
抗炎症薬としてのその範囲を明らかにするために、本発明者らは、デフラミンが足浮腫における炎症を軽減することができるかどうかをさらに試験した。足体積の％がｉ．ｐ．投与とｐ．ｏ．投与の両方で減少したが、それらは統計的に有意ではなく、血流のデフラミンの吸収と分布は両方の投与において限られていることを示唆している。しかしながら、デフラミンの局所投与において観察された有意な有効性は、ｉｎ ｓｉｔｕで投与されたときにその効果がより高いことを裏付ける。それは、デフラミンが皮膚を通して吸収され得ることも示唆している。ＭＭＰ−９と皮膚がん疾患との関係を考慮すると（Ｐｈｉｌｉｐｓら、２０１１）、本発明者らの結果は、デフラミン臨床応用のための新規の可能性を開くものである。
（結論−１）
マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の強力な阻害剤として、強力な抗炎症活性を示すデフラミンは、食用で本質的にタンパク質性であり、消化過程を乗り切り、炎症ならびにそれらに由来する任意の疾患の予防／治療における栄養補助食品または機能性食品として使用され得る新規タイプのＭＭＰＩを代表する。デフラミンは、経口、静脈内または局所投与に有効であるため、非常に幅広い疾患の予防または治療における栄養補助食品または機能性食品として有用であることが証明されている。
Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンは、β−コングルチンおよびδ−コングルチン大鎖フラグメントの混合物である。
デフラミン中のβ−コングルチンおよびδ−コングルチンのフラグメントの存在はかなり興味深い。β−コングルチンはジスルフィド架橋を含まない三量体タンパク質であり、そのモノマーは、グリコシル化されているかまたはされておらず、１６〜７０ｋＤａ超に及ぶが、多数のタンパク質分解プロセシング部位が多量の７Ｓタンパク質サブユニットを生じさせることが観察される非常に多数のポリペプチドからなる。その完全な分解後発芽は、β−コングルチンの貯蔵機能を強く支持する。興味深いことに、このタンパク質の別のフラグメントは真菌に対するその強力な生物活性で知られている：Ｂｌａｄ、レクチン様活性を示す２０ｋＤａの豊富な一過性β−コングルチン由来ポリペプチド鎖。反応性が高く、生物活性のあるクピンドメインが存在するため、まだ発見されていない特定の未知の活性を有するβ−コングルチンの他のフラグメントが存在する可能性がある。しかしながら、以前の研究は、デフラミンが抗真菌活性も殺菌活性も持たず（結果は示されていない）、デフラミンフラグメントの配列がＢｌａｄのそれと一致しないことを明らかにした。
δ−コングルチンは２Ｓ硫黄に富むアルブミンファミリーに属し、これもまたルピナスにおいて特定の未知の生物活性を有する可能性がある。δ−コングルチンとも呼ばれるルピナス種子２Ｓアルブミンは、２つの鎖間ジスルフィド結合によって連結された以下の２つの低分子ポリペプチド鎖を含む単量体タンパク質である：４．４ｋＤａの分子量となる３７アミノ酸残基からなるより小さなポリペプチド鎖、および８．８ｋＤａの分子量を有する７５アミノ酸残基を含むより大きなポリペプチド鎖。この後者の、より大きいポリペプチド鎖は、特にピーク３において、デフラミンについて得られたポリペプチドプロファイルのいくつかといくらか類似している（図４４〜４６を参照）。より大きなポリペプチド鎖は、２つの鎖内ジスルフィド架橋および１つの遊離スルフヒドリル基を含む。これは、デフラミンのＲ−とＮＲ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥとの間で検出された見かけの分子量のわずかな違いを暫定的に説明することができた（図４３を参照）。このタンパク質は、Ｌ．ａｌｂｕｓからのタンパク質の中でも、特異的で固有な独特の特徴を示す：その高いシステイン含有量に加えて、それは２８０ｎｍで低い吸光度を示す。
δ−コングルチンの生理学的役割に関する限り、このクラスのタンパク質について貯蔵機能が提案されている。しかしながら、二官能性トリプシン／アミラーゼ阻害剤を含む植物穀物阻害剤ファミリーとの構造的類似性は、その貯蔵役割に加えてこのタンパク質に対する防御機能を示唆し、ＭＭＰＩとしてのその役割を裏付けるかもしれない。δ−コングルチン中の遊離スルフヒドリル基の存在は、ＭＭＰ中のＺｎ２＋活性部位に対する高い親和性に関連する可能性があり、その阻害様式を説明し得る。実際、これらのコングルチンを単離するための１つの方法はＺｎ沈殿によるものである。さらに、Ｌ．ａｌｂｕｓ種子中のその存在は、種子重量の約３〜４％であると評価され、これは上記で得られた収量と一致する。また、ルピナス種子２Ｓアルブミンは、典型的にはアルブミン画分とグロブリン画分の両方に存在し、したがって２つのタンパク質画分中のＭＭＰ阻害活性について以前に得られた結果を説明している（Ｌｉｍａら、２０１６）。
デフラミンのＨＰＬＣピーク１および４（図４４〜４６）は、β−コングルチンフラグメントのみによって構成されており、低レベルではあるが依然としてＭＭＰＩ活性を示した。したがって、最も高い活性は、β−およびδ−コングルチン両方のタンパク質のフラグメントを含む特定の混合物に起因し得ると思われ、もっぱらβ−コングルチンだけに起因するわけではないと思われる。δ−コングルチンの大きなポリペプチド鎖のみがデフラミンに存在することがわかったという事実は、その３つのスルフヒドリル基がＭＭＰまたはβ−コングルチンフラグメントと自由に相互作用することができ（これは、デフラミンを含む明らかに３つのマイナー高分子量バンドの群の存在を説明することができる）、この複合体が最も高い活性を保持していることを示唆し得る。あるいは、δ−コングルチンのより小さなポリペプチド鎖がデフラミンに存在し得る。
（結論−２）
過去１０年間で、ＭＭＰＩを含む新規植物性食品の発見に向けてかなりの量の研究が向けられてきたが、デフラミンの、単離することが容易であり、高いＭＭＰ−９阻害活性を示すという見込みを提示するものは、あるとしてもわずかであった。好ましい実施形態では、デフラミンは、２つの特定のタンパク質前駆体：δ−およびβ−コングルチンからの可溶性フラグメントの複雑な混合物として特徴付けられている。全体として、このポリペプチド混合物は水に非常に溶けやすいことが示された；その生物活性は、煮沸、低ｐＨ値およびおそらく消化プロテアーゼに耐性がある；それはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−９および／またはＭＭＰ−２を強く阻害する、すなわちそれは低濃度で用量依存的にＭＭＰ阻害剤（ＭＭＰＩ）であり、それは細胞毒性を及ぼすことなく、ヒト結腸腺がん細胞株ＨＴ２９の浸潤能力を減少させる。これらのデータは、動物モデルを用いて行われた一連の前臨床によって強く支持された。これらの特徴は、デフラミンを、腫瘍形成および細胞浸潤、ならびにそれらに由来する任意の疾患の予防／治療における栄養補助食品として、または機能性食品の成分として使用することができる新規タイプのＭＭＰＩにする。マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の強力な阻害剤として、デフラミンは、ＭＭＰ−９活性に関連する非常に広範な疾患の予防および治療における栄養補助食品または機能性食品として有用であることが証明されている。経口投与されたときのその有効性および消化過程を乗り切るその能力は、それが合成ＭＭＰＩを特徴付ける有害な副作用を及ぼすことなく結腸内で効率的に作用することを示唆し、デフラミンを、結腸直腸がんの予防および治療に用いられる優れた候補とする。
（結論−３）
デフラミンは以下を示す：
−デフラミンは用量依存的に強力なゼラチン分解活性を示す；
−デフラミンは用量依存的に結腸がん細胞浸潤の強力な阻害を示す；
−高デフラミン濃度は結腸がん細胞を固体表面から引き離す；
−デフラミンは１００μｇ．ｍＬ−１の濃度であっても、結腸がん細胞に有意な細胞毒性作用を誘発しないようである；
−デフラミンは細胞増殖の有意な減少も生細胞数の減少も引き起こさない。
１つ以上のさらなる実施形態では、デフラミンは、ルーピン種子貯蔵タンパク質に課されるｉｎ ｖｉｔｒｏの厳しい処置の結果として、それ自体の精製および単離の間に実際に産生されるかまたは改良され得、これはオリゴマー構造を分解し、限られたタンパク質分解によってポリペプチドを切断し、もはや水溶性ではない最も折り畳まれていないポリペプチドを除去する。他のポリペプチドが放出され、デフラミンの一部になる可能性がある。言い換えれば、異なるタンパク質前駆体に由来するフラグメントであるポリペプチドの混合物からなると思われるデフラミンが、貯蔵タンパク質の抽出およびそれらの部分変性／タンパク質分解の後にｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されることが可能である。
（他の種からの種子におけるデフラミンの存在−ＩＩ）
他の種由来の種子中のデフラミンの存在の同定のために、異なる食用種子由来の可溶性タンパク質の逆ザイモグラフィーを行った（図７３）。
図７３は、ゼラチンならびにＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２を含有する１ｍＬのＨＴ−２９培地を用いて、１２．５％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で行った逆ザイモグラフィーの代表的画像を示す。各ウェルには、異なる種子種からの総抽出物の５０μｇのタンパク質を充填した。マメ科：Ｖ．ａ−Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ（アズキ）；Ｖ．ｒ−Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ（ヤエナリ）；Ｖ．ｍ−Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ（ウラドマメ）；Ｌ．ｍ−Ｌｕｐｉｎｕｓ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ（アンデスのルピナス）。穀物：Ｔ．ａ−Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通コムギ）；Ａ．ｓ−Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（エンバク）；Ｐ．ｇ．−Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ（キビ）；Ｔ．ｔ−Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ． ｔｕｒａｎｉｃｕｍ（カムットコムギ）。その他の双子葉植物：Ｃ．ｑ−Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ（キノア）、Ｈ．ａ−Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ（ヒマワリ）；Ｐ．ｄ−Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ（アーモンド）；Ｃ−Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ種（カボチャ）；Ｆ．ｔ−Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ（ソバ）；Ｓ．ｈ−Ｓａｌｖｉａ ｈｉｓｐａｎｉｃａ（チア）。矢印はデフラミンの存在を示す。
試験された他の種の中でも、およびデフラミンについて最初に評価された種（すなわちＬ．ａｌｂｕｓ、Ｃ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍおよびＧ．ｍａｘ）に加えて、Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ（ウラドマメ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ｍｕｔａｂｉｌｉｓおよびＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒａｎｉｃｕｍからの種子のみがデフラミンに類似のバンドを示した。それ故、他のマメ科の種、特にルピナス属のもの、およびコムギ属のものもさらに分析した。
（ルピナス属の他の種の種子におけるデフラミンの存在）
以下のルピナス種からの種子を、デフラミンの存在について分析した：
− Ｌ．ａｌｂｕｓ
− Ｌ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓ
− Ｌ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ
− Ｌ．ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ
− Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ
− Ｌ．ｌｕｔｅｕｓ
逆ザイモグラフィーゲルを以下の図７４に示す。図Ｈでは見づらいが、分析された全てのルピナス種はデフラミンを含むことが示された。
図７４は、ゼラチンならびにＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２を含有する１ｍＬのＨＴ−２９培地を用いて、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上で行った逆ザイモグラフィーを示す。各ウェルに、異なる種子種の総抽出物５０μｇを充填した：Ｌ．ａｌｂｕｓ；Ｌ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓ；Ｌ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ；Ｌ．ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ；Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ；ｅ Ｌ．ｌｕｔｅｕｓ。
（Ｌ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓの種子からのデフラミンの単離）
図７５は、デフラミン単離方法を用いた、１２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下でのデフラミンの潜在的相同体の代表的なポリペプチドプロファイルを示す。ウェルに、Ｌ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓから精製した１００μｇのタンパク質を充填した。
（他のマメ科種からの種子中のデフラミンの存在）
Ｖｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ（ウラドマメ）の種子からのデフラミンの精製は、ルピナス種からのものとはかなり異なるポリペプチドのパターンを生じた（図７６）。
図７６は、デフラミン単離方法を用いた、１２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲル中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下でのデフラミンの潜在的ホモログの代表的なポリペプチドプロファイルを示す。ウェルにＶｉｇｎａ ｍｕｎｇｏから精製した１００μｇのタンパク質を充填した。
（コムギ属の種の種子からのデフラミンの単離）
以下のコムギ種を、デフラミンの存在について分析した：
− Ｔ．ｓｐｅｌｔａ（スペルト）
− Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ）
− Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通コムギ）
− Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ． ｔｕｒａｎｉｃｕｍ（カムット）
逆ザイモグラフィーゲルを以下の図７７に示す。逆ザイモグラフィーは、以下の種におけるＭＭＰ−９阻害バンドの存在を示した：
− Ｔ．ｓｐｅｌｔａ
− Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ
− Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ＊、
ならびにおそらくほとんどの他の古来のコムギ種および品種、しかし一見したところ、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍにはない。
＊カムットとして商業的に知られているコーラサンコムギまたはオリエンタルコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ種ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒａｎｉｃｕｍとも呼ばれる）は、四倍体コムギ種である。Ｔ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍとして時々見られる識別は、正しくないようである。ＤＮＡフィンガープリント法による最新の遺伝学的証拠は、その品種がＴ．ｄｕｒｕｍとＴ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍとの天然の雑種に由来し得ることを示唆している。
図７７は、ゼラチンならびにＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２を含有する１ｍＬのＨＴ−２９培地を用いて１２．５％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドゲル上で行われた逆ザイモグラフィーを示している。各ウェルに、異なる種子種からの総抽出物中の５０μｇのタンパク質を充填した：Ｔ．ｓｐｅｌｔａ（スペルト）；Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギ）；Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（普通コムギ）；およびＴ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ（カムット）。
次いで、これらの種（すなわち、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ、およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ）の種子からのデフラミンの単離を実施した。結果を以下の図７８に表す。
図７８は、デフラミン単離方法を用いた、１２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）緩衝液中のデフラミンの潜在的相同体の代表的なポリペプチドプロファイルを示す。ウェルに１００μｇのタンパク質を充填した。レーン１−Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ（カムット）；レーン２−Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ；レーン３−Ｔ．ｓｐｅｌｔａ。
（デフラミン構造に関するさらなる研究）
特定の形態では、デフラミンはポリペプチドの複雑な混合物から構成され、これはＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓの場合には、β−およびδ−コングルチンの両方に由来するように思われる。一実施形態では、デフラミンをＬ．ａｌｂｕｓから単離し、２次元電気泳動（変性、還元条件下で実施した２次元；図７９）にかけ、主要スポットをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定した。驚くべきことに、分析されたスポットは、全てβ−およびδ−コングルチンに由来する同じポリペプチドを含む。
（Ｌ． ａｌｂｕｓデフラミン＆β−コングルチン前駆体ドメイン）
β−コングルチン前駆体５３１−アミノ酸残基配列（６１．９３１３９ｋＤａ）。Ｂｌａｄ１７３アミノ酸残基配列（２０．４０８９５ｋＤａ）が示されている
（Ｌ．ａｌｂｕｓデフラミンおよびδ−コングルチン前駆体ドメイン）
（コングルチンデルタタンパク質前駆体）
デフラミンは、より長いβ−コングルチンポリペプチドも含み得る。実際、ＭＳ／ＭＳ分析中に、そのようなデフラミンポリペプチドはフラグメント化され、これらのフラグメントのいくつかは失われ、図７９に示される同定されたβ−コングルチンペプチドのパターンをもたらす。一方のペプチド群は１３ｋＤＡの分子量に相当し、他方の群は１７ｋＤａに相当する。
（結論）
デフラミンの存在は、ルピナス属（Ｌ．ａｌｂｕｓ、Ｌ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｌ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ、Ｌ．ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ、Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓおよびＬ．ｌｕｔｅｕｓ）、他のマメ科属からの種（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＶｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ）、ならびに非マメ科種子由来の種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、およびおそらくほとんどの他の古来のコムギ種および品種）からの種を含む、かなりの数の種子において検出された。
デフラミンの存在は、マメ科植物（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓおよびＶｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）および非マメ科植物（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ、Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ、Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ種、Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍおよびＳａｌｖｉａ ｈｉｓｐａｎｉｃａ）の両方のいくつかの種からの種子では検出されなかった。
種子中にデフラミンが存在することに関して特に関連性のあるものは、ルピナス属およびコムギ属であるが、他のいくつかのマメ科種はそれらの種子にかなりのデフラミン生物活性を含むように思われる。
配列表

Claims (17)

  1. 療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するためのデフラミンポリペプチド組成物であって、前記治療が、好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである、組成物。
  2. 前記組成物が、下記の通りである配列を各々が含む１〜１００個の異なるポリペプチドを含む、請求項１に記載の使用のためのデフラミンポリペプチド組成物：
    （ａ）必要に応じてコングルチンタンパク質であるタンパク質の一部であって、前記一部が少なくとも５、１０、２０、３０もしくは５０アミノ酸長であるタンパク質の一部、および／または
    （ｂ）好ましくは前記一部と少なくとも７０％の同一性を有する、（ａ）で定義された一部の相同体、
    ここで前記タンパク質は必要に応じてコングルチンベータまたはコングルチンデルタであり；前記コングルチンタンパク質は必要に応じてコングルチンベータ１、２、３、４、５、６もしくは７であるか、またはコングルチンデルタ２タンパク質であり、
    前記組成物は必要に応じて、いかなる他のポリペプチドも含まない。
  3. 以下を含む、請求項１または２に記載の使用のためのデフラミン組成物：
    （ａ）１０〜２００アミノ酸長を有する少なくとも１〜１００個のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが必要に応じて請求項２に定義される通りであるポリペプチド、および／または
    （ｂ）必要に応じてコングルチン配列である配列の再配列により誘導される配列を含む１０〜２００アミノ酸長を有する少なくとも１〜１００個のポリペプチド。
  4. 植物原料からの抽出または組み換え発現によって得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのデフラミン組成物。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのデフラミン組成物であって：
    −前記ポリペプチドのいずれかが植物種子タンパク質の配列を含むかまたは植物種子タンパク質と少なくとも７０％の同一性を有し、ここで前記植物は必要に応じてルピナス属、ヒヨコマメ属またはダイズ属（好ましくはＬ．ａｌｂｕｓ、Ｌ．ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｌ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ、Ｌ．ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ、Ｌ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ、Ｌ．ｌｕｔｅｕｓ、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍまたはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）であり、および前記タンパク質が必要に応じてコングルチンタンパク質である；ならびに／または
    −前記ポリペプチドのいずれかが植物種子タンパク質の配列を含むか、または植物種子タンパク質と少なくとも７０％の同一性を有し、ここで前記植物が必要に応じてコムギ属またはササゲ属（好ましくはＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｄｕｒｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｖａｒ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍまたはＶｉｇｎａ ｍｕｎｇｏ）であり、前記タンパク質が必要に応じてコングルチンタンパク質である、組成物。
  6. 前記組成物が１〜１００個の異なるポリペプチドを含み、その各々が下記の通りである配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのデフラミン組成物：
    （ａ）配列番号８〜１９０のいずれか１つと同じか、もしくは少なくとも５、１０、２０もしくは５０アミノ酸長である配列番号８〜１９０のいずれかの一部である、および／または
    （ｂ）好ましくは（ａ）と少なくとも７０％の同一性を有する、（ａ）で定義された配列の相同体、
    ここで前記組成物は必要に応じて、いかなる他のポリペプチドも含まない。
  7. 以下を含む、適切な種子からのデフラミンの抽出方法：
    −高温、好ましくは少なくとも８０℃での、または煮沸させる少なくとも１つの工程；および
    −低ｐＨ、好ましくはｐＨ４以下での少なくとも１つの工程；
    −前記抽出物を高エタノール濃度、好ましくは少なくとも３０％、４０％、７０％または少なくとも９０％ｖ／ｖエタノールと接触させる少なくとも１つの工程；
    ここで好ましくは、前記方法は以下を含む：
    （ａ）無傷の種子を水中で煮沸した後、水中もしくは緩衝液中で抽出し、脂肪を除去する工程、または
    無傷の種子を粉にし、水中もしくは緩衝液中で抽出した後、脂肪を除去して煮沸させる工程、または
    前記粉から脂肪を除去した後、水中もしくは緩衝液中で抽出して煮沸させる工程、
    （ｂ）前記可溶性画分を十分に低いｐＨ値（例えばｐＨ４．０以下）にさらし、残渣タンパク質／ポリペプチドの大部分を沈殿させる工程、
    （ｃ）前記沈殿画分を３０％〜５０％（ｖ／ｖ）のエタノール、好ましくは約４０％（ｖ／ｖ）のエタノールに、場合によっては０．４ＭのＮａＣｌも含む溶液に再懸濁し、デフラミンを含有する上清を得る工程、
    ならびに必要に応じて以下の工程を実施する：
    （ｄ）前記可溶性画分を９０％（ｖ／ｖ）エタノールにしてデフラミンを沈殿させ、必要に応じて−５℃〜−３０℃、好ましくは−２０℃で保存する工程、または
    凍結乾燥などの他の手段によって前記デフラミンを沈殿させる工程、
    （ｅ）工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返すことにより、前記沈殿デフラミンを混入物質から除去する工程、
    （ｆ）前記沈殿デフラミンを、例えば、水に溶解させ、脱塩する工程。
  8. 以下を含む、必要に応じて請求項７に従属する適切な種子からデフラミンを抽出する方法：
    ・前記種子からの粉を提供する工程；
    ・前記粉を脱脂する工程；
    ・前記脱脂工程からの残渣試料を一定期間煮沸する工程；
    ・前記試料を一定期間遠心分離する工程；
    ・その後、得られたペレットを廃棄し、得られた上清をさらに処理して、そのｐＨを下げながらポリペプチドを沈殿させる工程；
    ・さらに遠心分離してさらなるペレットを得て；前記上清を捨てる工程；ならびに
    ・前記さらなるペレットをエタノールでさらに処理し、遠心分離してさらなるペレットを得て、それを廃棄する工程；その残渣上清はデフラミンを含む。
  9. 前記残渣上清にエタノールを添加し、デフラミンの沈殿を可能にする期間保存し、さらに遠心分離してデフラミンペレットを得る工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. １回以上のさらなるエタノール沈殿の工程をさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記種子が、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ種子、Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍもしくはＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘであり、および／または前記種子が調理されている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ポリペプチド（単数または複数）をコードする１つ以上の核酸から１つ以上のデフラミンポリペプチドを発現させる工程、および前記ポリペプチド（単数または複数）を精製する工程を含むデフラミンの製造方法であって、前記発現が好ましくは細胞内である方法。
  13. 療法による前記ヒトまたは動物の身体の治療方法に使用するためのデフラミン組成物を一緒にまたは個々に発現する１つ以上の核酸ベクターであって、前記治療が好ましくは炎症もしくはがんの予防もしくは治療、または栄養補助食品の提供であり、前記デフラミン組成物が、請求項１〜６のいずれか一項に定義された通りである、ベクター。
  14. 療法による前記ヒトまたは動物の身体の治療方法において同時に、別々にまたは連続して使用するためのデフラミン組成物を一緒に形成する、請求項２〜６のいずれか一項で定義したように多数の異なるポリペプチドを含む製品であって、前記療法が好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである、製品。
  15. 療法による前記ヒトまたは動物の身体の治療方法において同時に、別々にまたは連続して使用するためのデフラミン組成物を一緒に発現する多数の核酸ベクターを含む製品であって、前記療法が好ましくは炎症もしくはがんを予防もしくは治療することであるか、または栄養補助食品を提供することである、製品。
  16. 以下の通りである組成物：
    −請求項１〜６のいずれか一項に記載の、もしくは請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得られるデフラミン組成物；または
    −個別にまたは一緒に前記デフラミン組成物をコードする１つ以上の核酸を含む組成物、
    ここで必要に応じて
    −前記核酸は、デフラミン組成物を発現することができる発現ベクターであり、好ましくはウイルスベクターである、および／または
    −前記組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤も必要に応じて含む医薬組成物の形態である。
  17. 配列番号８〜１９０のいずれか１つに特異的であり、結合することができる抗体、またはそのフラグメント。
JP2019538725A 2016-09-30 2017-10-02 治療用タンパク質 Active JP7510255B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1616715.7 2016-09-30
PT109645A PT109645A (pt) 2016-09-30 2016-09-30 Composição de polipéptidos da deflamina, sua utilização num método de tratamento e sua preparação, vetores de ácido nucleico que a expressam e anticorpo para aqueles polipéptidos
PT109645 2016-09-30
GBGB1616715.7A GB201616715D0 (en) 2016-09-30 2016-09-30 Therapeutic protein
PCT/EP2017/075020 WO2018060528A2 (en) 2016-09-30 2017-10-02 Therapeutic protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020503060A true JP2020503060A (ja) 2020-01-30
JP7510255B2 JP7510255B2 (ja) 2024-07-03

Family

ID=60582543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019538725A Active JP7510255B2 (ja) 2016-09-30 2017-10-02 治療用タンパク質

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200113969A1 (ja)
EP (1) EP3518957B1 (ja)
JP (1) JP7510255B2 (ja)
KR (1) KR20190061015A (ja)
CN (1) CN110214017B (ja)
AU (1) AU2017334047A1 (ja)
BR (1) BR112019006174A2 (ja)
CA (1) CA3037800A1 (ja)
CL (1) CL2019000846A1 (ja)
CO (1) CO2019003865A2 (ja)
IL (1) IL265708A (ja)
MX (1) MX2019003751A (ja)
WO (1) WO2018060528A2 (ja)
ZA (1) ZA201902689B (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7304053B2 (ja) * 2019-02-15 2023-07-06 国立大学法人金沢大学 肝臓がん発症リスクの判定方法、及び肝臓がん発症リスクの判定キット
CN112753943A (zh) * 2021-01-27 2021-05-07 上海理工大学 一种具有炎症性肠病调节功能的能量棒及其制作方法
CN112772843A (zh) * 2021-01-27 2021-05-11 上海理工大学 一种适用于ibd炎症性肠病患者食用的代餐粉及其制备方法
CN114106083A (zh) * 2021-12-09 2022-03-01 南开大学 一种小米蛋白和小米蛋白水解物的制备方法及小米蛋白水解物的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006003110A1 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Process for the purification of protein fractions from lupin seeds, active on lipid metabolism
JP2009505637A (ja) * 2005-07-21 2009-02-12 デ・セイシャス・ボアヴィダ・フェレイラ、ヒカルド・マヌエル ルピナス属の植物から抽出され又は形質転換型で製造されるタンパク質、及びその使用方法
WO2009144278A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor USES OF CONGLUTIN-γ
JP2014503469A (ja) * 2010-10-12 2014-02-13 コンスモ エム ヴェルデ ビオテクノロジア ダス プランタス ソシエダット アノニマ 抗微生物タンパク質

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2155779B1 (en) * 2007-06-01 2012-11-07 Her Majesty the Queen in Right of Canada, as represented by the Minister of Agriculture and Agri-Food A process of aqueous protein extraction from brassicaceae oilseeds

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006003110A1 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Process for the purification of protein fractions from lupin seeds, active on lipid metabolism
JP2009505637A (ja) * 2005-07-21 2009-02-12 デ・セイシャス・ボアヴィダ・フェレイラ、ヒカルド・マヌエル ルピナス属の植物から抽出され又は形質転換型で製造されるタンパク質、及びその使用方法
WO2009144278A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor USES OF CONGLUTIN-γ
JP2014503469A (ja) * 2010-10-12 2014-02-13 コンスモ エム ヴェルデ ビオテクノロジア ダス プランタス ソシエダット アノニマ 抗微生物タンパク質

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FOOD CHEM. (OCT 2015) VOL.197, PART A, P.30-38, JPN6021036928, ISSN: 0005027155 *
J. FUNCT. FOODS (AUG 2015) VOL.18, PART A, P.358-367, JPN6021036927, ISSN: 0005027156 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017334047A1 (en) 2019-05-16
EP3518957A2 (en) 2019-08-07
ZA201902689B (en) 2019-11-27
CO2019003865A2 (es) 2019-04-30
WO2018060528A2 (en) 2018-04-05
CN110214017A (zh) 2019-09-06
KR20190061015A (ko) 2019-06-04
CA3037800A1 (en) 2018-04-05
IL265708A (en) 2019-05-30
JP7510255B2 (ja) 2024-07-03
CL2019000846A1 (es) 2019-11-15
WO2018060528A3 (en) 2018-07-05
CN110214017B (zh) 2024-07-23
EP3518957C0 (en) 2024-05-15
BR112019006174A2 (pt) 2019-06-18
EP3518957B1 (en) 2024-05-15
MX2019003751A (es) 2019-12-16
US20200113969A1 (en) 2020-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7510255B2 (ja) 治療用タンパク質
Liu et al. Cytoprotective effect and purification of novel antioxidant peptides from hazelnut (C. heterophylla Fisch) protein hydrolysates
Tan et al. Venom proteomics and antivenom neutralization for the Chinese eastern Russell’s viper, Daboia siamensis from Guangxi and Taiwan
Clemente et al. Bowman-Birk inhibitors from legumes as colorectal chemopreventive agents
Faisal et al. Proteomics, functional characterization and antivenom neutralization of the venom of Pakistani Russell's viper (Daboia russelii) from the wild
Caccialupi et al. Bowman-Birk inhibitors in lentil: Heterologous expression, functional characterisation and anti-proliferative properties in human colon cancer cells
Mukherjee et al. Characterization of a Kunitz-type protease inhibitor peptide (Rusvikunin) purified from Daboia russelii russelii venom
TR Gomes et al. Plant proteinases and inhibitors: an overview of biological function and pharmacological activity
Lalou et al. Inhibition of tumor cells proliferation and migration by the flavonoid furin inhibitor isolated from Oroxylum indicum
Finkina et al. A novel defensin from the lentil Lens culinaris seeds
Savvateeva et al. Glutenase and collagenase activities of wheat cysteine protease Triticain-α: Feasibility for enzymatic therapy assays
Palavalli et al. Imbibition of soybean seeds in warm water results in the release of copious amounts of Bowman–Birk protease inhibitor, a putative anticarcinogenic agent
Zheng et al. ACE-inhibitory and antioxidant peptides from coconut cake albumin hydrolysates: purification, identification and synthesis
Price et al. Kunitz trypsin inhibitor in addition to Bowman-Birk inhibitor influence stability of lunasin against pepsin-pancreatin hydrolysis
de Oliveira Toyama et al. Umbelliferone induces changes in the structure and pharmacological activities of Bn IV, a phospholipase A2 isoform isolated from Bothrops neuwiedi
Majumder et al. AkP from mushroom Termitomyces clypeatus is a proteoglycan specific protease with apoptotic effect on HepG2
Vander dos Santos et al. Hesperetin as an inhibitor of the snake venom serine protease from Bothrops jararaca
Deng et al. Role of bioactive peptides derived from food proteins in programmed cell death to treat inflammatory diseases and cancer
Sun et al. Activity‐based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva
Suvilesh et al. Purification and characterization of an anti-hemorrhagic protein from Naja naja (Indian cobra) venom
Karami et al. Health promoting and functional activities of peptides from Vigna bean and common bean hydrolysates: process to increase activities and challenges
Olías et al. Glycation affects differently the main soybean Bowman–Birk isoinhibitors, IBB1 and IBBD2, altering their antiproliferative properties against HT29 colon cancer cells
Donnini et al. A novel protein from the serum of Python sebae, structurally homologous with type-γ phospholipase A2 inhibitor, displays antitumour activity
Siddiqui et al. Insight into the biochemical, kinetic and spectroscopic characterization of garlic (Allium sativum) phytocystatin: Implication for cardiovascular disease
Bhadkaria et al. Peptide fraction from moth bean (Vigna aconitifolia (Jacq.)) seed protein hydrolysate demonstrates multifunctional characteristics

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191029

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20201001

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210921

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20211217

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220218

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220318

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220802

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221101

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221219

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230131

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230404

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230703

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230901

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231002

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20231024

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240222

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20240418

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240604

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240621

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7510255

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150