CN110214017A - 治疗性蛋白质 - Google Patents

治疗性蛋白质 Download PDF

Info

Publication number
CN110214017A
CN110214017A CN201780072761.XA CN201780072761A CN110214017A CN 110214017 A CN110214017 A CN 110214017A CN 201780072761 A CN201780072761 A CN 201780072761A CN 110214017 A CN110214017 A CN 110214017A
Authority
CN
China
Prior art keywords
deflamin
mmp
polypeptide
seed
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780072761.XA
Other languages
English (en)
Inventor
安娜·伊莎贝拉·古斯芒·利马
乔安娜·帕特里西亚·莫塔·格雷罗
里卡多·曼努埃尔·德·赛沙斯·博阿维达·费雷拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Instituto Superior de Agronomia
Original Assignee
Instituto Superior de Agronomia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PT109645A external-priority patent/PT109645A/pt
Priority claimed from GBGB1616715.7A external-priority patent/GB201616715D0/en
Application filed by Instituto Superior de Agronomia filed Critical Instituto Superior de Agronomia
Publication of CN110214017A publication Critical patent/CN110214017A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/31—Extraction of the material involving untreated material, e.g. fruit juice or sap obtained from fresh plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种deflamin多肽组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中，其中所述疗法优选的为预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。

Description

治疗性蛋白质
技术领域
本发明涉及一种治疗性蛋白质及其制备方法。
背景技术
在过去的几十年中，已经进行了深入研究以开发用于预防和治疗的新型抗癌药物。然而，尽管在诊断、筛查和治疗方面取得了重大进展，但患者的总体长期结果在过去几十年中并未发生显著变化。在此背景下，人们对各种生物来源进行了大量研究，以开发来对抗这种疾病的新型抗癌药物，其可用于预防、帮助化疗或预防再发病。此外，目前没有专门针对慢性炎症的处方药(当然，还有非处方药治疗轻微和暂时的炎症以及由于受伤或手术引起的伴随疼痛，例如手术。但是，这些都是不是为了治疗慢性炎症)。曾经用于对抗疟疾的一些药物，如羟氯喹，可用于治疗一些狼疮患者，但它们并不能治愈这种疾病。阿司匹林和他汀类药物在减少某些人炎症方面显示出前景，但是研究人员并不确定这类药物在这方面的作用有多广泛。除了远非完美的抗炎药物，如泼尼松(一种皮质类固醇，其带来了一系列副作用)，科学家们仍然在研究如何最好地控制炎症。
发明内容
发明人已经发现了deflamin，一种包含新多肽的新型组合物，其具有抗癌和抗炎活性。进一步的，deflamin具有营养保健品特质。因此，本发明提供了一种deflamin多肽组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中，其中所述疗法优选预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
在一个实施方案中，deflamin可以被认为是来自储存的蛋白的片段的混合物，存在于许多(但不是全部)种子中(在羽扇豆属植物的情况下为β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白)，通常通过特定步骤进行纯化，并显示出许多独特的生物/生物活性，即抗炎和抗癌活性，以及其衍生的其他生物活性。
Deflamin可以从许多种子物种中获得，例如来自羽扇豆种子和其他物种的种子。如本文所述，开发了一种特定的方法以从适合进行扩大规模的种子(羽扇豆和其它)中提取和纯化deflamin，从而允许其在工业设备中大量生产。本发明还包括重组生产deflamin。
本发明包括在所有疾病中预防和治疗使用deflamin，所述疾病直接或间接(即由给定治疗产生的炎症)发展为炎症和/或其涉及基质金属蛋白酶(MMPs)的活性。
Deflamin的定义
Deflamin可以通过其来源、生物活性、如何产生以及在某些情况下在结构上进行定义。Deflamin存在于许多但不是所有物种的种子中。在本发明中制备或使用的Deflamin可具有本文提及的一种或多种物理或治疗性质。这些性质包括在本文所述的任何测定(包括动物模型)中测量的一种或多种生物活性和通过本文所述的基于电泳的技术、HPLC和质谱测定法测量的物理性质。Deflamin可包含天然存在的序列或相关的人工(同源或重排)序列。
Deflamin的性质
Deflamin优选为可溶性多肽/小蛋白质的混合物形式，或者可以是单个多肽/小蛋白质的形式，其通常具有以下一种或多种特性：a)易于食用(对人体无毒)；b)它出现在种子中；c)可溶于水；d)它由低分子量多肽/小蛋白质的混合物中的一种或任何组合组成；e)它的生物活性能够耐受沸腾、宽范围的pH值、乙醇和/或消化蛋白酶(即它们能抵抗消化过程)；f)它强烈抑制基质金属蛋白酶(MMP)-9和/或MMP-2，即它是低浓度的MMP抑制剂(MMPI)；g)它降低人结肠腺癌细胞系HT29的迁移能力而不诱导显著的细胞毒性；h)它至少具有以下重要的生物活性：(i)有效的抗炎作用；(ii)有效的抗肿瘤(抗迁移和抗转移)；(iii)无明显的细胞毒性。
当口服给药时，deflamin不会引发任何显著的免疫原性(即IgG)或过敏原(即IgE)反应。此外，它在低浓度下具有生物活性。
在一个具体实施方案中，包含deflamin的多肽已被鉴定为是β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白大链的片段(例如来自羽扇豆种子的deflamin)。参见SEQ ID NO：192和SEQID NO：193。
如下文详细描述的，当经口服、腹膜内、静脉内或局部给药时，deflamin显示出动物模型中的生物活性。特别地，deflamin具有以下性质：a)抗炎活性，如通过以下任何一种途径给药时，在有疾病的动物模型(即小鼠)中所测量的，该给药途径是：口服、腹膜内、静脉内和局部；b)抗肿瘤活性，如通过强力抑制基质金属蛋白酶(即MMP-9和MMP-2)活性、癌细胞抗增殖活性和抑制细胞肿瘤侵袭所研究的。
与其他植物蛋白的关系
Blad是已知的生物活性植物多肽。Blad以及含Blad的寡聚体(BCO)包含β-羽扇豆球蛋白的片段。然而，它们与deflamin无关，deflamin通常包含β-羽扇豆球蛋白的其他片段和/或δ-羽扇豆球蛋白大链的片段。
在功能上，两者是不同的，其中deflamin完全没有抗微生物活性(就细菌和真菌而言)，而含Blad的寡聚物不抑制明胶酶。Blad对应于β-羽扇豆球蛋白的固定片段，即Blad包含β-羽扇豆球蛋白前体的残基109-281(即前体-β-羽扇豆球蛋白)。除δ-羽扇豆球蛋白大链外，deflamin通常对应于β-羽扇豆球蛋白的其他片段，例如其跨越整个多肽。
对基质金属蛋白酶(MMPs)和癌症的活性
Deflamin是一种新型的MMP-9和/或MMP-2抑制剂，在羽扇豆种子中发现，也存在于其他种子中，如鹰嘴豆和大豆。通常已确定某些癌症(例如结肠直肠癌患者)中患者的死亡通常由转移性疾病而非原发性肿瘤本身引起。转移涉及从原发性肿瘤释放癌细胞并附着于另一组织或器官。因此，癌细胞侵袭是转移中的关键因素，并且需要用于粘附/去粘附的整合素和用于局部蛋白水解的基质金属蛋白酶(MMP)。
需要局部蛋白水解来打开细胞外基质中的路径以使癌细胞穿过。伤口愈合测定提供了细胞对细胞侵袭能力的评估。通常，MMP-9活性与癌细胞侵袭高度相关，因此MMP-9活性的降低抑制了细胞侵袭，并且这两种活性通常是成对的。这就是为什么如此需要MMP-9抑制的原因，因为它直接阻断/限制细胞侵袭，因而通过转移抑制死亡。
另一方面，细胞通过称为整合素的特定蛋白质粘附到基质上，跨膜受体是细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用的桥梁。整合素对组织培养中的细胞的一个重要功能是它们在细胞迁移中的作用。整合素受肿瘤进展和转移调节，并与MMP-9和MMP-2活性紧密相关。在癌细胞膜中靶向和失活整合素也是可取的，因为当细胞从肿瘤中释放时，它们缺乏附着于另一组织的能力。这也将抑制转移，甚至可以帮助解剖原发肿瘤。
许多研究的另一个目标是对癌细胞的特异性细胞毒性。许多生物活性化合物，如酚类化合物，可以极大减少细胞生长并损害新陈代谢，在略高剂量时达到毒性水平。在生物活性化合物存在下细胞生长和细胞代谢的测量是其对细胞毒性的直接测量。MTT测定使用特定的着色剂，其需要被活的细胞吸收，然后由它们代谢成相应的甲瓒。
简而言之，MTT测定法是一种比色测定法，其通过线粒体琥珀酸脱氢酶用于测量可溶性黄色MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]的还原性。MTT进入细胞并进入线粒体，在那里其被还原成不溶的、有色(深紫色)的甲瓒产物[(E，Z)-5-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-1，3-二苯基甲瓒]。然后用有机溶剂(例如异丙醇)溶解细胞，并用分光光度法定量释放的、溶解的甲瓒试剂。由于MTT的减少只能在代谢活跃的细胞中发生，因此活性水平是细胞活力的量度。因此，如果细胞死亡或代谢受损，则不会产生着色剂。因此，颜色的更高水平表明更多数量的活的、代谢活跃的细胞。如果化合物减少细胞生长或杀死细胞，则颜色水平会降低。
从理论上讲，靶向和杀死癌细胞是一种很好的方法。然而，它只有在对癌细胞具有高度特异性而不对健康、正常(即非癌症)细胞具有高特异性时才有效。大多数破坏癌细胞的化合物也会在给定剂量下破坏正常的健康细胞，虽然许多研究只关注代谢物(如酚类化合物)以减少癌细胞生长的能力，但它们通常不会考虑它们对控制健康细胞的影响。为什么这是相当常见的原因之一，涉及这样的事实，即与正常的健康细胞不同，在实验室条件下培养癌细胞相对简单。因此，后来，在临床前或甚至临床测定的水平上，这些化合物的使用经常受到剂量限制性毒性、临床益处不足和极端不良副作用的阻碍。因此，减少细胞侵袭但不影响细胞正常代谢的生物活性剂(如与deflamin一样)将产生较少(甚至可忽略不计)的副作用，并且在预防性长期给药中使用更安全，因为它不会对常规细胞产生细胞毒性。
本发明的某些实施方案设想治疗和/或预防性方法和/或途径。例如，可将deflamin给予健康个体以预防疾病。本发明的某些实施方案设想了特定的给药途径，包括以下一种或多种：口服、肛门、注射和局部给药。
其他MMP抑制剂的性质
来自植物的其他植物MMP抑制剂具有如下一个或多个以下缺点：a)毒性；b)在消化过程中的化学灭活(例如变性)或降解/破坏(例如蛋白水解)；c)吸收进入血流中，有或没有引发免疫原性(即IgG)或过敏(即IgE)反应；d)煮沸(例如在烹调过程中)期间受到破坏；e)对所有或单个涉外明胶酶没有特异性；f)高剂量要求；g)缺乏合适、有效和低成本的隔离方法。
这在很大程度上解释了为什么仍然还没有一种植物来源的生物化合物在MMPI抑制水平上成功应用于人类健康和营养领域。
羽扇豆球蛋白
通常，deflamin多肽具有与羽扇豆球蛋白序列的片段相同或与羽扇豆球蛋白序列的片段具有强同源性的序列。在一个实施方案中，此类的羽扇豆球蛋白序列来自本文提及的特定羽扇豆球蛋白或来自那些特定羽扇豆球蛋白的天然存在的同源物。
在羽扇豆中，羽扇豆球蛋白被分为四个家族：α羽扇豆球蛋白、β羽扇豆球蛋白、γ羽扇豆球蛋白和δ羽扇豆球蛋白。β羽扇豆球蛋白是羽扇豆中的主要种子球蛋白，是豌豆球蛋白或种子贮藏蛋白的7S成员，而α羽扇豆球蛋白是豆科蛋白或种子贮藏蛋白的11S成员。在窄叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)中，先前总共鉴定了三个α-扇豆球蛋白，七个β-羽扇豆球蛋白，两个γ-羽扇豆球蛋白和四个δ-羽扇豆球蛋白编码基因。这些基因被称为羽扇豆球蛋白α1、α2和α3，羽扇豆球蛋白β1、β2、β3、β4、β5、β6和β7，羽扇豆球蛋白γ1和γ2，以及羽扇豆球蛋白δ1、δ2、δ3和δ4。
δ羽扇豆球蛋白属于富含2S硫的白蛋白家族。羽扇豆种子2S白蛋白，也称为δ-羽扇豆球蛋白，是一种单体蛋白质，包含两个由两个链间二硫键连接的小多肽链：一个较小的多肽链，由37个氨基酸残基组成，分子量为4.4kDa，和含有75个氨基酸残基的较大多肽链，分子量为8.8kDa。白羽扇豆δ羽扇豆球蛋白的唯一氨基酸序列已经从基因序列中推断出来。较大的多肽链含有两个链内二硫键和一个游离巯基。这种蛋白质在白羽扇豆蛋白质中呈现出独特的特征：除了它的高半胱氨酸含量外，它在280nm处具有低吸光度。
就δ-羽扇豆球蛋白的生理作用而言，已经提出了这类蛋白质的储存功能。与植物谷物抑制剂家族(包括双功能胰蛋白酶/α-淀粉酶抑制剂)的结构相似性可表明该蛋白质的保护功能以及其储存作用。它在白羽扇豆种子中的含量被评估为约10％至12％，但是最近的数据表明较低的含量为约3％至4％。白羽扇豆种子2S白蛋白通常存在于白蛋白和球蛋白级分中。
炎症
Deflamin可用于预防或治疗炎症。炎症是对病原体、化学品等有害刺激或身体伤害对组织和细胞的损害的身体直接反应。急性炎症是一种短期反应，通常会导致愈合：白细胞渗入受损区域，去除刺激并修复组织。相反，慢性炎症是一种延长的、失调的和适应不良的反应，其涉及活动性炎症、组织破坏和组织修复的尝试。Deflamin可用于预防或治疗急性或慢性炎症。
Deflamin可用于预防或治疗皮肤或粘膜炎症过程，如皮炎、黑色素瘤、牙周炎和牙龈炎症。它可用于治疗全身和慢性消化道炎症。
现在广泛接受的是，慢性炎症在许多常见且常常致命的疾病中起作用，包括：a)炎性肠病(IBD)、心脏病、中风、癌症、慢性呼吸道疾病、神经疾病、肥胖症和糖尿病；b)由人免疫病毒、哮喘、瘤、退行性疾病和心血管疾病介导的动脉粥样硬化、关节炎、糖尿病、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)；c)过敏和自身免疫疾病；d)肥胖和代谢疾病；e)阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病；f)抑郁症。
Deflamin可用于预防或治疗任何这些疾病。
癌症
癌症是一种疾病术语，其是异常细胞在没有控制的情况下分裂并且可以侵入同一生物体的附近组织。癌细胞还可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。有几种主要类型的癌症：a)上皮癌是从皮肤或组织中排列或覆盖内脏的癌症；b)肉瘤是一种从骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织开始的癌症；c)白血病是一种从血液形成组织(如骨髓)开始的癌症，并且会导致大量异常血细胞进入血液；d)淋巴瘤和多发性骨髓瘤是从免疫系统细胞开始的癌症；e)中枢神经系统癌症是从脑和脊髓组织开始的癌症；f)黑色素瘤是一种恶性(癌)细胞在黑素细胞(使皮肤着色的细胞)中形成的疾病。
癌症相关疾病：原位导管癌、男性乳腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胰腺外分泌癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、宫颈癌、皮肤黑色素瘤、上皮癌、基底细胞癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、卵巢癌、卵巢生殖细胞瘤、肺癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、子宫癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、肝癌、口咽癌、下咽癌、喉癌、鼻咽癌、咽癌、口腔癌、脑肿瘤、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、肾癌、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、尿道癌、小细胞肺癌、骨肉瘤、肉瘤、类癌、类癌综合征、慢性淋巴细胞白血病、肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、垂体瘤、毛细胞白血病、阴茎癌、白血病、阴道癌、尤文肉瘤、卡波西肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、乳头传呼疾病、胆囊癌、急性淋巴细胞白血病、眼部淋巴瘤、肾上腺皮质癌、腺癌、甲状旁腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、胃泌素瘤、Merkel细胞癌、唾液腺癌、外阴癌、胃肠道间质瘤、肛门癌。
本发明提供了用于预防或治疗上文或本文提及的任何类型的癌症或特定癌症的deflamin。Deflamin在肿瘤发生的初始阶段和抑制转移形成是有效的，作为化学疗法的一部分并且避免术后癌症的复发。
Deflamin的生产方法
用于本发明的治疗方面的Deflamin可通过任何合适的方法进行制备，例如本文所述的任何方法。优选通过重组表达或通过从植物材料中提取来制备。Deflamin可以从表达deflamin或deflamin前体的任何植物材料获得，所述植物材料通常是种子，例如成熟种子，例如本文提及的任何合适的植物属或种。
来自种子等植物材料
通常，通过遵循顺序沉淀方案的方法获得deflamin。该方法可以基于deflamin对高温、低pH值和高乙醇浓度的耐受性。如果使用粉状物质作为该方法的起始点，则可以通过研磨合适的种子来获得。
方法1
在一个实施例中，该方法包括从合适的种子中提取deflamin，包括：
-至少一步在高温下，优选至少80摄氏度或沸腾；和
-至少一步在低pH值下，优选pH＝4或更低；
-至少一步使提取物与高乙醇浓度，优选至少70％(v/v)乙醇或至少90％(v/v)乙醇接触。
方法2
在另一个实施例中，该方法包括以下步骤：
(a)将完整的种子在水中煮沸，然后在水或缓冲液中提取，去除脂肪，或将完整的种子还原成粉状物质，在水或缓冲液中提取，然后去除脂肪和煮沸，或从粉状物质中除去脂肪，然后在水或缓冲液中提取并煮沸；
(b)将可溶性部分暴露于足够低的pH值(例如pH＝4.0或更低)，以使大部分剩余的蛋白质/多肽沉淀；
(c)将沉淀的部分重新悬浮于约40％(v/v)乙醇中，溶液也可选的含有0.4M NaCl；上清液含有deflamin；
可选地，还可以进行以下步骤：
(d)将可溶性部分制成90％(v/v)乙醇以沉淀deflamin并储存在-20℃，或者可以通过其他方法实现分层沉淀，例如冷冻干燥；
(e)通过重复步骤(c)和(d)，可以清除沉淀的deflamin，使其免受最终污染物的影响；
(f)然后，可将沉淀的deflamin溶解在如水中，并通过任何合适的技术方法脱盐，以除去低分子量的污染物和/或储存冷冻(液体或干燥物)直至需要。
方法3
在一个实施例中，该方法包括以下步骤：
(a)从合适的种子中提供粉状物质；(b)对所述粉状物质进行脱脂；(c)从所述脱脂步骤中煮沸剩余样品一段时间；(d)将所述样品离心一段时间；(e)然后弃去所得的沉淀并进一步处理所得上清液以沉淀多肽，同时降低其pH值；(f)进一步离心以获得另一颗粒；并弃去上清液；(g)用乙醇进一步处理所述另外的颗粒并离心得到另外的颗粒，然后弃去；剩余的上清液包含deflamin。
步骤(a)至(g)中的任何步骤都可以用方法4和5中列出的更具体的等效步骤代替。
方法4
在一个实施例中，该方法包括以下步骤：
(a)来自种子的粉状物质脱脂。它可以用有机溶剂脱脂，然后悬浮在水中(通常1∶10至1∶50w/v；pH通常调节至pH＝8.0-8.5)，搅拌通常1至6小时，例如在室温下，或者将粉状物质在水中悬浮后(通常为1∶10至1∶50w/v；pH通常调节至pH＝8.0-8.5)，从浆液顶部简单除去脂肪，搅拌通常为在室温下1至6小时。作为水的替代物，通常在实验室规模，粉状物质可以悬浮在通常30至70mM、通常pH＝7.5的Tris-HCl缓冲液中。
(b)搅拌至少2至6小时后，如约4小时或过夜，通常在4℃下，通过离心获得可溶性蛋白质，通常为10,000至20,000g，例如13,500g，持续10至90分钟，例如30分钟，通常在4摄氏度，将颗粒弃去。
(c)将蛋白质溶液煮沸，通常在100摄氏度下煮5至20分钟，例如10分钟，并在10,000至20,000g离心，例如在13,500g下离心，通常在4摄氏度下离心20分钟；将颗粒弃去；收集上清液并提供热处理的提取物(HT)。
(d)通过加入稀释的HCl至约pH＝4.0，沉淀上清液中的多肽/蛋白质；在10,000至20,000g离心，例如在13,500g，通常在4摄氏度下离心20分钟时，弃去上清液。
(e)将颗粒在30％至50％，例如含有0.2至0.6M的NaCl如0.4M的NaCl的40％(v/v)乙醇中重新悬浮。在室温下搅拌，通常搅拌1小时，并在4摄氏度下以10,000至20,000g离心，例如13,500g，30分钟；与绝大多数种子贮藏蛋白不同，这种处理使得deflamin成为溶液；将颗粒弃去。
(f)将上清液制成80％至95％，例如90％(v/v)的乙醇并在低于-10摄氏度下例如，-20摄氏度储存至少4小时，例如过夜，沉淀出deflamin，然后在10,000至20,000g离心，例如13,500克，通常在4摄氏度下30分钟；弃去上清液。
可选地，应重复40至90％(v/v)乙醇差异沉淀。因此，可以进行以下额外的步骤：
(g)将沉淀中存在的deflamin再次溶于含有0.4M NaCl的40％(v/v)乙醇中，在室温下搅拌1小时，并在4℃下以13,500g离心30分钟；第二次洗涤，清除最终污染物中的deflamin；再次弃去沉淀物。
(h)将上清液再次制成90％(v/v)乙醇，在-20摄氏度下保存过夜，沉淀出去纤维素，然后在4摄氏度的情况下13,500g离心30分钟；弃去上清液。
(i)最终的颗粒含有纯的deflamin，随后溶解在尽可能小体积的Milli-Q水中；最后将deflamin溶液在Sephadex G-25柱(例如NAP-10柱，GE Healthcare Life Sciences)中脱盐，以除去低分子量污染物。
(j)获得的提取物可可选地储存在-20摄氏度。
方法5
在一个实施方案中，使用以下方法获得deflamin：
(a)来自合适种子的粉状物质：
-用正已烷脱脂，然后悬浮在水中(1∶20w/v；pH调节至pH 8.0-8.5)，在室温下搅拌2至3小时，或
-将粉状物质悬浮于水(1∶20w/v；pH调节至pH 8.0-8.5)中，在室温下搅拌2至3小时后，将脂肪从浆液上部简单地除去。
-作为水的替代物，通常在实验室规模，粉状物质可以悬浮在pH＝7.5的50mM的Tris-HCl缓冲液中；在4摄氏度下搅拌4小时(或过夜)。
(b)通过在4摄氏度下以13,500g离心30分钟获得可溶性蛋白质；将颗粒弃去。
(c)将蛋白质溶液在100摄氏度下煮沸10分钟，并在4摄氏度下以13,500g离心20分钟；将颗粒弃去；收集上清液并提供热处理的提取物(HT)。
(d)通过加入稀释的HCl至pH＝4.0沉淀上清液中的多肽/蛋白质；在4摄氏度下以13,500g离心20分钟后，弃去上清液。
(e)将沉淀重新悬浮在含有0.4M的NaCl的40％(v/v)乙醇中，在室温下搅拌1小时，并在4摄氏度下以13,500g离心30分钟；与绝大多数种子贮藏蛋白不同，这种处理使得deflamin成为溶液；将颗粒弃去。
(f)将上清液制成90％(v/v)乙醇并在-20摄氏度下保存过夜，沉淀出去纤维素，然后在4摄氏度下以13,500g离心30分钟；弃去上清液。
可选地，应重复40至90％(v/v)乙醇进行差异沉淀。因此，可以进行以下额外步骤：
(g)将存在于颗粒中的deflamin再次溶解在含有0.4M的NaCl的40％(v/v)乙醇中，在室温下搅拌1小时，并在4摄氏度下以13,500g离心30分钟；第二次洗涤可清除deflamin中的最终污染物；再次弃去沉淀物。
(h)将上清液再次制成90％(v/v)乙醇，并在-20摄氏度下保存过夜，沉淀出去纤维素，然后在4摄氏度下以13,500g离心30分钟；弃去上清液。
(i)最终的颗粒含有纯的deflamin，随后溶解在尽可能小体积的Milli-Q水中；在实验室规模下，最终将deflamin溶液在Sephadex G-25柱(例如NAP-10柱，GE HealthcareLife Sciences)中脱盐，以除去低分子量污染物。
(j)获得的提取物可选地储存在-20摄氏度。
任何上述方法中使用的粉状物质可选地通过研磨种子来获得，例如研磨约100g±0.1g干燥种子(通常没有胚和皮)以获得粉状物质。
方法6
重组蛋白的生产方法是本领域熟知的。本文应用的此类方法将涉及将编码deflamin多肽的多核苷酸插入合适的表达载体中-使得所述多核苷酸与一种或多种启动子(例如诱导型启动子，例如T7lac)并与其他目的多核苷酸或基因并置-将表达载体导入合适的细胞或生物体(例如大肠杆菌)中，在转化的细胞或生物体中表达多肽，并从该细胞或生物体中除去表达的重组多肽。为了辅助这种纯化，可以构建表达载体，使得多核苷酸另外编码例如可以辅助纯化的末端标签：例如用于亲和纯化的组氨酸残基标签。一旦重组多肽被纯化，就可以从多肽中除去纯化标签，例如通过有限的蛋白水解切割。
方法7
更简单的、经济的和快速的方法是可能的，导致相当纯的deflamin，但不如上述步骤所达到的那么多。这些方法必然涉及提取、煮沸、暴露于低pH值和用乙醇处理。
Deflamin的物理结构
Deflamin是包含一种或多种多肽的组合物。它通常包含至少1至200种不同的多肽，例如20至150、30至100或50至80种具有一种或多种下列特征的不同多肽：
(a)它们具有5至250个氨基酸残基的长度，例如5至200、50至200、75至150，或优选100至180或120至170个氨基酸残基，和/或
(b)它们包含序列，所述序列是来自羽扇豆球蛋白的序列的一部分和/或同源物，例如本文提及的任何羽扇豆球蛋白或SEQ ID NO：8至190中任一个所代表的部分，和/或
(c)它们各自包含一个序列，其是：
(i)一部分羽扇豆球蛋白，其中所述部分长度至少为5、10、20、30或50个氨基酸残基，和/或
(ii)(i)中定义的部分的同系物，其优选与所述部分具有至少70％的同一性，
其中所述的羽扇豆球蛋白可选的为羽扇豆球蛋白β1、β2、β3、β4、β5、β6或7或羽扇豆球蛋白δ2蛋白；和/或
(d)至少20、30或50个多肽包含序列，该序列是来自羽扇豆球蛋白的序列的重排。
Deflamin多肽可能表现出微观不均匀性。因此，在羽扇豆的情况下，deflamin多肽对应于羽扇豆球蛋白的序列，其大部分重叠但显示不同的长度。
具有重排序列的Deflamin多肽通常包含来自不同羽扇豆球蛋白或来自相同羽扇豆球蛋白分子的不同部分的序列部分；或这些部分的同系物。这些部分(包括部分的同源物)可以是至少5、10、20、30或50个氨基酸残基长。来自相同羽扇豆球蛋白的不同部分的部分可以在它们出现的原始羽扇豆球蛋白中分开至少10、20、50或200个氨基酸。具有重排序列的deflamin多肽可包含来自不同羽扇豆球蛋白分子和/或来自相同羽扇豆球蛋白分子的不同部分的羽扇豆球蛋白序列的至少2、3、4、5或6个不同部分。这些部分可以与本文提及的任何特定序列的相同、部分和/或同源，包括SEQ ID NO 8至190中的任何一个。
在一个实施例中，deflamin组合物包含SEQ ID NO 8至55和/或56至75和/或76至190的至少10％、20％、30％、50％、80％或全部序列，该序列作为所有存在的多肽的一部分；或任何这些特定序列的同源物或本文指定的任何其他序列。
Deflamin通常包含至少1至200种不同的多肽，例如20至150、30至100或50至80种不同的多肽，每种多肽包含的序列是：
(a)与SEQ ID NO 8至190中的任一个相同或是SEQ ID NO 8至190中任何长度为至少5、10、20、30或50个氨基酸残基的部分，和/或
(b)(a)中定义的序列的同源物，其优选与(a)具有至少70％的同源性。
在一个实施例中，deflamin组合物不包含除本节中定义的多肽之外的任何多肽，或者此类其他多肽占组合物中多肽总质量的小于30％，例如小于10％。
当本文提及定义为SEQ ID NO的多肽组时，最优选I类多肽(SEQ ID NO 8至55)，然后是II类(SEQ ID NO′s 56至75)，接着是III类(SEQ ID NO′s 76至190)。
在一个实施例中，该deflamin组合物在其所有多肽内的序列形式中包含来自羽扇豆球蛋白(例如本文提及的任何羽扇豆球蛋白)的序列的部分，其跨越所述羽扇豆球蛋白。通常，存在至少3、4、5或6部分，其中至少1、2或3部分出现在羽扇豆球蛋白多肽的前半部分和后半部分中(其中羽扇豆球蛋白的N末端代表开始的分子)。优选地，在这种情况下，如果想象将羽扇豆球蛋白多肽为分成三个相等长度的区段的话，则至少一部分来自羽扇豆球蛋白多肽的第一、第二和第三部分中的每一个。
在某些实施例中，deflamin包含衍生自β-和δ-羽扇豆球蛋白的多肽，例如来自β-和δ-羽扇豆球蛋白的至少1、2、3、5或10种肽(优选地白羽扇豆β和δ-羽扇豆球蛋白)。Deflamin可包含对应于13kDA和17kDa的分子量的2组这样的肽。它们的长度可以是至少或在由以下100、110、120、130、140、150或160个氨基酸残基中的任何两个或更多个限定的范围内。在某些实施方案中，deflamin由多肽的混合物组成，所述多肽源自两个多肽峰(13和17kDA)。
Deflamin：变体、同源物和部分
在本文所述的deflamin的任何实施例中，一种或多种deflamin多肽可以被“变体”替换，因此通常天然存在的序列可以用同源序列或天然序列的一个或多个部分替换。优选地，此类变体是SEQ ID NO 8至190所示序列的同源物和/或部分。下文描述了这些同源物的同一性的百分比水平。序列的部分将由原始序列的至少50％、80％或90％组成，并且长度可以是至少5、10、20或30个氨基酸残基。变体优选保留原始多肽/序列的活性，例如使用本文所述的任何测定或试验进行测量。
同源序列通常具有至少40％的同一性，优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少97％、最优选至少99％的同一性。例如，在整个序列上或在至少20个，优选至少30个、优选至少40个、优选至少50个、优选至少60个、优选至少80个、优选至少100个、优选至少120个、优选至少140个、最优选至少160个或更多个连续氨基酸残基。测量蛋白质同源性的方法是本领域熟知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，基于氨基酸同一性(有时称为“硬同源性”)计算同源性。
同源序列通常通过取代、插入或缺失与原始序列不同，例如通过1、2、3、4、5至8、9至15或更多个取代、缺失或插入。取代优选是“保守的”，也就是说氨基酸可以被相似的氨基酸取代，其中该相似的氨基酸共享下列基团(关于它们的侧链R)之一：芳香族残基(F/H/W/Y)、非极性脂肪族残基(G/A/P/I/L/V)、极性不带电荷的脂肪族残基(C/S/T/M/N/Q)和极性带电荷的脂肪族残基(D/E/K/R)。优选的亚组包括：G/A/P；I/LN；C/S/T/M；N/Q；d/E和K/R。
可以使用已知和可用的方法测量同源性(同一性)。例如，UWGCG包提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性(例如在其默认设置下使用)(Devereux等人(1984)，NucleicAcids Res.12，387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列(通常在其默认设置下)，例如Altschul(1993)，J.Mol.Evol.，36，290-300和Altschul等人(1990)，J.Mol.Biol，215,403-410。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中的相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻域字命中作为种子用于启动搜索以找到包含它们的HSP。只要累积比对得分可以增加，单词命中就沿着每个序列在两个方向上进行扩展。在以下情况下，停止每个方向上的单词命中的扩展：累积对齐分数从其最大实现值的数量X下降；由于一个或多个负评分残基排列的积累，累积评分为零或低于零；或者当达到任一序列的结尾时。BLAST算法参数W、T和X确定对准的灵敏度和速度。BLAST程序使用字长(W)为11的默认值，BLOSUM62评分矩阵比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，以及两条链的比较(参见Henikoff和Henikoff(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)。BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见，例如Karlin和Altschul(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果第一序列与第二序列的比较中的最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。
Deflamin的形式
包含、由其组成或基本上由deflamin组成的组合物通常是分离的或纯化的形式(例如从植物或细胞来源中除去)。这通常包含小于50％或小于20％或10％或5％的非deflamin干质量。
Deflamin组合物也可以是包含技术人员添加到组合物中的另一种化合物的制剂。在优选的实施方案中，这种制剂是包含deflamin和药学上可接受的载体或稀释剂的药物制剂。
技术人员将能够通过常规方法鉴定在任何特定环境中使用deflamin的合适浓度，例如当在治疗中施用时。优选地，例如，其使用浓度为至少1μg/mL，至少5μg/mL，至少10μg/mL，至少20μg/mL，至少50μg/mL，或至少100μg/mL，最高500μg/mL，最高600μg/mL，最高1mg/mL，最高2.5mg/mL，最高5mg/mL或最高10mg/mL。优选地，浓度在10μg/mL和5mg/mL之间，更优选地在50μg/mL和2.5mg/mL之间，更优选地在100μg/mL和1mg/mL之间，甚至更优选地在100μg/mL和600μg/mL(例如约250μg/mL)之间。
在一个实施方案中，该deflamin组合物包含小于20％，小于10％或小于1％重量或完全不含lunasin或Blad蛋白，例如由本文给出的特定序列定义。在另一个实施方案中，所述deflamin多肽均不包含来自lunasin蛋白或Blad蛋白的任何序列，即它们不包含来自lunasin蛋白和/或Blad蛋白的任何序列部分。
治疗用途
当用于治疗以预防或治疗病症时，deflamin优选以治疗有效量使用。优选地，治疗有效量对人或动物受试者无毒。
本发明提供了一种用于通过疗法治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物，其中所述疗法优选预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
为此，本发明还提供了治疗人或动物的方法，其包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的抗微生物多肽的组合物，所述抗微生物多肽除抗微生物多肽外还包含deflamin或含有deflamin。本发明还提供了deflamin在制备用于治疗或预防炎症或癌症或用于提供营养保健品的药物中的用途。
构成deflamin的各个多肽可以单独递送，因此本发明提供了包含多种不同多肽的产品，这些多肽一起形成deflamin组合物，用于在通过疗法治疗人体或动物体的方法中同时、分别或相继使用。其中，所述疗法优选预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
Deflamin可以通过任何合适的途径给药，例如通过皮内、皮下、肌肉内、静脉内、骨内和腹膜内、局部、口服或经粘膜(例如鼻、舌下、阴道或直肠)途径。
Deflamin优选与载体、稀释剂和助剂一起施用。药学上可接受的载体包括但不限于液体，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如无机酸盐、例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。尽管不是必需的，但优选制剂还含有用作稳定剂的药学上可接受的载体。也用作多肽稳定剂的合适载体的实例包括但不限于药物级葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其他合适的载体包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)及其组合。
一旦配制，可以使用各种已知的途径和技术将组合物体内递送至受试者。例如，液体制剂可以以可注射溶液、悬浮液或乳液提供，并使用常规针头和注射器或使用液体喷射注射系统通过肠胃外、皮下、皮内、肌肉内、静脉内、骨内或腹膜内注射给药。液体制剂也可局部给予眼睛、皮肤、毛发或粘膜组织(例如鼻、舌下、阴道或直肠)，或作为适于呼吸或肺部给药的细雾状喷雾提供。其他给药方式包括口服给药、栓剂和主动或被动透皮给药技术。
需要治疗的受试者可以是任何人或动物个体。受试者通常是脊索动物、哺乳动物、农业动物或啮齿动物。在优选的实施方案中，deflamin可用于治疗特别具有炎症或癌症风险的受试者。
可以通过使用在体内表达deflamin的核酸表达载体来施用Deflamin。本发明提供一种或多种核酸载体，它们一起或单独表达用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中的deflamin组合物，其中所述疗法优选预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。所述核酸载体可以是病毒载体或允许递送核酸的任何其他类型的载体。
本发明还提供了包含多种核酸载体的产品，所述核酸载体一起表达用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中同时，分别或相继使用的deflamin组合物，其中所述疗法优选预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
抗体
本发明提供一种或多种抗体或其片段，其以特定方式结合对应于序列SEQ ID NO8至190的任何一种多肽。
附图说明
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1显示了对应于Blad的β-羽扇豆球蛋白前体编码序列的内部片段；
图2显示了Blad的二级多肽结构；
图3显示了Blad的三级多肽结构；
图4显示了用于从羽扇豆种子中提取和纯化deflamin方法的示意图；
图5显示了最初分析的八种豆科植物种子中每一种白蛋白和球蛋白多肽谱之间的比较；
图6是显示最初分析的八种豆科植物种子的MMP-9抑制活性的图；
图7是显示比较最初分析的八个豆科植物种子中的每一个白蛋白和球蛋白级分之间的细胞增殖测定的图；
图8显示了三种豆科植物种子的细胞迁移伤口测定的图像：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆；
图9是显示细胞迁移伤口测定结果的图，比较来自最初分析的八个豆科种子中的每一个白蛋白和球蛋白级分(如图8所示进行的)；
图10是显示明胶水解活性的图，比较来自最初分析的八个豆科种子中的每一个白蛋白和球蛋白级分；
图11显示了MMP-9和MMP-2活性的酶谱图，比较来自三种豆科植物种子的白蛋白和球蛋白组分：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆；
图12是显示植酸蛋白浓度的图，比较来自分析的六种豆科植物种子的未煮熟和蒸煮的级分；
图13是显示皂苷浓度与来自分析的六种豆类种子的未煮熟和蒸煮的级分的比较的图；
图14是显示酚类化合物浓度的图，比较来自分析的六种豆类种子的未煮熟和蒸煮的级分；
图15是显示可溶性蛋白质浓度的图，比较来自分析的六种豆类种子的未煮熟和蒸煮的级分；
图16是显示通过R-SDS-PAGE获得的多肽谱，比较来自所分析的六种豆科植物种子的未煮熟和蒸煮的级分；
图17是显示通过伤口愈合测定法评估的细胞迁移图像，比较来自三种豆科植物种子的几种煮熟和未煮熟的部分：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆；
图18是显示伤口愈合测定的相对迁移率的图，比较来自三种豆科植物种子的几个煮熟和未煮过的部分：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆(图17)；
图19是显示来自三个豆科植物种子的几个煮熟和未煮过的部分的细胞增殖的图：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆；
图20是显示来自三种豆科植物种子的几种煮熟和未煮过的部分的明胶水解活性的图：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆；
图21是显示对来自三种豆科植物种子的几种煮熟和未煮过的部分的MMP蛋白水解活性的抑制作用的图：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆；
图22是显示通过FPLC凝胶过滤分级的来自白羽扇豆种子的deflamin部分纯化的提取物的蛋白质峰的图；
图23显示了图22中多肽峰的分离，通过Tricine SDS-PAGE分离；
图24是显示来自图22的每种蛋白质级分的MMP-9抑制活性的图；
图25是显示从白羽扇豆中分离的MMP抑制级分的HPLC-反相色谱图的图；
图26显示了从白羽扇豆分离的MMP抑制级分的还原条件下的电泳图谱(图25)；
图27是显示图25中所示的不同峰级分对MMP-9活性的影响的图；
图28显示了从图25中所示的HPLC运行中收集的峰2的白羽扇豆多肽组合物；
图29比较了图28的白羽扇豆样品与几种白羽扇豆蛋白质级分的伤口闭合百分比；
图30显示了对应于图29的伤口闭合测定的图像；
图31是显示对应于图29的明胶水解活性谱的图；
图32是显示对应于图29的定量的MMP-9和MMP-2活性的图；
图33是显示细胞暴露于deflamin中48小时后，MMP-9、MMP-2及其在GH29细胞外培养基中的酶原活性的酶谱；
图34显示了用缓冲液(提取缓冲液；BE)或热处理(HT)简单提取的白羽扇豆种子之间的多肽分布的代表性图像，并通过SDS-PAGE(左)或反向明胶酶谱(右)显现；
图35显示了在凝胶顶部指定的deflamin纯化方案的每个步骤后获得的多肽谱的代表性图像；
图36是显示在沿着deflamin纯化方案的各个阶段收集的提取物中MMP-9蛋白水解活性的总凝胶化活性的图；
图37是显示在沿着deflamin纯化方案的各个阶段收集的提取物中的HT29细胞迁移的图；
图38显示了在沿着deflamin纯化方案的各个阶段收集的提取物中获得的细胞迁移的实例(图37)；
图39是显示不同浓度的deflamin对明胶水解活性的影响的图；
图40是显示不同浓度的deflamin对细胞迁移的影响的图(图41)；
图41显示了对于不同浓度的deflamin获得的细胞迁移的实例；
图42显示了不同浓度的deflamin对细胞增殖的影响；
图43显示了在还原和非还原条件下的deflamin的多肽谱，标准品的分子量以kDa表示；
图44显示了在214nm处监测的deflamin分级成其组成多肽的代表性图(HPLC反相色谱法)；
图45显示了在280nm处监测的deflamin分级成其组成多肽的代表性图(HPLC反相色谱法)；
图46显示了从图44和45中的分级收集的每个峰的多肽谱，如通过SDS-PAGE显示的；
图47是显示在图44和45中通过分离deflamin得到的级分1-4中存在的MMP-9蛋白水解活性的图；
图48是显示选择的deflamin峰(通过图44和45中的deflamin分级获得的级分1至4)对细胞迁移的影响的图；
图49显示了可溶性的deflamin级分和用Ca和Mg沉淀的那些分离的电泳图谱，其中通过Ca2+和Mg2+将白羽扇豆deflamin分成两部分；
图50显示了deflamin及其两种亚组分对HT29细胞的细胞侵袭的抑制作用，它们是否与Ca和Mg一起沉淀或不沉淀，也就是说，它表明二乙醇胺与Ca2+和Mg2+的分离会影响其抗肿瘤活性；
图51显示了白羽扇豆deflamin对与炎症和肿瘤侵袭相关的HT29细胞中特定基因转录的影响；
图52显示了食品中白羽扇豆deflamin的生物活性(在HT29细胞侵袭抑制水平)，即用于制备熟盐渍饼干时；
图53显示了通过HPLC和电泳分析白羽扇豆deflamin；
图54显示了通过MALDI-TOF对两种白羽扇豆deflamin片段的质谱分析；
图55显示了deflamin对结肠炎诱导的小鼠的抗结肠炎作用的初步结果；
图56是显示几种去纤维素给药途径(和相应的对照)对结肠炎诱导的小鼠的结肠长度的影响的图；
图57是显示几种去纤维素给药途径(和相应的对照)对结肠炎诱导的小鼠肠道损伤程度的影响的图；
图58显示了从结肠炎诱导的小鼠的不同处理组(deflamin和对照)分离的结肠的宏观观察结果；
图59显示了从结肠炎诱导的小鼠的不同处理组(deflamin和对照)分离的结肠的宏观观察结果；
图60显示了deflamin给药对结肠炎诱导的小鼠结肠炎症的组织学特征的影响；
图61显示了deflamin给药对结肠炎诱导的小鼠中COX-2和iNOS的结肠组织表达的影响；
图62是显示去纤维蛋白给药对结肠炎诱导的小鼠的MMP-2和MMP-9的结肠组织明胶水解活性的影响的图；
图63显示了酶谱图，显示了去纤维蛋白给药对结肠炎诱导的小鼠的MMP-2和MMP-9的结肠组织明胶水解活性的影响；
图64是显示deflamin给药对大鼠爪水肿发展的影响的图；
图65是显示局部去纤维素给药对大鼠爪水肿的影响的图；
图66显示用deflamin处理的结肠炎诱导的小鼠的血液和粪便的反向酶谱；
图67显示了伤口闭合测定的代表性图，显示了deflamin(纯化的、煮熟的种子和未煮熟的种子)的细胞抗迁移作用；
图68显示了在白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆种子的不同提取物浓度存在下评估细胞迁移的伤口愈合测定的代表性图；
图69显示了通过图4中描绘的图来自白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆种子分离的deflamin的SDS-PAGE；
图70是显示来自白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆的deflamin的抗明胶酶(MMP-9和MMP-2)活性的比较图；
图71是显示不同浓度的来自白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆种子的抗侵袭活性的比较图；
图72是显示在来自白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆种子的deflamin存在下细胞生长的比较的图；
图73显示了在含有明胶和HT-29培养基的聚丙烯酰胺凝胶上进行的反向酶谱分析，该培养基含有MMP-9和MMP-2，以检测其他羽扇豆种子，其他豆科植物和其他非豆科植物种子的种子包括谷物和其他中是否存在去甲胺；
图74显示了在含有明胶和含有MMP-9和MMP-2的HT-29培养基的聚丙烯酰胺凝胶上进行的反向酶谱分析，以检测在羽扇豆属的其他物种的种子中是否存在去甲胺；
图75显示了在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE进行的羽扇豆去甲胺的代表性多肽谱；
图76显示了在还原和非还原条件下进行的SDS-PAGE的黑吉豆deflamin的代表性多肽谱；
图77显示了在含有明胶和含有MMP-9和MMP-2的HT-29培养基的聚丙烯酰胺凝胶上进行的反向酶谱分析，以检测小麦属物种的种子中去甲胺的存在；
图78显示来自小麦属各种物种分离的deflamin的SDS-PAGE代表性多肽谱；
图79显示了2D-凝胶电泳IPG pH 3-6，7cm和SDS-PAGE 17.5％(w/v)丙烯酰胺/双丙烯酰胺；IEF在4,000V下进行，电流限制为50μA/条，10,000V-h；在200V下SDS-PAGE分离65分钟。
具体实施方式
技术信息
随着炎性疾病发病率的增加，医疗和药物成本的不可避免的增加正在发生。人类健康的未来似乎越来越有可能依赖于两个基本领域：传统的临床治疗法，以及治疗和预防的适当饮食(包括营养保健品和功能性食品)。据预测，持续摄入减少炎症的功能性食品和/或营养保健品将构成对抗当今现代社会的大多数疾病的最有效的人类方法。MMP抑制剂(MMPI)被认为是原发性肿瘤和转移抑制剂的抗血管生成剂，并且还被证明可有效抑制癌前状态，例如结肠炎和其他炎性肠病。在过去的十年中，大量的研究已经转向发现新的植物性食物和具有MMPI活性的化合物，但是以特定方式靶向个体MMP证明是困难的。
本发明的实施方案描述了一种新型MMPI，其本质上是蛋白质的，在消化过程中存活并且可以口服、腹膜内、静脉内或局部施用，并且可以用作营养保健品或功能性食品在预防/治疗炎症、肿瘤发生和细胞增殖以及由它们衍生的任何疾病。已显示这些MMPI是基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2的有效抑制剂，因此表现出强大的抗炎、抗肿瘤和抗增殖活性。本发明的实施方案显示deflamin为有用的营养保健品或用于预防或治疗各种疾病的功能性食品的组合物。
关于Deflamin发现的简要说明
deflamin的实施方案包括从白羽扇豆种子中提取的新型MMP-9和/或MMP-2抑制剂，并且也存在于其他种子中，两种豆类(例如鹰嘴豆和大豆)和非-豆类。这些发现导致了有希望发现deflamin，deflamin是一组水溶性多肽/小蛋白质，从一种常吃的豆科植物白羽扇豆(Lupinus albus)的可食用种子中分离出来，当口服，腹膜内，静脉内或局部给药时，其对在培养的结肠癌细胞的中MMP-9和/或MMP-具有很强的抑制活性，并且减少了动物模型中的结肠炎，而不发挥任何明显的显著细胞毒性。还发现Deflamin也可以从其他种子获得，豆类(例如鹰嘴豆和大豆)和非豆科植物。在为白色羽扇豆的情况下，在某些实施方案中，deflamin包含来自β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白大链的多肽片段。除了对pH和温度的极端值的高稳定性之外，初步证据表明它们还抵抗消化，使得这些多肽/小蛋白质成为有价值的抗炎营养药物的优良候选物。在某些实施方案中，这些新的多肽/小蛋白质可以作为抗癌药物或营养药物产生。本发明的实施方案还包括分离deflamin的有效方法，适用于按比例放大至工业规模。寻找其他物种种子中的同源物，并将在未来进一步追求。
MMPs和癌症
在过去的几十年中，已经进行了深入的研究以开发预防和治疗的新型抗癌药物。然而，尽管在诊断、筛查和治疗方面取得了重大进展，但患者的总体长期结果在过去几十年中并未发生显著变化(Herszényi等，2012)。在此背景下，人们对各种生物资源进行了大量研究，以开发对抗这种疾病的新型抗癌药物，可用于预防、帮助化疗或防止再发病，特别是在植物性食品或生物活性植物化合物，可用作预防和辅助化疗的营养保健品(Su等，2006)。多年来，植物已被证明是用于医学治疗(包括癌症)的化合物的重要天然来源。据估计，在过去的20年中，25％至30％的新药进入美国市场是在植物中发现的。在全球范围内，这些药物的非处方药价值估计每年超过400亿美元。因此，世界各地的制药公司和机构正在实施植物筛选计划，作为识别新药的主要手段。
在欧盟(EU)，结直肠癌(CRC)是癌症死亡的第二大常见原因，具有巨大的健康和经济负担。欧洲每年约有436,000例新病例和212,000例死亡。CRC患者的死亡通常由转移性疾病引起，而不是由原发性肿瘤本身引起。
基质金属蛋白酶(MMPs)是锌依赖性内肽酶家族，其参与了结缔组织的重塑(Markle等人，2010)。MMP的一个亚组，也称为明胶酶(MMP-2和MMP-9)，已被证明在动物模型和患者中主要与CRC有关。他们的抑制剂(MMPIs)被证明可有效减少体外试验和动物模型中的癌症发展/转移，并且似乎在癌症的早期阶段或预防手术后未检出的微转移的发展方面最有效(Coussens等，2002；Mook等，2004；Zucker和Vacirca，2004；Sang等，2006；Herszényi等，2012)。在过去十年中，合成MMPI的发展成为学术和工业环境中研究的重要分支，并且已经在不同的临床试验中测试了许多MMP抑制剂，尤其是MMP-2抑制剂(Hidalgo和Eckhardt，2001)。因此，鉴于MMP-2和MMP-9参与各种疾病，认为特异性MMP上调的抑制能够改善患者的临床症状。然而，由于MMPs在正常发育和生理学中普遍存在是必不可少的，因此在疾病治疗中靶向MMP已经证明是困难的，并且先前在癌症患者的治疗中抑制MMP活性的努力产生非常不令人满意的结果，具有严重的不良副作用(Coussens等，2002；Ndinguri等，2012)。因此，基于MMP结构的合成肽抑制剂迅速成为特定抑制剂研究的热点。
因为MMPs最初是作为酶原合成的(因此是无活性的)，在酶活化之前必须从前肽结构域中除去前肽(Lu等，2012；Ndinguri等，2012)，肽类药物可以直接抑制细胞外MMPs的活化，而不会影响细胞内MMPs的表达，从而避免广泛的有害的副作用(Lu等，2012)。
如今，肽研究药物设计和发现是新药开发中最有前途的领域之一。与小分子化合物相比，肽类药物具有多种优势，例如高特异性和低毒性(Lu等，2012)。在过去十年中，大量研究已转向新型植物MMPI，其对各种类型癌细胞具有临床活性。然而，由于不理解的原因，这些研究经常忽略肽和小蛋白质。已知几种植物物种具有特定的生物活性肽和小蛋白质，具有防御病原体攻击或蛋白水解抑制等功能。例如，豆类种子就是这种情况(Park等，2007)。许多来自植物食品的这些抑制剂的事实使它们成为用作营养保健品和预防癌症饮食的完美候选，特别是在结肠癌的情况下。与传统的癌症治疗方法(如化学疗法或放射性治疗)相比，对癌细胞或肿瘤促进剂具有高度特异性的肽和小蛋白质可能在保护正常细胞和帮助患者快速恢复的同时，提供了杀死癌细胞的方法(Park等，2007)。
本发现已经发现来自一些可食用种子的肽和小蛋白质对MMP酶具有强烈的抑制活性。有利地，在某些实施方案中，它们可以不改变地通过人体消化道，因此可以用于治疗结肠癌。
在CRC控制和治疗研究中使用抗消化的肽和小蛋白MMPI似乎特别合适，因为结肠内部实际上可能被认为是“体外”，MMPI不会显示出副作用的情况，除非它们被吸收到血液中。
MMPs和炎症
炎症性肠病(IBD)的全球发病率和患病率随着时间的推移而急剧增加，证明其作为一种全球疾病的出现(Molodecky等，2012；Burisch等，2014)。因为IBD的死亡率很低(Duricova等，2010；Burisch等，2014)，并且该疾病最常见于年轻人(Loftus等，2002；Burisch等，2014)，预测在接下来的几年中，IBD的全球患病率将继续大幅上升(Abraham&Cho，2009；Molodecky等，2012)。尽管在过去的几十年中已经广泛研究了IBD的病因学(Podolsky，2002)，但是其疾病发病机制尚未完全了解(Jones等，2008；Mikhailov和Fumer，2009)。
IBD包括三种类型的疾病：克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)和未定义的炎性肠病(IBDU)。它们都主要以易感个体胃肠道病理组织学中的慢性粘膜炎症为特征(Podolsky，2002；Danese等，2004；Abraham和Cho，2009；Mikhailov和Furner，2009)。虽然IBD显著降低了患者的生活质量，并且可能发展为癌症前期状态(Xie和Itzkowitz，2008；Triantafillidis等，2009)，但整体IBD临床治疗容易引起副作用并呈现非特异性靶向，其是极其昂贵的且治疗效果并不令人满意(Dyson等，2012)。根据Xie和Itzkowitz(2008)的研究，患有长期IBD的患者发生CRC的风险增加。实际上，许多导致散发性CRC的分子改变也在结肠炎相关的结肠癌发生中起作用(Xie和Itzkowitz，2008)。
大量研究已经证明了MMPs参与动物模型、细胞系、改变的组织培养和患者活组织检查中的炎症过程(Baugh等，1999；Parks等，2004；Murphy和Nagase，2008；Lee等，2013)。明胶酶MMP-9和MMP-2长期以来被认为在炎症细胞募集过程中细胞外基质蛋白的转换和降解中发挥重要作用(Malla等，2008)和其他病理相关的肿瘤过程，如肿瘤发生、细胞粘附和转移(Herszényi等，2012)。尽管MMP-2在底物选择性上相似，但它们在成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞中组成型表达，并且仅适度参与炎性疾病(Huhtala等，1991)，而MMP-9表达主要在白细胞中观察到(Van den Steen等，2002)，对各种炎症病理反应高度诱导(Van denSteen等，2002)，是溃疡性结肠炎和其他IBD期间诱发的主要明胶酶(Garg等，2009；Moore等，2011)。
这些发现使MMP-9成为IBD预防和治疗以及预防早期癌症阶段和转移性迁移的理想治疗靶点。然而，将MMP-9抑制与临床前和临床IBD减少相关的研究非常少，并且已经证明靶向MMP本身是困难的。这可以至少部分地通过长期摄取天然食物产生的特异性MMP-9抑制剂来实现，所述MMP-9抑制剂是结肠可用的，而不是血清-生物可利用的。在过去几年中，已经强调一些具有营养功能的食物在预防和治疗某些疾病方面提供有益的健康效果(Ortega，2006；Sirtori等，2009)，并且在过去十年中进行了大量研究。已经转向呈现MMPIs的新型植物性食物。
来自植物种子的MMPIs
30多年来，MMP已被全世界的研究人员视为具有吸引力的癌症靶点。结果，许多化学的MMPI被开发为潜在的抗癌药物。众所周知的例子是由四环素、唑来膦酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，10-菲咯啉、2S，3R-3-氨基-2-羟基-4-(4-硝基苯基)丁酰基-L-亮氨酸和新诺瓦斯特(注册商标)(从鲨鱼软骨分离)提供。到目前为止，已经合成了无数的MMPI，其中一些已被用作限制肿瘤发展的潜在治疗剂(Bourguet等，2012)。然而，只有少数小型MMPI进入临床试验阶段，其中大多数(例如 )由于缺乏益处或强烈的不良副作用而提前终止(Wang等，2012)。因此，到目前为止，大多数癌症临床试验都相当令人失望。还合成了小的非天然肽以试图发现新的MMPI。因此，例如，Lu等(2012)将两种非天然十二肽鉴定为MMP-2抑制剂，而发现十八肽是MMP-9抑制剂(Qiu等，2013)。
一个独特的、更新的策略是从大自然可供我们使用的众多天然产品中寻找MMPIs。
人们早就知道植物器官和组织包括种子含有代谢物、肽和蛋白质，具有一系列潜在有用的生物活性，其中许多等待发现。一种这样的生物活性涉及它们抑制MMP的能力。在这方面，Cyr(2001)报道的工作表2和表4提供了大量的植物(受胁迫和未受胁迫)，其水提取物、乙醇提取物和有机提取物对人MMP-2和MMP-9酶分别具有抑制活性。这些提取物肯定包含次级代谢物，如以下另外的实施例所示。WithaferinA是一种甾体内酯，衍生自Acnistusarborescens、催眠睡茄和其他茄科成员，以及它的一些稳定衍生物(如3-azidowithaferin A；Rah等，2012)，消除了分泌型MMP-2表达和活性。还报道了黄酮类白杨素、芹菜素、染料木黄酮及其均配铜(II)复合物可减弱转移相关基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和分泌(Spoerlein等，2013)。
据报道，许多种子都含有MMPIs，例如来自葡萄(La等，2009)、大豆、向日葵(Ceccoli等，2010)和干龙眼(Euphoria longana Lam.)(Panyathep等，2013)的种子。在葡萄的情况下，原花青素是MMP抑制剂(Vayalil和Mittal，2004)，而在大豆的情况下，类黄酮染料木黄酮和肽lunasin(见下文)似乎是活性成分。
此外，通过含有多种蛋白质酶抑制剂，例如胰蛋白酶抑制剂和Bowman-Birk抑制剂，种子和豆科植物种子长期以来已经被认识到。来自大豆和鹰嘴豆的那些表现出昆虫活动。另一方面，已报道Bowman-Birk抑制剂可防止肿瘤发生并影响抗微生物活性。因此，Birk(1996)得出结论，当与人类相关时，应谨慎解释蛋白酶抑制剂对动物的体外作用。然而，应该注意的是，所有这些蛋白质酶抑制剂都通过热(包括烹饪)处理而失活。在这方面，是来自大豆、大米、豌豆或羽扇豆的蛋白质或糖蛋白，以及已知抑制MMP的其他植物提取物(Stuhlmann和Joppe，2013)。
对Lunasin的特别描述
值得一提的是来自大豆的Lunasin。Lunasin是一种具有43个氨基酸的残基、化学预防肽，最初在大豆中被鉴定，然后声称也存在于大麦、小麦、黑麦、黑小麦、龙葵和苋属种子中(Jeong等，2007)。使用针对43个氨基酸残基大豆lunasin制备的单克隆抗体，Herrera(2009)进行了详细研究，以检测总蛋白质提取物中的这种肽以及来自栽培和野生的羽扇豆种子的可溶性级分。申请人未能检测到来自白羽扇豆的白蛋白或球蛋白组分中的lunasin。在羽扇豆属的分析物种中，在具有种皮的白羽扇豆种子的醇溶蛋白部分中的lunasin和分别来自变色羽扇豆和L.stipulates种子的白蛋白和谷蛋白部分获得了阳性免疫信号。在没有种皮的白羽扇豆，和有和没有种皮的变色羽扇豆的种子的蛋白提取物中没有检测到Lunasin。对于大于25kDa的多肽条带获得免疫反应，该结果可能源自在羽扇豆子叶中具有凝集素活性的凝集素或贮藏蛋白的存在，已知通过SDS-PAGE分离并印迹到膜中后识别并结合糖基化的IgG。米切尔等(2013)找不到谷物中编码lunasin的基因(或基因片段)，并确认其存在于大豆和花生中。
Lunasin是小亚基肽(SEQ ID NO：191)，衍生自较大的子叶特异性2S种子白蛋白(Gm2S-1)复合物，其具有抗癌和抗炎活性。大规模的动物研究和人体临床试验确定了lunasin在体内的功效受到了合成lunasin的成本和缺乏从植物来源获得克数量的高纯度lunasin的方法的阻碍(Seber等，2012)。开发了一种可扩展的方法，该方法依次利用阴离子交换色谱、超滤和反相色谱。该方法产生纯度为0.99％的lunasin制剂，产率为442mg/kg脱脂大豆粉。lunasin行动的提出模式，正如由Kyle等人(2012)图4中作者提出的，不包括MMP抑制的作用，即lunasin似乎不与MMP物理相互作用。相反，物理相互作用似乎发生在lunasin和染色质和组蛋白之间(Jiang等，2016)。
羽扇豆种子贮藏蛋白的简要参考
羽扇豆中的主要种子贮藏蛋白，称为羽扇豆球蛋白，已被分为四个家族：α-羽扇豆球蛋白、β-羽扇豆球蛋白、γ-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白。β-羽扇豆球蛋白是羽扇豆中的主要种子球蛋白，是豌豆球蛋白或种子贮藏蛋白的7S成员，而α-羽扇豆球蛋白是豆科蛋白或种子贮藏蛋白的11S成员。在窄叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)中，先前总共鉴定了三个α-扇豆球蛋白，七个β-羽扇豆球蛋白，两个γ-羽扇豆球蛋白和四个δ-羽扇豆球蛋白编码基因(Foley等，2011，2015)。这些基因被称为羽扇豆球蛋白α1、羽扇豆球蛋白α2和羽扇豆球蛋白α3，羽扇豆球蛋白β1、羽扇豆球蛋白β2、羽扇豆球蛋白β3、羽扇豆球蛋白β4、羽扇豆球蛋白β5、羽扇豆球蛋白β6和羽扇豆球蛋白β7，羽扇豆球蛋白γ1和羽扇豆球蛋白γ2，以及羽扇豆球蛋白δ1、羽扇豆球蛋白δ2、羽扇豆球蛋白δ3和4。此外，所得多肽经历广泛和复杂的加工和组装过程，导致高度微观异质性，这是这些蛋白质的特征。
以羽扇豆2S蛋白为例，在该属中特别称为δ-羽扇豆球蛋白属于2S富含硫的白蛋白家族。羽扇豆种子2S白蛋白，也称为δ-羽扇豆球蛋白(Sironi等人，2005)，是一种单体蛋白质，其包含通过两个链间二硫键连接的两条小多肽链：较小的多肽链，其由37个氨基酸残基组成，导致分子量为4.4kDa，较大的多肽链含有75个氨基酸残基，分子量为8.8kDa(Salmanowich和Weder，1997)。从基因序列推断出白羽扇豆δ-羽扇豆球蛋白的唯一氨基酸序列。较大的多肽链含有两个链内二硫键和一个游离巯基(Salmanowich和Weder，1997)。这种蛋白质在来自白白羽扇豆的蛋白质中具有独特的特征：除了高半胱氨酸含量外，它在280nm处具有低吸光度。
就δ-羽扇豆球蛋白的生理作用而言，已经提出了这类蛋白质的储存功能。与植物谷物抑制剂家族(包括双功能胰蛋白酶/α-淀粉酶抑制剂)的结构相似性可表明该蛋白质的保护功能以及其储存作用。它在白羽扇豆种子中的含量被评估为约10％至12％，但是最近的数据表明较低的含量为约3％至4％。羽扇豆种子2S白蛋白通常存在于白蛋白和球蛋白级分中(Salmanowich和Przybylska，1994)，因此解释了我们之前获得的两种蛋白质级分中MMP抑制活性的结果(Lima等，2016)。
Blad的简明定义
Blad是20,408.95Da，173个氨基酸残基的多肽，其包含β-羽扇豆球蛋白前体的残基109-281(即前体-β-羽扇豆球蛋白)。β-羽扇豆球蛋白是球蛋白，是来自羽扇豆种子的主要贮藏蛋白(图1、2和3；Monteiro等，2003，2006)。在自然条件下，Blad在萌发开始后第4天和第14天之间积累在羽扇豆幼苗的子叶中。
食品特别是大豆中的抗癌活性
已发表的文献中有大量关于大多数食用食品的抗癌活性的证据。豆类种子也不例外，这些研究主要集中在大豆上。因此，有大量证据表明大豆中存在的化合物可以在许多不同的器官系统中预防癌症。这些包括Bowman-Birk抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、植酸、β-谷甾醇、异黄酮(例如染料木黄酮和大豆苷元)和皂苷(Kennedy，1995)。据报道，豆科种子蛋白质和尤其大豆蛋白质(包括BBIs)在各种动物模型中在抗癌和抗转移水平中发挥作用(Roy等人，2010)。Champ(2002)报道，来自大豆的BBI抑制或阻止小鼠、大鼠和仓鼠中化学诱导的肝、肺、结肠、口腔和食道癌的发展。Kennedy和Wan(2002)在体外观察到50至100μg大豆BBI/mL降低了前列腺癌细胞迁移。在体外、动物模型和人类IIa期临床试验中，BBI抑制MMP并显示出对抗肿瘤细胞的功效(Losso，2008)。
目前，没有专门针对慢性炎症的处方药。(当然，还有非处方药，用于治疗由于受伤或过程如手术引起的轻微和暂时性炎症以及伴随的疼痛。但是，这些并不意味着治疗慢性炎症。)曾经用于对抗疟疾的一些药物，如羟氯喹，可用于治疗一些狼疮患者，但它们并不能治愈这种疾病。阿司匹林和他汀类药物在减少某些人的炎症方面显示出前景，但研究人员并不确定这类药物在这方面的作用有多广泛。除了远非完美的抗炎药物，例如泼尼松(一种皮质类固醇，它带来了一系列副作用)，科学家们仍在研究如何最好地控制炎症。
细胞入侵和整合素
已大概确定结肠直肠癌患者的死亡通常由转移性疾病而非原发性肿瘤本身引起。转移涉及从原发性肿瘤释放癌细胞并附着于另一组织或器官。因此，癌细胞侵袭是转移中的关键因素，并且需要a)用于粘附/去粘附的整合素和b)用于聚集蛋白水解的基质金属蛋白酶(MMP)。
需要局部蛋白水解来打开细胞外基质中的路径以使癌细胞穿过。伤口愈合测定提供了细胞对细胞侵袭能力的估计。通常，MMP-9活性与癌细胞侵袭高度相关，因此MMP-9活性的降低抑制细胞侵袭，并且这两种活性通常是成对的。这就是为什么MMP-9抑制是如此需要的原因，因为它直接抑制细胞侵袭，因此通过转移抑制死亡。
另一方面，细胞通过称为整合素、跨膜受体的特定蛋白质粘附于底物，所述跨膜受体是细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用的桥梁。整联蛋白对组织培养中的细胞的一个重要功能是它们在细胞迁移中的作用。最近的研究表明，整合素受肿瘤发展和转移调节，并与MMP-9和MMP-2活性紧密相关(Hood和Cheresh，2002)。在癌细胞膜中靶向和失活整联蛋白也是可取的，因为当细胞从肿瘤中释放时，它们缺乏附着于另一组织的能力。这也将抑制转移，甚至可以帮助解剖原发肿瘤。
细胞增殖和代谢
许多研究的另一个目标是对癌细胞的特异性细胞毒性。许多生物活性化合物，如酚类化合物，可以强烈地减少细胞生长并损害新陈代谢，在高剂量时达到毒性水平。在生物活性化合物存在下，测量细胞生长和细胞代谢是其对细胞毒性的直接量度。MTT测定使用特定的着色剂，其需要被活细胞吸收，然后通过它们代谢以产生紫色，然后通过分光光度法定量。如果细胞死亡或代谢受损，则不会产生着色。因此，更高水平的颜色表明更多数量的活的、代谢活跃的细胞。如果化合物减少细胞生长或杀死细胞，则颜色水平会降低。
从理论上讲，靶向和杀死癌细胞是一种很好的方法。然而，它只有在对癌细胞具有高度特异性而不对健康、正常(即非癌症)细胞具有高特异性时才有效。大多数破坏癌细胞的化合物也会在给定剂量下破坏正常的健康细胞，虽然许多研究只关注代谢物(如酚类化合物)减少癌细胞生长的能力，但它们通常不会考虑它们对健康细胞的控制的影响。为什么这是相当常见的原因之一，涉及这样的事实：即与正常的健康细胞不同，在实验室条件下培养癌细胞相对简单。因此，后来，在临床前或甚至临床试验的水平上，这些化合物的使用受到剂量限制性毒性、临床益处不足和极端不良副作用的阻碍。
因此，减少细胞侵袭但不影响细胞正常代谢的生物活性剂(如具有deflamin的情况下)很可能会产生较少的副作用，并且在预防性长期给药中使用更安全，因为它不会对常规结肠细胞产生细胞毒性。
直到大约二十年前，生物科学才“醒来”进入次级代谢。这包括更基本的生物化学和分子生物学，以及更接近应用的领域，如农业、人类健康和营养。在过去的20年中，25％至30％的新药进入美国市场是在植物中发现的。在全球范围内，这些药物的非处方药价值估计每年超过400亿美元。然而，生物活性次级代谢物与小蛋白质/多肽之间的剂量依赖性生物活性存在主要差异，例如本文件中提到的那些。
生物活性有益的次级代谢物(例如抗氧化剂多酚)通常在低浓度下有效。然而，在特定阈值以上，它们变得剧毒。相反，小蛋白质/多肽要么是天然地是有益的(例如deflamin)，要么是有毒的(例如蓖麻毒素和存在于蛇和蝎子的毒液中的蛋白质)。
材料和方法
材料、溶剂和试剂
2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)5％(w/v)水溶液购自Sigma Chemical Co.Ketamine(1000)和甲苄噻嗪(Rompun 2％)购自Bio2 Produtos Veterinários(Lisbon，Portugal)。其他所有试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)。染料淬灭的(DQ)-明胶购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。
抗菌活性的测量
使用Bouhdid等人(2010年)描述的微量稀释方法在无菌96孔板(Greiner Bio-one，德国)中评估deflamin的抗菌活性。简而言之，将50μL的Müller-Hinton培养基(Biokar，法国)和50μL的deflamin溶液(以获得deflamin浓度为100μg/mL)加入第一个孔中，并以1∶2连续稀释至每个相邻的孔，最多10个稀释液。随后，将50μL浓度为2×105的UFC/mL的细菌悬浮液加入孔中。进行阳性对照(50μL的Müller-Hinton培养基+50μL细菌悬浮液)和阴性对照(100μL的Müller-Hinton培养基)。将平板在37℃温育24小时，并在接种开始时和测定结束时在546nm(Synergy HT，Biotek，USA)读取吸光度。
抗真菌活性的测量
通过向培养皿中生长了1周龄真菌培养物中加入20mL无菌水来制备孢子悬浮液，其培养皿中含有PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)作为培养基。生长条件为25℃±1℃，在黑暗中。过滤孢子悬浮液并使用血细胞计数器调节至105孢子/mL的浓度。将孢子悬浮液(100μL)加入含有PDA培养基的培养皿中，并用无菌耙子彻底铺展在培养皿的表面上。将由无菌滤纸(直径6mm)制成的圆盘，浸泡在6μL的deflamin溶液(100μg/mL)中，并沉积在培养基的表面上。通过用6μL无菌水浸泡无菌滤纸盘来制备对照品。然后，将培养皿储存在培养箱(25℃，黑暗中)中，并在2周时间内监测真菌生长。
最小抑制浓度(MICs)
使用如前所述的微量稀释方法(Bouhdid等人，2010)，在无菌96孔板(GreinerBio-one，德国)中评估最小抑制浓度(MIC)。简而言之，向每个孔中加入50μL的RPMI培养基。然后，将50μL每种样品加入第一个孔中，并以1∶2连续稀释至每个相邻的孔，最多10个稀释液。随后，向孔中加入50μL浓度为2×105个细胞/mL的HT29细胞悬浮液。进行阳性对照(50μL的RPMI培养基+50μL细胞悬浮液)和阴性对照(100μL的RPMI培养基)。将平板在37℃温育24小时，并通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定法测量细胞生长(Carmichael等，1987)。对于MMP-9MIC测定，收集来自每个孔的培养基，并用DQ-明胶测定明胶水解活性，如下所述。
种子
在某些实施方案中，使用以下豆科植物物种的干种子：白羽扇豆(Lupinus albusL.)、鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)和大豆(Glycine max L.)。在需要时，还使用其他豆类种子：小扁豆(Lens culinaris M.)、菜豆(Phaseolus vulgaris L.)、豌豆(Pisum sativumL.)、蚕豆(Vicia faba L.)和豇豆(Vignaunguiculata L)。
煮熟的种子
豆类种子，和已知的许多其他种子一样，含有抗营养因子，如消化酶抑制剂、凝集素、高植酸浓度、非蛋白质氨基酸等。因此，必须在烹饪后摄取它们以确保蛋白质抗营养因子的变性。由于这些原因并且因为发现deflamin抵抗沸腾，使用煮熟的种子进行了许多初始实验。为模拟烹条条件，将干燥的种子在蒸馏水(w/v)中煮沸，直至获得柔软、适合食用的质地(Xu和Chang，2008)。
蛋白质和非蛋白质化合物的提取和总可溶性蛋白质的提取
总可溶性蛋白质的提取
在某些实施方案中，来自种子的总可溶性蛋白质提取出来，提取条件是：在室温下搅拌2至3小时，在100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)中，以1∶5(w/v)的比例，含有聚乙烯基聚吡咯烷酮(0.5g的PVPP/0.5g鲜重)，并在4摄氏度下搅拌4小时。然后，将浆液在4摄氏度下以12,000g离心60分钟(Beckman J2-21M/E，rotor JA 20.000)。保留上清液并储存在-20℃的冰箱中。
非蛋白质化合物的提取
对于总酚提取，将种子研磨成粉状物质，用正已烷脱水，并通过每1g鲜重加入10mL丙酮水溶液(50％，v/v)进行提取。将样品在室温下搅拌4小时，并在4摄氏度下以12,000g离心10分钟(Beckman J2-21M/E，rotor JA 20.000)。重复该过程两次，收集上清液，合并并冷冻储存用于进一步分析。将上清液在60℃蒸发直至干燥，将得到的提取物重悬于反应缓冲液(50mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.6，含有150mM的NaCl，5mM的CaCl2和0.01％v/v吐温20，含12％v/v乙醇)。
从种子中提取和分离Deflamin
在这部分工作中使用了干燥白羽扇豆(Lupinus albus L.)的成熟种子。在某些实施方案中，对其他物种的种子遵循相同的程序。使用其抵抗沸腾和酸变性的能力分离MMPI蛋白质提取物。开发了一种从种子中分离出deflamin的方法，该方法适合于按比例放大至工业规模(图4)。
在一个实施方案中，纯化deflamin的方法是遵循连续沉淀方案的清洁步骤。它基于deflamin对高温、低pH和高乙醇浓度的抵抗力，并涉及以下步骤：
-将约100g±0.1g干燥的羽扇豆种子(没有胚和皮)研磨成粉状物质。
-用正已烷将粉状物质脱脂，然后悬浮在水中(1∶20w/v；pH调节至pH＝8.0-8.5)，在室温下搅拌2-3小时或
-在将粉状物质悬浮于水(1∶20w/v；pH调节至pH＝8.0-8.5)中，在室温下搅拌2-3小时后，将脂肪从浆液上方简单地除去。作为水的替代物，在实验室规模，粉状物质可以悬浮在pH＝7.5的50mM的Tris-HCl缓冲液中。在4℃(或过夜)下搅拌4小时后，通过在4℃以13,500g离心30分钟获得可溶性蛋白质；弃去沉淀物。
-将蛋白质溶液在100℃下，煮沸10分钟，并在4℃下以13500g离心20分钟；弃去沉淀物；收集上清液，并提供热处理的提取物(HT)。
-通过加入稀释的HCl至pH＝4.0沉淀上清液中的多肽/蛋白质；在4℃以13,500g离心20分钟后，弃去上清液。
-将沉淀重悬于含有0.4M的NaCl的40％(v/v)乙醇中，在室温下搅拌1小时，并在4℃下以13,500g离心30分钟；该处理使得deflamin成为溶液，不同于绝大多数种子贮藏蛋白；将颗粒弃去。
-将上清液制成90％(v/v)乙醇，在-20℃下保存过夜，沉淀出去纤维素，然后在4℃以13,500g离心30分钟；弃去上清液。
为获得最佳结果并获得更纯和更清洁的deflamin馏分，应重复40至90％(v/v)乙醇进行差异沉淀；从而，
-将存在于沉淀中的Deflamin再次溶解在含有0.4M的NaCl的40％(v/v)乙醇中，在室温下搅拌1小时并在4℃下以13,500g离心30分钟；第二次洗涤清洗掉deflamin的最终污染物；再次弃去沉淀物。
-将上清液再次制成90％(v/v)乙醇并在-20℃下储存过夜，沉淀出去纤维素，然后在4℃以13,500g离心30分钟；弃去上清液。
-最终的颗粒含有纯的deflamin，随后溶解在尽可能小体积的Milli-Q水中；在实验室规模下，最终将deflamin溶液在Sephadex G-25柱(NAP-10柱，GE Healthcare LifeSciences)中脱盐，以除去低分子量污染物。
-将获得的提取物储存在-20℃的falcon管中。
该方法成功地从白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆中分离出deflamin。
高效液相色谱法测定Deflamin的馏分
在某些实施方案中，将deflamin组成多肽在配备有Waters 2998光电二极管阵列检测器的高效液相色谱(HPLC)装置(Waters 2695Separations Module)中分级分离。蛋白质样品在C18反相柱中分离，Zorbax 300SB 5μm，250mm×4.6mm。用洗脱剂A(0.1％v/v三氟乙酸，TFA)和溶剂B(乙腈在0.1％v/v TFA中)进行洗脱。在214nm和280nm处进行峰值检测。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
在某些实施方案中，样品用100mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝6.8)处理，含有100mM的β-巯基乙醇、2％(w/v)SDS、15％(v/v)的甘油和0.006％(w/v)的间甲酚紫，在100℃加热5分钟。按照Laemmli(1970)描述的方法，在12.5％(w/v)丙烯酰胺溶解凝胶和5％(w/v)丙烯酰胺堆积凝胶中进行一维电泳，并在垂直电泳装置中以100V和20mA/凝胶进行。将凝胶在10％(w/v)TCA中固定20分钟，并在0.25％(w/v)考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)、25％(v/v)2-丙醇和10％(v/v)乙酸中染色。在25％(v/v)2-丙醇和10％(v/v)乙酸的溶液中进行脱色。
质谱(MS)分析
在某些实施方案中，在信息依赖性采集(IDA)模式下，通过LC/MS在5600TripleTOF上分析选择的分离峰。通过液相色谱(nanoLC Ultra 2D，)在MicroLC柱ChromXPTM C18CL反相柱(300μmID×15cm长，3μm颗粒，孔径，)上以5μL/min分离肽。用多步梯度将肽洗脱到质谱仪中：0-2分钟线性梯度从5到10％，2-45分钟线性梯度从10％到30％，和45-46分钟到35％的乙腈在0.1％的F A。使用具有50μm内径(ID)不锈钢发射器(New Objective)的电喷雾电离源(DuoSprayTM Source，AB Sciex)将肽洗脱到质谱仪中。
对于信息依赖性采集(IDA)实验，质谱仪设置为扫描全光谱(350-1250m/z)250ms，然后进行多达100次MS/MS扫描(动态累积时间为100-1500m/z)-超过强度阈值1000的前体至少30ms-以保持3.3s的循环时间)。候选离子的电荷状态+2和+5之间，并且计数超过每秒10个计数的最小阈值被分离用于分裂，在将这些离子添加到排出列表中25秒(质谱仪，其通过TF1.6操作，)之前收集一个MS/MS谱。使用滚动碰撞，碰撞能量扩展为5。对每个样品进行两次IDA实验，第二次分析使用先前鉴定的肽的排除列表进行。
使用Protein Pilot TM软件(v 5.0，)鉴定蛋白质，其具有以下搜索参数：来自2016年3月的uniprot数据库的鉴定，对肽样品没有烷基化或消化。作为蛋白质过滤的标准，我们使用1.3未使用的评分值和95％肽置信度过滤和＞0贡献。
细胞培养
生物材料
在整个这项工作中使用从44岁白人女性的腺癌获得的人结肠腺癌细胞系HT29(ECACC 85061109)。将HT29细胞系维持在RPMI培养基中，该RPMI培养基补充有10％(w/v)热灭活的胎牛血清(FBS)和200mM谷氨酰胺，2×104的IU.mL-1青霉素和20mg.mL-1链霉素，在37℃下，在5％(v/v)CO2的潮湿气氛中。通过倒置显微镜进行细胞活力的常规观察。
细胞增殖、粘附性和活力测定
将HT29培养的细胞接种在96孔板(2×104/孔)上，将样品以所需浓度(例如100μg/mL)加入生长培养基中并培养24小时。每次处理后，收集细胞外培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，以除去未附着的细胞。用磷酸盐缓冲溶液中的0.15％(w/v)胰蛋白酶收获附着于底部的细胞。如Carmichael等人(1987年)所述，使用标准的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定法测定细胞增殖和活力。使用血细胞计数器测定细胞数，用台盼蓝染色，其允许量化a)细胞粘附，b)细胞毒性，和c)细胞生长。所有处理在至少三次独立的实验中一式两份进行。
细胞迁移测定：体外伤口测定
在某些实施方案中，对于细胞迁移分析，进行伤口愈合测定。将HT29细胞(5×105个细胞/孔)接种在6孔板中并使其达到80％汇合。通过在细胞单层上划一个划痕来创建开放间隙，从而模仿伤口，从而进行“受伤”。然后，用PBS洗涤细胞两次，以除去漂浮的碎片。随后，用不同浓度(例如100μg/mL)的新鲜培养基填充每个孔，并使其生长至48小时，该培养基存在或不存在不同浓度的潜在抑制剂。在处理结束时，确定每个孔的划痕区域中的侵入区域或细胞数量，并与0小时的初始区域进行比较，并在相差显微镜下拍摄细胞。计算在处理开始时将细胞迁移到裸露区域所覆盖的区域。该比较允许我们评估每种蛋白质级分对HT29细胞迁移能力的抑制作用(如果有的话)。从每次三次处理的三至五个随机视野中计算细胞迁移面积，并表示为与时间0相关的百分比(在处理开始时通过迁移细胞覆盖到裸露区域的面积)。
酶法测定：deflamin对MMP-9和MMP-2催化活性的影响
用MMP-9进行明胶水解活性定量分析
对于荧光明胶测定，DQ-明胶购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)并以1mg/mL溶解于水中。在测定缓冲液(50mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.6，含有150mM的NaCl，5mM的CaCl2和0.01％v/v吐温20)中制备所有溶液和稀释液。在所有实验中，DQ-明胶以2.5μg/mL的浓度使用。
向96孔板宏观测定板(升气管，96孔，黑色)中加入0.1nM(最终体积为200μL)的酶(MMP-9，Sigma)。对于抑制剂测试，加入所需量的抑制剂(例如100μg/mL)，并将板在37℃下温育1小时。随后，加入终浓度为2.5μg/mL的DQ-明胶，并再次培养1小时。然后，测量荧光水平(例如485nm/em.530nm)。在每个实验中，包括阳性(无抑制剂)和阴性(无酶)对照品，以校正蛋白质样品中存在的可能的蛋白水解活性。通过减去它们各自的阴性对照来校正所有数据。
细胞培养基中的明胶水解活性定量分析
收集细胞外HT29培养基以量化暴露于不同抑制剂后存在的明胶水解活性。检测到的活性是由于酶MMP-9和MM-2的存在。除了将来自每种处理的HT29培养基加入到每个孔(150μL)中之外，采用与前述相同的方式进行测定。
结肠组织的总明胶水解活性
在暴露于deflamin提取物处理的小鼠结肠中测定组合的MMP-9和MMP-2活性，如Medina等人(2006年)所述，几乎没有任何改动。简言之，将结肠组织以l/100比例(w/v)在含有150mM的NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.6)中匀浆。将样品超声处理三次，每次间隔1秒，每次10秒。用冰处理10分钟后，将蛋白质提取物在13,000g和4℃下离心10分钟，保留上清液，并通过Lowry方法(Lowry等，1951)的改进测定蛋白质浓度。将样品储存在-80℃直至测定。如上所述，从每个结肠中提取蛋白质用于量化各自的明胶水解活性。购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的荧光底物染料淬灭(DQ)-明胶用于定量MMP-9和MMP-2活性。按照制造商的说明，将DQ明胶溶于1mg/mL的水中。在测定缓冲液(50mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.6，含有150mM的NaCl，5mM的CaCl2和0.01％v/v吐温20)中制备所有溶液和稀释液。使用96孔微量测定板(升气管，96孔，黑色)。将来自每个处理的每种结肠组织上清液加载(100μL)于每个孔中。随后，将DQ-明胶(终浓度为2.5μg/mL)加入各孔中，并将板培养1小时。测量荧光水平(例如485nm/em.530nm)。通过减去相应的阴性对照来校正所有数据。
酶谱
在酶谱分析中，检测到两种酶(MMP-9和MMP-2，通常称为明胶酶)以及它们相应的酶原或前酶(pro-MMP-9和pro-MMP-2)。根据定义，由于存在通常阻断进入活性位点的氨基酸短序列(称为前序列)，酶原或前酶是无活性的。在目前情况下，以这种形式合成MMP酶以防止例如它们在蛋白质合成期间开始降解核糖体同时仍然附着于核糖体。通过这种方式，这些蛋白质以无活性形式合成，并在其作用位点转化为其成熟的天然形式。在这里描述的酶谱测定中，前明胶酶也变得活跃，因为它们被SDS变性，从而暴露催化位点。因此，酶谱凝胶中的酶原质稍高，因为它们仍然保持半胱氨酸开关的短氨基酸序列。
明胶酶谱
根据具有如下变化的标准方法进行明胶酶谱分析：确定HT29癌细胞系的培养上清液中的金属蛋白酶活性，与1％(w/v)共聚的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12.5％w/v丙烯酰胺)制备明胶。用含有62.6mM的Tris-HCl pH＝6.8，2％(w/v)SDS，10％(v/v)甘油和0.01％(w/v)溴酚蓝的非还原缓冲液处理细胞培养上清液，和装入每个孔中。在100V下进行电泳2小时。电泳后，将凝胶在复性缓冲液(2.5％v/v Triton X-100)中洗涤三次，每次60分钟，以除去SDS。然后，将凝胶与显影缓冲液(50mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4，含有5mM的CaCl2，1μM的ZnCl2和0.01％w/v叠氮化钠)一起培养过夜。将凝胶用0.5％(w/v)考马斯亮蓝G-250染色30分钟，并用甲醇∶乙酸∶水(50∶10∶40)的溶液进行脱色。通过使用图像处理软件测量峰面积的光密度测定法测定蛋白质的条带强度。
反向明胶酶谱
如Hawkes等人(2001年，2010年)所述，在经过一些修改的情况下，反向明胶酶谱用于检测和定量不同样品中的MMPI蛋白质。用酶谱缓冲液(313mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝6.8，含有10％(w/v)SDS，50％(v/v)甘油和0.05％(w/v)溴酚蓝)处理蛋白质样品，并加载在SDS-聚丙烯酰胺(12.5％w/v丙烯酰胺)平板凝胶中，与明胶(1％w/v)和来自表达MMP-2和MMP-9或不同MMP-9浓度的细胞系(例如1μmol/mL)的条件培养基(1.0mL)共聚。如上所述进行电泳，并将凝胶在2.5％(v/v)Triton X-100中洗涤三次(每次60分钟)，以除去SDS，并如上所述孵育过夜用于底物酶谱。凝胶用0.5％(w/v)考马斯亮蓝G-250染色。暗区标志着MMPI介导的明胶降解抑制。在白色背景下可见的暗带标记了MMPI介导的明胶降解抑制(Hawkes，2001)。
结肠提取物的明胶酶谱
为了确定结肠提取上清液中的特异性金属蛋白酶的活性，根据具有以下变化的标准方法(Toth等，2012)进行明胶酶谱分析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12.5％w/v丙烯酰胺)与1％(w/v)明胶共聚合。结肠提取上清液，预先用含有62.6mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝6.8，2％(w/v)SDS，10％(v/v)甘油和0.01％(w/v)溴酚蓝的非还原缓冲液处理，将其装入SDS-凝胶的每个孔中。如上所述，在12.5％(w/v)丙烯酰胺溶解凝胶和5％(w/v)丙烯酰胺堆积凝胶中进行电泳，在垂直电泳装置中，在200V和20mA/凝胶下进行电泳。电泳后，将凝胶在2.5％(v/v)Triton X-100中洗涤三次，每次60分钟，以除去SDS。然后，将凝胶与显影缓冲液(50mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4，含有5mM的CaCl2，1μM的ZnCl2和0.01％w/v叠氮化钠)一起温育两天。在50％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸中用考马斯亮蓝G-250染色30分钟，用50％(v/v)甲醇、10％(v/v)乙酸的溶液进行脱色。在蓝色背景下，可见的白色条带标记了每种蛋白酶的明胶水解活性(Toth等人，2012)。
实验性炎症疾病的动物模型
结肠炎炎症模型
动物
将雄性CD-1小鼠，25至30g体重和5至6周龄(Harlan Iberica，Barcelona，Spain)饲养在标准聚丙烯笼中，随意获取食物和水，在室内的受控环境中饲养，该室内环境是：里斯本大学中央动物设施药学院，22摄氏度±1摄氏度，12小时光照，12小时黑暗周期。
动物护理和体内实验的维护
根据英国伦敦皇家出版局出版的“英国内政部动物操作指南(科学程序)法1986”中的内政部指导和美国国立卫生研究院出版的“实验动物护理和使用机构动物研究委员会指南”(NIH出版物编号85-23，1996年修订)以及目前采用的EC法规(指令2010/63/EU)进行了实验。最后，所进行的研究符合ARRIVE动物研究报告指南，摘要见http：//www.nc3rs.org.uk。该实验方案也得到了里斯本大学药学院伦理委员会的认可。此外，里斯本大学药学院的同事获得了葡萄牙兽医总局的许可，可以协调和开展独立的动物研究。所有研究均使用体重为100至150g的雄性5周龄Wistar大鼠(Harlan Iberica，巴塞罗那，西班牙)进行。所有动物均随意接受标准饮食和水。
使用Deflamin的口服给药(p.o.)的结肠炎模型
实验性结肠炎的诱导
如前所述，将2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)作为结肠内单剂量滴注(Impellizzeri等，2015)。简而言之，小鼠在24小时内保持不动。在诱导日(第0天)，用100mg/kg氯胺酮和10mg/kg赛拉嗪麻醉小鼠。然后，通过小心插入的导管给予100μL的TNBS溶液直至结肠中4.5cm。将小鼠在Tredelenburg位置保持1分钟以避免回流。诱导4天后，将小鼠麻醉，并通过心脏穿刺收集血液样品。通过颈椎脱臼对小鼠实施安乐死并进行尸体剖检。通过中线切口打开腹部。取出结肠，从周围组织中取出，并纵向打开以观察和分类腹泻严重程度。然后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤结肠，用于宏观观察组织，并进行生化分析或随后在多聚甲醛中固定以用于进一步处理。
实验组
如上所述，将动物随机分配到四个实验组中：
1.假手术组(n＝6)：对动物进行上述步骤，除了结肠内给药使用100μL盐水溶液。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水。
2.乙醇组(n＝6)：对动物进行上述步骤，除了结肠内给药使用100μL的50％(v/v)乙醇/水溶液。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水。
3.TNBS组(n＝10)：给动物施用100μL在50％(v/v)乙醇中的2.5％(w/v)TNBS。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水。
4.TNBS+提取物(或deflamin)组(n＝10)：给动物施用100μL在50％(v/v)乙醇中的2.5％(w/v)TNBS。在方案的4天期间，给动物口服(p.o.)提取物(或deflamin；15mg/kg)。
从最初施用TNBS后3小时开始，通过胃管饲法每天进行口服给药。
结肠炎严重程度的宏观评估
除去结肠后，对实验组不知情的观察者进行纵向切口，以观察腹泻严重程度的含量和分类。然后，用盐水冲洗结肠，并通过手术显微镜肉眼观察，以更仔细地观察组织并捕获病变图像。然后，测量结肠以及损伤程度(如果存在的话)。
出血性损伤的评估
粪便血红蛋白，作为出血性损伤的指标，使用免疫比浊定量法(Kroma Systems)进行测定。
组织学和免疫组织化学过程
取出结肠，在室温下，在PBS中的4％(w/v)多聚甲醛中固定72小时，通过梯度乙醇系列脱水，并包埋在石蜡中(每组n＝3)。如前所述(Rocha等，2015)进行苏木精和伊红(H&E)染色，并使用亮视野Axioscop显微镜(Zeiss，德国)获得图像。
在微观截面上的炎症程度和结肠损伤从0到3∶0进行半定量分级，没有病变的正常结肠，厚度均匀的粘膜，连续隐窝，正常隐窝结构，无细胞浸润、水肿或渗出物，无炎症迹象；1.结肠轻度病变，粘膜糜烂，小表面溃疡沿结肠长度散在，伴有轻微隐窝丢失和单核细胞浸润；2.结肠中度病变，肠道广泛侵蚀和溃疡，伴有中度隐窝丢失和中性粒细胞浸润；3.结肠非常严重溃疡，粘膜薄，隐窝丢失，中性粒细胞和急性炎性渗出物浸润明显增加。
对于免疫染色，在室温下在黑暗中，将6μm厚的切片在含有1.5％(v/v)H2O2的20mM柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复15分钟，在Tris/EDTA缓冲液中于84℃温育10分钟。在室温下，在PBS中的1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)中封闭1小时。将一抗[兔抗COX2(CellSignaling#4842，1∶100)和小鼠抗iNOS(BD Transduction Laboratories#610328，1∶100)]在PBS中的0.5％(w/v)BSA中在4℃条件下过夜。在PBS中洗涤后，在室温下，将切片与抗兔与辣根过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnology，1∶5000)在PBS中的0.5％(w/v)BSA中培养1小时，在SIGMAFAST DAB中用Metal Enhancer(Sigma，美国)培养10分钟，并用Entellan(Merck，德国)封固。用亮视野Axioscop显微镜(Zeiss，德国)显现组织切片。
结肠炎模型使用腹膜内注射(i.p.)施用Deflamin
还测试了通过腹膜内施用deflamin对结肠炎的抗炎作用。除了通过腹膜内注射施用deflamin提取物之外，完全如上所述处理小鼠。测试了如下实验组：
1.假手术组(n＝6)：对动物进行上述步骤，除了结肠内给药使用100μL盐水溶液。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水或腹膜内注射相同量的盐水。
2.乙醇组(n＝6)：对动物进行上述步骤，除了结肠内给药使用100μL的50％(v/v)乙醇/水溶液。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水，腹膜内注射相同量的盐水。
3.TNBS组(n＝10)：给动物施用100μL在50％(v/v)乙醇中的的2.5％(w/v)TNBS。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水，腹膜内注射相同量的盐水。
4.TNBS+提取物(或deflamin)组(n＝10)：给动物施用100μL在50％(v/v)乙醇中的L的2.5％(w/v)的TNBS。在方案的4天期间，给动物腹膜内(i.p.)注射提取物(或deflamin；10mg/kg)。
如上所述，通过胃管饲法，每天从初始施用TNBS后3小时开始腹膜内注射给药，并进行相同的评价，如口服给药所述。
预防效果与Deflamin的疗效
为了将deflamin的预防效果和其治疗效果进行比较，按如上所述喂养和处理小鼠并随机分配到四个实验组：
1.假手术组(n＝6)：对动物进行上述步骤，除了结肠内给药使用100μL盐水溶液。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水。
2.TNBS组(n＝10)：给动物施用50μL(v/v)乙醇中的100μL的2.5％(w/v)TNBS。在方案的4天期间，给动物口服10mL/kg蒸馏水。
3.TNBS+deflamin p.o.(n＝9)：给动物施用100μL在50％(v/v)乙醇中的2.5％(w/v)TNBS。在方案的4天期间，动物口服给予deflamin(15mg/kg)。
4.Deflamin预防性治疗+TNBS(n＝10)：TNBS诱导前3天，动物口服给予deflamin(15mg/kg)。然后，给动物施用100μL在50％(v/v)乙醇中的2.5％的(w/v)TNBS。
在方案的4天期间，经口服对动物给予deflamin(15mg/kg)。
在4天实验后，对如上所述进行结肠炎严重性进行宏观评估。
角叉菜胶诱导的炎症爪水肿模型
动物护理和体内实验的维护
根据英国伦敦皇家出版局出版的“英国内政部动物操作指南(科学程序)法1986”中的内政部指导和美国国立卫生研究院出版的“实验动物护理和使用机构动物研究委员会指南”(NIH出版物编号85-23，1996年修订)以及目前采用的EC法规(指令2010/63/EU)进行了实验。最后，所进行的研究符合ARRIVE动物研究报告指南，摘要见http：//www.nc3rs.org.uk。因此，研究所伦理委员会批准了动物研究方案，同时也考虑到作者Sepodes和Rocha已获得葡萄牙兽医总局许可，以协调和开展独立的动物研究。所有研究均使用体重为100g至150g的5周龄雄性Wistar大鼠(Harlan Iberica，巴塞罗那，西班牙)进行。所有动物均任意接受标准饮食和水。
使用Deflamin口服给药的爪水肿模型
实验性爪水肿的诱导和水肿严重程度的评估。角叉菜胶诱导的大鼠后爪的爪水肿是研究急性局部炎症的合适模型，并且被广泛认为是评价抗炎活性的最有用的模型之一。该模型用于测试口服或局部给予的deflamin的抗炎活性。
爪水肿模型
将0.1mL的1％(w/v)λ-角叉菜胶无菌盐水溶液通过单次足底注射到大鼠左后爪中诱导爪水肿。使用体积描记器(Digital Plethysmometer LE7500；Letica ScientificInstruments，Letica，西班牙)通过体积置换法测量爪体积。在注射角叉菜胶(V0或基础体积)后6小时(V6h)立即测量爪体积。爪量的增加被视为水肿量。
实验组
如下所述，将动物随机分配到以下组中：
1.对照组(n＝6)：将0.1mL无菌盐水通过足底注射到大鼠左后爪中，并给予盐水(1mL/kg，腹膜内)。
2.角叉菜胶组(n＝6)：对动物进行爪水肿诱导并给予盐水(1mL/kg，腹膜内)。
3.Deflamin组(n＝5)：对动物进行爪水肿诱导，并在λ-角叉菜胶注射前30分钟用deflamin提取物(15mg粗提物/kg，经口服和腹膜内给药)进行预处理。
4.吲哚美辛组(n＝6)：在λ-角叉菜胶注射前30分钟，对动物进行爪水肿诱导并用吲哚美辛(10mg/kg，腹膜内)预处理。
5.Trolox组(n＝6)：在λ-角叉菜胶注射前30分钟，对动物进行爪水肿诱导并用Trolox(30mg/kg口服)预处理。
局部施用Deflamin的结肠炎模型
基本上按照前面所述对动物进行治疗，并按照前面所述进行分组：
1.对照组(n＝6)：将0.1mL无菌盐水进行足底注射到大鼠左后爪中，并给予盐水(1mL/kg，腹膜内)。
2.角叉菜胶组(n＝6)：对动物进行爪水肿诱导并给予盐水(1mL/kg，腹膜内)。
3.Deflamin组(n＝5)：对动物进行爪水肿诱导，并在注射λ-角叉菜胶后用deflamin提取物(溶于水和甘油30∶70，v/v)进行局部处理。
4.对照组(n＝6)：在λ-角叉菜胶注射后，对动物进行爪水肿诱导并用甘油溶液(水和甘油30∶70，v/v)进行局部处理。
统计分析
对于动物结肠炎模型，所有结果表示为n次观察的平均值±SEM，其中，n表示研究的动物数。使用单因素ANOVA测试比较结果，然后，使用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad，San Diego，CA，USA)进行Bonferroni事后检验。对于明胶水解活性，所有实验按一式三份进行操作，至少三次独立，数据表示为平均值±标准偏差(SD)。SigmaPlot软件(版本12.5)用于比较不同的治疗效果，使用单向和双向方差分析(ANOVA)。Tukey′s检验用于比较组间差异和统计学差异，当P值小于0.05时，认为具有统计学意义。
结论
豆科植物种子总提取物中的MMPI活性
在最近发表于食品化学的一项初步研究中，并且在发现deflamin之前，申请人筛选了许多总种子提取物中是否存在抑制性MMP活性。
研究的这些种子是：鹰嘴豆(Cicerarietinum L.)、大豆(Glycine max L.)、小扁豆(Lens culinaris M.)、白羽扇豆(Lupinus albus L.)、菜豆(Phaseolus vulgaris L.)、豌豆(Pisum sativum L)、蚕豆(Vicia faba L.)和豇豆(Vigna unguiculata L)。我们继续研究并将在这里讨论的最有希望的是鹰嘴豆、羽扇豆和大豆(图5和6-11；Lima等，2016)。
图5比较了最初分析的八种豆科植物种子中的每一种白蛋白和球蛋白的多肽谱。图5显示了通过SDS-PAGE分离的八种豆科植物种子的白蛋白和球蛋白之间多肽分布的代表性图像。G-球蛋白，A-白蛋白。在还原条件下，将蛋白质提取物(每个永道40μg)加载到12.5％(w/v丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上(Lima等人，2016)。
应注意，在天然条件下进行总种子蛋白质、总白蛋白和总球蛋白的提取。因此，图6-11解决了许多种子亚组分对八种物种中存在的MMP活性的影响：
图6中的总可溶性提取物(因此包括低分子量代谢物，如黄酮类和其他多酚，以及肽和蛋白质，可能包括lunasin)；图6涉及MMP-9抑制活性。来自八种不同豆科植物种子(白羽扇豆、鹰嘴豆、蚕豆、菜豆、豌豆、豇豆、小扁豆和大豆)的总可溶性提取物对MMP-9蛋白水解活性的影响。将总可溶性提取物加入到含有MMP-9的反应混合物中，并通过DQ荧光测定法进行明胶水解活性。
图7中显示了HT29细胞增殖后的白蛋白和球蛋白(暴露24小时)；
图7涉及HT29细胞增殖测定。HT29细胞在预先从八种种子中提取的白蛋白或球蛋白级分存在下生长24小时。
图8和9中，HT29细胞迁移后白蛋白和球蛋白(24小时暴露)；图8涉及HT29细胞迁移伤口测定。使细胞生长直至达到80％汇合，并用移液管尖端刮擦单层(第0天)。将HT29细胞暴露于来自八种种子的白蛋白或球蛋白级分，48小时后测定细胞迁移。获得最高抑制性种子提取物的细胞迁移的实例是：白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆。
图9涉及HT29细胞迁移伤口测定。使细胞生长直至达到80％汇合，并用移液管尖端刮擦单层(第0天)。在HT29细胞暴露于来自八种种子的白蛋白或球蛋白级分48小时后，测定细胞迁移。相对迁移率(D)；
图10中HT29细胞外培养基中存在的明胶酶的蛋白水解活性的白蛋白和球蛋白(暴露48小时)；
图10涉及在通过DQ荧光法定量的从八种种子中分离的白蛋白或球蛋白级分暴露48小时后，存在于HT29细胞外培养基中的明胶酶的蛋白水解活性。
图11中暴露于白蛋白或球蛋白48小时后，HT29细胞胞外培养基中存在的MMP-9和MMP-2活性的酶谱图。
图11涉及细胞暴露于白蛋白或球蛋白蛋白质级分48小时后，HT29细胞外培养基中存在的MMP-9和MMP-2活性的酶谱图。仅显示产生最显著抑制的种子提取物(即白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆)。聚丙烯酰胺凝胶(12.5％w/v丙烯酰胺)与1％(w/v)明胶共聚。MMP-9和MMP-2条带的相对活性计算为控制率％。G，Glob-含有100μg蛋白质/mL的总球蛋白部分；A，Alb-总白蛋白分数，含有100μg蛋白质/mL。表示的所有值是至少三次重复实验的平均值±SD，并表示为相应对照的百分比。垂直条表示SD。*P＜0.05，**P＜0.001。
重要的是要提及的这些研究/提取物中没有一个涉及煮熟的种子、煮沸的提取物、暴露于低pH值的提取物和/或经历消化过程的提取物。所得的结果清楚地表明，在所研究的八个种子中，种子中存在MMP抑制活性或活性，在羽扇豆、大豆和鹰嘴豆中，通过降低数量级，突出显著。这种MMP抑制活性归因于文献中广泛说明的次级代谢物(例如来自大豆的染料木黄酮)和低分子量蛋白质(即lunasin)。
尽管全世界甜羽扇豆种子的消费量正在增加，但食品行业有很多应用，野生(即含有苦味或生物碱)的种子自古以来就被用作人类食物，并继续作为地中海国家的小吃。只要它们煮沸，生物碱就会在流水下冲洗掉。有趣的是，使野生型种子有毒的相同生物碱似乎对糖尿病产生有益作用。尽管如此，在我们日常的西方生活方式中，其他豆类种子(如鹰嘴豆和大豆)比羽扇豆更常食用。本发明的实施方案集中于最后三个物种，一些额外的结果也集中于一些非豆科植物种子。
煮熟的多样化种子的生物活性代谢物
如上文材料和方法部分所述，由于几个原因，干燥的种子(包括谷物和豆类的种子)不会被摄取。首先，我们很难咀嚼它们。第二个，也是最重要，豆类种子，像许多其他种子一样已知含有抗营养因子，如消化酶抑制剂、凝集素、高植酸浓度、非蛋白质氨基酸等。因此，他们必须在烹饪后摄取，以确保蛋白质抗营养因子的变性，以及一些非蛋白质成分的破坏或浸出。由于这些原因，并且因为发现deflamin抵抗沸腾性，使用煮熟的种子进行了许多初始实验。
除蛋白质外，植物种子还含有多种生物活性次生代谢产物，其中大部分在烹调后保留了其大部分的生物活性。
以下实施例说明了来自几种豆科植物的生的和熟的种子的植酸、皂苷、酚类化合物和蛋白质的浓度。如上所述，应该考虑到，由烹调诱导的特定化合物的减少(表示为每单位干重)，从植酸蛋白到蛋白质，通常是由于分子破坏和浸入周围水中。因此，人们普遍知道煮熟蔬菜的水应该用来制作汤。
在下一个实验块中，豌豆和豇豆在MMP抑制方面的结果不好，因此被遗弃(参见上述)。因此，实施例仅涉及六种，即鹰嘴豆、大豆、小扁豆、白羽扇豆、菜豆和蚕豆。
植酸
植酸(也称为肌醇六磷酸、PA、肌醇六磷酸和IP6)，例如，被认为是一种抗营养素，因为当过量存在时会抑制消化酶(例如胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶)和与某些矿物质(最明显的是锌和钙和铬的较小程度)结合，从而干扰其生物利用度(网站1)。
图12显示了研究中几种物种的植酸种子含量。在所研究的物种中，种子植酸含量似乎相当恒定，并且不受任何显著方式的烹调的影响。
图12显示了几种豆科植物种子中的植酸浓度，如通过Gao等人(2007年)描述的方法定量的。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。
皂苷
皂苷具有作为天然或合成形式的药物和/或营养药物的相当大的潜力。它们已被证明具有抗癌、神经保护、抗炎和抗氧化活性等(Rao和Gurfinkel，2000)。
图13显示了研究中的几种物种的皂苷种子含量。与植酸不同，所分析的物种中的皂苷含量差异显著，大豆和鹰嘴豆的最高值和羽扇豆的最低值。沸腾一致地减少了存在的皂苷量，损失范围从大约7％(小扁豆)至90％以上(鹰嘴豆)。图13显示了几种豆科植物种子中的皂苷浓度，如通过Hiai等人(1976年)描述的方法定量的。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。
酚类化合物
酚类化合物普遍存在于植物中，并且已知具有高抗氧化能力和自由基清除能力。因此，它们通常被认为是预防和治疗许多氧化应激相关疾病的潜在药剂，该疾病例如心血管疾病、癌症、衰老、糖尿病和神经退行性疾病，主要归因于它们的心脏保护作用、抗癌、抗炎和抗菌生物活性(Li等人，2014)。然而，主要问题涉及其生物利用度和潜在的毒性，绝大多数研究没有考虑它们对烹调和消化过程的抵抗力。此外，与生物活性蛋白质不同，它们的有益/有害生物活性通常是剂量依赖性的。
羽扇豆中酚类化合物的种子浓度更高，其次是大豆、菜豆和扁豆(图14)。据推测，多酚中的种子水平越高，其抗癌生物活性越大。烹调显著减少了种子酚类物质的含量(在60％至90％之间，取决于物种的比例)。图14显示了来自几种豆科植物的种子中酚类化合物的浓度，如通过Folin-Ciocalteau方法(Attard，2013)进行定量的。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。
总可溶性蛋白质
蛋白质组成了一类惊人的生物分子，可以满足各种各样的生物活性，在任何其他类别的分子中都不可对比。选择以前未知的蛋白质并确定其生物学功能不仅困难，而且也是生物和化学研究人员最具挑战性和最有趣的任务之一。除了执行它们进化的生物学作用之外，由于具有广泛的有益活性，许多蛋白质也可用于人类的益处。因此，例如，食品和药物管理局(FDA)授权在食品标签和食品标识上使用关于大豆蛋白与降低冠心病风险之间关联的健康声明(FDA，1999)。
正如预期的那样，大豆种子含有最高量的总可溶性蛋白质(297.4mg/g干重)，其次是通过降低蛋白质浓度，羽扇豆(190.4mg/g干重)、鹰嘴豆(138.2mg/g干重)、蚕豆(114.5mg/g干重)、小扁豆(79.0mg/g干重)和菜豆(720.0mg/g干重)；图15)。在烹调时，在所有情况下，这些值均降低至低于20mg/g干重，得到了最高蛋白质浓度的小扁豆、羽扇豆、鹰嘴豆和大豆。重要的是要注意，图15涉及可溶性蛋白质，并且煮熟的种子肯定含有变性的不溶性的大部分蛋白质。
图15显示了通过Bradford方法(Nobel，2000)定量的来自几种豆科植物的种子中的总可溶性蛋白质浓度。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。
图16中呈现的数据允许比较来自完整种子的可溶性蛋白质的多肽谱与来自相应煮熟种子的多肽谱之间的每个物种。如所预期的，在永道C中存在的每种情况下，与在烹调中存活的多肽完全不同。注意，图16中的泳道不含有相同量的蛋白质。相反，它们对应于固定量的种子干重。因此，可以对每个物种进行直接的定量和定性比较。
图16显示了通过R-SDS-PAGE(17.5％w/v丙烯酰胺补充的com 10％v/v甘油；还原条件)从原始(NC)和蒸煮(C)种子中提取的可溶性蛋白质级分获得的代表性多肽谱。为了进行定量和定性比较分析，将级分NC和C重新悬浮并以相等体积加载到凝胶中。
本发明的实施方案主要涉及鹰嘴豆、大豆和白羽扇豆。
细胞迁移
图17和图18中显示的数据显示由鹰嘴豆、大豆和白羽扇豆制备的可溶性提取物抑制HT29细胞的迁移。然而，在种子的提取物、物种和条件(即烹饪与否)之间发现了相当大的差异。因此，所有检测的非蛋白质提取物对细胞迁移显示出显著的抑制作用。在从原始种子制备的可溶性蛋白质提取物中，细胞迁移抑制活性对于大豆几乎可忽略不计，羽扇豆中间体略微可忽略不计，而鹰嘴豆则略高。然而，从煮熟的种子制备的可溶性蛋白质提取物中获得了令人惊讶和令人惊讶的结果：与鹰嘴豆和大豆不同，烹饪羽扇豆种子在增强所得可溶性蛋白质提取物的细胞迁移抑制活性方面具有显著效果。奇怪的是，再次不同于鹰嘴豆和大豆，对于从煮熟的羽扇豆种子制备的非蛋白质提取物而言，实现了完全相同的效果。这些数据表明羽扇豆种子含有蛋白质和低分子量非蛋白质化合物，它们表现出了HT29细胞迁移活性，其效果通过以预先烹调的种子显著增强，这使得它们特别适合于人类营养。
这项研究可能是第一个考虑烹调(人类健康和营养方面最重要的主题)豆类种子对癌细胞迁移潜力的影响。
可以提出若干假设以试图解释由煮熟的羽扇豆种子与原始种子制备的非蛋白质和蛋白质可溶性提取物的细胞迁移抑制活性的增加。
1.浓度影响。我们知道大多数羽扇豆种子蛋白质在烹饪过程中变性并浸出到周围的水中。还已知许多(如果不是大多数)低分子量代谢物被破坏或浸入沸水中。在图17和图18中描绘的伤口愈合测定中，使用100μg可溶性蛋白质/mL或10mg可溶性非蛋白质生物分子/mL。与从原始种子制备的提取物相比，这意味着对于在烹饪过程中存活的那些代谢物和蛋白质具有大的浓度效应。
2.在寡聚蛋白的情况下的热诱导和不可逆的解离效应，在单个亚基或原始寡聚体的剩余部分可溶并且表现出增强的生物活性的情况下。
3.deflamin在可溶性蛋白质级分和可溶性低分子量非蛋白质级分中都存在是可能的。
然而，鹰嘴豆或大豆没有观察到相同的效果，这使得羽扇豆有些特殊。
图17显示了通过伤口愈合测定法评估的HT29细胞迁移的代表性图像(A)。使细胞生长直至达到80％汇合，并用移液管尖端刮擦单层(第0天)。在将HT29细胞暴露于缓冲液(对照)、非蛋白质提取物(10mg/mL)或来自所研究的三种种子的蛋白质提取物(100μg/mL)中，48小时后测定细胞迁移。图18显示了相对迁移率绘制在(B)中。NP：从原始种子制备的可溶性非蛋白质提取物；NPC：从煮熟的种子制备的可溶性非蛋白质提取物；P：由原始种子制备的可溶性蛋白质提取物；PC：从煮熟的种子制备的可溶性蛋白质提取物。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。*P＜0.05。
与可溶性低分子量非蛋白质化合物不同，由原始种子制备的可溶性大豆蛋白质级分对HT29细胞的迁移没有显示出显著的抑制活性。由于已知大豆种子中存在Bowman-Birk抑制剂(BBI)，这可能会令人惊讶。一种可能的解释可能在于Fereidunian及其同事(Fereidunian等，2014)纯化12mg的BBI/g大豆种子，该值相当于大豆总可溶性蛋白质的约9％。一个简单的推断告诉我们ca.从用于测定的原始大豆种子制备的可溶性蛋白质提取物中包括9μg大豆BBI(图17和18)，其量远低于Fereidunian及其同事使用的量。
细胞活力和增殖
图19中显示的结果显示了种子的不同提取物、种类和条件(即烹调与否)对HT29细胞增殖的影响。除了从鹰嘴豆种子制备的可溶性非蛋白质提取物之外，似乎可以合理地得出结论，所有提取物对HT29细胞呈现低毒性，因为这些细胞在暴露24小时后仍然存活。此外，它们似乎不抑制细胞增殖。Giron和同事(Giron-Calle等，2004)在从鹰嘴豆种子中提取的丙酮可溶性代谢物的存在下检测到对Caco-2细胞增殖的有效抑制。图19显示了细胞增殖测定。HT29细胞在来自研究中的三种种子的缓冲液(对照)、非蛋白质提取物(10mg/mL)或蛋白质提取物(100μg/mL)存在下生长24小时。NP：从原始种子制备的可溶性非蛋白质提取物；NPC：从煮熟的种子制备的可溶性非蛋白质提取物；P：由原始种子制备的可溶性蛋白质提取物；PC：从煮熟的种子制备的可溶性蛋白质提取物。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。*P＜0.05。
与图19中显示的结果相反，关于豆科种子蛋白发表的数据表明在细胞增殖水平上具有抑制作用。Fereidunian及其同事(Fereidunian等，2014)观察到在200μg的BBI/mL存在下，HT29细胞增殖减少50％以上。对于BBI浓度为400μg/mL，该值增加至超过80％。据报道，来自鹰嘴豆的BBI在体外抑制乳腺癌细胞增殖，而来自菜豆、大豆和鹰嘴豆的BBI也在体外减少前列腺癌细胞增殖(Magee等，2012)。
Bawadi及其同事(Bawadi等，2005)报道了前列腺癌细胞增殖和细胞迁移的抑制作用，以及水溶性黑豆缩合单宁对MMP-9和MMP-2分泌的抑制作用。Park等(2013)报道，从黄檀的甲醇提取物中获得的黄颜木素抑制纤维肉瘤HT-1080细胞的MMPs、增殖和侵袭性，和Aparicio-Femandez等(2006)使用人类腺癌HeLa细胞和人类癌前角质形成细胞(HaCaT)发现，来自黑色Jamapa种子的100％甲醇粗提物显示出对HeLa癌细胞增殖的抑制作用，但对HaCaT癌前细胞的侵袭性较小。Zhou等人(1999)表明大豆异黄酮(染料木黄酮或大豆苷元)或大豆植物化学浓缩物在体外抑制前列腺癌细胞LNCaP、DU 145和PC-3的生长。
HT29细胞外培养基中的明胶水解活性
在正常条件下(例如在不存在抑制剂的情况下)，癌细胞将MMP-9和MMP-2分泌到外部miliue中以降解基质蛋白，从而允许细胞迁移。任何抑制明胶酶的病症都会抑制转移形成。因此，发现MMP的天然抑制剂具有潜在的意义。
如前一部分所述，从羽扇豆、鹰嘴豆和大豆种子制备的一些含有蛋白质和低分子量代谢物的可溶性提取物对HT29细胞迁移表现出强烈的抑制作用，但对HT29细胞增殖没有作用。这种差异可以通过其作用机制来解释。与癌细胞侵袭性相关的主要因素之一是MMP-9和MMP-2酶的活性。因此，在暴露于几种提取物48小时后，在HT29细胞外培养基中测定这些活性(图20)，如通过DQ荧光法定量的。
图20显示了通过DQ荧光方法定量的HT29细胞外培养基中总MMP活性的蛋白水解活性。HT29细胞在来自研究中的三种种子的缓冲液(对照)、非蛋白质提取物(10mg/mL)或蛋白质提取物(100μg/mL)存在下生长48小时。NP：从原始种子制备的可溶性非蛋白质提取物；NPC：从煮熟的种子制备的可溶性非蛋白质提取物；P：由原始种子制备的可溶性蛋白质提取物；PC：从煮熟的种子制备的可溶性蛋白质提取物。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。*P＜0.05。
图20中显示的结果显示，测试的所有提取物对HT29细胞外培养基上存在的明胶水解活性水平表现出一定程度的抑制。然而，当与对照相比时，发现对于所有可溶性蛋白质提取物(由原始的或煮熟的种子制备)和从大豆原始种子制备的可溶性非蛋白质提取物具有极强的抑制(在80％和90％之间)。
一般而言，值得注意的是，HT29细胞迁移主要受可溶性非蛋白质代谢物的影响(图17和18)，而HT29细胞外培养基中的总MMP抑制能力基本上由可溶性蛋白质调节(图20)。这些结果表明豆类蛋白质在抑制MMP活性方面更有效，而可溶性非蛋白质代谢物似乎使用其他作用机制来抑制细胞迁移。
图20中所示的测定法测量总明胶水解活性，即组合的MMP-9(92kDa)和MMP-2(72kDa)的那些。要将这两种活动分开，必须使用不同的方法，例如酶谱法或反向酶谱法。这些实验的结果(数据未显示)表明MMP-9是主要靶标。实际上，在HT29细胞与图20中使用的四种提取物中的每一种一起培养，48小时后收集的细胞外培养基的酶谱显示出基本上靶向MMP-9和pro-MMP-9(83kDa)的抑制活性。
该实验似乎表明来自羽扇豆、鹰嘴豆和大豆的可溶性蛋白质基本上通过MMP-9抑制来抑制HT29细胞迁移。然而，应该注意的是，即使在同一研究中，关于明胶酶抑制活性的不同报道也会产生相互矛盾的结果。因此，上面刚刚描述的实验表明，来自羽扇豆、鹰嘴豆和大豆的蛋白质级分和代谢物级分都显著抑制MMP-9而不抑制MMP-2。相反，图32中所示的实验显示来自羽扇豆的总蛋白质级分强烈抑制两种明胶酶。
在现有文献中给出了相同的结果。大豆BBI在200e400μg/mL的浓度下抑制MMP-9和MMP-2(浓度远高于本研究中使用的浓度；Fereidunian等，2014)。Bawadi等(2005)报道了Caco-2结肠、MCF-7和Hs578T乳房和DU145前列腺癌细胞与水溶性黑豆缩合单宁培养24小时后，导致分泌到单宁浓度高于12μM的培养基中的活性MMP-2和MMP-9水平急剧下降。在15μM时，黄颜木素抑制50％MMP-9和其他MMP，但显然不是MMP-2(Park等，2013)。2.5mM的植酸抑制用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激的结肠癌Caco-2细胞中MMP-9、MMP-2和其他MMP的表达；(Kapral等，2012)。用大豆皂苷处理纤维肉瘤HT-1080细胞抑制了mRNA的表达并减少了分泌的MMP-2和MMP-9的量(Kang等人，2008)。
一个显著的观察是显而易见的：除了蛋白酶抑制剂(例如胰蛋白酶抑制剂和BBI)之外，很少进行实验来评估蛋白质对MMP活性的潜在抑制作用。
图21阐明了另一个实验，其中，在所有情况下，使用相同的种子对鹰嘴豆、大豆和羽扇豆种子提取物对商业MMP-9的抑制活性进行评估，从而允许直接比较并模拟这些种子的摄取。图21显示了可溶性种子提取物对MMP-9的蛋白水解活性的抑制作用。将提取物加入含有市售MMP-9的反应混合物中，通过DQ荧光测定法测定明胶水解活性。添加到每个反应混合物中的提取物(100μL)的体积对应于相同的种子质量。NP：从原始种子制备的可溶性非蛋白质提取物；NPC：从煮熟的种子制备的可溶性非蛋白质提取物；P：由原始种子制备的可溶性蛋白质提取物；PC：从煮熟的种子制备的可溶性蛋白质提取物。垂直条代表至少三个生物学重复的平均值±SD。*P＜0.05。
总之，该实验显示出蛋白质级分和非蛋白质级分均具有抑制MMP-9的活性。这种抑制作用对于非蛋白质部分似乎更高，并且在羽扇豆中比在鹰嘴豆或大豆中更强。正如预期的那样，烹饪种子的效果降低了，但只是略微降低了所有部分的抑制能力。这些结果解释了在图17和18中观察到的效果，其中与原始种子相比，来自煮熟的羽扇豆种子的非蛋白质和蛋白质级分获得的较高HT29细胞迁移(通过伤口愈合测定评估)可归因于烹饪抗性的浓缩效果，有效成分。
从羽扇豆种子中分离潜在新型MMP-9和MMP-2抑制剂
发现Deflamin
为了分离蛋白质组分，发现它们是MMP-9抑制的原因，根据其天然大小分离白羽扇豆的蛋白质，并测试它们对MMP-9的抑制活性。图22至24显示了对于白羽扇豆总蛋白质提取获得的尺寸排阻色谱(SEC)，收集的级分F1至F6的相应电泳蛋白质谱，以及每个级分的MMP-9抑制活性。
如材料和方法部分中所述，从白羽扇豆种子中提取肽、多肽和蛋白质。含有总蛋白质提取物的脱盐提取物使用系统通过尺寸排阻色谱法在Superdex 75柱中分级分离。收集蛋白质峰作为级分F1至F6(如图22所示)。
在某些实施方案中，蛋白质/多肽根据其分子大小使用含有尿素和二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液分离，这允许分离不同的低分子量级分。测试了其他缓冲液，其不能在该大小范围内有效分离白羽扇豆蛋白/多肽，这与我们实验室中获得的先前结果一致。然后，使用DQ明胶测定法测试每个级分的MMP-9抑制活性。图24显示了每种级分(F1-F6)对MMP-9活性的影响。
图24清楚地显示了级分4引起MMPs催化活性的100％抑制。随后确认该级分含有deflamin。
图22-24显示了如材料和方法部分中所述从白色羽扇豆种子中提取肽、多肽和蛋白质。含有总蛋白质提取物的脱盐提取物使用系统通过尺寸排阻色谱法在Superdex75中分级分离。收集蛋白质峰作为级分F1至F6(22)，并在还原条件(23)下通过TricineSDS-PAGE分离。(24)使用DQ明胶测定法测试每个级分的MMP-9抑制活性。结果以任意荧光单位表示，并代表三次重复的平均值±SD。如图22至24所示，仅级分4表现出非常高水平的MMP-9抑制。通过反相(RP)-HPLC法进一步分离该样品，以分析承担该活性的特定肽。图25至27显示了对级分4获得的HPLC图谱。基本上获得了四个峰，通过SDS-PAGE分析每个峰，并通过DQ明胶测定评估其MMP-9抑制活性。峰2表现出最高的MMP-9抑制活性，并且峰3在较小程度上也表现出抑制活性(图27)。值得注意的是，在这个阶段，我们得出峰2由至少两个，可能更多的多肽组成(图25中的方框2)。
注意，图28至32中使用的所有蛋白质级分预先都经过沸腾和低pH值，以确定其对变性的抗性，同时模拟消化过程，以及部分分离过程，并且随后用于HT29细胞伤口闭合和明胶分析测定以及酶谱分析。这清楚地表明了deflamin对沸腾和低pH值的抵抗力。
图31显示了在相同蛋白质级分存在下，HT29细胞培养基的明胶水解活性，而图32评估了酶谱分离中MMP-9和MMP-2的活性。结果表明，从图25中描绘的HPLC色谱图中收集的包含峰2的多肽确实是强MMP抑制剂，特别是在热处理后，并且它们可以抑制MMP-9和MMP-2的催化活性。
用峰2蛋白(100μg蛋白/mL)培养细胞48小时后，对HT29细胞外培养基的分析显示了deflamin抑制MMP-9和MMP-2活性，如DQ-明胶荧光法所示(图32)和酶谱(图33)。图33中可见的黑色(当用颜色观察时为蓝色)背景是由于考马斯亮蓝染色明胶，其与丙烯酰胺共聚以形成凝胶基质。带状活性MMP酶或pro-MMP酶原的存在局部降解基质嵌入的明胶，产生白色条带。抑制剂(例如deflamin)的存在阻断MMP的蛋白水解作用，使未改变的明胶染色。因此，图33中“Deflamin”泳道中没有白色条带表明：100μg/mL的deflamin完全抑制了HT29细胞外培养基中存在的所有MMP形式的活性，并表明该抑制在酶谱测定期间没有恢复。
应该考虑的是，图33中描绘的凝胶中加载的部分不完全是deflamin-因此，符号deflamin。实际上，在某些实施方案中，deflamin是按照图4中详述的分离方法从种子获得的蛋白质级分-在某些实施方案中，这是其定义的一部分。使用不同的方法纯化图33中使用的生物活性级分。
图33显示细胞暴露于deflamin(100μg蛋白质/mL)48小时后，HT29细胞外培养基中MMP-9和MMP-2酶活性的酶谱图的代表性图像。对照：HT29细胞在不存在deflamin的情况下培养48小时。
虽然能够抑制细胞侵袭(图30)，但相同浓度的deflamin不会影响细胞增殖，这表明没有细胞毒性。
来自羽扇豆的Deflamin的纯化与鉴定
提供了本发明方法的一个实施方案(参见图4)，以从适合进行放大的种子中提取和纯化deflamin，从而允许其在工业设施中大量生产。该方法在方法部分中以详细方式描述。
应该记住，方法部分中提到的HPLC步骤用于分离deflamin成分多肽而不是分离去纤维素。
连续提取允许白羽扇豆deflamin的分离，deflamin比总提取物具有更高的MMPI活性。
图34显示了简单地用缓冲液(缓冲液提取；BE)或热处理(HT)后提取的羽扇豆种子之间的多肽分布的代表性图，并通过SDS-PAGE(左)和反向明胶酶谱(右)显现。
将蛋白质提取物(50μg/mL)加载到17.5％(w/v丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上，在反向酶谱法的情况下与明胶和MMP-9共聚。
在具有低于20kDa的分子量的泳道BE和HT中可见的多肽带对应于deflamin。如图34所示，deflamin在热处理后保持其生物活性。
初步结果表明，来自白羽扇豆的MMPI蛋白质部分(即deflamin)在水中高度可溶并且表现出对热变性的抗性。因此，建立了一种顺序沉淀分离方法(适用于未来扩大规模的工业规模)。
在几次连续提取以分离MMPI活性蛋白质级分后获得的电泳图谱的代表性图显示在图35中。
图35显示了在凝胶上部指定的纯化方法的每个步骤后获得的多肽谱的代表性图。将蛋白质样品(25μg)上样到17.5％(w/v丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶上。MW-分子量标记；BE-缓冲液提取；HT s-热处理，上清液；HT p-热处理，颗粒；pH4s-酸沉淀，上清液；pH4p-酸沉淀，沉淀；40％s-40％v/v含有0.4M的NaCl的乙醇，上清液；40％p-40％v/v含有0.4M的NaCl的乙醇，颗粒；90％-90％v/v乙醇在-20℃过夜，沉淀；和D-Deflamin。
在图4中描绘的分离方法的每个步骤之后对多肽谱的分析揭示了分子量低于20kDa的蛋白质级分的逐步纯化，其被称为deflamin。使用DQ明胶测定法进行比较获得的主要蛋白质级分，即总蛋白质/缓冲液提取物(BE)、热处理的提取物(HT)和分离的deflamin级分的MMPI活性。所得结果显示在图36中。
在测试的蛋白质浓度(50μg/mL)下，图36显示了所有样品都能够显著抑制MMP-9蛋白水解活性。然而，在所分析的样品中观察到显著差异(P＜0.05)，对于deflamin检测到最高抑制(P＜0.05)，其诱导大于80％的MMP-9活性的降低。
换句话说，在图36中，缓冲液提取(BE)、热处理(HT)和deflamin(D)蛋白质级分从白羽扇豆种子获得，并用于评估它们对MMP-9对DQ明胶的蛋白水解活性的抑制活性。阴性对照(C)不抑制MMP-9，导致该蛋白酶的100％蛋白水解活性。以50μg/mL的浓度添加蛋白质样品，并通过DQ荧光测定法测量明胶水解活性。MMP活性表示为相对荧光强度，以控制率％表示，并且表示至少三次重复实验(n＝3)±SD的平均值。*P＜0.05，**P＜0.001。
总之，随着deflamin逐渐被纯化，其作为MMPI的抑制作用增加。
白羽扇豆Deflamin在抑制结肠癌细胞侵袭和增殖方面更有效
注意：此主题中的“更多”一词用于双重意义：
1-随着分离方法，从最初的总蛋白质提取物进入纯化的deflamin，其生物活性逐渐增加，用分离的deflamin达到最大值。在每个纯化步骤后进行的比较测试使用来自每个样品的相同蛋白质量的蛋白质，随着deflamin纯化程度的增加，每个部分中deflamin相对于总蛋白质的量也增加，证明当deflamin生物活性从对纯净的deflamin馏分纯度较低。
2-Deflamin是细胞增殖的不良抑制剂(意味着细胞毒性低；见下文；比较图39至42)，但是结肠癌细胞侵袭和增殖的有效抑制剂。
对HT29细胞中的分离的deflamin活性进行了表征，同时将其与总提取物和经过热处理的白羽扇豆提取物进行比较。图37至38显示了在暴露于总提取物、热处理的提取物和分离的deflamin(50μg蛋白质/mL)48小时后这些蛋白质级分中的每一种对HT29细胞迁移的影响。
图37和38显示了暴露于缓冲液提取(BE)、热处理(HT)和分离的deflamin(D)后的HT29细胞迁移，如通过伤口愈合测定所确定的。(图37)-相对迁移率。值是至少三次重复实验的平均值±SD，并且表示为相对于第0天的伤口闭合％。(图38)-获得最高抑制性蛋白质级分(即deflamin)的细胞迁移的实例。使细胞生长直至达到80％汇合，并用移液管尖端刮擦单层(第0天)。然后，将细胞暴露于50μg蛋白质/ml提取物，48小时后记录细胞迁移。*P＜0.05，**P＜0.001。
这些结果表明，与其他蛋白质样品研究相比，deflamin对迁移率的抑制作用最强(P＜0.05)，导致细胞迁移率降低60％。此外，在使用的浓度下，HT和deflamin在统计学上不同于对照(P＜0.05)，而BE样品在统计学上与对照相似(P＞0.05)。这个结果至少在某种程度上可以解释为什么以前没有发现过deflamin。
白羽扇豆Deflamin的活力依赖于剂量
开发用于分离deflamin的方法(在图4中描述并在方法部分中详细地描述了)证明了在分离承担白羽扇豆MMPI活性的MMPI部分方面是高效的。进一步测试该部分(即deflamin)的作用，看它是否是剂量依赖性的。使用DQ明胶法和HT29结肠癌细胞中的伤口侵袭测定法测试一组四种不同的deflamin浓度(100、50、10和5μg/mL)，结果分别在图39和40至41中表示。
图39显示了不同浓度的deflamin(100、50、10和5μg/mL)对明胶水解活性的影响。从白羽扇豆种子获得四种不同浓度的deflamin，并用于评估它们对MMP-9对DQ-明胶的蛋白水解活性的抑制活性。阴性对照(C)不抑制MMP-9，导致该蛋白酶的100％蛋白水解活性。以100、50、10和5μg/mL的浓度添加Deflamin，并通过DQ荧光测定法测量明胶水解活性。明胶水解活性表示为相对荧光，以控制率％表示，并且代表至少三次重复实验(n＝3)±SD的平均值。
图40至41显示了暴露于不同浓度的deflamin后HT29细胞迁移，如通过伤口愈合测定所确定的。(图40)-相对迁移率。值是至少三次重复实验的平均值±SD，并且表示为相对于时间0的伤口闭合％。(图41)-测试的四种deflamin浓度加上对照获得的细胞迁移的实例。使细胞生长直至达到80％汇合，并用移液管尖端刮擦单层(第0天)。然后，将细胞暴露于100、50、10和5μg/mL的deflamin，并在48小时后记录细胞迁移。与对照相比，**表示P＜0.001，*表示P＜0.05。
图40显示了所有测试浓度(100，50，10和5μg/mL)与对照相比能够显著抑制明胶酶蛋白水解活性(P＜00.1)。然而，每种浓度的抑制水平以剂量依赖性方式不同，对于100μg/mL的deflamin检测到最高抑制，其诱导大于90％的明胶水解活性的降低。图40和41显示了deflamin抑制结肠癌细胞侵袭的能力。
图40和41显示了deflamin抑制HT29细胞迁移的能力随着deflamin浓度逐渐增加，从5至50μg的deflamin/mL。然而，对于所研究的最高的deflamin浓度(100μg/mL)，获得了不同且令人感兴趣的结果：HT29细胞在100μg的delaminmin/mL时完全分离(参见图40和41)，证明了在图40的图中没有这种浓度。白羽扇豆deflamin不会减少结肠癌细胞中的细胞生长和代谢。
为了测试deflamin是否对HT29细胞具有细胞毒性，如果它影响细胞生长，我们使用标准细胞增殖试验测试相同的浓度。
图42显示了在用MTT(其仅能被活细胞代谢)染色后测定的不同的deflamin浓度(100、50、10和5μg/mL)存在下，生长后HT29活细胞的数量。结果显示，与对照相比，暴露于deflamin的2天不会诱导细胞生长或活细胞数量的显著降低(P＞0.001)。此外，没有可见的细胞毒性作用。该结果表明，即使在100μg的deflamin/mL时，deflamin对HT29细胞也相对无毒性。
图42显示了暴露于不同浓度的deflamin 24小时后HT29细胞增殖。细胞在100、50、10和5μg蛋白质/mL提取物存在下生长24小时，并用MTT染色。表示的值是至少三次重复实验(n＝3)±SD的平均值，并表示为对照的百分比。
由于细胞生长不受deflamin的影响，因此测定细胞侵袭、细胞分离、MMP抑制和细胞生长的最小抑制浓度(MIC)。
图42中显示的结果显示，与对照相比，2天暴露于deflamin没有诱导细胞生长或活细胞数量的显著降低(P＞0.001)。此外，没有可见的细胞毒性作用(数据未显示)。该结果表明，即使在100μg的deflamin/mL时，deflamin对HT29细胞也相对无细胞毒性，并且它不会干扰正常的细胞代谢。
然而，对于最高的deflamin剂量，HT29细胞被分离(图40-41)，如果与任何程度的细胞毒性无关，则可能与细胞粘附有关。已知细胞通过其整合素粘附于底物，即跨膜受体，其是细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用的桥梁。整合素对组织培养中的细胞的一个重要功能是它们在细胞迁移中的作用。最近的研究表明，整合素受肿瘤进展和转移的调节，并与MMP-9和MMP-2活性紧密相关。然而，很少有研究表明MMPI存在时细胞脱离效应。这些结果表明，deflamin的作用方式可能涉及更广泛的机制而不仅仅诱导明胶酶抑制作用。观察到最高的deflamin剂量(即100μg/mL)没有引起明显的细胞毒性作用，这表明它对消化系统无害，因此可用于预防性饮食，没有任何副作用。
由于细胞生长不受deflamin的影响，我们开始在不同的测试中确定最小抑制浓度(MIC)和在不同的测试中，诱导50％效果(EC50)的deflamin所需的浓度：细胞生长、细胞侵袭、细胞分离和MMP抑制。结果列于表1中。
表格1。确定最小抑制浓度(MIC)和诱导50％效果(EC50)的deflamin生物活性对细胞生长、细胞侵袭、细胞分离和MMP抑制的浓度。结果以μg/mL表示。ND：未确定。
在所测试的条件下，细胞侵袭和MMP抑制的MIC值低于所研究的其他参数的MIC。发现10μg.mL-1的deflamin浓度足以显著抑制50％的细胞侵袭(P＜0.05)，使其成为细胞侵袭的EC50值。对于MMP抑制，EC50也是10μg的deflamin/mL。这与MMP-9活性和细胞侵袭之间的高度关系一致，并证实MMP抑制至少是deflamin的主要作用方式之一。尽管如此，细胞入侵的MIC水平低于10μg/mL，但在5μg/mL时没有统计学意义(P＜0.05)，而在5μg/mL的存在下MMP已经被非常显著地抑制，这就是为什么MIC值低于该浓度的原因。MMP抑制的MIC值低于细胞侵袭的MIC值，预计MMP抑制仅在一定程度的抑制后诱导显著的细胞侵袭减少。另一方面，在测试的最高分辨率浓度下，仅在＞100μg/mL时实现细胞分离的MIC，其中未检测到显著的细胞毒性。
显然，与细胞生长受损或细胞毒性相比，MMP抑制和细胞侵袭的减少是deflamin最强的活性，细胞生长受损或细胞毒性仅受到非常低程度的影响。这非常重要。具有高特异性和低副作用的MMPI很难找到，并且大多数临床试验产生不令人满意的结果。另一方面，在预防癌症饮食中，需要以低量减少MMP-9和MMP-2活性，但即使在较高剂量下对结肠细胞的低毒性水平也是非常重要的要求。与诸如多酚的低分子量化合物相比，多肽MMPI提供了各种优点，例如高特异性和低毒性。与传统癌症治疗方法如化学疗法或放射性治疗的相比，具有针对肿瘤启动子的高特异性同时呈现低毒性的肽和小蛋白质，如MMP，其可代表癌症治疗/预防的未来。
白羽扇豆Deflamin是低分子量β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白片段的复合物
由于图35中分析的deflamin部分似乎由一个以上的多肽带组成，因此在还原和非还原条件下，通过电泳分离相同的样品(即分离的deflamin)以检测其多肽组成以及确定潜在的二硫键存在。所得结果显示在图43中。
图43显示了在还原和非还原条件下的deflamin多肽谱。在还原(R)和非还原(NR)条件下，通过SDS-PAGE法从羽扇豆种子分离的deflamin的多肽分布的代表性图。将Deflamin(50μg/mL)加载到17.5％(w/v丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上，用还原缓冲液(100mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝6.8，含有100mM的β-巯基乙醇，2％(w/v)SDS，15％(v/v)甘油和0.006％(w/v)间甲酚紫)和非还原缓冲液(100mM的Tris-HCl缓冲液，pH＝6.8，含2％(w/v)SDS，15％(v/v)甘油和0.006％(w/v)间甲酚紫)。
通过反相HPLC进一步分析Deflamin，以分离其不同的多肽成分。图44至46显示了在280和214nm处获得的色谱图，以及相应的电泳图。结果显示存在deflamin标准条带，分散在整个峰2至峰4中。
从HPLC反相柱在45至50分钟洗脱的280nm峰不含蛋白质和生物活性。出于这个原因，它的研究已经停止。
为了确定具有更高活性的峰值部分，我们使用DQ明胶和细胞侵袭测定法进一步确定了4个峰的MMPI活性(图47和48)。结果分别显示在图47和48中。
结果似乎表明所有选定的峰都表现出一定程度的MMP抑制并且还抑制了侵袭，但峰3是观察到的活性最高的峰。通过质谱法进一步分析4个选定的峰，用于鉴定。
Deflamin是第一种蛋白质MMPI，其可通过成本效益和扩大规模步骤进行纯化
通过含有多种蛋白质酶抑制剂，例如胰蛋白酶抑制剂和BBI，长期以来已经认识了豆类种子。然而，尽管自然发生的MMPI的存在可以被认为在植物组织中普遍存在，但是，当考虑它们的生产用于临床和/或营养学目的时，它们都存在几个缺点：高浓度或长时间暴露的毒性；烹调时和/或通过消化过程中化学灭活(例如变性)或破坏(例如蛋白质水解)；缺乏特定的；以及分离方法高成本且低效，它可以阻止MMPI通常有效地扩展到工业水平。在这项工作中报道的分离的deflamin超过了所有这些限制，因为它耐沸腾并且是酶抑制剂；另一方面，所开发的顺序沉淀法简单、成本低廉且易于在工业环境中应用。作为羽扇豆种子中天然存在的可食用多肽的混合物，它不会在较高剂量下产生毒性问题，大多数酚类化合物和其他生物活性次级代谢物都会产生毒性，并且使用酸和乙醇沉淀确保去除可能的有毒污染物以及较高分子量的蛋白质。
提取步骤的产率见表2。结果显示，每100g干燥种子，我们获得100mg的deflamin，其对应于种子总蛋白质含量的约0.5％。
表2干燥的白羽扇豆种子在deflamin中的产率(以％表示)
这些结果证明，deflamin确实以非常低的浓度存在与种子中，因此，在BE级分中观察到较低的活性。它还表明单独食用羽扇豆可能无法提供足够的deflamin来产生其分离形式所能提供的相同效果。
重要的是，要注意提取过程的低产率不是由于方法本身，而是由于种子中的deflamin量很低。尽管如此，使用过滤和流动离心以及低成本试剂如乙醇，以成本有效且简单的方式，该方法的相对容易性和升级扩大到更大量的可能性表明工业生产的高潜力。
此外，鉴于deflamin的潜力，我们开发的步骤对于对该蛋白质级分进行更全面的表征也是特别重要的，例如其特性、剂量反应效应和EC50，以及临床和临床前研究。对羽扇豆的其他品种和种类，来自其他豆科植物种子和来自其他植物种子的种子的研究以及其生长条件的变化可以提高种子中deflamin的量。分离的deflamin有效抑制MMP-9和减少癌细胞侵袭的事实表明了其具有广泛临床用途的高潜力。由于MMP-9与炎症以及肿瘤过程密切相关，MMPI deflamin可能既可用于抗癌治疗，也可用于抗炎治疗，特别是与消化道有关的治疗，如结直肠癌(CRC)和炎性肠病(IBDs)。
用质谱法-I鉴定包含白羽扇豆Deflamin的多肽
按照图4的实施方案中详述的方法，从羽扇豆种子中分离出Deflamin。随后通过RP-HPLC法，将Deflamin分级成下面描述的四个峰。通过质谱法鉴定包含如图46中所示的这些峰中的每一个多肽。所得结果显示在下面的(峰1)、(峰2)、(峰3)和(峰4)，并表明存在以下峰：
-峰1：羽扇豆球蛋白β1、β2、β3、β、β5和β7的片段。注意检测到跨越整个分子的β-羽扇豆球蛋白片段。在峰1中未检测到δ-羽扇豆球蛋白片段。
-峰2：羽扇豆球蛋白β1、β2和β6的片段，以及羽扇豆球蛋白δ-2大链。注意，检测到β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白片段，其跨越其前体的整个分子。
-峰3：羽扇豆球蛋白β1和羽扇豆球蛋白δ-2大链的片段。注意，检测到β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白片段，其跨越其前体的整个分子。
-峰4：羽扇豆球蛋白β1、β2、β3、β6和β7的片段。注意检测到跨越整个分子的β-羽扇豆球蛋白片段。在峰1中未检测到δ-羽扇豆球蛋白片段。
换句话说，图44至46显示通过RP-HPLC和SDS-PAGE法将deflamin分级分离成其组成多肽的代表性图。通过图4中开发和示出的方法从羽扇豆种子中提取和纯化Deflamin。(图44)和(45)-在214nm(图44)和280nm(图45)处监测的deflamin的反相(RP)-HPLC色谱。(图46)在还原条件下(R-SDS-PAGE)进行SDS-PAGE(17.5％w/v丙烯酰胺)可视化从HPLC过程中收集的每个峰的多肽谱。将蛋白质峰(50μg)加载到17.5％(w/v丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上。用考马斯亮蓝染色总多肽。
图47显示了通过HPLC分级分离得到的级分1至4的MMP-9蛋白水解活性。以25μg/mL的浓度添加蛋白质样品，并通过DQ荧光测定法测量明胶水解活性。结果以任意荧光单位表示，并代表至少三次重复实验(n＝3)±SD的平均值。**表示与对照相比P＜0.001，*表示P＜0.05。
图48显示了暴露于RP-HPLC分级分离后收集的每个选定的deflamin峰后的HT29细胞迁移-相对迁移率。值是至少三次重复实验的平均值±SD，并且表示为相对于第0天的伤口闭合％。细胞生长直至达到80％汇合，并且用移液管尖端刮擦单层(第0天)。然后，将细胞暴露于25μg蛋白质/ml提取物中，48小时后记录细胞迁移。**代表P＜0.05。
从所有这些结果中可以得出两个主要结论：
-白羽扇豆deflamin由β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白片段的复杂混合物组成；
-β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白都是白羽扇豆deflamin的前体。
对白羽扇豆deflamin的峰组分(参见图44-46和SEQ ID Nos：194-197)进行质谱分析。通过RP-HPLC对白羽扇豆分离deflamin，得到4个峰，每个峰含有通过质谱鉴定的多肽。
颜色码表示肽的置信度：
·绿色残基对应肽，置信度为95％；
·黄色对应置信度在50％至95％之间的肽；
·红色对应置信度低于50％的肽；
·和灰色对应于未识别的残留物。
用Ca2+e Mg2+分裂两种分离的白羽扇豆Deflamin
来自白羽扇豆的分离的deflamin包含两个部分(一个来自β-羽扇豆球蛋白，另一个来自δ-羽扇豆球蛋白)，它们不通过HPLC分离，但实际上可以通过添加Ca2+和Mg2+来分离，因为β-羽扇豆球蛋白结合这些阳离子，进行自聚集并变得不可溶。
方法
将通过HPLC分离的deflamin级分进行冻干并溶解在水中并搅拌。向deflamin溶液中加入来自储备溶液的CaCl2和MgCl2，直至达到10mM的CaCl2和10mM的MgCl2，然后，搅拌4小时或过夜。将悬浮液以30,000g离心1小时。将上清液和沉淀物在预先在水中平衡的NAP-10柱上脱盐，并冻干以备将来分析。所有操作均在4℃下进行。
将两种冻干级分用电泳分离，并使用荧光DQ-明胶测定法、HT29细胞中的伤口愈合测定法和底物酶谱法测定它们的MMP-9抑制活性，如前所述。
结论
图49显示了Ca/Mg可溶性和不溶性deflamin级分的电泳图谱。该图显示了Ca/Mg可溶性和不溶性deflamin级分的电泳图谱。D-通过RP-HPLC分离的deflamin；Ds-在阳离子(上清液)存在下不沉淀的deflamin级分；Dp-在阳离子(沉淀)存在下沉淀的deflamin级分。
将白羽扇豆Deflamin分裂成两个部分会影响其抗癌活性
当分成两部分时，白羽扇豆deflamin失去其抑制细胞侵袭的活性。但是当这些分数再次组合时，它会恢复部分初始活动。这些结果如图50所示，表明这两种组分对于deflamin生物活性的表达至关重要。
图50显示了通过用10mM的CaCl2和10mM的MgCl2溶液沉淀或不沉淀的deflamin和deflamin亚级分对HT29细胞中细胞侵袭的抑制。C对照；D-deflamin；Ds-在阳离子(上清液)存在下不沉淀的deflamin级分；Dp-在阳离子(颗粒)存在下沉淀的deflamin级分；和Ds+p-两个级分，Dp和Ds等分组合。
白羽扇豆Deflamin对炎症和肿瘤侵袭相关基因表达的影响
基于某些疾病的自然史和流行病学研究，在特定的慢性炎症状况和最终的肿瘤外观之间建立了密切的联系。某些基因在这些病理过程中表达更高，它们表达的蛋白质通常被认为是炎症和肿瘤发生的生物标志物。这些例子是：几种类型的MMP，如MMP-1、MMP-7、MMP-9和MMP-2，以及肿瘤坏死因子α(TNFα)，参与全身炎症的细胞信号蛋白(细胞因子)，核因子kappaB(NF-KB)，控制DNA转录的蛋白质复合物，和TIMP1，内源性金属蛋白酶组织抑制剂，以及炎症介质iNOs和COX2。其中，一些在图51中进行了测试。
方法
将HT29细胞暴露于50μL/g的deflamin并使其生长24小时。使用NZY总RNA分离试剂盒(Nzytech)从HT29细胞中提取总RNA并进行一些修饰，并使用Take3多体积板(Bio-TekInstruments Inc.Inc.Winooski，美国)在Synergy HT Multiplate Reader中使用Gene5软件进行定量。对于逆转录，根据制造商的推荐使用用oligod(T)试剂盒引发的RevertAid逆转录酶引发(Thermo Scientific)。
使用一组与炎症和癌症侵袭相关的特定基因的引物。当扩增证实表达时，通过实时PCR(qPCR)定量转录物，在20μL反应体积中进行，该反应体积由来自2μg的RNA、0.5μM基因特异性引物(表3)和使用iQ5实时热循环仪(BioRad，Hercules，CA)的SsoFast EvaGreenSupermixes(Bio-Rad，Hercules，CA)。循环的反应条件是95℃3分钟，然后在95℃下进行40个循环10秒，在61℃下进行25秒，在72℃下进行30秒。在每种情况下产生熔解曲线以确认单一产物的扩增和引物二聚化的缺失。每个分析在一式三份反应中进行，每个反应进行三次生物学重复(n＝9，其中每次重复是三次技术测量的平均值)。将由iQ5光学系统软件(Bio-Rad，Hercules，CA)获得的相应定量循环(Cq)输出至MS Excel电子表格(Microsoft Inc.)以进行定量。将每种目的基因的Cq值相对于肌动蛋白(Act)标准化。在deflamin暴露中的相对基因表达值在下面图51中显示出来，其作为与对照条件相关的倍数变化值。
表3用于评估研究中基因转录的特异性引物对
结论
图51中所显示的结果表明，deflamin不会显著改变与炎症和肿瘤发生相关的特定基因的表达，也不会与MMP-9相关，证实了deflamin对基因表达没有显著直接活性的假设，而是通过直接作用与MMP-9的相互作用。值得注意的是，对与MMP-1和MMP-7相关的基因表达的小抑制活性，其通常在晚期转移性疾病期间表现出增强的表达。
换句话说，图51显示了HT29细胞中对deflamin的转录反应。
Deflamin在食品中的活性
白羽扇豆Deflamin用于制作咸味煮熟的饼干。重要的是要注意，在此过程中，温度升高到180℃。然而，图52中获得的结果显示，deflamin在咸味煮熟的饼干中维持其癌细胞侵袭抑制活性。
图52显示了由含有(D)或不含(C)deflamin的饼干制备的蛋白质提取物对HT29细胞中细胞侵袭的抑制。C-对照；CF-未经烹煮的对照饼干；CS-煮熟的饼干；DF-含有deflamin的未烹煮的饼干；DS-含有deflamin的煮熟的饼干。
白羽扇豆Deflamin-II的分离与鉴定
通过RP-HPLC和电泳分析Deflamin
图53显示了通过RP-HPLC(洗脱液为乙腈和TFA)和相应的SDS-PAGE的白羽扇豆deflamin级分的代表性图。从白羽扇豆(Lupinus albus)种子中提取和纯化Deflamin。
图53显示了HPLC和电泳图谱。A-在280nm处监测反相(RP)-HLCLC色谱。Deflamin峰值由箭头标识。B-在还原条件下通过SDS-PAGE(17.5％w/v丙烯酰胺)显现从HPLC运行中收集的deflamin峰的多肽谱。将在30分钟(50μg)洗脱的蛋白质峰加载到17.5％(w/v丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上并用考马斯亮蓝染色。
用MALDI-TOF II的Deflamin两个片段的质谱分析
方法
仪器包括Ultraflex II MALDI-TOF TOF Bruker-Daltonics，配备LIFT电池和N2激光器。
电离：MALDI
操作模式：质谱仪在线性模式下以正极性操作，并且在m/z 5000-20000的范围内获得光谱。在50Hz的激光频率下在每个光点位置获得总共1000个光谱。外部校准：来自Bruker的蛋白质校准标准I(胰岛素[M+H]+(5734.51m/z)；泛素I(8565.76m/z)、细胞色素c(12360.97m/z)、肌红蛋白(16952.30m/z))；细胞色素c(6180.99m/z)和肌红蛋白(8476.65m/z)的[M+2H]2+)。
结论
白羽扇豆deflamin的MALDI-TOF分析清楚地显示出存在两个质量为13和17kDa的多肽片段，其由几个彼此同源的片段组成，具有略微不同的长度(图54)。
换句话说，图54显示了通过MALDI-TOF MS分析的来自白羽扇豆的deflamin。
Deflamin抗菌活性
针对以下微生物来测试Deflamin的抗微生物活性，发现无效：
革兰氏菌+细菌：
-单核细胞增生李斯特菌(NCTC 11994)
-蜡状芽孢杆菌(NCTC 7464)
-金黄色葡萄球菌(NCTC 10788)
革兰氏菌：
-大肠杆菌(NCTC 9001)
-沙门氏菌Goldcoast(NCTC 13175)。
菌类：
-交链孢菌(Alternaria altemata)
-灰霉病菌(Botrytis cinerea)
-Phaeoacremonium aleophilum
-交链孢霉属(Alternaria sp)。
-青霉属(Penicillium sp)。
结肠炎的动物模型
Deflamin抗结肠炎作用的初步结果
关于deflamin对结肠炎的生物活性的初步结果显示在图55中。对于deflamin的抗结肠炎作用的初步结果：将小鼠模型中的对照和deflamin处理进行相比，结肠炎诱导的病变的代表性图。该测定作为初步研究进行，在诱导结肠炎后在它们的饮食中仅引入一种浓度的deflamin。
Deflamin给药减少了结肠炎损伤的宏观和功能征象。
为了确定deflamin的抗炎作用，使用两种类型的给药方式，口服(p.o.)和腹膜内注射(i.p.)测试其对TNBS诱导的结肠炎小鼠的作用。在结肠炎诱导后3小时施用去纤维蛋白酶。图56和57分别显示了deflamin对结肠长度(cm)和肠损伤程度(cm)的影响。
图56显示了deflamin给药对结肠长度(cm)的影响。假手术组(n＝6)，EtOH组(n＝6)，TNBS组(n＝10)，TNBS+deflamin p.o.组(n＝9)和TNBS+deflamin i.p.组(n＝10)。与假手术组相比，#P＜0.001，与TNBS组相比，*P＜0.001。
图57显示了deflamin给药对肠损伤程度(cm)的影响。假手术组(n＝6)、EtOH组(n＝6)、TNBS组(n＝10)、TNBS+deflamin p.o.组(n＝9)、TNBS+deflamin i.p.组(n＝10)。与假手术组相比，#P＜0.001，与TNBS组相比，*P＜0.01。
图58显示了deflamin给药对肉眼观察结肠的影响。(A)假手术组(n＝6)、(B)EtOH组(n＝6)、(C)TNBS组(n＝8)、(D)TNBS+deflamin p.o.组(n＝9)。与假手术组相比，#P＜0.001，与TNBS组相比，*P＜0.01。
图59显示了deflamin给药对肉眼观察结肠的影响。(A)假组(n＝6)，(B)EtOH组(n＝6)、(C)TNBS组(n＝8)、(D)TNBS+deflamin i.p.组(n＝10)。与假手术组相比，#P＜0.001，与TNBS组相比，*P＜0.01。
假手术组和乙醇组中的动物没有表现出结肠损伤的宏观征象，并且没有死亡率，而结肠内注射TNBS/EtOH导致结肠长度的显著(P＜0.05)减少和可见程度(溃疡形成)的增加。在deflamin治疗组(p.o.和i.p.)中，与TNBS组相比，结肠损伤的所有宏观征兆均显著降低(图56和57)。
结果显示，deflamin(i.p.和p.o.)的使用导致结肠炎症的总体减少，并且在p.o.的情况下，结肠长度减少显著(P＜0.05)减少，并且可见损伤的程度(溃疡形成)显著(P＜0.05)减弱。在实验结束时，结肠收集后立即通过显微镜观察新鲜和漂洗的结肠，可以容易地察觉到这些差异。图58和59显示了通过台式手术显微镜获得的从不同处理组分离的结肠的这些显微镜观察的代表性图片。在结肠内施用TNBS后4天，结肠出现松弛并充满液体粪便。与TNBS诱导的结肠炎相比，图像的观察显示用deflamin处理的动物中结肠损伤的明显减弱(图42和43)。
关于给药类型，当比较结肠炎的形态学征和结肠损伤的程度时，在两种类型的给药之间观察到一些差异，其在i.p.给药(表1和图59；P＜0.05)。当比较两种处理时(即p.o.与i.p.；图58和59)，宏观观察也证实了这种趋势。
Deflamin减弱了结肠炎损伤的组织学特征和炎症标志物。
为了启发担负deflamin作用的机制，我们分析了组织学损伤的严重程度，并确定了炎症和癌症进展，COX2和iNOS的特异性标志物的存在。
实验性诱导结肠炎的结肠组织中环氧合酶-2(COX-2)和一氧化氮合酶(iNOS)的表达下降(D′Acquisto等，2002)，与结肠炎的严重程度的降低和疾病的宏观和微观征象的缓解相关。特别是在肠道中，通过诱导型iNOS的表达上调NO的产生代表了迅速的肠道抗菌反应的一部分；然而，NO也与人类IBD炎症的发生和维持有关(Kolios等，2004)，研究表明，iNOS衍生的NO水平与溃疡性结肠炎的疾病活动性相关(Cross和Wilson，2003)。一氧化氮在发炎的肠道中比在非发炎的肠道中以更大的量局部产生和释放，并且实际上甚至被建议作为用于诊断和监测IBD患者的新型临床生物标志物(Lundberg等人，2005)。与COX-2类似，实验性结肠炎研究中的免疫染色测定显示实际上在经历结肠炎诱导的动物中iNOS的表达增加。
组织学评估如图60所示。
图60显示了deflamin给药对结肠炎症的组织学特征的影响。(A)假手术组(n＝6)、(B)EtOH组(n＝6)、(C)TNBS组(n＝8)、(D)TNBS+deflamin p.o.组(15mg/kg，n＝9)、(E)TNBS+deflamin i.p.组(10mg/kg，n＝10)。
虽然对照样本显示正常结肠没有病变、粘膜厚度均匀、隐窝结构正常且无炎症迹象，但在TNBS治疗中，结肠显示严重溃疡伴隐窝丢失、粘膜较薄、中性粒细胞浸润明显，等于得分3。
相比之下，来自给予deflamin的动物样品呈现更温和的病变，部分完整的隐窝和一些中性粒细胞浸润，表明较低的伤害评分为2，特别是以口服方式施用。
图61显示了deflamin给药对COX-2和iNOS的结肠组织表达的影响。(A)-COX-2表达：(1)假手术组、(2)TNBS组、(3)TNBS+Deflamin p.o.组，(4)TNBS+Deflamin i.p.组；B)-iNOS表达：(1)假手术组、(2)TNBS组、(3)TNBS+Deflamin p.o.组、(4)TNBS+Deflamin i.p.组。
图61显示了结肠组织中的COX-2和iNOS表达。结果显示，与对照样品相比，TNBS处理诱导沿着剩余隐窝的COX-2和iNOS表达显著增加，由棕色表示。根据组织学观察，用deflamin处理的动物表现出对COX-2和iNOS的染色减少，表明结肠上的炎症过程减少，特别是在口服组中。
在预防和治疗中诱导Deflamin效应
既然口服施用会产生更好的结果，我们进一步测试了通过口服饮食补充Deflamin的预防方法，而不仅仅是治疗方法会产生类似的效果。
表4显示了两种治疗中结肠炎的形态学和功能体征，治愈性(D-p.o.在TNBS诱导后3小时给予deflamin)和预防性(Dp-o.p.在TNBS给药前3天给予Deflamin的)。
假手术组和乙醇组中的动物没有表现出结肠损伤的宏观征象，并且没有死亡率，而结肠内注射TNBS/EtOH导致结肠长度的显著(P＜0.05)减少和可见的损伤(溃疡形成)和腹泻严重程度的增加，表现出50％的死亡率。
表4收集后立即对两种治疗进行的结肠的形态学和功能观察，治愈性(D-p.o.在TNBS诱导后3小时施用deflamin)和预防性给药(Dp-p.o.施用TNBS前3天施用deflamin)。*与Sham组相比，p＜0.001；与TNBS组相比，#p＜0.05；和φp＜0.05D组与Dp组。
结果表明，deflamin的施用既可以治疗也可以预防，导致结肠炎症总体减少，结肠长度显著(P＜0.05)减少，并且可见损伤(溃疡形成)显著减少(P＜0.05)。此外，与TNBS组相比，观察到腹泻严重程度、死亡率和结肠炎症的一般组织学特征的显著降低(P＜0.05)。此外，在预防和治疗方法之间以及在deflamin治疗和对照之间没有观察到显著差异(P＞0.05)。
Deflamin降低新鲜结肠组织中MMP-9的活性
为了测试在deflamin处理中观察到的抗炎作用是否是由于MMP-9和/或MMP-2抑制，测试了这些酶在来自不同实验动物组(治疗和预防)的新鲜结肠组织中的明胶水解活性。图62显示了通过猝灭染料DQ-明胶法定量的结肠样品中存在的总明胶水解活性。
图62显示了deflamin施用对结肠炎诱导的小鼠的MMP-2和MMP-9的结肠组织明胶水解活性的影响。通过DQ荧光法定量结肠中存在的明胶酶的蛋白水解活性。结果表示为相对荧光，以控制率％表示，并且代表至少三次重复实验(n＝3)±SD的平均值。TNBS组＝C+；假手术组＝C-；D＝用deflamin治疗(15mg/kg，n＝9，口服)；和Dp＝用deflamin预处理(15mg/kg，n＝6，口服)。*与假手术组相比，p＜0.001；与TNBS组相比，#p＜0.05；和D组和Dp组相比，φp＜0.05。
图62显示，与对照组相比，TNBS诱导明胶水解活性显著增加(P＜0.001)，而当与TNBS施用相比，治疗性和预防性deflamin施用均显著降低了(P＜0.05)总MMP-9+MMP-2活性，但是，治疗组和预防组之间没有显著差异(P＞005)。
鉴于DQ-明胶测定提供了结肠组织中总明胶水解活性的证据(即MMP-9+MMP-2)，两种明胶酶之间没有可能的区别，我们通过底物酶谱法进一步测试了它们的特异性，其中MMP-9和MMP-2以其天然和原始形式可以通过电泳容易地解析。图63显示了从不同实验组中的结肠组织获得的蛋白质提取物的酶谱图谱的实例。白色条带显示特定条带的明胶活性。
图63显示了deflamin施用对结肠炎诱导的小鼠的MMP-2和MMP-9的结肠组织明胶水解活性的影响。结肠的MMP-9和MMP-2活性的酶谱图的代表性图。将结肠的蛋白质提取物上样到与1％(w/v)明胶共聚的12.5％(w/v丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上。TNBS组(n＝10)；假手术组(n＝6)；D＝在治疗中用deflamin处理的动物结肠(15mg/kg，n＝9，口服)和Dp＝来自用预防性治疗中的deflamin处理的动物结肠(15mg/kg，n＝9，口服)。
酶谱图显示，当与MMP-2和MMP-9的活性形式是低活性的对照进行相比时，TNBS是如何不仅增加MMP-9活性而且增加MMP-2活性，包括酶的天然形式和酶原形式。然而，在deflamin处理中，当与TNBS组相比时，MMP-9和MMP-2活性(天然和酶原形式)明显减少。
然而，MMP抑制的特异性和强度在治疗之间不同。虽然在治愈性治疗中，MMP-2和MMP-9都以类似的方式降低(对于两种酶形式)，这种趋势在预防方法上并不相同，其中MMP-9清楚和明显地比pro-MMP-2更加具有抑制作用，而pro-MMP-2被抑制，但MMP-2未被抑制(图63)。
Deflamin对其他急性炎症模型也具有生物活性
图64显示了deflamin施用对水肿诱导后6小时角叉菜胶引起的大鼠爪水肿发展的影响。单次给予deflamin提取物(15mg/kg；n＝5；口服)与单次给予角叉菜胶(1mL/kg；n＝6；腹膜内)、吲哚美辛(10mg/kg)的效果比较；口服；n＝6)，tempol(30mg/kg；n＝8；口服)或Trolox(30mg/kg；n＝8；口服)。SF：足底注射0.1mL无菌盐水并且用盐水施用(1mL/kg，腹膜内，n＝6)。数据以标准偏差的方式表示。*与SF组相比，p＜0.001；与角叉菜胶组相比，#p＜0.001。
图65显示了在角叉菜胶诱导水肿后6小时，deflamin局部施用对大鼠爪水肿的影响。与单次施用角叉菜胶(1mL/kg；n＝6；腹膜内)的效果相比，单次施用地雷明提取物(15mg/kg；n＝3；口服)的效果。SF：足底注射0.1mL无菌盐水并给予盐水(1mL/kg，腹膜内，n＝6)。数据以标准错误的方式表示。*与SF组相比，p＜0.001；与角叉菜胶组相比，#p＜0.05；与SF组相比，φp＜0.01。
测试Deflamin以观察它是否能够减轻炎症的另一动物模型中的炎症：角叉菜胶诱导的爪水肿，也使用不同的给药：通过口服、腹膜内注射或局部应用。图64显示了在口服和腹膜内给药的条件下deflamin对爪水肿的影响，和图65显示了局部给药的结果，以爪体积增加的百分比表示。对于角叉菜胶组，在两个图中观察到爪体积％非常显著地增加(P＜0.001)，而用抗炎对照的治疗显著降低(P＜0.05)。
结果显示，在角叉菜胶给药后，deflamin处理减少了爪体积的增加百分比，但是对于局部给药仅显著降低(P＜0.05)(图65)，而在腹膜内和口服给药(图58)，效果与角叉菜胶组无显著差异(P＞0.05)。
Deflamin消化率
图66显示了小鼠血液和粪便的反向酶谱(分别为入分数和出分数)。在0天(对照)、4天(T4)和7天(T7)期间，对大鼠口服给予Deflamin。M：分子量标记物。
反向酶谱(图66)显示了在小鼠粪便中存在蛋白酶抑制剂(即deflamin)，但在小鼠血液中不存在。该结果由图34中所示的数据证实。尽管在图66中未清楚地看到，但在较长时间(即7天)内摄入deflamin的动物中发现这种活性更强烈。
这些结果表明，deflamin在小鼠消化过程中存活，因为它在通过结肠后保持其生物活性。在小鼠血液中未检测到抑制剂活性，表明deflamin可能不进入血流。或者，所遵循的方法可能不够灵敏，无法保证其在血液样本中的检测。
小鼠摄取deflamin导致其在出分数(即结肠)中的检测。缺乏证据表明口服给予的deflamin可能不会进入血液。这可以解释为意味着在发挥其生物活性后，deflamin在小鼠粪便中排泄。如果确认动物血液中缺少deflamin，则可能非常有利于避免已知的二次侧向效应，这种副作用通常是由人体MMPs的非特异性抑制引起的，通常描述为合成MMPIs。重要的是重点观察所揭示的观点，即即使在通过小鼠整个消化道后，deflamin似乎仍保持其抗明胶生物活性，这与其在人类健康和营养中的潜在应用密切相关。
蒸煮的白羽扇豆种子对抑制HT29细胞迁移的效果
许多热不稳定的生物活性化合物已在种子中描述。然而，大多数种子在烹调后由于各种原因被摄取，包括例如存在毒性、热不稳定的肽、蛋白质(例如凝集素、酶抑制剂和释放有毒化合物的酶，例如存在于氰基植物中的糖苷酶)和其他化合物。在这些条件下，除了在消化过程中存活之外，存在于功能性种子中的生物活性化合物通常需要抵抗烹调。
图67显示了deflamin的HT29细胞抗迁移作用。用deflamin处理或用来自煮熟的种子和未煮过的种子的可溶性蛋白质提取物处理后HT29细胞中伤口闭合测定的代表性图。使细胞生长直至达到80％汇合，并通过用移液管尖端(0h)刮擦细胞来进行创伤。然后，将细胞暴露于100μg蛋白质提取物/mL，并在48小时后监测伤口愈合。
图67分析了通过伤口愈合测定对种子烹调对白羽扇豆种子抑制HT29细胞迁移的能力的影响。分离的deflamin在蛋白质浓度为100μg/mL时完全抑制HT29细胞的迁移。实际上，这种deflamin浓度不仅阻止细胞迁移，而且还从固体支持物中分离出细胞。总种子蛋白质的提取物也抑制细胞迁移，在煮熟的种子的情况下，这种效果被发现特别强烈。这种明显令人惊讶的结果可以通过对沸腾产生的deflamin和其他耐热蛋白质的浓度效应来解释。换句话说，在烹调的种子中存在于100μg的种子总可溶性蛋白质中的deflamin的量高于未烹饪的种子，因为许多种子蛋白质通过热处理变性(因此变得不可溶)。
可以得出结论，deflamin在低浓度下显示出抑制细胞侵袭和MMP-9和MMP-2活性的有效能力，而不会以显着的方式影响结肠细胞的生长。因此，deflamin在CRC中显示出作为抗炎和抗肿瘤剂的高潜力。它对消化过程、沸腾和低pH值具有很高的抵抗力，使得deflamin成为人类健康和营养保健品的理想选择。它的生物活性在煮熟的总种子提取物中同样有效，这一观察使羽扇豆成为一种极好的功能性食品，作为地中海饮食良好的另一个重要益处，在世界各地实施-2010年11月16日由教科文组织政府间委员会列入人类非物质文化遗产代表名单。
Lunasin和哪些Deflamin前体的氨基酸残基序列
上述数据表明在deflamin制剂中存在β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白-2大链片段。因此，B-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白-2大链可以被认为是deflamin前体。
使用http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上的NCBI BLAST(Basic LocalAlignment搜索工具)工具检查大豆43-氨基酸残基lunasin和蛋白质之间氨基酸残基序列的可能相似性，其多肽被鉴定为deflamin的成分，即β-羽扇豆球蛋白的片段和δ-羽扇豆球蛋白的重链。
在适当的时候，还使用了http：//web.expasy.org/tmp/1week/blastf29720.html上提供的ExPASy BLAST工具。
基于上述观察结果，deflamin显然包含β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白＜10kDa片段的混合物，用在BLAST分析中的查询序列和主题序列是：lunasin(大豆)(SEQ IDNO：191)、β-羽扇豆球蛋白(白羽扇豆)(SEQ ID NO：192)、δ-羽扇豆球蛋白-2大链(狭叶羽扇豆)(SEQ ID NO：193)和δ-羽扇豆球蛋白(白羽扇豆)(SEQ ID NO：194)。
当与蛋白质数据库中存在的所有条目相比时，lunasin(大豆)氨基酸残基序列与大豆2S白蛋白显示出出非常强的同源性(超过95％)。BLAST适当分析清楚地说明了这一点。
也进行了lunasin与deflamin前体的氨基酸残基序列比较。Lunasin与来自白羽扇豆的羽扇豆球蛋白β前体与Lunasin对凝集素δ-2大链之间未发现氨基酸残基序列同源性。
在lunasin的氨基酸序列和对应于来自白羽扇豆的δ-羽扇豆球蛋白的轻链的片段之间碰到了相当大的同源性。
沿着43个氨基酸残基lunasin，存在一段25个氨基酸，其与包含残基21至45的羽扇豆属δ-羽扇豆球蛋白区域具有48％的同源性(25个中的12个残基)。
可以得出结论，lunasin的氨基酸序列与deflamin前体的氨基酸序列没有同源性，即β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白-2大链。
序列ID No：195证实了lunasin含有25个长区域，其氨基酸序列与羽扇豆属δ-羽扇豆球蛋白小链内的相应区域具有48％的同源性，但与狭叶羽扇豆的羽扇豆球蛋白δ-2大链不同。然而，这一观察结果与Herrera(2009)报道的结果相矛盾。
序列ID NO：195显示了羽扇豆属δ-羽扇豆球蛋白(保藏号Q333K7；黑色、橙色和红色)与两种多肽之间的序列匹配：大豆lunasin(保藏号AF005030；绿色)和狭叶羽扇豆的羽扇豆球蛋白δ-2大链(保藏号P09931；蓝色)。
除了不同的氨基酸残基序列，lunasin和deflamin之间的另一个主要差异涉及它们对消化蛋白水解的敏感性。虽然deflamin抵抗消化过程，但lunasin却没有(Cruz-Huerta等，2015)。此外，与deflamin不同，lunasin的提取和纯化不适合进行放大步骤，使得这种生物活性肽不适合大规模生产。
来自白羽扇豆以外的种子的DeflaminI
发现Deflamin存在于羽扇豆以外的种子中。图68显示了来自白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆的几种浓度的总可溶性蛋白质提取物对HT29细胞迁移的抑制作用。结果表明在分析的种子中存在细胞迁移抑制活性。
图68显示了通过伤口愈合测定评估的HT29细胞迁移的代表性图。使细胞生长直至达到80％汇合，并用移液管尖端(0h)刮擦单层。在将HT29细胞暴露于缓冲液(对照)48小时后测定细胞迁移，并从羽扇豆、鹰嘴豆和大豆的种子中提取几种浓度的总可溶性蛋白质。
随后按照图4中描述的针对白羽扇豆deflamin的步骤，从白羽扇豆、鹰嘴豆和大豆种子中纯化和分离出Deflamin。来自白羽扇豆(称为deflamin La)、大豆(称为deflaminGm)和鹰嘴豆(称为deflamin Ca)的deflamin的多肽谱显示在图69中。
图70、71和72中显示的结果比较了通过DQ明胶测定法在体外测量的抗明胶水解活性，通过伤口愈合测定法确定对HT29细胞迁移的抑制活性，以及通过deflamin的MMT方法测定的HT29细胞生长，deflamin分别从白羽扇豆(deflamin La)、大豆(deflamin Gm)和鹰嘴豆(deflamin Ca)中分离出。
图70至72中显示的数据显示，来自大豆和鹰嘴豆的deflamin也抑制体外MMP-9和MMP-2明胶酶以及HT29细胞迁移，但对任何HT29细胞生长的显着程度没有影响，与从羽扇豆中获得的deflamin的结果平行。然而，来自羽扇豆的deflamin似乎比大豆或鹰嘴豆更有效。最后一次观察可能与以上提到的地中海饮食无关，因为人们通常每餐摄入比羽扇豆更多的鹰嘴豆或大豆。
简要讨论上述呈现结果的选定的主题
Deflamin是一种新型抗消化明胶酶抑制剂，可通过口服补充剂减轻结肠炎的损伤。MMP-9抑制剂(MMPIs)主要被认为是原发性肿瘤和转移抑制剂的抗血管生成剂，但它们也被证明可有效抑制癌前状态，例如结肠炎和其他炎症性肠病。30多年来，全世界的研究人员一直认为MMPs是癌症和炎症的有吸引力的治疗靶点。结果，已经合成了无数的MMPIs，其中一些已被用作潜在的治疗剂(Bourguet等，2012)。然而，只有少数小MMPIs进入临床试验阶段，其中大多数由于缺乏益处或强烈的不良副作用而过早终止(Wang等，2012)。理想情况下，对于特定的MMP-9抑制剂作为膳食补充剂成功用于治疗炎症性肠病(IBD)，它应该是结肠可用的，而不是血清生物可利用的，对消化过程有抵抗力，对结肠细胞也无毒。这里给出的结果清楚地表明，deflamin在消化过程中存活并且能够减弱由TNBS诱导的结肠炎引起的损伤，导致结肠炎症的几种功能和组织学标志物的减少，即：结肠长度的减少，可见损伤程度(溃疡形成)的减少，腹泻严重程度的降低，降低的死亡率，粘膜出血的减少和结肠炎症的一般组织学特征减少。而且，这种效果在口服给药和腹膜内给药中是明显的，证明了其在饮食方法中的潜在用途。事实上，在口服给药中获得的总体结果表明，deflamin不仅对消化具有抗性，而且在通过更有效地原位作用减少结肠炎损伤方面比腹膜内给药更有效。有趣的是，预防性方法，更长时间的饮食给予deflamin与治疗方法相比没有显着差异，在TNBS诱导后仅3小时施用deflamin。这表明它可以以有效和快速的方式充当炎症抑制物，表明了在急性情况下以及在慢性炎症中可能用作营养保健品。
口服施用deflamin降低了炎症信号级联中涉及的炎性标志物的表达。
组织学上午分析和一些重要的炎症标志物的表达也证实了deflamin的抗炎作用。我们在实验性结肠炎研究的动物的结肠中进行的免疫染色测定显示，与假动物相比，结肠炎症的诱导导致了COX-2的表达增加，这与临床和流行病学研究一致，证明了COX-2和前列腺素在IBD患者肠道炎症进展中的重要作用(Ogasawara等，2007；Chen等，2014)。施用deflamin导致COX-2染色减少，表明它损害了受损肠组织中COX-2的表达。
而且，特别是在肠中，观察到一氧化氮的产量上调。据报道，该化合物在发炎的肠道中比在非发炎的肠道中以更大的量局部产生和释放，被建议作为用于诊断和监测IBD患者的新型临床生物标志物(Lee等人，2013)。与COX-2类似，实验性结肠炎研究中的免疫染色测定法显示了实际上在经历结肠炎诱导的动物中iNOS的表达增加。同样，deflamin给药，特别是通过口服给药，能够降低iNOS表达，因此有助于损伤结肠中的炎症过程。
Deflamin在体内抑制MMP-9和MMP-2
目前已经证明，deflamin在体外测定中抑制结肠细胞中的MMP-9和MMP-2，并且它对热和酸变性具有抗性，这使其成为IBD和结肠癌的营养品的良好候选物。然而，需要进行体内试验以进一步确定其消化后的有效性并证实其作为营养保健品的潜力。在这方面，总体生理和形态学结果证实了deflamin确实可以抑制结肠炎引起的TNBS组中观察到的MMP-9和MMP-2活性的升高，将它们调整到更接近于对照中观察到的活动强度。
有趣的是，尽管在预防性治疗和治愈性治疗之间没有观察到形态学和功能差异，但在酶谱分析中，两种酶的特异性抑制之间存在显着差异。在治愈性治疗中，deflamin似乎直接作用于TNBS强烈诱导的两种明胶酶，在预防性治疗中观察到MMP-9活性形式和pro-MMP-2的特异性抑制，但不是pro-MMP-9的表达，也不是MMP-2的活性形式。MMP通常作为酶原(pro-MMPs)合成，其催化活性被半胱氨酸开关阻断，并且仅通过有限的蛋白水解除去它而活化。在酶谱分析中，前明胶酶也变得有活性，因为它们被SDS变性，从而暴露出催化位点(因为它们仍保持半胱氨酸转换的短氨基酸序列，由此它们在酶谱凝胶中的原酶含量略高)。只有活性形式的MMP-9才被deflamin抑制，这一事实表明它对这种形式显示出一定程度的特异性，可能对催化位点，仅暴露在活性形式中。
另一方面，pro-MMP2似乎被抑制但不是MMP2。因为MMP-2是激活MMP-9的蛋白酶之一，似乎有理由认为，在更长时间里暴露于deflamin时，MMP-9的高抑制作用将通过反馈诱导更高的MMP-2活化以激活MMP-9。
虽然更长时间暴露于deflamin似乎表明了明胶酶的合成和活化具有更深远的影响，但结果表明，作为预防给药方式时，其在治疗方法中的施用与减少结肠炎损伤一样有效。与临床试验中使用的大多数广泛MMPI相反，对MMP-9的更高特异性仍然是重要的，因为它确保了低的副作用。
Deflamin还可以减少其他型号的炎症
为了阐明deflamin作为抗炎剂的范围，我们进一步测试了deflamin是否能够减轻爪水肿中的炎症。虽然在腹膜内和口服给药中爪的体积百分比有所减少，但是它们没有统计学意义，这表明在两种给药方式中，通过血流的deflamin的吸收和分布是有限的。然而，在deflamin局部给药中观察到的显着功效证实了当原位施用时其效果更高。它还表明，deflamin可以通过皮肤吸收。考虑到MMP-9与皮肤癌疾病之间的关系(Philips等，2011)，我们的研究结果为deflamin临床应用开辟了新的可能性。
结论-1
作为基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2的有效抑制剂并具有强大的抗炎活性，deflamin代表了一种新型MMPI，它可食用，具有蛋白质性质，可在消化过程中存活，可用作营养保健品，并且其可用作预防/治疗炎症以及由它们衍生的任何疾病的营养保健品或功能性食品。在口服、静脉内或局部给药中有效，deflamin可用作预防或治疗各种疾病的营养保健品或功能性食品。
白羽扇豆deflamin是β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白大链片段的混合物。
Deflamin中β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白片段的存在是相当有趣的。β-羽扇豆球蛋白是一种不含二硫桥的三聚体蛋白，其中单体由大量的糖基化或未糖基化的多肽组成，范围从16到70kDa，但是大量的蛋白水解加工位点产生丰富的观察到7S蛋白亚基。其在萌发后完全降解有力地支持了β-羽扇豆球蛋白的储存功能。有趣的是，这种蛋白质的另一个片段因其对抗真菌的有效生物活性而闻名：Blad，20kDa的大量瞬时β-羽扇豆球蛋白衍生的多肽链，具有凝集素样活性。由于具有高反应性并且存在生物活性的cupine域，因此可能存在具有特定未知活性的β-羽扇豆球蛋白的其他片段尚待发现。然而，先前的研究表明，deflamin既没有抗真菌活性也没有杀菌活性(结果未显示)，并且deflamin片段的序列与Blad的序列不匹配。
δ-羽扇豆球蛋白属于富含2S硫的白蛋白家族，其在羽扇豆中也可能具有特定的未知生物活性。羽扇豆种子2S白蛋白，也称为δ-羽扇豆球蛋白，是一种单体蛋白质，其包含通过两个链间二硫键连接的两条小多肽链：由37个氨基酸残基组成的较小的多肽链，分子量为4.4kDa，和含有75个氨基酸残基的较大多肽链，分子量为8.8kDa。后来，较大的多肽链与一些从deflamin获得的多肽谱有些相似，特别是在峰3中(参见图44至46)。较大的多肽链含有两个链内二硫键和一个游离巯基。这可以暂时解释在deflamin的R-和NR-SDS-PAGE之间检测到的表观分子量的微小差异(参见图43)。该蛋白质在来自白羽扇豆的蛋白质中具有特定的固有独特特征：除了其高半胱氨酸含量外，它在280nm处显示出低吸光度。
就δ-羽扇豆球蛋白的生理作用而言，已经提出了这类蛋白质的储存功能。然而，与植物谷物抑制剂家族(包括双功能胰蛋白酶/淀粉酶抑制剂)的结构相似性可能表明：除了其储存作用和可能证实作为MMPI的作用外，该蛋白质具有防御功能。δ-羽扇豆球蛋白中游离巯基的存在可能与MMPs中对Zn2+活性位点的高度亲和力有关，并且可以解释其抑制方式。实际上，分离这些羽扇豆球蛋白的一种方法是通过Zn沉淀。此外，其在白羽扇豆种子中的存在被评估为种子重量的约3至4％，这与上文获得的产率是一致的。此外，羽扇豆种子2S白蛋白通常存在于白蛋白和球蛋白级分中，因此解释了先前获得的两种蛋白质级分中MMP抑制活性的结论(Lima等人，2016)。
deflamin的HPLC峰1和峰4(图44-46)仅由β-羽扇豆球蛋白片段组成，并且仍呈现MMPI活性，尽管水平较低。因此，最高活性似乎可归因于包含两种蛋白质、β-和δ-羽扇豆球蛋白和不唯一为β-羽扇豆球蛋白的片段的特定混合物。事实上，只发现了δ-羽扇豆球蛋白的大多肽链存在于deflamin中，这可能表明它的三个巯基可以自由地与MMPs或与β-羽扇豆球蛋白片段相互作用(这可以解释一组显然是三个较小的较高分子量带，其包括deflamin)，并且该复合物具有最高的活性。另外，δ-羽扇豆球蛋白较小的多肽链可以存在于deflamin中。
结论-2
在过去的十年中，大量的研究已经转向发现含有MMPI的新型植物性食物，但很少，如果有任何存在deflamin的潜力，因为它很容易分离和显示高MMP-9抑制活性。在一个优选的实施方案中，deflamin的特征在于来自两种特定蛋白质前体的可溶性片段的复合物：δ-和β-羽扇豆球蛋白。总之，该多肽混合物显示出高度溶于水；它的生物活性抵抗沸腾，低pH值，可能还有消化蛋白酶；它强烈抑制基质金属蛋白酶(MMP)-9和/或MMP-2，即它是低浓度和剂量依赖性的MMP抑制剂(MMPI)，并且降低了人结肠腺癌细胞系HT29的侵袭能力，而不会发挥细胞毒性。用动物模型进行的一系列临床前强有力支持这些数据。这些特征使得deflamin成为一种新型的MMPI，可用作营养保健品或作为功能性食品的成分，用于预防/治疗肿瘤发生和细胞侵袭，以及由它们衍生的任何疾病。作为基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2的有效抑制剂，deflamin可用作预防和治疗与MMP-9活性相关的各种疾病的营养品或功能性食品。它在口服给药时的功效及其在消化过程中存活的能力表明它可以在结肠中有效地发挥作用，而不会发挥合成的MMPI表征的有害的副作用，使deflamin成为用于预防和治疗结直肠癌的优秀候选者。
结论-3
Deflamin表现出：
-Deflamin以剂量依赖的方式表现出强效的明胶水解活性；
-Deflamin以剂量依赖的方式显示出对结肠癌细胞侵袭的有效抑制作用；
-高deflamin浓度使结肠癌细胞从固体表面分离；
-即使浓度为100μg.mL-1，Deflamin也不会对结肠癌细胞产生明显的细胞毒作用；
-Deflamin不会导致细胞生长显着减少，也不会导致活细胞数量减少。
在一个或多个进一步的实施方案中，由于对羽扇豆种子贮藏蛋白施加的体外苛刻处理，实际上可以在其自身的纯化和分离过程中产生或改善deflamin，其拆分寡聚结构，通过有限的蛋白水解切割多肽，并除去不再溶于水的大多数未折叠的多肽。其他多肽被释放并可能成为deflamin的一部分。换句话说，在提取保留蛋白质及其部分变性/蛋白质水解后在体外形成deflamin是可能的，deflamin显然由多肽混合物组成，这些多肽是来自不同蛋白质前体的片段。
在其他物种的种子中存在的Deflamin-II
为了鉴定来自其他物种的种子中deflamin的存在，进行来自不同可食用种子的可溶性蛋白质的逆向酶切(图73)。
图73显示了在含有明胶和1mL含有MMP-9和MMP-2的HT-29培养基的12.5％(w/v)丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上进行的反向酶谱的代表性图。每个孔加载50μg来自不同种子物种的总提取物的蛋白质。豆科：V.a-赤豆(Vigna angularis，azuki bean)；V.r-绿豆(Vignaradiata，mung bean)；V.m-黑吉豆(Vigna mungo，urad bean)；L.m-变色羽扇豆(Lupinusmutabilis，Andes’lupine)。谷物：T.a-普通小麦(Triticum aestivum，common wheat)；A.s-燕麦(Avena sativa，oat)；P.G-小米(Pennisetum glaucum，millet)；T.t-卡姆小麦(T.turgidum var.turanicum，kamut wheat)。其他双子叶植物：C.q-藜麦(Chenopodiumquinoa，quinoa)；H.a-油葵(Helianthus annus，sunflower)；P.d-杏仁(Prunus dulcis，almond)；C-南瓜(Curcubita sp，pumpkin)；F.t-荞麦(Fagopyrum tataricum，buckwheat)；S.h-奇亚籽(Salvia hispanica，chia)。箭头表示存在deflamin。
在测试的其他物种中，除了最初评估的deflamin(即羽扇豆、鹰嘴豆和大豆)之外，只有来自黑吉豆、变色羽扇豆和卡姆小麦的种子显示出与deflamin相似的带。因此，进一步分析了其他种类的豆科植物，特别是羽扇豆属(Tupicus)和小麦属(Triticum)。
在羽扇豆属的其他种类的种子中存在的Deflamin
分析来自以下羽扇豆属种子中deflamin的存在：
-白羽扇豆
-变色羽扇豆
-西班牙羽扇豆
-努特卡羽扇豆
-狭叶羽扇豆
-黄羽扇豆
反向酶谱凝胶显示在下面的图74中。尽管在图H中很难看到，但所有分析的羽扇豆物种都显示出含有deflamin。
图74显示了在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上用明胶和1mL含有MMP-9和MMP-2的HT-29培养基进行的反向酶谱分析。每个孔装载50μg不同种子物种的总提取物：白羽扇豆、变色羽扇豆、西班牙羽扇豆、努特卡羽扇豆、狭叶羽扇豆、黄羽扇豆。
从变色羽扇豆的种子中分离Deflamin
图75显示了，在12.5％(w/v)丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE在还原(R)和非还原(NR)条件下，使用deflamin分离方法deflamin的潜在同源物的代表性多肽谱。向孔中加载100μg从变色羽扇豆纯化的蛋白质。
其他豆科植物种子中存在的Deflamin
纯化来自黑吉豆(urad bean)种子的deflamin，产生了与羽扇豆种类相比不同的多肽模式(图76)。
图76显示了，在12.5％(w/v)丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE在还原(R)和非还原(NR)条件下使用deflamin分离方法的deflamin潜在同系物的代表性多肽谱。向孔中加入100μg从黑吉豆纯化的蛋白质。
从小麦属植物种子中分离的Deflamin
分析以下Triticum物种是否存在deflamin：
-斯卑尔脱小麦
-硬粒小麦
-普通小麦
-卡姆小麦
反向酶谱凝胶显示在下面的图77中。反向酶谱显示了该物种中存在MMP-9抑制带：
-斯卑尔脱小麦
-东方小麦
-卡姆小麦*，
而且，很可能是其他古老的小麦品种和品种，但显然不是普通小麦。
东方小麦(Khorasan wheat，Oriental wheat，Triticum turgidumssp.tranranum，也称为Triticum turanicum)，商业上称为kamut，是一种四倍体小麦物种。有时被视为T.polonicum的标识似乎是不正确的。最近来自DNA指纹图谱的遗传证据表明，该品种可能来源于硬粒小麦(T.durum)和波兰小麦(T.polonicum)之间的天然杂种。
图77显示在12.5％(w/v)丙烯酰胺凝胶上用明胶和1mL含有MMP-9和MMP-2的HT-29培养基进行的反向酶谱分析。每个孔在来自如下不同种子物种的总提取物中加载50μg蛋白质：斯卑尔脱小麦(T.spelta，spelt)；硬粒小麦(T.turgidum var.durum，durum wheat)；普通小麦(T.aestivum，common wheat)和卡姆小麦(Triticum turgidum var.turanicum，kamut)。
然后，从这些物种的种子(即斯卑尔脱小麦、硬粒小麦和卡姆小麦)中分离出deflamin。结果如下图78所示。
图78显示了在12.5％(w/v)丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE在还原(R)和非还原(NR)缓冲液中使用deflamin分离方法的deflamin的潜在同源物的代表性多肽谱。将孔加载100μg蛋白质。泳道1-卡姆小麦；泳道2-硬粒小麦；泳道3-斯卑尔脱小麦。
对deflamin结构的进一步研究
在某些形式中，如果为羽扇豆属的情况下，deflamin由多肽复合物组成，其似乎衍生自β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白。在一个实施方案中，从白羽扇豆中分离出deflamin，进行2D电泳(在变性、还原条件下进行第二维步骤；图79)和通过LC/MS/MS鉴定的主要斑点。令人惊讶的是，分析的斑点含有相同的多肽，所有多肽均衍生自β-羽扇豆球蛋白和δ-羽扇豆球蛋白。
白羽扇豆deflamin和β-羽扇豆球蛋白前体结构域
β-羽扇豆球蛋白前体531-氨基酸残基序列(61.93139kDa)。显示了Blad 173-氨基酸残基序列(20.40895kDa)：
-信号肽_30个残基[1，30]
-前肽残基[31，108]
-Blad-173个残基[108，281]
XXX-第一个cupin域-148个残基[126，273]
-第2个cupin域-157残基[338，494]
X-可能的糖基化位点
-在FCT-UNL获得的正确序列：EQEEWQPR
-在FCT-UNL获得的正确序列：RGQEQSHQDEGVIVR
-在FCT-UNL获得的正确序列：SNEPIYSNK
-在FCT-UNL获得的正确序列：EQIQELTK
白羽扇豆deflamin和δ-羽扇豆球蛋白前体结构域
δ-羽扇豆球蛋白蛋白前体
-羽扇豆球蛋白δ信号肽_22个残基[1，22]
-羽扇豆球蛋白δ小链-37个残基[23，59]
-羽扇豆球蛋白δ大链-77个残基[72，148]
XXX-植物脂质转运蛋白-62个残基[76，137]
Deflamin也可包含更长的β-羽扇豆球蛋白多肽。实际上，在MS/MS分析期间，这种deflamin多肽是片段化的，并且这些片段中的一些可能丢失，这导致鉴定的β-羽扇豆球蛋白肽的模式如图79所示。一组肽对应于13kDA的分子量，另一组对应于17kDa的分子量。
结论
在相当多的种子中检测到了deflamin的存在，包括来自羽扇豆属(白羽扇豆(L.albus)、变色羽扇豆(L.mutabilis)、西班牙羽扇豆(L.hispanicus)、努特卡羽扇豆(L.nootkatensis)、狭叶羽扇豆(L.angustifolius)、黄羽扇豆(L.luteus))的物种，来自其他豆科植物(鹰嘴豆(Cicer arietinum)，大豆(Glycine max)和黑吉豆(Vigna mungo))的物种，以及来自非豆科(东方小麦(Triticum turanicum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、硬粒小麦(T.turgidum var.durum)、卡姆小麦(Triticum turgidum var.turanicum))的种子以及最可能的其他古老小麦物种和品种)。
在几种植物的种子中未检测到deflamin的存在，该植物包括豆科植物(Vignaangularis和Vigna radiata)和非豆科植物(普通小麦(Triticum aestivum)、燕麦(Avenasativa)、小米(Pennisetum glaucum)、藜麦(Chenopodium quinoa)、油葵(Helianthusannus)、杏仁(Prunus dulcis)、荞麦(Fagopyrum tataricum)和奇亚籽(Salviahispanica)。
尽管其他几种豆科植物种子中似乎含有相当多的deflamin生物活性，但是特别涉及与种子中deflamin的存在有关的是羽扇豆属和小麦属。
序列表
SEQ ID NO：1(β-羽扇豆球蛋白3)
N13-羽扁豆球蛋白beta 3
SEQ ID NO：2(β-羽扇豆球蛋白1)
N17-羽扇豆球蛋白beta 1
SEQ ID NO：3(β-羽扇豆球蛋白7)
N21-羽扇豆球蛋白beta 7
SEQ ID NO：4(δ-羽扇豆球蛋白2大链)
N10-羽扁豆球蛋白delta-2大链
SEQ ID NO：6(β-羽扇豆球蛋白6)
N17-羽扇豆球蛋白beta 6
SEQ ID NO：7(β-羽扇豆球蛋白2)
N4-羽扁豆球蛋白beta 2
SEQ ID NO：191(Lunasin序列)
SEQ ID NO：192(B-羽扇豆球蛋白序列)
SEQ ID NO：193(D-羽扇豆球蛋白-2大链)
SEQ ID NO：194(D-羽扇豆球蛋白序列)
SEQ ID NO：195
白羽扇豆δ-羽扁豆球蛋白(登记号Q333K7；黑色、橙色和红色)和两个多肽之间的序列
匹配：甘氨酸最大lunasin(登记号af005030；绿色)和狭叶羽扇豆羽扇豆球蛋白delta-2
大链(登记号p09931；蓝色)
SEQ ID NO：196
峰1：羽扇豆白蛋白beta1，2，3，4，5和7
对白羽扇豆deflamin的峰1组分(参见图44-46)进行质谱分析。通过deflamin的RP-HPLC对白羽扇豆deflamin进分离得到4个峰，每个峰含有通过质谱鉴定的多肽。
颜色代码表示肽的置信度：
·绿色残基对应置信度为95％的肽；
·黄色对应置信度在50％至95％之间的肽；
·红色对应置信度低于50％的肽；
·和灰色对应于未识别的残基。
SEQ ID NO：197
峰2：羽扇豆球蛋白beta1，2和6+羽扇豆球蛋白delta 2(大链)
N3-羽扇豆球蛋白beta 1
N10-羽扇豆球蛋白delta-2大链
N17-羽扇豆球蛋白beta6
对白羽扇豆deflamin的峰2组分(参见图44-46)进行质谱分析。通过deflamin的RP-HPLC对白羽扇豆deflamin进分离得到4个峰，每个峰含有通过质谱鉴定的多肽。
颜色代码表示肽的置信度：
·绿色残基对应置信度为95％的肽；
·黄色对应置信度在50％至95％之间的肽；
·红色对应置信度低于50％的肽；
·和灰色对应于未识别的残基。
SEQ ID NO：198
峰3：羽扁豆球蛋白beta 1+羽扁豆球蛋白delta 2(大链)
N3-羽扁豆球蛋白delta-2大链
N2-羽扁豆球蛋白beta 1
对白羽扇豆deflamin的峰3组分(参见图44-46)进行了质谱分析。通过deflamin的RP-HPLC对白羽扇豆deflamin进分离得到4个峰，每个峰含有通过质谱鉴定的多肽。
颜色代码表示肽的置信度：
·绿色残基对应置信度为95％的肽；
·黄色对应置信度在50％至95％之间的肽；
·红色对应置信度低于50％的肽；
·和灰色对应于未识别的残基。
SEQ ID NO：199
峰4：羽扇豆球蛋白beta1，2，3，6和7
对白羽扇豆deflamin的峰4组分(参见图44-46)进行了质谱分析。通过deflamin的RP-HPLC对白羽扇豆deflamin进分离得到4个峰，每个峰含有通过质谱鉴定的多肽。
颜色代码表示肽的置信度：
·绿色残基对应置信度为95％的肽；
·黄色对应置信度在50％至95％之间的肽；
·红色对应置信度低于50％的肽；
·和灰色对应于未识别的残基。

Claims (17)

1.一种通过疗法用于治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物，其中所述疗法优选为预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
2.根据权利要求1所述的用于治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物，其中所述组合物包含1-100种不同的多肽，每种多肽包含如下序列：
(a)蛋白质的一部分，其可选的为羽扇豆球蛋白蛋白质，其中所述部分的长度为至少5、10、20、30或50个氨基酸，和/或
(b)上述(a)中限定的部分的同系物，其优选与所述部分具有至少70％的同一性，其中所述蛋白质可选的为羽扇豆球蛋白β或羽扇豆球蛋白δ；其中所述羽扇豆球蛋白蛋白可选的为羽扇豆球蛋白β1、β2、β3、β4、β5、β6或β7，或羽扇豆球蛋白δ2蛋白，和
其中所述组合物可选的不包含任何其他多肽。
3.根据权利要求1或2所述的用于治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物，其包含：
(a)至少1至100种长度为10至200个氨基酸的多肽，其中所述多肽可选地是如权利要求2所限定的多肽；和/或
(b)至少1至100个长度为10至200个氨基酸的多肽，其包含通过序列重排而衍生的序列，所述序列可选的为羽扇豆球蛋白序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物，其通过从植物材料中提取或通过重组表达获得。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物：
-其中任意所述的多肽包含植物种子蛋白质的序列或与植物种子蛋白质具有至少70％的同一性，其中所述植物可选的是羽扇豆属、鹰嘴豆属或大豆属(优选白羽扇豆(L.albus)、变色羽扇豆(L.mutabilis)、西班牙羽扇豆(L.hispanicus)、努特卡羽扇豆(L.nootkatensis)、狭叶羽扇豆(L.angustifolius)、黄羽扇豆(L.luteus)、鹰嘴豆或大豆，并且所述蛋白质可选的是一种羽扇豆球蛋白蛋白质；和/或
-其中任何所述多肽包含植物种子蛋白的序列或与植物种子蛋白具有至少70％的同一性，其中所述植物可选的为小麦属或豇豆属(优选东方小麦(Triticum turanicum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、硬粒小麦(T.turgidum var.durum)、卡姆小麦(Triticum turgidumvar.turanicum)、黑吉豆(Vigna mungo))，并且所述蛋白质可选的地是一种羽扇豆球蛋白蛋白质。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗人体或动物体的方法的deflamin多肽组合物，其中所述组合物包含1-100种不同的多肽，每种多肽包含如下序列：
(a)与SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 190中的任一个相同，或是SEQ ID NO 8至SEQ ID NO190中任何长度至少为5、10、20或50个氨基酸的一部分；和/或
(b)如上述(a)中限定的序列的同源物，其优选与(a)具有至少70％的同一性，
其中所述组合物可选的不包含任何其他多肽。
7.一种从合适的种子中提取deflamin的方法，包括：
-至少一步在高温，优选至少80摄氏度或沸腾条件下；和
-至少一步在低pH，优选pH＝4或更低条件下；
-至少一步使提取物与高浓度乙醇接触，优选至少30％、40％、70％或至少90％v/v的乙醇；
其中优选地，所述方法包括：
(a)将完整的种子在水中煮沸，然后在水或缓冲液中提取，并除去脂肪，或
将完整的种子减少到粉状物质，在水或缓冲液中提取，然后去除脂肪和煮沸，或
从粉状物质中除去脂肪，然后在水或缓冲液中提取并煮沸；
(b)将可溶性部分暴露于足够低的pH值(例如pH＝4.0或更低)，以使大部分剩余的蛋白质/多肽沉淀；
(c)将沉淀的级分重新悬浮在30％至50％(v/v)的乙醇中，优选约40％(v/v)乙醇，溶液也可选的还含有0.4M的NaCl，得到含有deflamin的上清液；
并可选地进行以下步骤：
(d)将可溶性部分补足至90％(v/v)的乙醇以沉淀deflamin，并可选的地储存在-5℃至-30℃，优选-20℃；或
通过其他方式如冷冻干燥沉淀deflamin；
(e)重复步骤(c)和(d)从污染物中清除沉淀的deflamin；
(f)将沉淀的deflamin溶解，如在水中溶解，并脱盐。
8.一种可选的根据权利要求7所述的从合适的种子中提取deflamin的方法，所述方法包括：
·从所述种子中提供粉状物质；
·对该粉状物质进行脱脂；
·对来自所述脱脂步骤中的剩余样品煮沸一段时间；
·将所述样品离心一段时间；
·然后，弃去所得的颗粒并进一步处理所得的上清液以沉淀多肽，同时降低其pH值；
·进一步离心以获得更多颗粒；并弃去上清液；和
·进一步用乙醇处理所述另外的颗粒，并离心以获得另外的颗粒，然后将其弃去；剩余的上清液中包含deflamin。
9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括以下步骤：向所述剩余上清液中加入乙醇并储存一段时间以使得deflamin沉淀并进一步离心以获得deflamin颗粒。
10.根据权利要求8或9的方法，还包括：一种或多种其他乙醇沉淀的步骤。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述种子是白羽扇豆种子、鹰嘴豆或大豆，和/或其中所述种子是煮熟的。
12.一种制备deflamin的方法，包括：从编码所述多肽的一种或多种核酸中表达一种或多种deflamin多肽，并纯化所述多肽，其中所述表达优选在细胞中。
13.一种或多种核酸载体，其一起或单独表达用于通过疗法治疗人体或动物体的方法的deflamin组合物，其中所述疗法优选为预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品，其中所述的deflamin组合物可选的地如权利要求1至6中任一项中所限定的。
14.一种产品，其包含多种根据权利要求2至6中任一项所限定的不同多肽，其一起形成用于通过疗法治疗人体或动物体的同时、分别或相继使用的方法中的deflamin组合物，其中所述疗法优选为预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
15.包含多种核酸载体的产品，所述核酸载体一起表达用于通过疗法治疗人体或动物体的同时、分别或相继使用的方法中的deflamin组合物，其中所述疗法优选预防或治疗炎症或癌症，或提供营养保健品。
16.一种组合物，其是：
-权利要求1至6中任一项所限定的deflamin组合物，或通过权利要求7至12中任一项所述的方法获得的deflamin组合物；或者
-包含一种或多种核酸的组合物，所述核酸单独或一起编码所述deflamin组合物；
其中可选的，
-所述核酸是表达载体，其可以表达deflamin组合物，优选病毒载体；和/或
-所述组合物为药物组合物的形式，可选的还包含药学上可接受的载体或稀释剂。
17.一种抗体或其片段，其特异于并能够结合SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 190中的任一个。
CN201780072761.XA 2016-09-30 2017-10-02 治疗性蛋白质 Pending CN110214017A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PT109645 2016-09-30
PT109645A PT109645A (pt) 2016-09-30 2016-09-30 Composição de polipéptidos da deflamina, sua utilização num método de tratamento e sua preparação, vetores de ácido nucleico que a expressam e anticorpo para aqueles polipéptidos
GBGB1616715.7A GB201616715D0 (en) 2016-09-30 2016-09-30 Therapeutic protein
GB1616715.7 2016-09-30
PCT/EP2017/075020 WO2018060528A2 (en) 2016-09-30 2017-10-02 Therapeutic protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110214017A true CN110214017A (zh) 2019-09-06

Family

ID=60582543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780072761.XA Pending CN110214017A (zh) 2016-09-30 2017-10-02 治疗性蛋白质

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200113969A1 (zh)
EP (1) EP3518957B1 (zh)
JP (1) JP2020503060A (zh)
KR (1) KR20190061015A (zh)
CN (1) CN110214017A (zh)
AU (1) AU2017334047A1 (zh)
BR (1) BR112019006174A2 (zh)
CA (1) CA3037800A1 (zh)
CL (1) CL2019000846A1 (zh)
CO (1) CO2019003865A2 (zh)
IL (1) IL265708A (zh)
MX (1) MX2019003751A (zh)
WO (1) WO2018060528A2 (zh)
ZA (1) ZA201902689B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112753943A (zh) * 2021-01-27 2021-05-07 上海理工大学 一种具有炎症性肠病调节功能的能量棒及其制作方法
CN112772843A (zh) * 2021-01-27 2021-05-11 上海理工大学 一种适用于ibd炎症性肠病患者食用的代餐粉及其制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7304053B2 (ja) * 2019-02-15 2023-07-06 国立大学法人金沢大学 肝臓がん発症リスクの判定方法、及び肝臓がん発症リスクの判定キット
CN114106083A (zh) * 2021-12-09 2022-03-01 南开大学 一种小米蛋白和小米蛋白水解物的制备方法及小米蛋白水解物的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006003110A1 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Process for the purification of protein fractions from lupin seeds, active on lipid metabolism
WO2009144278A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor USES OF CONGLUTIN-γ
EP2333086A1 (en) * 2005-07-21 2011-06-15 Instituto Superior de Agronomia Use of a lupinus protein
WO2012049215A1 (en) * 2010-10-12 2012-04-19 Consumo Em Verde - Biotecnologia Das Plantas, S.A. Antimicrobial protein
US8557963B2 (en) * 2007-06-01 2013-10-15 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Process of aqueous protein extraction from Brassicaceae oilseeds

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006003110A1 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Process for the purification of protein fractions from lupin seeds, active on lipid metabolism
EP2333086A1 (en) * 2005-07-21 2011-06-15 Instituto Superior de Agronomia Use of a lupinus protein
US8557963B2 (en) * 2007-06-01 2013-10-15 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Process of aqueous protein extraction from Brassicaceae oilseeds
WO2009144278A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor USES OF CONGLUTIN-γ
WO2012049215A1 (en) * 2010-10-12 2012-04-19 Consumo Em Verde - Biotecnologia Das Plantas, S.A. Antimicrobial protein

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DORIS MARIA GRUBER / VIENNA: "Vaginal and cervical irritations New ways to bridge watchful waiting periods", 《ANTALYA》 *
GLENN G. LILLEY等: "Amino acid sequence of conglutin δ, a sulfur-rich seed protein of Lupinus angustifolius L Sequence homology with the C-III α-amylase inhibitor from wheat", 《FEBS LETTERS》 *
J. KING等: "Functional Properties of Lupin Protein Isolates (Lupinus albus cv Multolupa)", 《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112753943A (zh) * 2021-01-27 2021-05-07 上海理工大学 一种具有炎症性肠病调节功能的能量棒及其制作方法
CN112772843A (zh) * 2021-01-27 2021-05-11 上海理工大学 一种适用于ibd炎症性肠病患者食用的代餐粉及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3518957A2 (en) 2019-08-07
BR112019006174A2 (pt) 2019-06-18
MX2019003751A (es) 2019-12-16
WO2018060528A2 (en) 2018-04-05
WO2018060528A3 (en) 2018-07-05
CO2019003865A2 (es) 2019-04-30
JP2020503060A (ja) 2020-01-30
CL2019000846A1 (es) 2019-11-15
EP3518957B1 (en) 2024-05-15
IL265708A (en) 2019-05-30
KR20190061015A (ko) 2019-06-04
CA3037800A1 (en) 2018-04-05
AU2017334047A1 (en) 2019-05-16
ZA201902689B (en) 2019-11-27
US20200113969A1 (en) 2020-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Orona-Tamayo et al. Bioactive peptides from selected latin american food crops–A nutraceutical and molecular approach
Jakubczyk et al. Current trends of bioactive peptides—New sources and therapeutic effect
Khong et al. Improved collagen extraction from jellyfish (Acromitus hardenbergi) with increased physical-induced solubilization processes
Yan et al. Isolation, identification and synthesis of four novel antioxidant peptides from rice residue protein hydrolyzed by multiple proteases
Sharma et al. Food-derived anticancer peptides: a review
CN110214017A (zh) 治疗性蛋白质
Jo et al. Marine bioactive peptides: Types, structures, and physiological functions
Clemente et al. Bowman-Birk inhibitors from legumes as colorectal chemopreventive agents
Majid et al. Millet derived bioactive peptides: A review on their functional properties and health benefits
Gianfranceschi et al. Biochemical requirements of bioactive peptides for nutraceutical efficacy
Gitlin-Domagalska et al. Bowman-Birk inhibitors: Insights into family of multifunctional proteins and peptides with potential therapeutical applications
Lee et al. Antioxidant and anticancer effects of functional peptides from ovotransferrin hydrolysates
S Liberio et al. Anticancer peptides and proteins: a panoramic view
Zheng et al. ACE-inhibitory and antioxidant peptides from coconut cake albumin hydrolysates: purification, identification and synthesis
do Nascimento et al. Identification of bioactive peptides released from in vitro gastrointestinal digestion of yam proteins (Dioscorea cayennensis)
Landi et al. Quinoa as source of type 1 ribosome inactivating proteins: A novel knowledge for a revision of its consumption
Gu et al. Identification and characterization of two novel α-glucosidase inhibitory peptides from almond (Armeniaca sibirica) oil manufacture residue
de Matos et al. Production of black cricket protein hydrolysates with α-amylase, α-glucosidase and angiotensin I-converting enzyme inhibitory activities using a mixture of proteases
Samtiya et al. Production, purification, and potential health applications of edible seeds’ bioactive peptides: A concise review
Sharma et al. Plant derived antimicrobial peptides: Mechanism of target, isolation techniques, sources and pharmaceutical applications
Majumder et al. AkP from mushroom Termitomyces clypeatus is a proteoglycan specific protease with apoptotic effect on HepG2
Ye et al. Antitumor and HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activities of a hemagglutinin and a protease inhibitor from mini-black soybean
Usman et al. Comparative evaluation of pseudocereal peptides: A review of their nutritional contribution
Hou et al. A review of bioactive peptides: Chemical modification, structural characterization and therapeutic applications
Karami et al. Health promoting and functional activities of peptides from Vigna bean and Common bean hydrolysates: process to increase activities and challenges

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination