PT103322A

PT103322A - Proteína extraída de plantas do género lupinus, sequência nucleotídica que a codifica e sua utilização no combate a fungos patogénicos por aplicação directa, na forma recombinante ou por expressão em plantas transgénicas

Info

Publication number: PT103322A
Application number: PT10332205A
Authority: PT
Inventors: Virgilio Borges Loureiro; Ricardo Manuel De Seixas Boavida Ferreira; Sara Alexandra Valadas Da Silva Monteiro; Artur Ricardo Nascimento Teixeira
Original assignee: Inst Superior Agronomia; Virgilio Borges Loureiro; Ricardo Manuel De Seixas Boavida Ferreira; Sara Alexandra Valadas Da Silva Monteiro; Artur Ricardo Nascimento Teixeira
Priority date: 2005-07-21
Filing date: 2005-07-21
Publication date: 2007-01-31
Also published as: ZA200800581B

Abstract

A INVENÇÃO DIZ RESPEITO À OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA A PARTIR DE SEMENTES, DE COTILÉDONES OU DE PLÂNTULAS DO GÉNERO LUPINUS, BEM COMO AO MODO DE A PRODUZIR DE FORMA RECOMBINANTE E DE A EXPRESSAR EM PLANTAS TRANSGÉNICAS. DEVIDO ÀS CARACTERÍSTICAS EXCEPCIONAIS EXIBIDAS POR ESTA PROTEÍNA NO QUE SE REFERE A: (L) ACTIVÍDADE ANTI-FÚNGICA POTENTE, QUE LHE CONFERE POTENCIALIDADES DE FUNGICIDA, (2) EXTREMA RESISTÊNCIA À DESNATURAÇÃO, QUE LHE POSSIBILITA A SUA UTILIZAÇÃO EM CONDIÇÕES DE CAMPO E (3) GRANDE SUSCEPTIBILIDADE À PROTEÓLISE, QUE A TORNA INÓCUA EM TERMOS DE TOXICIDADE PARA O AMBIENTE, E PARA O HOMEM EM PARTICULAR, É REIVINDICADA A SUA UTILIZAÇÃO, OU DE QUALQUER FORMA MODIFICADA DELA RESULTANTE QUE MANTENHA AS MESMAS PROPRIEDADES BIOLÓGICAS, COMO FUNGICIDA, COMO INSECTICIDA, COMO FERTILIZANTE FOLIAR OU NA PREPARAÇÃO DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS. A PRESENTE INVENÇÃO INSERE-SE NO CAMPO DA BIOLOGIA, PERTENCENDO A SUA APLICAÇÃO PRÁTICA COMO FUNGICIDA, INSECTICIDA OU FERTILIZANTE FOLIAR AOS DOMÍNIOS TÉCNICOS DAS CIÊNCIAS AGRÁRIAS E DA AGRICULTURA.

Description

DESCRIÇÃO "PROTEÍNA EXTRAÍDA DE PLANTAS DO GÉNERO LUPINUS, SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA QUE A CODIFICA E SUA UTILIZAÇÃO NO COMBATE A FUNGOS PATOGÉNICOS POR APLICAÇÃO DIRECTA, NA FORMA RECOMBINANTE OU POR EXPRESSÃO EM PLANTAS TRANSGÉNICAS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção insere-se no campo da Biologia, pertencendo a sua aplicação prática como fungicida, insecticida ou fertilizante foliar aos domínios técnicos das Ciências Agrárias e da Agricultura.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma proteína com propriedades anti-fúngicas, extraída de sementes, de cotilédones ou de plântulas do género Lupinus, e à sua utilização no controlo de agentes patogénicos que atacam as plantas. Esta proteína pode ser aplicada directamente sobre as plantas, ou as plantas podem ser geneticamente modificadas para expressarem a proteína de Lupinus nos seus tecidos. A presente invenção também descreve a sequência de nucleótidos do DNA correspondente ao fragmento do gene que 1 codifica a proteína de Lupinus, bem como a sua sequência de resíduos de aminoácidos, microrganismos transformados com o fragmento do gene que codifica a proteína de Lupinus e métodos para a sua aplicação como fungicida, insecticida ou fertilizante foliar. É também objecto da presente invenção a proteína caracterizada por apresentar a sequência de resíduos de aminoácidos referida anteriormente, em que um ou mais resíduos de aminoácidos estão ausentes, foram substituídos ou adicionados, ou caracterizada por ter sofrido uma modificação química, como por exemplo glicosilação, e apresentar uma actividade fungicida. 0 controlo dos agentes patogénicos constitui um problema sério nas culturas agronomicamente importantes a nível mundial. Os fungos patogénicos são particularmente importantes no que refere ao armazenamento das colheitas. Presentemente, o controlo sobre o crescimento dos fungos é geralmente conseguido por aplicação generalizada de fungicidas químicos. No entanto, os produtos fito-farmacêuticos que se encontram hoje no mercado, apresentam alguns inconvenientes que podem ser considerados graves. Se, por um lado, apresentam custos económicos e ambientais elevados, por outro, alguns fungos têm vindo a adquirir resistências relativamente a alguns deles.

As plantas, embora não possuindo sistema imunológico, têm desenvolvido um certo grau de resistência intrínseca ao ataque dos fungos patogénicos. No entanto, as modernas tecnologias de crescimento das plantas e os processos de colheita e armazenamento, providenciam frequentemente um 2 ambiente favorável para o desenvolvimento dos agentes patogénicos.

Além destes aspectos, o número de fungos diferentes que podem causar problemas é bastante elevado. Como exemplo podem-se citar os seguintes géneros: Alternaria, Ascochyta, Botrytis, Cercospora, Colletotrichum, Diplodia, Erysiphe, Fusarium, Gaeumanomyces, Macrophomina, Nectria, Phoma, Phomopsis, Phymatotrichum, Phytophthora, Plasmopara, Puccinia, Pythium, Rhizoctonia, Uncínula, Verticillium. Como tal, os fungicidas existentes no mercado podem estar limitados apenas a alguns destes géneros, não constituindo uma solução efectiva no controlo das infecções das plantas.

Uma estratégia alternativa para combater os fungos patogénicos das plantas é a identificação e a purificação de compostos de origem biológica com reconhecida actividade anti-fúngica. A identificação destes compostos envolve a pesquisa em vários organismos, tais como, plantas e microrganismos, de substâncias que posteriormente são testadas em ensaios anti-fúngicos e finalmente isoladas e caracterizadas.

Desta forma, muitas classes de proteínas com actividade anti-fúngica foram já isoladas, incluindo-se quitinases, proteínas ricas em resíduos de cisteína que se ligam fortemente à quitina, β-l,3-glucanases, permeatinas, tioninas e proteínas de transferência de lípidos. Estas proteínas são consideradas como desempenhando um papel fundamental nas defesas naturais das plantas contra o ataque de agentes patogénicos. 3

Na bibliografia encontram-se descritas diversas metodologias para a utilização de proteínas anti-fúngicas, extraídas de microrganismos ou de plantas, quer em aplicação directa sobre os agentes patogénicos, quer em plantas transgénicas que expressam essas proteínas. As proteínas anti-fúngicas mais utilizadas nestas metodologias incluem quitinases, glucanases, proteínas do tipo osmotina e lisozimas. Vários estudos demonstraram que plantas transgénicas a sobre-expressar estas proteínas apresentavam uma resistência acrescida a vários microrganismos (Patente Europeia n° 0392 225).

As técnicas modernas de biologia molecular permitiram o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante e, consequentemente, a transformação de plantas com genes de proteínas anti-fúngicas. Este processo envolve geralmente a inserção num tecido da planta do gene que codifica a proteína de interesse e a subsequente regeneração da planta a partir do tecido modificado.

No entanto, a actividade de algumas destas proteínas é reduzida pela presença de alguns iões, nomeadamente de potássio, sódio e cálcio. Por este motivo, embora aquelas proteínas apresentem marcada actividade anti-fúngica em ensaios realizados in vitro, revelam-se muitas vezes ineficazes in vivo, em virtude de aqueles catiões existirem em grande quantidade nas plantas para o seu normal desenvolvimento fisiológico.

Do exposto, conclui-se que a identificação e a purificação de compostos de origem biológica para utilização no combate aos agentes patogénicos que atacam as plantas é essencial, sendo particularmente importante a pesquisa de compostos 4 que sejam eficazes sobre uma larga gama de agentes e que mantenham a sua actividade biológica em condições in vivo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 problema técnico que a presente invenção pretende solucionar corresponde à identificação e purificação de compostos de origem biológica que sejam eficazes sobre uma larga gama de agentes patogénicos que atacam as plantas e que mantenham a sua actividade biológica em condições in vivo. A solução baseia-se no facto de os presentes inventores terem identificado uma proteína em plantas do género Lupinus que, surpreendentemente, apresenta (i) uma actividade anti-fúngica potente, que lhe confere potencialidades de fungicida, (ii) uma extrema resistência à desnaturação, que lhe possibilita a sua utilização em condições de campo, e (iii) uma grande susceptibilidade à proteólise, que a torna inócua em termos de toxicidade para o ambiente e para o homem em particular.

Assim, um primeiro aspecto da presente invenção refere-se à proteína definida na reivindicação 1. Um segundo aspecto da presente invenção diz respeito a um fragmento de DNA que codifica essa proteína (reivindicação 3). A invenção refere-se igualmente à utilização da proteína como fungicida, insecticida ou fertilizante foliar, quer por aplicação directa, quer na forma recombinante ou por expressão em organismos transgénicos. 5

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig.l - Folhas de videira gravemente infectas com oídio foram pulverizadas com água (folha da direita) ou com a proteína extraída de Lupinus (folha da esquerda). (A) 24 horas após a pulverização; (B) 2 meses após a pulverização.

Fig. 2 - Observações ao microscópio óptico da germinação dos esporos do fungo responsável pelo oídio da videira. Os esporos do fungo foram cuidadosamente removidos da superfície de folhas jovens infectadas com o fungo e inoculados em agar de água 0,6% (m/v) . (A), (B) e (C) controlos; (D) e (E) adição de 200 pg da fracção proteica total de uvas contendo as proteínas PR (do inglês Pathogenesis-Related); (F) e (G) adição de 200 pg da proteína extraída de Lupinus. Cada ensaio foi observado ao fim de 24 e 48 horas. O sistema de lentes utilizado foi o de contraste de fase e a ampliação foi a mesma em todos os casos (125χ).

Fig. 3 - Observações ao microscópio metalúrgico de folhas de videira; (A) folhas sãs, (B) folhas atacadas com oídio, (C) folhas atacadas com oídio, 12 horas após a pulverização com a proteína extraída de Lupinus. Em cada fotografia está indicada a ampliação utilizada.

Fig. 4 - Efeito da proteína de Lupinus, produzida em Escherichia coli de forma recombinante, sobre a germinação e o desenvolvimento de esporos do fungo Uncinula necator, responsável pelo oídio da videira. 6

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma nova proteína com propriedades anti-fúngicas, que exibe actividade efectiva sobre a germinação e o desenvolvimento dos esporos dos fungos que infectam as plantas. A sequência de nucleótidos do DNA do fragmento do gene que codifica a proteína de Lupinus não apresenta homologia significativa com nenhuma outra proteína anti-fúngica descrita em plantas. A proteína de Lupinus representa um novo elemento no grupo das proteínas anti-fúngicas isoladas das plantas. A proteína a que se refere esta invenção é purificada a partir de cotilédones de sementes germinadas do género Lupinus. Na presente invenção encontra-se descrita a metodologia para isolar a proteína dos tecidos da planta, a sequência de nucleótidos do DNA do fragmento do gene (A) que a codifica e a correspondente sequência de resíduos de aminoácidos (B). (A) 5'CGTAGACAAAGGAACCCTTATCACTTCAGCTCTCAAAGATTCCAAACTCTTTACAAA AATAGGAATGGCAAAATCCGTGTGCTCGAGAGGTTTGACCAAAGAACCAATAGACTTGA GAATCTCCAAAACTACCGCATTGTTGAGTTCCAATCAAAACCTAACACTCTCATTCTCC CTAAACACTCTGATGCTGACTACGTCCTCGTTGTACTCAATGGTAGAGCCACAATCACG ATAGTAAACCCTGATAGAAGACAAGCATATAACCTTGAGTATGGCGATGCTCTCAGAAT CCCAGCTGGCTCAACTTCATATATCCTTAACCCGGATGACAACCAGAAGCTTAGAGTAG TCAAGCTCGCAATACCCATCAACAATCCTGGCTACTTTTATGATTTCTATCCATCGAGT AC TAAAGAC CAACAAT CCTACTTCAGTGGCTT CAG CAGGAACAC T T TAGAGGC CAC C T T CAATACT CGT TAT GAAGAGATACAAAGGAT TAT T T TAGGGAATGAGGAT3' 7 (B) 5'RRQRNPYHFS SQRFQTLYKN RNGKIRVLER FDQRTNRLEN LQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLVV LNGRATITIV NPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRVVKL AIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILG NE Da-

Esta proteína ocorre naturalmente apenas durante um curto período de tempo nas plântulas do género Lupinus. Foi demonstrado, pelos presentes inventores, que a conglutina β, a principal proteína de reserva das sementes do género Lupinus, é o precursor biossintético da proteína de Lupinus. Com efeito, trata-se de uma proteína com vários níveis de processamento, o que dificultou tremendamente o seu estudo, a determinação da sua sequência de resíduos de aminoácidos e a sequência de nucleótidos que lhe corresponde. Durante a fase de formação da semente, o gene que codifica a conglutina β é transcrito no mRNA correspondente, de cuja tradução resulta o precursor biossintético da conglutina β. Este precursor sofre depois vários tipos de processamento, incluindo glicosilação, de que resultam as várias dezenas de tipos de subunidades de que se compõe a conglutina β. No ciclo vegetativo seguinte, alguns dias após o início da germinação, a fase inicial de degradação da conglutina β envolve a cisão proteolítica de todas ou de muitas das suas subunidades constituintes, de que resulta a acumulação da proteína descrita nesta invenção. Dadas as suas propriedades anti-fúngicas, e que são naturalmente exploradas pela própria planta, esta proteína mantém-se presente em concentração elevada nos cotilédones das plântulas em desenvolvimento, precisamente 8 numa fase da vida da planta em que ela se mostra mais susceptível ao ataque de fungos e insectos, antes de ser degradada ao cabo de alguns dias e os seus aminoácidos utilizados no crescimento da jovem planta. A proteína de Lupinus descrita na presente invenção, apresenta propriedades que a distinguem fundamentalmente das outras proteínas anti-fúngicas descritas na bibliografia e que a tornam num alvo promissor e de utilização potencial, no desenvolvimento de um meio eficaz de combater os fungos que atacam as plantas e/ou os animais: (1) Actividade anti-fúngica potente, que lhe confere potencialidades de fungicida, (2) Extrema resistência à desnaturação, que possibilita a sua utilização em condições de campo e (3) Grande susceptibilidade à proteólise, que a torna inócua em termos de toxicidade para o ambiente, e para o homem em particular. A proteína pode também ser utilizada como insecticida ou como fertilizante foliar de plantas.

Outro aspecto da invenção diz respeito à metodologia utilizada para a produção recombinante da proteína de Lupinus em bactérias, com vista à modificação genética de plantas para a sua expressão constitutiva. Desta forma, estas plantas apresentarão um grau elevado de resistência aos fungos, nomeadamente aos fungos de difícil acesso (como é o caso dos fungos do lenho), relativamente aos quais os fungicidas de aplicação exógena são ineficazes. A proteína foi extraída de plântulas de Lupinus albus cv. LeBlanc com oito dias de germinação. As sementes foram 9 colocadas numa estufa com temperatura 25°C dia e 20°C noite e fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de escuro.

Após a colheita dos cotilédones, procedeu-se ao seu congelamento em N2 liquido. A extracção da proteína foi efectuada em tampão Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, com 10% (m/v) de NaCl, contendo 10 mM de EDTA (ácido etildiamina tetra-acético) e 10 mM de EGTA (ácido etilguanil tetra-acético). Após um período de incubação de 30 minutos a 4 °C, o extracto foi centrifugado a 30.000 g durante 1 hora a 4 °C. 0 sobrenadante foi dessalinizado e posteriormente efectou-se a purificação da proteína extraída de Lupinus por cromatografia de troca aniónica no sistema FPLC (do inglês - Fast Protein and Peptide Liquid Chromatography). A determinação da sequência N-terminal da proteína extraída de Lupinus foi efectuada recorrendo à técnica que se baseia na degradação de Edman. Com base na sequência de resíduos de aminoácidos obtida desenharam-se iniciadores degenerados. O mRNA foi extraído de sementes de Lupinus albus onde a produção do precursor da proteína em estudo é máxima. A extracção do mRNA foi efectuada utilizando protocolos de purificação de mRNA em material vegetal. O cDNA correspondente ao fragmento do gene que codifica a proteína extraída de Lupinus foi amplificado recorrendo aos iniciadores degenerados mencionados e através da técnica de PCR (do inglês - Polymerase Chain Reaction). Com base na sequência obtida, desenharam-se novos iniciadores e recorrendo à técnica 3'e 5' RACE (do inglês - Rapid Amplification of cDNA Ends) obteve-se a sequência completa do fragmento do gene que codifica a proteína extraída de Lupinus. 10 A produção da proteína de Lupinus em forma recombinante foi efectuada na bactéria Escherichia coli. 0 fragmento do gene que codifica a proteína de Lupinus foi clonado num vector apropriado, sendo este vector desenhado para que o gene de interesse fique associado ao promotor T7lac. Este promotor é indutivo; como tal, ocorre apenas expressão dos genes que lhe estão associados na presença do açúcar isopropiltio-β-galactósido. Finalmente, procedeu-se à transformação de células competentes de Escherichia coli.

Com o procedimento descrito no ponto anterior obteve-se a proteína de Lupinus de forma recombinante produzida pelas bactérias; no entanto, para ser testada como fungicida, a proteína de Lupinus recombinante teve que ser isolada de todas as outras proteínas produzidas pelas bactérias. Uma vez que a proteína de Lupinus recombinante foi produzida com uma cauda de histidinas (denominada de His-Tag), a metodologia de purificação baseou-se na afinidade que os iões níquel têm para a cauda de histidinas. Desta forma, tendo os iões níquel ligados a uma matriz de agarose, a purificação da proteína recombinante efectua-se sabendo que do extracto proteico total das bactérias, apenas a proteína de Lupinus ficou ligada na matriz. Posteriormente, através de um conjunto apropriado de lavagens e eluições, a proteína de Lupinus foi recuperada.

Para a modificação genética das plantas é necessário proceder à escolha de um promotor apropriado. Na bibliografia encontram-se descritos vários tipos de promotores que permitem a expressão dos genes que lhe estão associados. Para a expressão do fragmento do gene que codifica a proteína descrita nesta invenção, o promotor escolhido pode ser de natureza indutiva ou constitutiva, 11 consoante o tipo de expressão que se pretende. A escolha do promotor também é importante para direccionar a proteína sintetizada para o tecido ou o compartimento celular de interesse (modificações pós-transcricionais). A transformação das plantas pode ser efectuada seguindo diferentes metodologias, tais como, por exemplo, a transformação das plantas mediada pelo Agrobacterium, a transformação de protoplastos, a transferência de genes para o grão de polén, a injecção directa nos órgãos reprodutivos ou em embriões imaturos e o bombardeamento de partículas. Todos estes métodos têm vantagens e desvantagens, embora todos tenham já sido utilizados em diferentes tipos de plantas.

Para a transformação das plantas com o fragmento do gene que codifica a proteína de Lupinus, o método escolhido foi a transformação mediada pelo Agrobacterium (Fraley, 1983), utilizando um vector apropriado de expressão, contendo uma região codificante para o gene de interesse associado a um gene marcador apropriado. A regeneração, desenvolvimento e transferência para o meio de cultura a partir de um único protoplasto pode ser efectuada seguindo diferentes metodologias disponíveis na bibliografia. Este processo inclui etapas de selecção das células transformadas e a cultura destas células pelos processos usuais do desenvolvimento de culturas embriogénicas. As "plantinhas" regeneradas são finalmente cultivadas em meio de cultura apropriado, geralmente terra. É ainda objecto da presente invenção uma composição agrícola que inclua como substância activa a proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, ou a sua forma 12 recombinante obtida de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser utilizada na prevenção, controlo e combate a fungos patogénicos ou pragas provocadas por insectos ou como fertilizante foliar.

Para melhor se perceberem as potencialidades da presente invenção, seguem-se vários exemplos da sua aplicação. No entanto, estes exemplos não são limitantes, podendo ser empregues metodologias alternativas para a utilização da proteína de Lupinus como agente de controlo anti-fúngico, como agente insecticida ou como fertilizante foliar.

Exemplos de aplicação

Exemplos 1 e 2: Efeito da pulverização com a proteína de Lupinus na superfície de folhas de videira infectadas com o fungo Uncinula necator (responsável pelo oídio da videira). A actividade anti-fúngica da proteína de Lupinus foi avaliada pulverizando a superfície de uma folha de videira com uma solução contendo 200 yg/mL de proteína. Como controlo utilizou-se a pulverização de uma folha em iguais condições com água. O resultado obtido pode ser visualizado na fig. 1. Como se observa, ao final de dois meses de aplicação da proteína, a folha permanece sã, sem indícios da presença do fungo, embora tenha sido mantida em permanente contacto com folhas infectadas.

Outro ensaio foi realizado seguindo o mesmo protocolo, mas as observações das superfícies das folhas foram feitas utilizando o microscópio metalúrgico (Fig. 3). 13

Exemplo 3 : Efeito da proteína de Lupinus sobre a germinação e desenvolvimento de esporos do fungo Uncinula necator.

Esporos do fungo Uncinula necator foram removidos da superfície de folhas infectadas e inoculados em meio de agar/água 0,6% (m/v) contendo 200 pg da proteína de Lupinus por mL, ou 200 pg da fracção proteica total de uvas (contendo proteínas PR) por mL. A germinação e o desenvolvimento do tubo germinal dos esporos foi seguida por microscopia óptica, utilizando o sistema de lentes de contraste de fase, durante 24 e 48 horas. Como se pode observar na fig. 2, apresentada em anexo, houve uma marcada inibição, quer no número de esporos germinados, quer no comprimento do tubo germinal na presença no meio que continha a proteína de Lupinus. Este efeito é notório quando comparado com o observado na presença das proteínas PR.

Exemplo 4 : Efeito da proteína de Lupinus sobre a germinação e desenvolvimento dos esporos do fungo Phomopsis viticola (responsável pela escoriose da videira).

Esporos do fungo Phomopsis viticola foram inoculados em meio PDA ( do inglês - Potato Dextrose Agar) . Ao fim de 15 dias, removeram-se os esporos e misturaram-se com uma solução de proteína de Lupinus num volume final de 25 pL. Estas gotas foram colocadas em placas de petri e por cima colocaram-se lâminas que posteriormente foram seladas. O desenvolvimento dos esporos foi seguido por observações ao microscópio óptico. Observou-se uma inibição da germinação 14 dos esporos. Ao final de 24 horas as hifas em formação sofreram uma lise da parede celular.

Exemplo 5 : Efeito da proteína de Lupinus recombinante sobre a germinação dos esporos do fungo Uncinula necator. A proteína de Lupinus recombinante, expressa em bactérias, foi purificada e a sua actividade anti-fúngica testada. Os ensaios foram realizados da mesma forma que os descritos nos exemplos 2 e 3. Como se pode observar na fig. 4, a proteína recombinante apresenta as mesmas propriedades anti-fúngicas das observadas com a proteína extraída da planta. Na presença da proteína de Lupinus recombinante, 48 horas após a incubação, há uma destruição da parede celular dos esporos.

Exemplo 6: Efeito da proteína de Lupinus recombinante sobre a germinação dos esporos do fungo Plasmopara vitícola (responsável pelo míldio da videira).

Esporos do fungo Plasmopara vitícola foram removidos da superfície de folhas infectadas e colocados em meio de agar 0,6% (m/v) contendo 200 pg da proteína de Lupinus recombinante por mL. A germinação dos esporos foi seguida por observações realizadas ao microscópio óptico, durante 48 horas. Como controlo, utilizou-se apenas a germinação dos esporos em meio de agar. Observou-se que, ao final de 24 horas, a parede celular dos esporos foi destruída, ocorrendo a libertação do conteúdo celular.

Lisboa, 20 de Julho de 2005 15

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína extraída de plantas do género Lupinus, caracterizada por: (a) compreender uma sequência de resíduos de aminoácidos representada por (B) (B) 5'RRQRNPYHFS sqrfqtlykn RNGKIRVLER FDQRTNRLEN LQNYRIVEFQ SKPNTLILPK HSDADYVLW LNGRATITIV NPDRRQAYNL EYGDALRIPA GSTSYILNPD DNQKLRWKL AIPINNPGYF YDFYPSSTKD QQSYFSGFSR NTLEATFNTR YEEIQRIILG NEDs- (b) compreender a sequência de resíduos de aminoácidos (B) , em que um ou mais resíduos de aminoácidos estão ausentes, foram substituídos, adicionados ou modificados e apresentar uma actividade fungicida.
2. A proteína extraída de plantas do género Lupinus de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser glicosilada, fosforilada, alquilada e/ou prenilada.
3. Um fragmento de DNA que codifica a proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: (a) compreender uma sequência de nucleótidos representada por (A) 1 (A) 5 ’ CGTAGACAAAGGAACCCTTATCACTTCAGCTCTCAAAGATTCCAAACTCTTTACAAA AATAGGAATGGCAAAATCCGTGTGCTCGAGAGGTTTGACCAAAGAACCAATAGACTTGA GAATCTCCAAAACTACCGCATTGTTGAGTTCCAATCAAAACCTAACACTCTCATTCTCC CTAAACACTCTGATGCTGACTACGTCCTCGTTGTACTCAATGGTAGAGCCACAATCACG ATAGTAAACCCTGATAGAAGACAAGCATATAACCTTGAGTATGGCGATGCTCTCAGAAT CCCAGCTGGCTCAACTTCATATATCCTTAACCCGGATGACAACCAGAAGCTTAGAGTAG TCAAGCTCGCAATACCCATCAACAATCCTGGCTACTTTTATGATTTCTATCCATCGAGT ACTAAAGACCAACAATCCTACTTCAGTGGCTTCAGCAGGAACACTTTAGAGGCCACCTT CAATACTCGTTATGAAGAGATACAAAGGATTATTTTAGGGAATGAGGATs' b) compreender a sequência de nucleótidos (A) , em que um ou mais nucleótidos estão ausentes, foram substituídos, adicionados ou modificados e codificar uma proteína com actividade fungicida.
4. Um vector recombinante caracterizado por compreender o fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 3.
5. Uma célula transformada caracterizada por ser transformada com o vector recombinante de acordo com a reivindicação 4.
6. A célula transformada de acordo com a revindicação 5, caracterizada por derivar de Escherichia coli.
7. A célula transformada de acordo com a revindicação 5, caracterizada por derivar de uma planta, animal ou microrganismo.
8. Uma planta transgénica caracterizada por compreender uma célula transformada de acordo com a reivindicação 5 e 2 apresentar resistência a fungos patogénicos ou pragas provocadas por insectos, sendo obtenível por regeneração da referida célula transformada.
9. Um método para a produção da proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a cultura das células transformadas de acordo com as reivindicações 5 a 7 e a recuperação da proteína com actividade fungicida a partir da cultura ou do extracto celular.
10. Uma composição, agrícola ou não, caracterizada por compreender como substância activa a proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, ou a sua forma recombinante obtida de acordo com a reivindicação 9.
11. A composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por ser utilizada na prevenção, controlo e combate de fungos, patogénicos ou não, ou de pragas provocadas por insectos ou como fertilizante foliar.
12. Utilização da proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, ou sua forma recombinante obtida de acordo com a reivindicação 9, na preparação de uma composição, caracterizada por se destinar à prevenção, controlo e combate de fungos, patogénicos ou não, ou de pragas provocadas por insectos ou à aplicação como fertilizante foliar.
13. Utilização da proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, ou sua forma recombinante obtida de acordo com a reivindicação 9, na prevenção, controlo e combate a fungos, patogénicos ou não, ou a pragas provocadas por insectos, caracterizada por se aplicar à planta um extracto de 3 Lupinus, parcial ou total, compreendendo a proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, ou a sua forma recombinante obtida de acordo com a reivindicação 9. Lisboa, 19 de Setembro de 2005 4