BR112019015074A2 - Composições e métodos para proteção de hospedeiros contra infecções por patógenos - Google Patents
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Abstract
uma proteína quimérica e um método de criação de uma planta e partes geneticamente alteradas da mesma com uma proteína quimérica em que a proteína quimérica inclui um elemento reconhecimento e um elemento lise ligados por um ligante, em que o elemento de reconhecimento liga-se a um agente patogênico e o elemento lise lisa o patógeno e em que o elemento de reconhecimento é derivado a partir de uma primeira proteína e o elemento de lise é derivado de uma segunda proteína, em que a primeira proteína e a segunda proteína são endógenas para o hospedeiro a ser tratado com a proteína quimérica.
Description
COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA PROTEÇÃO DE HOSPEDEIROS CONTRA INFECÇÕES POR PATÓGENOS
DECLARAÇÃO RELATIVA À PESQUISA OU AO DESENVOLVIMENTO PATROCINADA(O) FEDERALMENTE [001] Não aplicável.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA VIA EFS-WEB [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporado por referência na sua totalidade. O conteúdo do arquivo de texto ASCII da listagem de sequência, criado em 16 de janeiro de 2017, é nomeado Anti_ Xf_Chimera_011618_ST25.txt e tem 53 Kbytes de tamanho e foi enviado eletronicamente via EFS-Web.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL APRESENTADO EM UM CD [003] Não aplicável.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [004] Os antibióticos são comumente usados para direcionar genes específicos de bactérias gram-positivas e gram-negativas e eliminá-los antes que possam causar danos fisiológicos a um hospedeiro infectado. No entanto, nas últimas duas décadas, o uso generalizado do rápido surgimento de resistência a antibióticos envolvendo mutações nos genes alvo, efluxo eficiente de antibióticos, transferência horizontal de genes de resistência etc., limitou severamente seu uso clinico (Peschel, 2002, Trends Microbiol. 10: 17 9) . O mundo clinico testemunhou uma tendência alarmante na qual várias gram-positivos e gramnegativos se tornaram cada vez mais resistentes a antibióticos comumente usados, tais como penicilina e
Petição 870190094531, de 20/09/2019, pág. 8/70
2/58 vancomicina.
[005] A descoberta de proteínas antimicrobianas lineares, tais como as cecropinas de insetos e proteínas antimicrobianas ligadas em ponte com dissulfeto, tais como as defensinas, inicialmente levantou esperanças de que as proteínas antimicrobianas (AMPs) possam se tornar uma alternativa viável a antibióticos. As cecropinas e as defensinas foram evolutivamente conservadas em invertebrados e vertebrados e constituem a primeira linhagem de defesa imunológica inata do hospedeiro (Boman, 2003, J. Int. Med. 254: 197-215; Raj & Dentino, FEMS Microbiol. Lett., 202, 9, 2002; Hancock The LANCET 1, 156, 201) . Membros das famílias cecropina e defensina/tionina foram isolados de plantas, insetos, mamíferos e humanos. Eles são normalmente armazenados nos grânulos citoplasmáticos de células de planta, de insetos e de humanos e sofrem liberação no local do ataque de patógenos. Em vez de visar a maquinaria bacteriana intracelular, os AMPs carregados positivamente interagem com os componentes da membrana carregados negativamente (e um pouco conservados), isto é, peptidoglicano de membrana (PGN) em bactérias gram-positivas e lipopolissacarídeo (LPS) em bactérias gram-negativas. Além disso, os AMPs também têm como alvo as membranas virais e fúngicas (world wide webncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMCl4 97874/) .
[006] Após a identificação e caracterização inicial das cecropinas e defensinas/tioninas, previa-se que esses peptídeos não estivessem submetidos à resistência microbiana. Defensinas/tioninas são peptídeos antimicrobianos que atuam principalmente por perturbar a
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3/58 estrutura das membranas celulares bacterianas. No entanto, logo foi descoberto que as bactérias gram-positivas e gramnegativas podem desenvolver resistência contra essas proteínas antimicrobianas, modificando seus componentes glicolipidicos da membrana. Essas modificações provavelmente enfraquecem a interação inicial desses peptídeos antimicrobianos com o glicolipideo da membrana e, assim, reduzem significativamente sua capacidade de formar poros e lisar a membrana bacteriana.
[007] Globalmente, um quinto da produção potencial de colheita é perdida devido a doenças de plantas, principalmente como um resultado de patógenos bacterianos. Por exemplo, Xylella fastidiosa (Xf) é um patógeno bacteriano devastador que causa a doença de Pierce em videiras (Davis et al., 1978, Science 199: 75-77), amarelinho dos citros (Chang et al., 1993, Curr. Microbiol. 27: 137-142), doença de nanismo de alfafa (Goheen et al., 1973, Phytopathology 63: 341-345) e doença de queima das folhas ou sindromes de nanismo em várias outras plantas com importância agricola, incluindo amêndoas, café e pêssego (Hopkins, 1989, Annu. Rev. Phytopathol. 27: 271-290; Wells et al., 1983, Phytopathology 73: 859-862; De Lima et al., 1996, Fitopatologia Brasileira 21(3)) . Muitas plantas de importância agricola são suscetíveis a doenças causadas por Xf. Na maioria das plantas, Xf se comporta como um endófito inofensivo (Purcell e Saunders, 1999, Plant Dis. 83: 825830) . Diferentes cepas de Xf infectam diferentes hospedeiros de plantas (Hendson, et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol 67: 895-903). Por exemplo, certas cepas causam doenças em plantas especificas, enquanto não em
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4/58 outras. Adicionalmente, algumas cepas colonizarão uma planta hospedeira sem causar a doença que uma cepa Xf diferente causa na mesma planta. Situações semelhantes são encontradas nas cepas de Xanthamonas e Pseudomonas (jb.asm.org/content/82/6/913.full.pdf).
[008] Xf é adquirido e transmitido às plantas por cigarrinhas da familia Cicadellidae e cigarrinhas das pastagens da familia Cercropidae (Purcell e Hopkins, 1996, Annu. Rev. Phytopathol. 34: 131-151) . Uma vez adquiridas por esses vetores de insetos, as colônias Xf formam uma biopelicula de células Xf mal afixadas no interior do intestino anterior do inseto (Briansky et al., 1983,
Phytopathology 73: 530-535; Purcell et al., 1979, Science 206: 839-841). Posteriormente, o vetor de inseto permanece um hospedeiro para o espalhamento de Xf e uma fonte de transmissão para as plantas (Hill e Purcell, 1997, Phytopathology 87: 1197-1201). Em plantas suscetíveis, Xf se multiplica e se espalha do local de inoculação para o xilema, onde forma colônias que eventualmente ocluem os vasos do xilema, bloqueando o transporte de água.
[009] A doença de Pierce é uma doença letal causada por Xf nas videiras na América do Norte através da América Central, e tem sido relatada em partes do noroeste da América do Sul. Está presente em algumas vinhas da Califórnia anualmente, e causa as mais severas perdas de colheita no Vale de Napa e em partes do Vale Central. A Doença de Pierce é transmitida eficientemente pelo vetor de inseto atirador de asas vitreo. Na Califórnia, o atirador de asas vitreo deve se espalhar para o norte no cinturão citricola do Vale Central e provavelmente se tornará parte
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5/58 permanente de vários habitats no norte da Califórnia. Alimenta-se e se reproduz em uma grande variedade de árvores, plantas ornamentais lenhosas e plantas anuais em sua região de origem, no sudeste dos Estados Unidos. Extremosa e sumac são especialmente preferidas. Reproduz-se em eucaliptos e carvalhos Quercus agrifolia no sul da Califórnia.
[0010] Ao longo dos anos, um grande esforço tem sido focado no uso de inseticidas para eliminar o espalhamento de patógenos, incluindo Xf. No entanto, os inseticidas não eliminaram o Xf causador. Por exemplo, ainda não existe tratamento eficaz para a Doença de Pierce. Outros cultivos encontrados nessas regiões do estado da Califórnia também foram efetuados, incluindo os cultivos de amêndoas e oleandros. O California Farm Bureau relata que havia 13 condados da Califórnia infestados com o atirador de asas vitreo no ano 2000, e que a ameaça ao Estado da Califórnia é de US $ 14 bilhões em cultivos, empregos, plantas e árvores residenciais, plantas nativas, árvores e habitats.
[0011] Observe que a discussão a seguir se refere a várias publicações por autor(es) e o ano de publicação, e que, devido às recentes datas de publicação, certas publicações não devem ser consideradas como estado da técnica à presente invenção. A discussão de tais publicações nesta invenção é dada para um histórico mais completo e não deve ser interpretada como uma admissão de que tais publicações são estado da técnica para fins de determinação de patenteabilidade.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0012] Uma modalidade da presente invenção provê um
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6/58 composto para uso no tratamento de um hospedeiro, o composto compreendendo um elemento de reconhecimento e um elemento de lise conectado por um ligante, em que o elemento de reconhecimento se liga a uma proteína de superfície no patógeno e no elemento de lise lisa o patógeno, e em que o elemento de reconhecimento é derivado de uma primeira proteina e o elemento de lise é derivado de uma segunda proteina, em que a primeira proteina e a segunda proteina são endógenas ao hospedeiro (por exemplo, uma planta, um animal ou um humano) . Por exemplo, o composto é uma proteina quimérica para o tratamento de um hospedeiro infectado ou com risco de se infectar com um patógeno que causa doença no hospedeiro. Além disso, o elemento de reconhecimento compreende uma sequência derivada da subtilisina, tal como uma sequência de aminoácidos da Proteinase K ou uma porção da mesma, ou uma sequência com homologia com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos de proteina de aumento da permeabilidade bactericida (BPI)/proteina de ligação a lipopolissacarideo (LBP), ou porção da mesma ou uma sequência com homologia com a mesma. Por exemplo, o elemento de reconhecimento tem uma afinidade de ligação especifica a uma proteina da membrana externa, tal como mopB na superfície do patógeno. Além disso, o elemento de lise compreende uma sequência de definsina, tal como uma sequência de aminoácidos de tionina, ou uma porção da mesma ou uma sequência com homologia com a mesma.
[0013] Em uma modalidade, o elemento de lise é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 9, 10, 15 e 35 ou uma sequência com homologia com a
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7/58 mesma e o elemento de reconhecimento é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs 1, 3, 5, 8, 11, 12, 16, 34 e 3 6 ou uma sequência com homologia com a mesma. Além disso, o ligante é uma sequência de aminoácidos que varia em comprimento, por exemplo, de 1-50 aminoácidos em comprimento. Por exemplo, o ligante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em arginina-triptofano, serina-arginina-ácido aspártico, SEQ ID NO 17-23 e 26-28, e sequências de aminoácidos tendo homologia ao mesmo. Em uma outra modalidade, a proteina quimérica tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 30, 31, 32 e 33 ou uma sequência de aminoácidos com homologia com a mesma. Em uma modalidade, a proteina quimérica é codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor para produzir um vetor de expressão. A homologia da sequência de aminoácidos é de 50% ou maior, 60% ou maior, 70% ou maior, 80% ou maior, 90% ou maior, 95% ou maior. Em uma modalidade da presente invenção, a planta é uma planta de cultivo de produção.
[0014] Uma outra modalidade compreende uma proteina quimérica com i) um elemento de reconhecimento compreendendo um peptideo ou uma proteina de um membro da familia subtilisina de proteinases, ou sequência de BPI/LBP; ii) um elemento de lise compreendendo uma sequência de tionina e um ligante que separa i) e ii) de modo que i) e ii) possam dobrar em uma forma tridimensional apropriada e reter uma atividade. A subtilisina reconhece a proteina MopB da membrana externa Xf conservada, enquanto
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BPI/LBP reconhece as porções LPS conservadas de Xf. 0 ligante de uma ou mais modalidades pode ser um ligante de aminoácido tendo um comprimento de um ou mais aminoácidos, mas pode variar no comprimento de aminoácidos, por exemplo, 1-5, 5-10, 10-15, 15-50 e 50-100 ou mais aminoácidos. Os aminoácidos que compõem o ligante podem ser de ocorrência natural ou não natural. Uma outra modalidade compreende um polinucleotideo de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteina quimérica desta modalidade. Uma outra modalidade inclui um vetor de expressão compreendendo este polinucleotideo operacionalmente ligado a um promotor. É ainda outra modalidade uma planta geneticamente alterada ou partes da mesma e sua progênie compreendendo este polinucleotideo operacionalmente ligado a um promotor, em que a planta ou partes da mesma e sua progênie produzem a proteina quimérica. Por exemplo, sementes e pólen contêm esta sequência de polinucleotideos ou um homólogo da mesma, uma célula de planta geneticamente alterada compreendendo esse polinucleotideo operacionalmente ligado a um promotor, de modo que a célula de planta produza a proteina quimérica. Uma outra modalidade compreende uma cultura de tecidos compreendendo uma pluralidade de células de planta geneticamente alteradas. Em uma modalidade adicional, a proteina quimérica pode compreender SEQ ID NOs 4-7 ou SEQ ID NOs 30-33 ou uma sequência com homologia com a mesma. Outra modalidade compreende um polinucleotideo de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica SEQ ID NOs 4-7 ou 30-33 ou uma sequência com homologia com as mesmas. Uma sequência da revelação pode ter cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%,
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| cerca | de | 35%, | cerca | de | 40%, | cerca | de | 45%, | cerca | de | 50%, |
| cerca | de | 55%, | cerca | de | 60%, | cerca | de | 65%, | cerca | de | 70%, |
| cerca | de | 75%, | cerca | de | 80%, | cerca | de | 81%, | cerca | de | 82%, |
| cerca | de | 83%, | cerca | de | 84%, | cerca | de | 85%, | cerca | de | 85%, |
| cerca | de | 86%, | cerca | de | 87%, | cerca | de | 88%, | cerca | de | 89%, |
| cerca | de | 90%, | cerca | de | 91%, | cerca | de | 92%, | cerca | de | 93%, |
| cerca | de | 94%, | cerca | de | 95%, | cerca | de | 96%, | cerca | de | 97%, |
| cerca | de | 98%, | cerca | de | 99% ou | cerca | de | 100 | % de homologia |
da sequência de aminoácidos com pelo menos uma das SEQ ID Nos. SEQ ID NOs 4-7 ou SEQ ID NOs 30-33 ou uma definsina ou subtilisina ou uma sequência de BPT/LBP revelada neste documento. Outra modalidade inclui um vetor de expressão compreendendo este polinucleotideo operacionalmente ligado a um promotor. Uma planta geneticamente alterada ou partes da mesma e sua progênie compreendendo este polinucleotideo operacionalmente ligado a um promotor, em que a planta ou partes da mesma e sua progênie produzem a proteina quimérica é ainda outra modalidade. Por exemplo, sementes e pólen contêm esta sequência de polinucleotideos ou um homólogo da mesma, uma célula de planta geneticamente alterada compreendendo esse polinucleotideo operacionalmente ligado a um promotor, de modo que a célula de planta produza a proteina quimérica. Outra modalidade compreende uma cultura de tecidos compreendendo uma pluralidade de células de planta geneticamente alteradas. Uma outra modalidade provê um método para construir uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma tendo resistência aumentada a infecções bacterianas em comparação com uma planta não geneticamente alterada ou parte da mesma, o método que compreende as etapas de: introduzir um
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10/58 polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica em uma planta ou parte da mesma para prover uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma, em que a proteína quimérica que compreende o ligante varia em comprimento entre três aminoácidos e aproximadamente quarenta e quatro aminoácidos; e selecionar uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma que expressa a proteína quimérica, em que a proteína quimérica expressada tem atividade antibacteriana; e em que a planta geneticamente alterada ou parte da mesma tem resistência aumentada a infecções bacterianas em comparação com a resistência a infecções bacterianas da planta não geneticamente alterada ou parte da mesma. Um polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica é introduzido por introgressão ou transformação da planta com um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor.
[0015] Uma outra modalidade provê um método para intensificar a resistência de uma planta do tipo selvagem a doenças bacterianas compreendendo transformar uma célula da planta do tipo selvagem com um polinucleotídeo que codifica uma proteína quimérica para gerar uma célula da planta transformada; e crescimento da célula de planta transformada para gerar uma planta geneticamente alterada, em que a proteína quimérica compreende um elemento de reconhecimento, um elemento de lise; em que o elemento de lise compreende uma tionina ou pró-tionina, e o elemento de reconhecimento compreende Proteinase K ou pró-Subtilisina, ou subtilisina ou pró-subtilisina. Um ligante pode conectar o elemento de reconhecimento e o elemento de lise de uma maneira que cada um possa dobrar em sua forma
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11/58 tridimensional apropriada e reter sua atividade em relação a um patógeno. 0 ligante de peptideo varia em comprimento entre três aminoácidos e aproximadamente quarenta e quatro aminoácidos; em que a planta geneticamente alterada ou parte da mesma produz a proteina quimérica; e em que a proteina quimérica mata bactérias que causam as doenças bacterianas; e em que a resistência da planta geneticamente alterada às doenças bacterianas é maior que a resistência da planta do tipo selvagem às doenças bacterianas. Além disso, outra modalidade compreende um hospedeiro geneticamente alterado, por exemplo, uma planta (por exemplo, uma uva ou parte da mesma que é produzida por este método). Um polinucleotídeo que codifica a proteina quimérica pode ser introduzido na planta usando um vetor de expressão para agrobacterium para a transformação.
[0016] Uma outra modalidade provê uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma e sua progênie compreendendo o polinucleotídeo que codifica o composto operacionalmente ligado a um promotor, em que a planta ou partes da mesma e sua progênie produzem o composto. Além disso, a planta geneticamente alterada ou parte da mesma, em que sua progênie é uma semente da planta geneticamente alterada e/ou em que suas partes são pólens da planta geneticamente alterada e/ou em que suas partes são células de planta da planta geneticamente alterada que compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor, em que a célula de planta produz o composto. Além disso, a planta geneticamente alterada ou parte da mesma em que a célula de planta forma uma cultura de tecidos.
[0017] Uma outra modalidade da presente invenção provê
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12/58 um método para a construção de uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma com resistência aumentada à infecção por um patógeno em comparação com uma planta não geneticamente alterada ou parte da mesma, o método que compreende as etapas de introdução de um polinucleotídeo que codifica uma proteina quimérica para uma planta ou parte da mesma para prover uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma. A proteina quimérica compreende um elemento de reconhecimento e um elemento de lise, em que o elemento de reconhecimento é derivado de uma primeira proteina, e o elemento de lise é derivado de uma segunda proteina, em que a primeira proteina e a segunda proteina são endógenas à planta destinada a ser tratada pela proteina quimérica, em que o elemento de reconhecimento se liga ao patógeno e o elemento de lise lisa o patógeno para produzir atividade antipatogênica. Uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma que expressa a proteina quimérica é selecionada, em que a proteina quimérica expressada tem atividade antipatogênica. A planta geneticamente alterada ou parte da mesma tem resistência aumentada a infecções por patógenos em comparação com a resistência a infecções por patógenos da planta não geneticamente alterada ou parte da mesma. Por exemplo, a introdução do polinucleotídeo que codifica a proteina quimérica ocorre via introgressão ou transformação da planta com um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor. A planta que pode ser produzida por esse método é uma videira que produz uvas.
[0018] Ainda uma outra modalidade provê um método para
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13/58 intensificar a resistência de uma planta do tipo selvagem a doenças bacterianas, que compreende as etapas de transformação de uma célula da planta do tipo selvagem com um polinucleotídeo que codifica uma proteina quimérica para gerar uma célula da planta transformada. A célula de planta transformada é desenvolvida para gerar uma planta geneticamente alterada, em que uma proteina quimérica compreende um elemento de lise e um elemento de reconhecimento. 0 elemento de lise compreende uma tionina ou pró-tionina, e o elemento de reconhecimento compreende Proteinase K ou pró-Proteinase K. A planta geneticamente alterada ou parte da mesma produz a proteina quimérica. A proteina quimérica mata patógenos que causam doenças por patógenos no hospedeiro, a resistência da planta geneticamente alterada às doenças por patógenos é maior que a resistência da planta do tipo selvagem às doenças por patógenos. A planta que pode ser produzida por esse método é, por exemplo, uma videira que produz uvas.
[0019] Outra modalidade da presente invenção provê um vetor de expressão para transformação mediada por agrobacterium usando o polinucleotídeo que codifica a proteina quimérica.
[0020] Uma outra modalidade provê uma composição compreendendo a proteina quimérica como aqui descrito. A composição pode ser usada como tratamento tópico de plantas em risco de infecção por Xylella fastidiosa (Xf). Ainda, é uma modalidade que provê um método de tratamento de plantas em risco de infecção por Xf, compreendendo as etapas de aplicação da composição às plantas em risco de infecção por Xf.
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14/58 [0021] Uma outra modalidade prevê um método de tratamento de uma planta de cultivo de produção que corre o risco de ser infectado com um patógeno que prejudicará a planta de cultivo de produção, o método que compreende as etapas de aplicação tópica de uma proteína quimérica, como descrito neste documento à planta de cultivo de produção em risco de ficar infectada.
[0022] Uma outra modalidade provê um método de tratamento de uma planta de cultivo de produção em risco de ser infectada com um patógeno que prejudicará a planta de cultivo de produção, o método que compreende as etapas de introdução de uma sequência que codifica uma proteína quimérica da reivindicação 1 à planta de produção em risco de infecção. Por exemplo, a etapa de introdução inclui a introdução de uma sequência que codifica a proteína quimérica para os cultivares porta-enxerto e cultivares de enxerto.
[0023] Um outro método prevê o uso de uma proteína quimérica ou polinucleotideo que codifica o mesmo em um método de conferir resistência a uma doença nos cultivares porta-enxerto de cultivo de produção ou nos cultivares de enxerto de cultivo de produção compreendendo as etapas de transformação de cultivares porta-enxerto de cultivo de produção ou cultivares de enxerto de cultivo de produção com uma sequência que codifica a proteína quimérica como descrito neste documento.
[0024] Outra modalidade da presente invenção provê cultivares porta-enxerto de cultivo de produção transgênicos ou cultivares de enxerto de cultivo de produção transgênicos transformados com um polinucleotídeo
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15/58 que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteina quimérica da reivindicação 1.
| [0025] | Ainda | mais, outra modalidade | compreende | uma | |
| composição | que | compreende | uma proteína | quimérica i | como |
| revelada : | neste | documento | como um tratamento tópico | de |
plantas com risco de infecção com um patógeno, por exemplo, um Xf e um método de tratamento de plantas com risco de infecção com o patógeno, por exemplo, Xf compreendendo a aplicação da composição às plantas em risco de infecção por Xf.
[0026] Um aspecto de uma modalidade da presente invenção provê uma proteina quimérica tendo um elemento de reconhecimento e um elemento de lise do proteoma hospedeiro. Nesta modalidade, cada um do elemento de reconhecimento e do elemento de lise é especifico para o patógeno, por exemplo Xf.
[0027] Um aspecto de uma modalidade da presente invenção provê linhagens de plantas transgênicas que expressam a proteina quimérica.
[0028] Um outro aspecto da presente invenção provê uma linhagem de plantas transgênicas que é resistente a patógenos, por exemplo, resistente a Xf.
[0029] Um outro aspecto de uma modalidade da presente invenção é uma linhagem de plantas transgênicas que se espera que mostre alta eficácia contra um patógeno, por exemplo, infecção por Xf e nenhuma fitotoxicidade. Uma outra modalidade prevê que a planta seja uma planta de uva.
[0030] Um outro aspecto da presente invenção provê uma proteina quimérica feita de proteínas imunológicas inatas da uva úteis para criar uma planta transgênica com
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16/58 imunidade inata à doença causada por Xf.
[0031] Um outro aspecto da presente invenção provê sinergia entre o elemento de reconhecimento e o elemento de lise para facilitar a redução da carga de patógenos encontrada em uma planta infectada com o patógeno. Em outro aspecto da presente invenção, a sinergia do elemento de reconhecimento e do elemento de lise facilita a depuração ou redução de um patógeno ou uma carga de patógeno encontrado(a) em uma planta infectada com o patógeno. (Proc Natl Acad Sei EUA, 6 de março de 2012; 109(10):3721-5).
[0032] Um outro aspecto da presente invenção provê um método para intensificar a resistência de uma planta a doenças por patógenos, transformando uma planta com uma proteina quimérica introduzida na planta (ou alterando o DNA da planta para expressar a proteina quimérica) com um ou mais polinucleotídeo (s) que codifica (m) uma ou mais proteina(s) quimérica(s) descrita(s) neste documento, de modo que a planta que contém o DNA heterólogo produza a proteina quimérica, e a proteina quimérica mata o patógeno, por exemplo, uma bactéria que causa danos à planta depois que as bactérias infectam a planta.
[0033] Em referência a qualquer modalidade, a identidade pode ser calculada por métodos conhecidos. Porcentagens de identidade ou homologia, como mencionado neste documento, são aquelas que podem ser calculadas com o programa Blast ou programa GAP, executado sob GCG (Genetics Computer Group Inc., Madison, Wis., EUA) . Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appl.
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Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Nat. Acad Sci. EUA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:23744, 1988;
Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson et al.,
| Meth Mol. | Bio. | 24 : 307-31, | 1994. Altschul | et | al., J. Mol. |
| Biol. 215 | :403- | -10, 1990, | apresenta uma | consideração | |
| detalhada | dos | métodos de | alinhamento | de | sequência e |
cálculos de homologia.
[0034] Objetos, vantagens e novos recursos, além de escopo de aplicabilidade da presente invenção serão estabelecidos em parte na descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com o desenho anexo, e em parte se tornará evidente para os técnicos no assunto após a análise do que se segue, ou pode ser aprendida pela prática da invenção. Os objetivos e as vantagens da invenção podem ser realizado(a)s e alcançado(a)s por meio dos instrumentos e das combinações particularmente apontado(a)s nas reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS [0035] Os desenhos anexos, que são incorporados e fazem parte do relatório descritivo, ilustram uma ou mais modalidades da presente invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção. Os desenhos são apenas para a finalidade de ilustrar uma ou mais forma(s) de realização preferida(s) da invenção e não deve(m) ser interpretada(s) como limitativa(s) da invenção. Nos desenhos:
[0036] Figura 1. Uma membrana típica de três camadas de
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18/58 uma bactéria gram-negativa como Xf é mostrada. A proteína da membrana externa mopB e LPS são possíveis alvos de reconhecimento. 0 mopB é direcionado pela subtilisina da uva, enquanto o LPS é direcionado pela BPI/LBP da uva. As gama-tioninas da uva com seletividade para bactérias gramnegativas, tal como Xf, são escolhidas como elementos/domínios de lise.
[0037] Figura 2. As quimeras de acordo com uma modalidade da presente invenção compreendem subtilisina e tionina de uva. Códigos: X = subtilisina; Y = defensina; Z = ligante. Figura 2A Defensina no terminal N e subtilisina no terminal C. Figura 2B subtilisina no terminal N e Defensina no terminal C.
[0038] Figura 3. As quimeras de acordo com uma modalidade da presente invenção compreendem BPI/LBP de uva e tionina. Códigos: W = BPI/LBP; X = defensina; Z = ligante. Figura 3A Defensina no terminal N e BPI/LBP no terminal C. Figura 3B BPI/LBP no terminal N e Defensina no terminal C.
[0039] Figura 4. Sequências de aminoácidos das quimeras mostradas nas Figuras 2 e 3 são ilustradas na estrutura da fita. A subtilisina foi escolhida como elemento/domínio de reconhecimento (divagem) sobre HNE devido à sua maior atividade de divagem no mopB. As proteínas da família de BPI/LBP são conservadas em humanos, animais e plantas. A uva de BPI/LBP consiste em dois elementos/domínios semelhantes que podem se ligar a LPS e penetrar na membrana externa de bactérias gram-negativas. Eles são acompanhados por um ligante rico em prolina. Um desses elementos/domínio BPI/LBP e o mesmo ligante é escolhido quando a BPI/LBP está
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19/58 no terminal N da quimera. Quando a def ensina da uva no terminal N da quimera, o ligante GSTAPPA (SEQ ID NO 18) é usado para unir BPI/LBP e a subtilisina. Também foram projetadas quimeras estendendo a sequência de defensina da uva além da última cisteína por VFDEK (SEQ ID NO 2 9) para aumentar a atividade e diminuir a toxicidade.
[0040] Figura 5. Os peptídeos quiméricos são ilustrados de acordo com uma modalidade da presente invenção tendo um primeiro domínio, segundo domínio e um terceiro domínio.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0041] Uma modalidade da presente invenção prevê o tratamento de doenças do hospedeiro causadas por patógenos, tais como bactérias, por exemplo, a bactéria Xylella fastidiosa (Xf), limitada por xilema, que infecta hospedeiros, tais como videiras, que causa a doença de Pierce e as cepas de Xanthamonas e Pseudominas que causam pontos e manchas no tomate. Como esta invenção envolve a produção de hospedeiros geneticamente alterados e composições para uso na transformação de hospedeiros e envolve técnicas de DNA recombinante, as seguintes definições são providas para auxiliar na descrição desta invenção. Os termos isolado, purificado ou biologicamente puro, como usados neste documento, referem-se a material substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material em seu estado nativo ou quando o material é produzido. Em uma modalidade de exemplo, a pureza e a homogeneidade são determinadas usando técnicas químicas analíticas, tal como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Um ácido nucleico ou uma
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20/58 bactéria especifica que são as espécies predominantes presentes em uma preparação é substancialmente purificado(a). Em uma modalidade de exemplo, o termo purificado indica que um ácido nucleico ou uma proteina que dá origem a essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Tipicamente, ácidos nucleicos ou proteínas isolado(a)s têm um nivel de pureza expressado como uma faixa. A extremidade inferior da faixa de pureza para o componente é de cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% e a extremidade superior da faixa de pureza é de cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais do que cerca de 90%.
[0042] O termo ácido nucleico, como usado neste documento, refere-se a um polimero de ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotideos. Tipicamente, os polímeros de ácido nucleico ocorrem na forma de fita simples ou dupla, mas também são conhecidos por formar estruturas compreendendo três ou mais fitas. O termo ácido nucleico inclui polímeros de ácido nucleico de ocorrência natural, bem como ácidos nucleicos que compreendem análogos de nucleotídeos conhecidos ou residues ou ligações de esqueleto modificados, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência, e que são metabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de referência. Análogos de exemplo incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirais, 2-0-metil ribonucleotídeos e ácidos nucleicos de peptídeos (PNAs). DNA, RNA, polinucleotideos, sequência de
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21/58 polinucleotídeos, oligonucleotídeo, nucleotídeo, ácido nucleico, molécula de ácido nucleico, sequência de ácidos nucleicos, fragmento de ácido nucleico e fragmento de ácido nucleico isolado são usados neste documento indistintamente.
[0043] Para ácidos nucleicos, os tamanhos são dados em kilobases (kb) ou pares de bases (bp) . As estimativas são tipicamente derivadas da eletroforese em gel de agarose ou acrilamida, de ácidos nucleicos sequenciados ou de sequências de DNA publicadas. Para proteínas, os tamanhos são dados em quilodaltons (kDa) ou em números de resíduos de aminoácidos. Os tamanhos das proteínas são estimados a partir de eletroforese em gel, de proteínas sequenciadas, de sequências de aminoácidos derivadas ou de sequências de proteínas publicadas.
[0044] Em uma modalidade da presente invenção, uma proteína quimérica é uma sequência de ocorrência não natural tendo um elemento de reconhecimento que é derivado de uma primeira sequência de peptídeos ou proteínas encontrada em um hospedeiro a ser tratado com a proteína quimérica e também incluída na proteína quimérica é um elemento de lise que é derivado de um(a) segundo(a) peptídeo ou proteína encontrado(a) no hospedeiro a ser tratado com a proteína quimérica, em que individualmente o (a) primeiro(a) peptídeo ou proteína e o (a) segundo(a) peptídeo ou proteína proveem à atividade antipatogênica do hospedeiro, e em que o (a) primeiro(a) peptídeo ou proteína e o(a) segundo(a) peptídeo ou proteína se ligam a diferentes alvos no patógeno.
[0045] A menos que indicado de outra forma, uma
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22/58 sequência de ácidos nucleicos especifica também envolve implicitamente variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códons degenerados), a sequência complementar (ou complemento) e a sequência complemento inversa, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códons degenerados podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por residues de base mista e/ou desoxininosina (ver, por exemplo, Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)) . Como as sequências de aminoácidos de D4E1, tionina, pró-tionina, tionina otimizada, pró-tionina otimizada, ligante 1, ligante 2, ligante 3, ligante 4, ligante 5, ligante 6 e as proteínas quiméricas são descritas, pode-se quimicamente sintetizar um polinucleotideo que codifica esse(a)s polipeptídeos/proteínas quiméricas. Devido à degenerescência dos códons de ácido nucleico, podem ser usados vários polinucleotídeos diferentes para codificar polipeptídeos idênticos. A Tabela 2, infra, contém informações sobre quais códons de ácido nucleico codificam quais aminoácidos.
TABELA 1 Aminoácidos e Códons de ácidos nucleicos
| Aminoácido | Códons de ácido nucleico |
| Ala/A | GCT, GCC, GCA, GCG |
| Arg/R | CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG |
| Asn/N | AAT, AAC |
| Asp/D | GAT, GAC |
| Cys/C | TGT, TGC |
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| Gln/Q | CAA, CAG |
| Glu/E | GAA, GAG |
| Gly/G | GGT, GGC, GGA, GGG |
| His/H | CAT, CAC |
| Ile/I | ATT, ATC, ATA |
| Leu/L | TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG |
| Lys/K | AAA, AAG |
| Met/M | ATG |
| Phe/F | TTT, TTC |
| Pro/P | CCT, CCC, CCA, CCG |
| Ser/S | TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC |
| Thr/T | ACT, ACC, ACA, ACG |
| Trp/W | TGG |
| Tyr/Y | TAT, TAC |
| Val/V | GTT, GTC, GTA, GTG |
[0046] Além da natureza degenerada dos códons de nucleotídeos que codificam aminoácidos, alterações em um polinucleotideo que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado local, mas não afetam as propriedades funcionais do polipeptídeo codificado, são bem conhecidos na técnica. Substituições de aminoácidos conservadoras são aquelas substituições que são previstas para interferir menos com as propriedades do polipeptídeo de referência. Em outras palavras, as substituições conservadoras de aminoácidos conservam substancialmente a estrutura e a função da proteína de referência. Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico, tal como glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico, tal como valina,
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24/58 leucina ou isoleucina. De forma similar, alterações que resultem na substituição de um residue carregado negativamente por outro, tal como ácido aspártico por ácido glutâmico, ou um residue carregado positivamente por outro, tal como Usina por arginina ou histidina, pode ser também esperado para produzir uma proteina ou um polipeptídeo funcionalmente equivalente. A Tabela 3 provê uma lista de substituições conservadoras de aminoácidos de exemplo. As substituições conservadoras de aminoácidos geralmente mantêm (a) a estrutura do esqueleto de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha beta ou conformação alfa helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local da substituição e/ou (c) a maior parte da cadeia lateral.
TABELA 2 Aminoácidos e Substitutos Conservadores
| Aminoácido | Substituto conservador |
| Ala | Gly, Ser |
| Arg | His, Lys |
| Asn | Asp, Gin, His |
| Asp | Asn, Glu |
| Cys | Ala, Ser |
| Gin | Asn, Glu, His |
| Glu | Asp, Gin, His |
| Gly | Ala |
| His | Asn, Arg, Gin, |
| Glu | |
| Ile | Leu, Vai |
| Leu | Ile, Vai |
| Lys | Arg, Gin, Glu |
| Met | Ile, Leu |
| Phe | His, Leu, Met, |
| Trp, Tyr | |
| Ser | Cys, Thr |
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| Thr | Ser, Vai |
| Trp | Phe, Tyr |
| Tyr | His, Phe, Trp |
| Vai | Ile, Leu, Thr |
[0047] Oiigonucleotídeos e polinucleotídeos que não estão disponíveis comercialmente podem ser sintetizados quimicamente, por exemplo, de acordo com o método do triéster de fosforamidita em fase sólida descrito pela primeira vez por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981), ou usando um sintetizador automatizado, como descrito em Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). Outros métodos para sintetizar oiigonucleotídeos e polinucleotídeos são conhecidos na técnica. A purificação de oiigonucleotídeos é
| por | eletroforese em | gel de acrilamida | nativa | ou por HPLC | |
| por | troca | aniônica, | como descrito em Pearson & | Reanier, J. | |
| Chrom. 255 | : 137-149 | (1983). | |||
| [0048] | 0 termo | recombinante | quando | usado com |
referência, por exemplo, a uma célula, ou a ácido nucleico, à proteína ou ao vetor, indica que a célula, o organismo, o ácido nucleico, a proteína ou o vetor foi modificada(o) pela introdução de um(a) ácido nucleico ou proteína heterólogo (a) ou alteração de uma proteína ou um ácido nucleico nativa(o)/endógena(o), ou que a célula seja derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes podem expressar genes que não são encontrados na forma nativa (não recombinante ou do tipo selvagem) da célula ou expressar genes nativos, proteínas ou porções das mesmas que, de outra forma, são
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26/58 anormalmente expressadas - superexpressadas, subexpressadas ou não expressadas de todo, por exemplo, um peptídeo ou uma proteina da forma da proteina quimérica ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de proteínas quiméricas.
[0049] Os termos transgênico, transformado, transformação e transfecção têm significado semelhante a recombinante. Transformação, transgênico e transfecção se referem à transferência de um polinucleotídeo para o genoma de um organismo hospedeiro ou para uma célula. Essa transferência de polinucleotídeos pode resultar em herança geneticamente estável dos polinucleotídeos, ou os polinucleotídeos permanecendo extracromossomalmente (não integrados no cromossomo da célula). A herança geneticamente estável pode potencialmente exigir que o organismo ou célula transgênica seja submetido, por um período de tempo, a uma ou mais condições que exijam a transcrição de parte ou de todo o polinucleotídeo transferido para que o organismo ou célula transgênica viva e/ou cresça. Os polinucleotídeos que são transformados, transfectados ou transferidos para uma célula, mas não estão integrados no cromossomo do hospedeiro, permanecem como um vetor de expressão dentro da célula. Pode ser necessário crescer a célula sob certas condições ambientais ou de crescimento para que o vetor de expressão permaneça na célula ou na progênie da célula. Além disso, para que a expressão ocorra, o organismo ou a célula pode precisar ser mantido(a) sob certas condições. Organismos hospedeiros ou células que contêm o polinucleotídeo recombinante podem ser referidos como
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27/58 organismos ou células transgênico(a)s ou transformado(a)s ou simplesmente como transformantes, bem como organismos ou células recombinantes.
[0050] Um organismo geneticamente alterado é qualquer organismo com qualquer alteração no seu material genético, seja no núcleo ou no citoplasma (organela) . Como tal, um organismo geneticamente alterado pode ser um organismo recombinante ou transformado. Um organismo geneticamente alterado também pode ser um organismo que foi submetido a uma ou mais mutagêneses ou a progênie de um organismo que foi submetido a um ou mais mutagêneses e tem alterações em seu DNA causadas por um ou mais mutagêneses, em comparação com o organismo do tipo selvagem (isto é, o organismo não submetido às mutagêneses). Além disso, um organismo que foi criado para incorporar uma mutação em seu material genético é um organismo geneticamente alterado. Para as finalidades desta invenção, o organismo é uma planta.
[0051] O termo vetor refere-se a alguns meios pelos quais DNA, RNA, uma proteina ou polipeptídeo podem ser introduzidos em um hospedeiro. Os polinucleotídeos, as proteínas e os polipeptídeos que devem ser introduzidos em um hospedeiro podem ser de natureza terapêutica ou profilática; pode codificar ou ser um antígeno; pode ser de natureza regulatória; etc. Existem vários tipos de vetores, incluindo vírus, plasmídeo, bacteriófagos, cosmídeos e bactérias.
[0052] Um vetor de expressão é o ácido nucleico capaz de se replicar em uma célula ou um organismo hospedeira(o) selecionada(o). Um vetor de expressão pode replicar-se como uma estrutura autônoma ou, alternativamente, pode integrarPetição 870190094531, de 20/09/2019, pág. 34/70
28/58 se, no todo ou em parte, aos cromossomos da célula hospedeira ou aos ácidos nucleicos de uma organela, ou é usado como um transportador para dispensar DNA estranho às células e, portanto, replicar junto com o genoma da célula hospedeira. Assim, um vetor de expressão é de polinucleotídeos capazes de se replicarem em uma célula hospedeira, uma organela ou um organismo selecionada(o), por exemplo, um plasmídeo, um vírus, um cromossomo artificial, um fragmento de ácido nucleico, e para os quais certos genes no vetor de expressão (incluindo genes de interesse) são transcritos e traduzidos em um polipeptídeo ou uma proteína dentro da célula, da organela ou do organismo; ou qualquer construção adequada conhecida na técnica, que compreende um cassete de expressão. Em contraste, como descrito nos exemplos deste documento, um cassete é um polinucleotídeo contendo uma seção de um vetor de expressão desta invenção. 0 uso dos cassetes auxilia na montagem dos vetores de expressão. Um vetor de expressão é um replicon, tal como, plasmídeo, fago, vírus, vírus quimérico ou cosmídeo, e que contém a sequência de polinucleotídeos desejada operacionalmente ligada à(s) sequência(s) de controle de expressão.
[0053] Uma sequência de polinucleotídeos é operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão (por exemplo, um promotor e, opcionalmente, um intensificador) quando a sequência de controle de expressão controla e regula a transcrição e/ou tradução dessa sequência de polinucleotídeos.
[0054] A transformação e a geração de células de planta monocotiledôneas e dicotiledôneas geneticamente alteradas
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29/58 são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Pat. US N°
5.679.558; Agrobacterium Protocols, ed: Gartland, Humana Press Inc. (1995); e Wang et al. Acta Hort. 461:401-408 (1998) . A escolha do método varia de acordo com o tipo de planta a ser transformada, a aplicação específica e/ou o resultado desejado. A técnica de transformação apropriada é prontamente escolhida pelo profissional habilitado.
[0055] Métodos de transformação/transfecção de exemplo disponíveis para os técnicos no assunto incluem, mas não estão limitados a: captação direta de construções estranhas de DNA (ver, por exemplo, EP 295959); técnicas de eletroporação (ver, por exemplo, Fromm et al., Nature 319:791 (1986)); e bombardeamento balístico de alta velocidade com partículas de metal revestidas com as construções de ácido nucleico (ver, por exemplo, Kline, et al., Nature 327: 70 (1987) e Patente US 4.945.050). Métodos específicos para transformar genes heterólogos em cultivos comercialmente importantes (para preparar plantas geneticamente alteradas) são publicados para colza (De Block et al., Plant Physiol. 91: 694-701 (1989)); girassol (Everett, et al., Bio/Technology 5:1201 (1987)); soja (McCabe et al., Bio/Technology 6: 923 (1988), Hinchee et al., Bio/Technology 6: 915 (1988), Chee et al., Plant
Physiol. 91: 1212-1218 (1989), e Christou et al., Proc.
Natl. Acad. Sei EUA 86: 7500-7504 (1989)); arroz (Hiei et al., Plant J. 6: 271-282 (1994)), e milho (Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) e Fromm et al.,
Biotechnology 8: 833-839 (1990)). Outros métodos conhecidos são revelados na Pat. US 5.597.945; 5.589.615; 5.750.871;
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5.268.526; 5.262.316; e 5.569.831.
[0056] Um método de exemplo inclui o emprego de Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente transformador para transferir DNA heterólogo para a planta. As técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens estão bem descritas na literatura cientifica. Ver, por exemplo, Horsch, et al. Science 233: 496-498 (1984) e Fraley, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80:4803 (1983). Tipicamente, uma célula de planta, um explante, um meristema ou uma semente é infectada(o) com Agrobacterium tumefaciens transformada com o(a) vetor/construção de expressão que contém o ácido nucleico heterólogo ligado operacionalmente a um promotor. Sob condições apropriadas conhecidas na técnica, as células de planta transformadas são desenvolvidas para formar brotos, raízes e se desenvolverem ainda mais em plantas geneticamente alteradas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo pode ser introduzido nas células de planta, por meio do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. O plasmídeo Ti é transmitido às células de planta na infecção por Agrobacterium tumefaciens, e é integrado de maneira estável no genoma da planta. Ver, por exemplo, Horsch, et al. (1984) e Fraley, et al. (1983).
[0057] As células de planta transformadas, que são derivadas por qualquer uma das técnicas de transformação acima, podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o fenótipo transformado desejado. Tais técnicas de regeneração dependem da manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente confiando em um marcador de biocida
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31/58 e/ou herbicida que foi introduzido juntamente com as sequências de nucleotídeos desejadas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, em Handbook of Plant Cell Culture, págs. 124-176, MacMillan Publishing Company, Nova Iorque, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, em Plant Protoplasts, págs. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calos de plantas, explantes, órgãos ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são
| descritas | geralmente em Klee et | al., | Ann. | Rev. of Plant |
| Phys. 38:4 | 67-486 (1987) . | |||
| [0058] | Esta invenção utiliza | técnicas | de rotina no | |
| campo da | biologia molecular. | Os | textos | básicos que |
descrevem os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Green e Sambrook, 4a ed. 2012, laboratório Cold Spring Harbor; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1993); e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, 1994 - atual, John Wiley & Filhos. Salvo indicação em contrário, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Benjamin Lewin, Genes IX, publicado pela Oxford University Press, 2007 (ISBN 0763740632); Krebs, et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado pela Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-63202182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado pela VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0059] O termo planta inclui plantas inteiras, órgãos
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32/58 de plantas, progênie de plantas inteiras ou órgãos de planta, embriões, embriões somáticos, estruturas semelhantes a embriões, protocormos, corpos semelhantes a protocormos (PLBs), e suspensões de células de planta. Os órgãos de planta compreendem, por exemplo, órgãos/estruturas vegetativas do broto (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raizes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, gineceus, anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma e revestimento de sementes) e frutas (o ovário maduro), tecido vegetal (por exemplo, tecido vascular, tecido do solo e similares) e células (por exemplo, células-guarda, óvulos, tricomas e similares). A classe de plantas que pode ser usada no método da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores suscetíveis às técnicas de biologia molecular e de melhoramento de plantas descritas neste documento, especificamente plantas angiospermas (monocotiledôneas (monocots) e dicotiledôneas (dicots) incluindo eudicotiledôneas. Inclui plantas com diversos níveis de ploidia, incluindo aneuploidia, poliploidia, diploidia, haploidia e hemizigótica. As plantas geneticamente alteradas descritas neste documento podem ser cultivos de monocotiledôneas, tais como, sorgo, milho, trigo, arroz, cevada, aveia, centeio, milheto e triticale. As plantas geneticamente alteradas descritas neste documento também podem ser cultivos de dicotiledôneas, tais como, maçã, uva, pera, pêssego, ameixa, laranja, limão siciliano, limão tahiti, toranja, romã, azeitona, amendoim, tabaco etc. Além disso, as plantas geneticamente alteradas
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| (ou plantas | com | DNA genômico | alterado) | podem | ser plantas |
| hortícolas, | tais | como, rosa, calêndula, | prímula | , sanguinho- | |
| legítimo, | amor | perfeito, | gerânio | etc. | Em algumas |
modalidades, as plantas geneticamente alteradas são plantas de citrinos. Em outras modalidades, as plantas geneticamente alteradas são plantas N. benthamiana ou tabaco.
[0060] Uma vez que uma planta geneticamente alterada tenha sido gerada, pode-se cultivá-la com uma planta de tipo selvagem e triar plantas heterogêneas de geração F1 contendo a alteração genética presente na planta geneticamente alterada. Em seguida, plantas de geração F2 podem ser geradas que são homozigotas para a alteração genética. Essas plantas de geração F1 heterogêneas e plantas F2 homozigotas, progênie da planta geneticamente alterada original, são consideradas plantas geneticamente alteradas, tendo o material genômico alterado da planta precursora geneticamente alterada.
[0061] Depois que se obtém uma planta geneticamente alterada que expressa a proteína quimérica, pode-se produzir eficientemente a planta geneticamente alterada com outras plantas contendo as características desejadas. Pode ser usado marcadores moleculares (isto é, sondas de polinucleotídeos) com base na sequência da proteína quimérica como descrito acima para determinar qual prole de cruzamentos entre a planta geneticamente alterada e a outra planta tem o polinucleotideo que codifica a proteína quimérica. Esse processo é conhecido como Introgressão de Característica Rápida Assistida por Marcador (MARTI). Resumidamente, o MARTI envolve (1) cruzar a planta
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34/58 geneticamente alterada com uma linhagem de plantas tendo fenótipo/genótipo desejado (precursor de elite) para introgressão para obter prole Fl. A geração F1 é heterozigótica para a característica de proteína quimérica. (2) Em seguida, uma planta F1 é retrocruzada para o precursor de elite, produzindo BC1F1 que produz geneticamente de proteína quimérica 50% de tipo selvagem e 50% heterozigota. (3) PCR usando a sonda de polinucleotídeo é realizada para selecionar as plantas heterozigotas geneticamente alteradas contendo polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica. (4) Os heterozigotos selecionados são então retrocruzados para o precursor de elite para realizar introgressão adicional. (5) Esse processo do MARTI é realizado por mais quatro ciclos. (6) Em seguida, a planta geneticamente alterada heterozigota é autopolinizada por ensacamento para produzir a geração de BC6F2. A geração de BC6F2 produz uma taxa de secretação fenotípica de 3 plantas precursoras do tipo selvagem para 1 planta quimicamente alterada de proteína quimérica. (7) Seleciona-se plantas de proteínas quiméricas geneticamente alteradas na geração de BC6F2 no estágio de plântulas usando PCR com a sonda de polinucleotídeo e pode opcionalmente ser combinada com a seleção fenotípica na maturidade. Esses ciclos de cruzamento e seleção podem ser alcançados em um período de 2 a 2,5 anos (dependendo da planta), em comparação com muitos outros anos para o método de introgressão de retrocruzamento convencional agora em uso. Assim, a aplicação de MARTI usando PCR com uma sonda de polinucleotídeo reduz significativamente o tempo para introgressar a alteração genética da proteína quimérica em
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35/58 linhagens de elite para a produção de híbridos comerciais.
produto final é uma linhagem de plantas endocruzada quase idêntica (99%) à planta precursora endocruzada de elite original que é o homozigoto do polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica.
[0062] Os termos aproximadamente e cerca de referem-se a uma quantidade, um nível, um valor ou uma quantidade que varia em até 30%, ou em outra modalidade em até 20%, e em uma terceira modalidade em até 10% para uma quantidade, um nível, um valor ou uma quantidade de referência. Como usado neste documento, a forma singular um, uma e a e o incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo uma bactéria inclui uma única bactéria e uma pluralidade de bactérias.
[0063] Tendo descrito a invenção em termos gerais, abaixo são exemplos que ilustram a geração e a eficácia da invenção.
[0064] Com referência à figura 1, são identificados os locais de reconhecimento MopB e Lipopolissacarídeo na superfície da Xf gram-negativa.
[0065] Com referência agora à figura 5, uma proteína quimérica é ilustrada tendo um elemento de reconhecimento para atingir mopB e lipopolissacarídeo (LPS) na membrana da Xf. O elemento de reconhecimento pode ser localizado no terminal (N) amina da proteína quimérica ou no terminal (C) carboxi da quimera ou entre as mesmas. O elemento de reconhecimento é unido a uma defensina de uva (tionina) para formar a quimera. A defensina pode ser localizada no terminal amina ou no terminal carboxi ou em uma posição
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36/58 entre os mesmos e pode ser conectada ao elemento de reconhecimento por um ligante. 0 elemento de reconhecimento pode ser uma subtilisina que tem como alvo mopB, uma vez que possui maior atividade de divagem no mopB do que no HNE. Em uma modalidade, a subtilisina é um homólogo da planta que será tratado com a quimera e não de uma espécie diferente ou um homólogo humano. 0 elemento de reconhecimento também pode ser a proteina de aumento da permeabilidade bactericida (BPI)/proteína de ligação a lipopolissacarídeo (LBP). A BPI/LBP pode ser um homólogo da planta a ser tratada, por exemplo, uva com o elemento de reconhecimento tendo especificidade para LPS da Xf. Além de se ligar a LPS, a BPI/LBP pode aumentar a permeabilidade da quimera, aumentando assim a capacidade de formação de poros da membrana do elemento defensina ou lise. Em uma modalidade, no terminal amina existe uma sequência de sinalização que facilita a secreção da quimera no xilema (o local da colonização por Xf) . 0 ligante pode ser uma pluralidade de aminoácidos ou outro tipo de ligante. 0 ligante pode estar entre 2-10, 10-20, 20-40, 40-100 ou 100200 ou mais aminoácidos. Alternativamente, o ligante pode ser um ligante não aminoácido.
[0066] Com referência agora à Figura 2, dois tipos de quimeras de proteínas são ilustrados na estrutura da fita. O painel A ilustra uma quimera tendo defensina no terminal N e subtilisina no terminal C. O painel B ilustra uma quimera com subtilisina no terminal N e defensina no terminal C. Em uma modalidade, a subtilisina é um homólogo de uva que pertence à família subtilisina.
[0067] Com referência agora à Figura 3, é ilustrada uma
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37/58 estrutura de fita de uma proteína quimérica. 0 painel A ilustra uma quimera com defensina no terminal N e BPI/LBP no terminal C. 0 painel B ilustra uma quimera com BPI/LBP no terminal N e defensina no terminal C.
[0068] Com referência agora à Figura 4, a sequência de aminoácidos de quatro modalidades diferentes de proteínas quiméricas é ilustrada. Observe que, além das sequências da quimera ativa com elemento de reconhecimento, ligante e elemento de lise, a sequência sinal a montante também é incluída nessas modalidades. A sequência sinal facilita a secreção da quimera no xilema (o local da colonização de Xf) quando uma sequência de nucleotídeos que codifica a quimera é introduzida na planta. Em uma modalidade, o elemento de reconhecimento (BPI/LBP e subtilisina) e o elemento de lise (defensina) são escolhidos a partir do proteoma hospedeiro, por exemplo, o proteoma da uva. Espera-se que as proteínas quiméricas, como descritas neste documento, sejam mais ativas que as proteínas quiméricas HNE e Cecropina B de insetos descritas anteriormente. Um aspecto da utilização de um elemento de reconhecimento e um elemento de lise é prover uma proteína quimérica com pouca ou nenhuma toxicidade para a planta a ser tratada com a proteína quimérica, e também permitirá o melhoramento de cruzamento de plantas de precisão e cruzamento mediado por agrobacterium por CRISPR/CAS tornando assim a invenção mais cultivadora e favorável ao consumidor. Quando a sequência correspondente a uma tionina, subtilisina ou BPI/LBP está localizada no terminal amino da proteína quimérica, ela pode ser codificada como uma pró-proteína (pró-tionina ou pró-subtilisina ou pró-BPI/LBP) que pode conter uma
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38/58 sequência sinal de aminoácidos (o número exato de aminoácidos na sequência sinal pode variar de acordo com o organismo). A sequência do sinal auxilia no tráfego da proteina quimérica para o retículo endoplasmático ou uma vesícula celular. Não desejando estar ligado a uma hipótese particular, acredita-se que a sequência sinal é clivada pró-proteína antes, durante ou após a passagem da próproteína através da membrana lipídica para produzir proteína madura. Ver Romero et al., Eur. J. Biochem. 243:202-8 (1997). Quando tionina, subtilisina ou BPI/LBP está localizada no terminal carboxila da proteína quimérica, tionina, subtilisina ou BPI/LBP não contém uma sequência sinal de aminoácidos. No entanto, a proteína quimérica ainda pode conter uma sequência sinal de aminoácido no terminal amino da proteína quimérica, como descrito abaixo. A tionina (ou pró-tionina) pode ser uma tionina (ou pró-tionina) existente em uma planta (e mais especificamente em uma planta de uva), ou uma tionina otimizada (ou pró-tionina otimizada), como descrito abaixo. A subtilisina (ou pró-subtilisina) pode ser uma subtilisina (ou pró-subtilisina) que existe em uma planta (e mais especificamente em uma planta de uva), ou uma subtilisina otimizada (ou pró-subtilisina), como descrito abaixo. A BPI/LBP (ou pró-BPI/LBP) pode ser uma BPI/LBP (ou proBPI/LBP) existente em uma planta (e mais especificamente em uma planta de uva) ou uma BPI/LBP otimizada (ou pro BPI/LBP) como descrito abaixo. O ligante de peptídeo, pode ser um selecionado dentre as SEQ ID NOs: 17-23 e 27-28 ou uma variante do mesmo ou um ligante não aminoácido.
Tabela 3 Listagem de sequência
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| SEQ ID NO | ID | Nome | AA/nucleotídeo |
| 1 | XM_00228 0906.3 | Subtilisina stb6.1 ou subtilisina (vitis vinifera) 0 dominio do aminoácido 204-469 da proteina longa de aminoácido 1046 Sequência de Subtilisina *a partir de elastase neutrofilica de humano NM_00197 2,3 | 1 MTLGRRLACL FLACVLPALL LGGTALASER |
| GLWEKGYTGA KVKMAIFDTG IRANHPHFRN 61 IKERTNWTNE DTLNDNLGHG TFVAGVIAGQ YDECLGFAPD TEIYAFRVFT DAQVSYTSWF 121 LDAFNYAIAT NMDVLNLSIG GPDYLDLPFV EKVWELTANN IIMVSAIGND GPLYGTLNNP 181 ADQSDVIGVI DYGDHIASFS SRGMSTWEIP HGYGRVKPDV VAYGREIMGS SISANCKSLS 241 GTSVASPVVA GWCLLVSVI PEHDRKNILN PASMKQALVE GAARLPDANM YEQGAGR | |||
| 2 | XM_01065 4727.2 | Gama tionina (vitis vinifera) | 1 MERKSLGFFF FLLLILLASQ MVVPSEA |
| RVC ESQSHKFEGA CMGDHNCALV CRNEGFSGGK | |||
| 61 CKGLRRRCFC TKLCVFDEK | |||
| 3 | XP_00227 2020.1 | Dominio de BPI/LBP (vitis vinifera) | 1 MRPSVLVIFI AFLLFTPSQA HLKSTESSFI |
| SILISSQGLD FIKNLLITKA ISSLTPLQLP 61 QIKKSVKIPF LGRVDIAFSN ITIYHIDVSS SNIAPGDTGV AIIASGTTCN LSMNWHYSYN 121 TWFVPVEISD SGTAQVQVEG MEVGLTLGLE NREGSMKLSA KDCGCYVEDI SIKLDGGASW 181 LYQGVVDAFE EQIGSAVEST ITKKLKEGII KLDSFLQALP KEIPVDNIAS LNVTFVNDPL 241 LSNSSIGFDI NGLFT RANAT TLPKYYQNSR HPVSCTDPSK | |||
| 4 | TIonina-Ligante- BPI/LBP (vitis vinifera) | 1 MERKSLGFFF FLLLILLASQ MVVPSEA | |
| RVC ESQSHKFEGA CMGDHNCALV CRNEGFSGGK | |||
| CKGLRRRCFC TKLCVFDEK GSTAPPA SSQG LDFIKNLLIT KAISSLTPLQ LPQIKKSVKI PFL GR VDIAF SNI TI YHID V SSSNIAP GD T GVAIIASGTT CNLSMNWHYS YNTWFVPVEI SDSGTAQVQV EGMEVGLTLG LENREGSMKL SAKDCGCYVE DISIKLDGGA SWLYQGVVDA 241 FEEQIGSAVE STITKKLKEG IIKLDSFLQA LPKEIPVDNI ASLNVTFVND PLLSNSSIGF 301 DINGLFT | |||
| 5 | BPI/LBP-Ligante- Tionina (vitis vinifera) | 1 MRPSVLVIFI AFLLFTPSQA HLKSTESSFI | |
| SIEISSQGLD FIKNLLITKA ISSLTPLQLP 61 QIKKSVKIPF LGRVDIAFSN ITIYHIDVSS SNIAPGDTGV AlIASGTTCN LSMNWHYSYN 121 TWFVPVEISD SGTAQVQVEG MEVGLTLGLE NREGSMKLSA KDCGCYVEDI SIKLDGGASW 181 LYQGVVDAFE EQIGSAVEST ITKKLKEGII KLDSFLQALP KEIPVDNIAS LNVTFVNDPL 241 LSNSSIGFDI NGLFT RANAT TLPKYYQNSR HPVSCTDPSK RVCESQSHKF EGACMGDHNC 301 ALVCRNEGFS GGKCKGLRRR CFCTKLC | |||
| VFDEK | |||
| 6 | Tionina-LiganteSubtilisina (vitis vinifera) | 1 MERKSLGFFF FLLLILLASQ MWPSEARVC ESQSHKFEGA CMGDHNCALV | |
| CRNEGFSGGK |
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| 61 CKGLRRRCFC TKLCVFDEKG STAPPA | |||
| RGLW EKGYTGAKVK MAIFDTGIRA NHPHFRNIKE RTNWTNEDTL NDNLGHGTFV AGVIAGQYDE CLGFAPDTEI YAFRVFTDAQ VSYTSWFLDA FNYAIATNMD VLNLSIGGPD YLDLPFVEKV WELTANNIIM VSAIGNDGPL YGTLNNPADQ SDVIGVIDYG DHIASFSSRG MSTWEIPHGY GRVKPDVVAY GREIMGSSIS ANCKSLSGTS VASPVVAGVV CLLVSVIPEH DRKNILNPAS MKQALVEGAA RLPDANMYEQ GAGR | |||
| 7 | Subtilisina-LiganteTionina (vi tis vlnlfera) | 1 MTLGRRLACL FLACVLPALL LGGTALASER | |
| GLWEKGYTGA KVKMAIFDTG IRANHPHFRN 61 IKERTNWTNE DTLNDNLGHG TFVAGVIAGQ YDECLGFAPD TEIYAFRVFT DAQVSYTSWF 121 LDAFNYAIAT NMDVLNLSIG GPDYLDLPFV EKVWELTANN IIMVSAIGND GPLYGTLNNP 181 ADQSDVIGVI DYGDHIASFS SRGMSTWEIP HGYGRVKPDV VAYGREIMGS SISANCKSLS 241 GTSVASPWA GWCLLVSVI PEHDRKNILN PASMKQALVE GAARLPDANM YEQGAGRGST 301 APP AR VCESQ SHKFEGACMG | |||
| DHNCALVCRN EGFSGGKCKG LRRRCFCTKL | |||
| CVFDEK | |||
| 8 | FN595233 | Domínio de Subtilisina (ou subtilase) (que mostra 27% de identidade com a sequência 1) a partir de Proteína longa de aminoácido 822 (vitis vlnlfera) | 1 MIYAFRITLI YTYSNSINGF SASLTLSELE |
| ALKKSPGYLS STPDQF | |||
| 47 VQPH TTRSHEFLGL 61 RRGSGAWTAS NYGNGVIIGL VDSGIWPESA SFKDEGMGKP PPRWKGACVA DANFTSSMCN 121 NKIIGARYYN RGFLAKYPDE TISMNSSRDS EGHGTHTSST AAGAFVEGVS YFGYANGTAA 181 GMAPRAWIAV YKAIWSGRIA QSDALAAIDQ AIEDGVDILS LSFSFGNNSL NLNPISIACF 241 TAMEKGIFVA ASAGNDGNAF GTLSNGEPWV TTVGAEMGTK PAPMVDIYSS RGPFIQCPNV 301 LKPDILAPGT SVLAAWPSNT PVSDNFYHQW YSDFNVLSGT SMATAHVAGV AALVKAVHPN 361 WSPAAIRSAL MTTANTLDNT | |||
| 9 | XM_00227 4317 3 55% de identida de com a sequência 2 | Gama tionina (vitis vlnlfera) | 1 MKGSQRLFSA FLLVILLFMA TEMGPMVAEA |
| RTCESQSHRF KGTCVRQSNC AAVCQTEGFH 61 GGNCRGFRRR CFCTKHC | |||
| 10 | XM_00226 3344 4 64% de identida de com a sequência 2 | Gama tionina (vitis vlnlfera) | 1 MKHLEDLKFK KKKMTKKKEE AMEKKSPLGL |
| TFLLLLLLMA SQETEA RLCE SQSHWFRGVC 61 VSNHNCAWC RNEHFVGGRC RGFRRRCFCT | |||
| RNC | |||
| 11 | XM_00227 7107 4 59% de identida de com a sequência 3 | Domínio de BPI/LBP (vitis vlnlfera) | 1 MGLSSNLMAP AAFFIVLALF SVP TDAQIKS DEGFISVFIS SKGLGFVKDL LMHKAVSSLT 61 PIEIQPIEKI VKIPLVGQVD ILLSNITILS VGVGTSYVSS GGAGWIVAS GGTANMSMNW 121 KYSYDTWLFP ISDKGAASVL VEGMAMELTL GLKDQNGTLS LSLLDWGCFV KDIFVKLDGG 181 ATWFYQGLVD AFKEQIASAV EDSVSKRIRE GIIKLDSLLQ SVPKEIPVDH VAALNVTFVK |
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| 241 DPVSSNSSID FEINGLFT AK DGIPAPTNYH KKHRAPVSCT GPAKM | |||
| 12 | XM_00227 7107 4 59% de identida de com a sequência 3 | Domínio de BPI/LBP (vitis vinifera) | 1 MGLSSNLMAP AAFFIVLALF SVP TDAQIKS DEGFISVFIS SKGLGFVKDL LMHKAVSSLT 61 PIEIQPIEKI VKIPLVGQVD ILLSNITILS VGVGTSYVSS GGAGWIVAS GGTANMSMNW 121 KYSYDTWLFP ISDKGAASVL VEGMAMELTL GLKDQNGTLS LSLLDWGCFV KDIFVKLDGG 181 ATWFYQGLVD AFKEQIASAV EDSVSKRIRE GIIKLDSLLQ SVPKEIPVDH VAALNVTFVK 241 DPVSSNSSID FEINGLFT |
| 13 | Subtilisina endógena stb6.1 ou subtilisina (vitis vinifera) | 1 MVASRSSFAY YFLLVLVSFC LLRLGDRINY ETLTLTPPRT | |
| 14 | (XM 0022 80906.3) | Subtilisina stb6.1 ou subtilisina (vitis vinifera) | 1 GLWEKGYTGA KVKMAIFDTG IRANHPHFRN 61 IKERTNWTNE DTLNDNLGHG TFVAGVIAGQ YDECLGFAPD TEIYAFRVFT DAQVSYTSWF 121 LDAFNYAIAT NMDVLNLSIG GPDYLDLPFV EKVWELTANN IIMVSAIGND GPLYGTLNNP 181 ADQSDVIGVI DYGDHIASFS SRGMSTWEIP HGYGRVKPDV VAYGREIMGS SISANCKSLS 241 GTSVASPWA GWCLLVSVI PEHDRKNILN PASMKQALVE GAARLPDANM YEQGAGR |
| 15 | XM_01065 4727 2 | Gama tionina (vitis vinifera) | 1 RVC ESQSHKFEGA CMGDHNCALV |
| CRNEGFSGGK 61 CKGLRRRCFC TKLCVFDEK | |||
| 16 | XP_00227 2020.1 | BPI/LBP (vitis vinifera) | 1 SSQG LDFIKNLLIT KAISSLTPLQ LPQIKKSVKI PFL GR VDIAF SNI TI YHID V SSSNIAP GD T GVAIIASGTT CNLSMNWHYS YNTWFVPVEI SDSGTAQVQV EGMEVGLTLG LENREGSMKL SAKDCGCYVE DISIKLDGGA SWLYQGVVDA 241 FEEQIGSAVE STITKKLKEG IIKLDSFLQA LPKEIPVDNI ASLNVTFVND PLLSNSSIGF 301 DINGLFT |
| 17 | Ligante | AKDGIPAPTNYHKKHRAPVSCTGPAKM | |
| 18 | Ligante | GSTAPPA | |
| 19 | Ligante | RANATTLPKYYQNSRHPVSCTDPSK | |
| Ligante | RW | ||
| Ligante | 3RD | ||
| 20 | Ligante | GSTAPPAGSTAPPA | |
| 21 | Ligante | QASHTCVCEFNCAPL | |
| 22 | Ligante | ARKKASIPNYYNSNLQPPVF CSDQSKM | |
| 23 | Ligante | YEQGAGRGSTAPPA | |
| 27 | Ligante | GSTA | |
| 28 | Ligante | GGGSGGGTDGR | |
| 24 | Sequência Signal | MVASRSSFAY YFLLVLVSFC LLRLGDRINY | |
| ETLTLTPPRT | |||
| 25 | Sequência Signal | MGKHHVTLCC WFAVLCLAS SLAQA | |
| 26 | Sequência Signal | MELKFSTFLSLTLLFSSVLNPALS | |
| 29 | Sequência Artificial | VFDEK | |
| 30 | BPI/LBP_Tionina Proteína quimérica | SQGLD FIKNLLITKA ISSLTPLQLPQIKKSVKIPF LGRVDIAFSN ITIYHIDVSS SNIAPGDTGV AIIASGTTCN |
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| madura desprovida de sequência sinal | LSMNWHYSYNTWFVPVEISD SGTAQVQVEG MEVGLTLGLE NREGSMKLSA KDCGCYVEDI SIKLDGGASWLYQGVVDAFE EQIGSAVEST ITKKLKEGII KLDSFLQALP KEIPVDNIAS LNVTFVNDPL LSNSSIGFDI NGLFTRANAT TLPKYYQNSRHPVSCTDPSK RVCESQSHKF EGACMGDHNCALVCRNEGFS GGKCKGLRRR | ||
| CFCTKLCVFD EK | |||
| 31 | Tionina_BPI/LBP Proteina quimérica madura desprovida de sequência sinal | RVC ESQSHKFEGA CMGDHNCALV CRNEGFSGGK | |
| CKGLRRRCFC TKLCVFDEKG STAPPASSQG LDFIKNLLIT KAISSLTPLQ LPQIKKS VKIPFL GR VDIAFSNITI YHID VSSSNI APGDTGVAII ASGTTCNLSM NWHYSYNTWF VPVEISDSGTAQVQVEGMEVGLTLGLENRE GSMKLSAKDC GCYVEDISIK LDGGASWLYQ GWDAFEEQIGSAVESTITK KLKEGIIKLD SFLQALPKEI PVDNIASLNV TFVNDPLLSN SSIGFDINGL | |||
| 32 | Tionina_Subtillsina Proteina quimérica madura desprovida de sequência sinal | RVC ESQSHKFEGA CMGDHNCALV CRNEGFSGGK | |
| CKGLRRRCFC TKLCVFDEKG | |||
| STAPPARGLWEKGYT GAKVKMAIFD TGIRANHPHF RNIKERTNWT NEDTLNDNLG HGTFVAGVIA GQYDECLGFA PDTEIYAFRV FTDAQVSYTS WFLDAFNYAI ATNMDVLNLS IGGPDYLDLP FVEKVWELTA NNIIMVSAIG NDGPLYGTLN NPADQSDVIG VIDYGDHIAS FSSRGMSTWE IPHGYGRVKP DWAYGREIM GSSISANCKS LSGTSVASPV VAGWCLLVS VIPEHDRKNI LNPASMKQAL VEGAARLPDA NMYEQGAGR | |||
| 33 | Subtilisina_Tionina Proteina quimérica madura desprovida de sequência sinal | 1 GLWEKGYTGA KVKMAIFDTG IRANHPHFRN IKERTNWTNE DTLNDNLGHG TFVAGVIAGQ YDECLGFAPD TEIYAFRVFT DAQVSYTSWF LDAFNYAIAT NMDVLNLSIG GPDYLDLPFV EKVWELTANN IIMVSAIGND GPLYGTLNNP ADQSDVIGVI DYGDHIASFS SRGMSTWEIP HGYGRVKPDV VAYGREIMGS SISANCKSLS GTSVASPWA GVVCLLVSVI PEHDRKNILN PASMKQALVE GAARLPDANM YEQGAGRGST APPARVCESQ SHKFEGACMG DHNCALVCRN | |
| EGFSGGKCKG LRRRCFCTKL CVFDEK | |||
| 34 | Uva: BPI/LBP | 1 MRPSVLVIFI AFLLFTPSQA HLKSTESSFI | |
| SIEISSQGLD FIKNLLITKA ISSLTPLQLP 61 QIKKSVKIPF LGRVDIAFSN ITIYHIDVSS SNIAPGDTGV AIIASGTTCN LSMNWHYSYN 121 TWFVPVEISD SGTAQVQVEG MEVGLTLGLE NREGSMKLSA KDCGCYVEDI SIKLDGGASW 181 LYQGVVDAFE EQIGSAVEST ITKKLKEGII KLDSFLQALP KEIPVDNIAS LNVTFVNDPL 241 LSNSSIGFDI NGLFT | |||
| 35 | Uva: Tionina | 1 MERKSLGFFF FLLLILLASQ MWPSEARVC | |
| ESQSHKFEGA CMGDHNCALV CRNEGFSGGK | |||
| 61 CKGLRRRCFC TKLCVFDEK | |||
| 36 | Uva: Subtilisina | 1 MTLGRRLACL FLACVLPALL LGGTALASER GLWEKGYTGA KVKMAIFDTG IRANHPHFRN 61 IKERTNWTNE DTLNDNLGHG TFVAGVIAGQ YDECLGFAPD TEIYAFRVFT DAQVSYTSWF 121 LDAFNYAIAT NMDVLNLSIG GPDYLDLPFV EKVWELTANN IIMVSAIGND GPLYGTLNNP |
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181
SRGMSTWEIP
SISANCKSLS
241
PEHDRKNILN
YEQGAGR
ADQSDVIGVI HGYGRVKPDV
GTSVASPWA
PASMKQALVE
DYGDHIASFS
VAYGREIMGS
GWCLLVSVI
GAARLPDANM
Legenda da tabela: Para sequências de peptídeos quiméricas, itálico indica BPI/LBP ou subtilisina/subtilisina; negrito indica ligante; itálico sublinhado em negrito indica Tionina e sublinhado indica sequência sinal.
[0069] A proteína quimérica de uma modalidade da presente invenção pode ser produzida usando qualquer um de vários sistemas para obter as quantidades desejadas da proteína. Existem muitos sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. (Ver, por exemplo, Gene Expression Systems, Fernandes e Hoeffler, Eds. Academic Press, 1999; Ausubel, supra.). Tipicamente, o polinucleotídeo que codifica a quimera ou componente da mesma é colocado sob o controle de um promotor que é funcional na célula hospedeira desejada. Uma variedade extremamente ampla de promotores está disponível, e pode ser usada nos vetores de expressão da invenção, dependendo da aplicação específica. Normalmente, o promotor selecionado depende da célula na qual o promotor deve estar ativo. Outras sequências de controle de expressão, tais como, locais de ligação a ribossomo, locais de terminação da transcrição e similares, também estão opcionalmente incluídas. As construções que incluem uma ou mais dessas sequências de controle são denominadas cassetes de expressão ou construções. Por conseguinte, os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos unidos são incorporados para expressão de alto nível em uma célula hospedeira desejada.
[0070] A produção de CHAMPs como proteínas secretadas
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44/58 em sistemas de expressão de plantas, insetos e mamíferos é geralmente preferida, uma vez que os componentes ativos da quimera normalmente requerem várias modificações póstraducionais para produzir polipeptídeos biologicamente ativos corretamente dobrados. Em particular, considerando que as defensinas contêm até quatro pontes dissulfeto necessárias para a atividade funcional, e os SRDs podem conter locais de glicosilação e ligações dissulfeto, é preferível a expressão de quimeras SRD/defensina como proteínas secretadas, a fim de aproveitar a integridade estrutural robusta processada por essas modificações póstraducionais.
[0071] Por exemplo, as células de inseto possuem uma via secretora compartimentalizada na qual proteínas recémsintetizadas que portam uma sequência sinal N-terminal transitam do retículo endoplasmático (ER), para o aparelho de Golgi e, finalmente, para a superfície celular através de intermediários vesiculares. Os compartimentos da via secretora contêm ambientes especializados que intensificam a capacidade das proteínas que passam por se dobrarem corretamente e assumem uma conformação estável. Por exemplo, o ER suporta um ambiente oxidante que catalisa a formação de ligação dissulfeto, e o aparelho de ER e Golgi contêm enzimas de glicosilação que ligam as cadeias de oligossacarídeos a proteínas secretórias para conferir estabilidade e solubilidade. Em geral, as proteínas secretadas recebem essas modificações como uma forma de estabilizar a estrutura da proteína no ambiente mais severo da superfície celular, na presença de proteases extracelulares e alterações de pH. Um exemplo de um sistema
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45/58 de expressão de insetos que pode ser usado para expressar as quimeras da invenção é um sistema de expressão de baculovírus (ver abaixo). 0 uso de um sistema de expressão de baculovírus para expressar um protótipo de quimera de
SRD/defensina é ilustrado no Exemplo 3, infra.
[0072] Para ilustrar, as quimeras podem ser expressadas em um sistema de baculovírus da seguinte maneira. Resumidamente, o DNA que expressa uma quimera é clonado em uma forma modificada do vetor de transferência de Baculovírus pAcGP67B (Pharmingen, San Diego, Califórnia). Este plasmídeo contém a sequência sinal para gp67, uma abundante glicoproteína da superfície do envelope no virus de poliedrose nuclear de Autographa Californica (AcNPV) que é essencial para a entrada de partículas de Baculovírus nas células de insetos alvo. A inserção do gene da quimera neste vetor produzirá a expressão de uma fusão do peptídeo sinal gp67 com a quimera, sob o controle do forte promotor da poliedrina do Baculovírus. O peptídeo sinal direcionará toda a proteína através da via secretora para a superfície celular, em que o peptídeo sinal é clivado e a proteína quimérica pode ser purificada a partir do sobrenadante celular.
[0073] O vetor de transferência de baculovírus pAcGP67B pode ser modificado através da inserção de um epítopo myc e 6 vezes. Sua etiqueta na extremidade 3' da região de clonagem múltipla para fins de identificação e purificação (pAcGP67B-MH). Os genes quiméricos inseridos na pAcGP67B-MH podem ser co-transf ectados com o DNA de Baculogold em células Sf21 usando o kit de transfecção Baculogold (Pharmingen). Os vírus recombinantes formados por
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46/58 recombinação homóloga são amplificados, e a proteína purificada a partir de uma amplificação final em células High Five (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia), derivada de homogeneizados de óvulos de Trichoplusia ni. Demonstrou-se que as células High Five são capazes de expressar níveis significativamente mais altos de proteínas recombinantes secretadas em comparação com as células de inseto Sf9 e Sf21.
[0074] Vários sistemas de expressão de plantas transgênicas também podem ser utilizados para a geração das proteínas quiméricas da invenção, incluindo, sem limitação, sistemas de plantas de tabaco e batata (por exemplo, ver Mason et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 93: 53355340) .
[0075] Opcionalmente, um biorreator pode ser empregado, tal como o biorreator CELLine 350 (Integra Biosciences). Esse biorreator particular provê a cultura de células de planta dentro de uma câmara retangular de volume relativamente baixo (5 ml), delimitada por uma membrana permeável a oxigênio em um lado, e uma membrana de corte de peso molecular impermeável a proteínas de 10 kD no outro lado, separando o compartimento celular do reservatório de meio de nutrientes maior (350 ml) . O uso desse biorreator permite o monitoramento simples das concentrações de proteínas na câmara celular, em função do tempo, e a caracterização simples das proteínas secretadas no meio usando SDS-PAGE. Assim, esses biorreatores também facilitam a expressão de proteínas heterólogas em sistemas de expressão de plantas. Vários outros sistemas de biorreator e de cultura em suspensão podem ser empregados. Ver, por
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47/58 exemplo, Decendit et al., 1996, Biotechnol. Lett. 18: 659662 .
Geração de Plantas Transgênicas Resistentes a Xf:
[0076] Os genes que codificam as quimeras anti-Xf da invenção podem ser introduzidos nas videiras usando vários tipos de abordagens de transformação desenvolvidas para a geração de plantas transgênicas (ver, por exemplo, Szankowski et al., 2003 Plant Cell Rep. 22: 141-149) .
Técnicas de transformação padrão, tais como, transformação mediada por Agrobacterium, bombardeio de partículas, microinjeção e eletroporação podem ser utilizadas para construir plantas transgênicas transformadas de maneira estável (Hiatt et al., 1989, Nature 342: 76-78) . Além disso, vírus recombinantes que infectam plantas de videira podem ser usados para expressar a proteína quimérica heteróloga de interesse durante a replicação viral no hospedeiro infectado (ver, por exemplo, Kumagai et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90: 427-430).
[0077] São conhecidos vetores capazes de facilitar a expressão de um transgene em células embriogênicas de plantas de videira, vários dos quais são mostrados na Figura 9 a título ilustrativo, não limitativa (ver, por exemplo, Verch et al., 2004, Cancer Immunol. Immunother. 53: 92-99; Verch et al., 1998, J. Immunol. Methods 220: 6975; Mason et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 93: 5335-5340). Ver também Szankowski et al., 2003, Plant Cell Rep. 22: 141-149.
[0078] Como mostrado pelos resultados do estudo descrito no Exemplo 4, supra, as plantas de uva transgênicas que expressam uma proteína de teste no xilema
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48/58 da planta podem ser geradas usando metodologias padrão. Em uma modalidade, a informação genética necessária para expressar uma quimera anti-Xf pode ser introduzida nas células embrionárias da videira para gerar videiras transgênicas que expressam a quimera usando metodologias transgênicas padrão. Em modalidades preferidas, o DNA que codifica a quimera é fundido com uma sequência de direcionamento do xilema ou um peptídeo líder de secreção a partir de uma proteína ou precursor de planta expressada(o) no xilema. Em vista do sucesso alcançado com a proteína de teste, PGIP de pera (ver Exemplo 4, supra), uma modalidade específica utiliza o peptídeo líder de secreção de PGIP: MELKFSTFLSLTLLFSSVLNPALS (SEQ ID NO. 26).
[0079] Um outro exemplo de um líder de secreção que pode ser empregado é o líder de alfa-amilase do arroz: MGKHHVTLCC WFAVLCLAS SLAQA (SEQ ID NO. 25).
[0080] Como é conhecido na técnica, diferentes organismos utilizam, de preferência, diferentes códons para gerar polipeptídeos. Tais preferências de uso de códons podem ser usadas no projeto de moléculas de ácido nucleico que codificam as quimeras da invenção, a fim de otimizar a expressão em um sistema de células hospedeiras particular.
[0081] Uma outra modalidade prevê o tratamento de plantas infectadas com proteína quimérica tópica, como descrito neste documento. A sequência sinal no terminal N não estará presente na proteína quimérica para uso tópico. O tratamento tópico limpará Xf das plantas infectadas de acordo com uma modalidade. A capacidade de produzir as quimeras em larga escala também permitirá a dispensação tópica para curar videiras já infectadas com Xf e bloquear
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PD. Também há a capacidade de melhorar adicionalmente a atividade de quimeras (BPI/LBP e defensina) e (subtilisina e defensina).
Tratamento da doença de Pierce:
[0082] As quimeras anti-Xylella fastidiosa da invenção podem ser usadas para o tratamento da Doença de Pierce em videiras. As quimeras candidatas podem ser inicialmente avaliadas usando ensaios de sobrevivência celular capazes de avaliar a morte de Xf. As quimeras que mostram atividade em tais sistemas de ensaio in vitro podem ser adicionalmente avaliadas em sistemas de ensaio de plantas. As quimeras que demonstram a morte de Xf nesses sistemas podem ser usadas para o tratamento terapêutico de videiras sintomáticas ou assintomáticas ou para o tratamento profilático de videiras expostas a Xf ou com risco de serem expostas a Xf.
[0083] Para tratamento terapêutico, uma quimera de antipatógenos (por exemplo, uma quimera anti-Xf) é administrada à planta afetada de uma maneira que permita que a quimera tenha acesso ao xilema, onde as colônias de Xf estão localizadas. Por conseguinte, a quimera pode ser administrada diretamente ao sistema do xilema, por exemplo, via microinjeção na planta (por exemplo, caule, pecíolo, tronco). Em uma modalidade, a composição de quimera anti-Xf é injetada diretamente em uma videira infectada, em uma modalidade através de um orifício tamponado de aproximadamente 0,5 cm perfurado na vinha, através do qual uma seringa contendo a composição pode ser inserida para dispensar a composição ao xilema.
[0084] Em uma modalidade, um método de tratamento da
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Doença de Pierce em uma planta de Vitus vinifera infectada com Xf, compreende pulverizar a planta de Vitus vinifera com uma composição aderente contendo uma quimera anti-Xf. São conhecidas várias composições aderentes, e tipicamente são formuladas em liquido para facilitar a aplicação com um pulverizador. Pós aderentes ou semilíquidos também podem ser empregados. Uma modalidade relacionada é um método para impedir o desenvolvimento da Doença de Pierce em uma planta de Vitus vinifera, e compreende pulverizar a planta de Vitus vinifera com uma composição aderente contendo uma quimera anti-Xf.
[0085] Alternativamente, um gene expressável que codifica a quimera pode ser introduzido em um virus de planta capaz de infectar plantas de videira, e o virus recombinante usado para infectar a planta, resultando na expressão da quimera na planta. Em tais aplicações, o uso de sinais secretores do xilema pode ser usado para direcionar o produto quimera para o xilema da planta infectado.
[0086] A quimera também pode ser administrada à planta através do sistema radicular, a fim de obter administração sistêmica e acesso às câmaras do xilema primário. De forma
| similar, a quimera pode | ser | administrada aos | troncos | de |
| videira, diretamente nas | câmaras do xilema primário, a | fim | ||
| de dispensar a quimera | ao | xilema a montante | em toda a | |
| planta. | ||||
| [0087] 0 tratamento | da | Doença de Pierce | usando | as |
quimeras da invenção também pode ter como alvo os vetores de insetos responsáveis pelo espalhamento da Doença de Pierce. Neste aspecto da invenção, quimeras anti-Xf são
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51/58 introduzidas no próprio vetor de inseto, de modo que a quimera possa matar as colônias de Xf que residem no inseto, inibindo assim o espalhamento adicional do patógeno. Em uma modalidade, plantas suscetíveis à alimentação por um inseto vetor Xf (por exemplo, atirador de asas vítreo) são pulverizadas com uma composição que compreende a quimera e um carreador capaz de aderir à superfície das plantas de videira. Quando o inseto vetor se alimenta da planta tratada, parte da composição é ingerida pelo inseto e injetada na planta. Com efeito, o inseto assim medeia a injeção da composição na seiva do xilema da planta à medida que se alimenta da planta. Por conseguinte, a composição antimicrobiana tem então a oportunidade de inibir o desenvolvimento de colônias Xf na planta recéminfectada matando bactérias no local de inserção da alimentação. Além disso, a ingestão da composição pelo inseto também oferece uma oportunidade de ter como alvo e matar colônias Xf residentes no inseto vetor, inibindo assim o espalhamento adicional.
[0088] São contempladas variações desta abordagem. Por exemplo, uma composição compreendendo uma quimera anti-Xf de uma modalidade da presente invenção, uma fonte de alimento para insetos e/ou um atrativo biológico ou químico de insetos pode ser colocada localmente em regiões em risco de, ou conhecidas por serem suscetíveis a, Xf de vetor de insetos (por exemplo, vinhas, bosques). Em uma modalidade, tal composição compreende uma quimera anti-Xf solubilizada em solução de sacarose. Em outra modalidade, tal composição compreende uma quimera anti-Xf solubilizada ou em suspensão em uma seiva ou solução contendo seiva, de preferência
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52/58 usando seiva das fontes naturais de alimentos do vetor de inseto. A composição pode ser exposta ao vetor de insetos de várias maneiras, incluindo por exemplo, colocar vasos alimentadores apropriados em vinhedos suscetíveis, áreas de cultivo adjacentes, bosques habitados ou em habitats de reprodução. Nesse sentido, o atirador de asas vitreas habita pomares de citrinos e abacate e alguns ornamentais amadeirados em números extraordinariamente altos. Em risco imediato, há vinhedos perto de pomares de citrinos.
[0089] Além do tratamento de infecções por Xf estabelecidas, doenças causadas por Xf podem ser prevenidas ou inibidas usando as quimeras da invenção em uma abordagem de tratamento profilático, usando os mesmos métodos ou métodos semelhantes aos descritos acima. Em uma abordagem, por exemplo, plantas que não são suscetíveis à infecção por Xf e/ou doença causada por Xf, mas que são usadas pelos vetores de insetos Xf para reproduzir ou alimentar, podem ser pulverizadas com uma composição contendo uma quimera anti-Xf da invenção. Os vetores de insetos que se alimentam dessas plantas, por exemplo, ingerem a composição, que está disponível para matar Xf presente no vetor de insetos, impedindo assim o espalhamento de novas infecções para plantas suscetíveis ou carreadoras.
Exemplo 1 [0090] A proteinase K humana está muito bem caracterizada e a análise de divagem mostra que é mais ativa no Xf mopB do que no HNE. Os homólogos da proteainase K na uva pertencem à família das subtilisinas e possuem 43% de similaridade e sequência com a proteinase humana K. A protease do tipo subtilisina SBT6.1 de vitis vinifera com a
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53/58 sequência mostrada na Figura 4. Entre as defensinas da uva, os membros da família de gama tionina parecem ser mais eficazes em bactérias gram-negativas, como Xf. Foi escolhido um membro da família gama tionina como elemento/domínio da lise para a nossa quimera. Também adicionamos outra versão de tionina com VFDEK (SEQ ID NO. 29) adicionada no terminal C para aumentar a atividade e diminuir a toxicidade. Demonstrou-se que a proteína BPI/LBP humana tenha atividades na membrana externa de bactérias gram-negativas. Os membros da família BPI/LBP de uva têm estruturas de domínio semelhantes ao homólogo humano e mostram 43% de similaridade de sequência. Inicialmente, foi escolhido um membro da família BPI/LBP para nossa quimera. Vários tipos de ligantes são escolhidos: por exemplo, um ligante GSTAPPA sintético (SEQ ID NO: 18) e outro ligante natural, RANATTLPKYYQNSRHPVSCTDPSK (SEQ ID NO: 19), que une os dois domínios semelhantes de BPI/LBP. 0 método com base em estrutura anteriormente desenvolvido por nós foi empregado para projetar a quimera usando domínio de reconhecimento, ligante e domínio de lise. As quimeras de proteína projetadas serão expressadas em sistemas eucarióticos pelos métodos desenvolvidos por nós. As quimeras de proteínas expressadas e purificadas serão testadas quanto às suas atividades in vitro. Finalmente, as uvas transgênicas serão geradas usando transformação mediada por agrobacterium ou melhoramento de precisão pelo CRISPR/CAS.
[0091] Os exemplos precedentes podem ser repetidos com sucesso semelhante substituindo os reagentes descritos genericamente ou especificamente e/ou as condições de
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54/58 operação desta invenção pelos usados nos exemplos anteriores .
[0092] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com referência particular a exemplos, e a uma ou mais modalidades, outras modalidades podem alcançar os mesmos resultados. A identidade pode ser calculada por métodos conhecidos. Porcentagens de identidade ou homologia, como mencionado neste documento, são aquelas que podem ser calculadas com o programa Blast ou GAP, executado sob GCG (Genetics Computer Group Inc., Madison, Wis., EUA). Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appl. Matemática. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson e Lipman, Proc. Nat. Acad Sci. EUA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 23744, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; e Pearson et al., Meth Mol. Bio. 24: 307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990, apresenta uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequência e cálculos de
| homologia | Uma | proteina | quimérica | da | revelação | pode | ter | ||||
| cerca | de | 5%, . | cerca | de | 10%, | cerca | de | 15%, | cerca | de | 20%, |
| cerca | de | 25%, | cerca | de | 30%, | cerca | de | 35%, | cerca | de | 40%, |
| cerca | de | 45%, | cerca | de | 50%, | cerca | de | 55 %, | cerca | de | 60%, |
| cerca | de | 65%, | cerca | de | 70%, | cerca | de | 75%, | cerca | de | 80%, |
| cerca | de | 81%, | cerca | de | 82%, | cerca | de | 83%, | cerca | de | 84%, |
| cerca | de | 85%, | cerca | de | 85%, | cerca | de | 86%, | cerca | de | 87%, |
| cerca | de | 88%, | cerca | de | 89%, | cerca | de | 90%, | cerca | de | 91%, |
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| cerca | de | 92%, | cerca de 93%, cerca de 94% | , cerca de | 95%, |
| cerca | de | 96%, | cerca de 97%, cerca de 98%, | cerca de 99 | % ou |
| cerca | de | 100% | de homologia de sequência de | aminoácidos | com |
pelo menos uma das SEQ ID Nos 4-7 e 30-33. Uma sequência que faz parte da proteina quimérica da revelação pode ter
| 5%, cerca | de 10%, cerca | de 15% | , cerca de | : 20%, | cerca | de | 25% | |||
| cerca | de | 30%, cerca | de | 35%, | cerca | de | 40%, | cerca | de | 45% |
| cerca | de | 50%, cerca | de | 55%, | cerca | de | 60%, | cerca | de | 65% |
| cerca | de | 70%, cerca | de | 75%, | cerca | de | 80%, | cerca | de | 81% |
| cerca | de | 82%, cerca | de | 83%, | cerca | de | 84%, | cerca | de | 85% |
| cerca | de | 86%, cerca | de | 87%, | cerca | de | 88%, | cerca | de | 89% |
| cerca | de | 90%, cerca | de | 91%, | cerca | de | 92%, | cerca | de | 93% |
| cerca | de | 94%, cerca | de | 95%, | cerca | de | 96%, | cerca | de | 97% |
cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% de homologia de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos subtilisina, BPI/LBP ou definsina, como revelado neste documento. Uma proteina quimérica expressada no hospedeiro pode ser madura e não incluir a sequência sinal.
[0093] As variações e modificações da presente invenção serão óbvias para os técnicos no assunto e pretende abranger nas reivindicações anexas todas essas modificações e equivalentes. As revelações completas de todas as referências, aplicativos, patentes e publicações citadas acima são incorporadas neste documento por referência.
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Claims (36)
- REIVINDICAÇÕES1. Proteína quimérica para tratamento de um hospedeiro infectado ou com risco de se infectar com um patógeno que causa doença no hospedeiro, a proteína quimérica caracterizada pelo fato de compreender:um elemento de reconhecimento e um elemento de lise conectados por um ligante, em que o elemento de reconhecimento se liga ao patógeno e o elemento de lise lisa o patógeno, e em que o elemento de reconhecimento é derivado de uma primeira proteína e o elemento de lise é derivado de uma segunda proteína, em que a primeira proteína e a segunda proteína são endógenas ao hospedeiro.
- 2. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o elemento de reconhecimento compreende uma sequência de subtilisina ou uma sequência com homologia com a mesma, ou uma sequência de aminoácidos de proteína que aumenta a permeabilidade bactericida (BPI)/proteína de ligação a lipopolissacarídeo (LBP) ou uma sequência com homologia com a mesma.
- 3. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o elemento de lise compreende uma sequência de aminoácidos definsina ou uma sequência com homologia com a mesma.
- 4. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o elemento de lise é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 9, 10, 15 e 35 ou uma sequência com homologia com as mesmas e o elemento de reconhecimento é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs 1, 3, 5, 8, 11, 12, 16, 34 e 36 ou uma sequência com homologia com as mesmas.Petição 870190094526, de 20/09/2019, pág. 8/152/7
- 5. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína quimérica tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 4, 5, 6, 7, 30, 31, 32 e 33 ou uma sequência de aminoácidos com homologia com as mesmas.
- 6. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante é uma sequência de aminoácidos de 1-50 aminoácidos de comprimento.
- 7. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ligante é selecionado do grupo que consiste em Arginina-Triptofano, Serina-ArgininaÁcido Aspártico, SEQ ID NOs 17-23 e 26-28 e sequências de aminoácidos tendo homologia com as mesmas.
- 8. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos .
9. Proteína quimérica, caracterizada pelo fato de acordo com a reivindicação 8, é de que o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor para produzir um vetor de expressão. 10. Proteína quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizada pelo fato de que a homologia da sequência de aminoácidos é 50% ou maior. - 11. Proteína quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizada pelo fato de que a homologia da sequência de aminoácidos é 60% ou maior.
- 12. Proteína quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizada pelo fato de que a homologia da sequência de aminoácidos é de 70% ou maior.Petição 870190094526, de 20/09/2019, pág. 9/153/7
- 13. Proteína quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizada pelo fato de que a homologia da sequência de aminoácidos é 80% ou maior.
- 14. Proteína quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizada pelo fato de que a homologia da sequência de aminoácidos é 90% ou maior.
- 15. Proteína quimérica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizada pelo fato de que a homologia da sequência de aminoácidos é de 95% ou maior.
- 16. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o hospedeiro é selecionado de uma planta, um animal ou um humano.
- 17. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de cultivo de produção.
- 18. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o elemento de reconhecimento tem afinidade de ligação específica a uma proteína da membrana externa, tal como mopB, na superfície do patógeno.
- 19. Planta geneticamente alterada ou parte da mesma e sua progênie, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 8, operacionalmente ligado a um promotor, em que a planta ou partes da mesma e sua progênie produzem a proteína quimérica.
- 20. Planta geneticamente alterada ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que sua progênie é uma semente da planta geneticamente alterada.Petição 870190094526, de 20/09/2019, pág. 10/154/Ί
- 21. Planta geneticamente alterada ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que suas partes são pólen da planta geneticamente alterada.
- 22. Planta geneticamente alterada ou parte da reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que suas partes são células de planta da planta geneticamente alterada que compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor, em que a célula de planta produz a proteína quimérica.
- 23. Planta geneticamente alterada ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a célula de planta forma uma cultura de tecidos.
- 24. Método para construir uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma com resistência aumentada à infecção por um patógeno em comparação com uma planta não geneticamente alterada ou parte da mesma, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:introduzir um polinucleotídeo que codifica uma proteína quimérica em uma planta ou parte da mesma para prover uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma, em que a proteína quimérica compreende um elemento de reconhecimento e um elemento de lise, em que o elemento de reconhecimento é derivado de uma primeira proteína e o elemento de lise é derivado de uma segunda proteína, em que a primeira proteína e a segunda proteína são nativas da planta na qual a proteína quimérica é introduzida, em que o elemento de reconhecimento se liga ao patógeno e o elemento de lise lisa o patógeno para produzir atividade antipatogênica; e selecionar uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma que expressa a proteína quimérica, em que aPetição 870190094526, de 20/09/2019, pág. 11/155/7 proteína quimérica expressada tem atividade antipatogênica;e em que a planta geneticamente alterada ou parte da mesma tem resistência aumentada a infecções por patógenos em comparação com a resistência a infecções por patógenos da planta não geneticamente alterada ou parte da mesma.
- 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a introdução do polinucleotídeo que codifica a proteína quimérica ocorre por introgressão ou transformação da planta com um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor.
- 26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o elemento de lise é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 9, 10, 15 e 35, ou uma sequência com homologia com as mesmas e o elemento de reconhecimento é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs 1, 3, 5, 8, 11, 12, 16, 34 e 36 ou uma sequência com homologia com as mesmas.
- 27. Método para intensificar uma resistência de uma planta do tipo selvagem a doenças bacterianas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:transformar uma célula da planta do tipo selvagem com um polinucleotídeo que codifica uma proteína quimérica para gerar uma célula da planta transformada; e desenvolver a célula de planta transformada para gerar uma planta geneticamente alterada, em que a proteína quimérica compreende um elemento de lise e um elemento de reconhecimento; em que o elemento de lise compreende uma tionina ou pró-tionina, e o elemento de reconhecimento compreende Proteinase K ou pró-Proteinase K; em que aPetição 870190094526, de 20/09/2019, pág. 12/156/Ί planta geneticamente alterada ou parte da mesma produz a proteína quimérica; e em que a proteína quimérica mata patógeno que causa as doenças por patógenos no hospedeiro; e em que a resistência da planta geneticamente alterada às doenças por patógenos é maior que a resistência da planta de tipo selvagem às doenças por patógenos.
- 28. Planta geneticamente modificada ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método conforme definido na reivindicação 24.
- 29. Planta geneticamente modificada ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método conforme definido na reivindicação 27.
- 30. Planta geneticamente modificada ou parte da mesma, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a planta é uma uva.
- 31. Vetor de expressão para transformação mediada por agrobacterium, caracterizada pelo fato de usar o polinucleotideo conforme definido na reivindicação 8.
- 32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína quimérica, conforme definida na reivindicação 1, para uso como um tratamento tópico de plantas em risco de infecção por Xylella fastidiosa (Xf) .
- 33. Método para tratar plantas em risco de infecção por Xf, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:aplicar a composição como definida na reivindicação 32 às plantas em risco de infecção por Xf.
- 34. Método de tratamento de uma planta de cultivo de produção em risco de ser infectado por um patógeno que prejudicará a planta de cultivo de produção, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:Petição 870190094526, de 20/09/2019, pág. 13/157/7 aplicar topicamente uma proteína quimérica, conforme definida na reivindicação 1, à planta de produção em risco de ser infectada.
- 35. Método de tratamento de uma planta de cultivo de produção que está em risco de ser infectada por um patógeno que prejudicará a planta de cultivo de produção, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:introduzir uma sequência que codifica uma proteína quimérica, conforme definida na reivindicação 1, para a planta de cultivo de produção em risco de ser infectada.
- 36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a introdução de uma sequência que codifica a proteína quimérica inclui cultivares porta-enxerto e cultivares de enxerto.
- 37. Método para conferir resistência a uma doença pa cultivares porta-enxerto de cultivo de produção ou cultivares de enxerto de cultivo de produção, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:transformar cultivares porta-enxerto de cultivo de produção ou cultivares de enxerto de cultivo de produção com uma sequência que codifica a proteína quimérica conforme definida na reivindicação 1.
- 38. Cultivares porta-enxerto de cultivo de produção transgênicos ou cultivares de enxerto de cultivo de produção transgênicos, caracterizados pelo fato de serem transformados com um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína quimérica conforme definida na reivindicação 1.
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