BR102016025433A2

BR102016025433A2 - moléculas de ácido nucleico rab5 que conferem resistência às pragas coleópteras e hemípteras

Info

Publication number: BR102016025433A2
Application number: BR102016025433-7A
Authority: BR
Inventors: Kenneth E. Narva; Elane Fishilevich; Murugesan Rangasamy; Meghan Frey; Wendy LO; Sarah E. Worden; Premchand GANDRA
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2019-02-05
Also published as: UY36971A; US20180223308A1; CA3003131A1; AU2016350628A1; AR106544A1; EP3371296A1; WO2017079036A1; AU2016350628B2; EP3371296A4; TW201723177A; CN108350413A

Abstract

moléculas de ácido nucleico rab5 que conferem resistência às pragas coleópteras e hemípteras. esta revelação refere-se às moléculas de ácido nucleico e aos métodos de seu uso para o controle de pragas coleópteras através da inibição mediada pela interferência do rna das sequências alvo de codificação e não codificação transcritas nas pragas coleópteras. a revelação também refere-se aos métodos para a produção de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas coleópteras, as células vegetais e as plantas assim obtidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO RAB5 QUE CONFEREM RESISTÊNCIA ÀS PRAGAS COLEÓPTERAS E HEMÍPTERAS.

PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. No. de Série 62/249.463 depositado em 02 de novembro de 2015, cuja divulgação inteira é aqui incorporada por esta referência.

CAMPO TÉCNICO DA DIVULGAÇÃO [0002] A presente invenção refere-se de uma forma geral ao controle genético de danos nas plantas provocados por pragas coleópteras e/ou hemípteras. Nas formas de realização particulares, a presente divulgação refere-se à identificação das sequências alvos de codificação e não codificação, e o uso de tecnologias de DNA recombinante para pós-transcricionalmente reprimir ou inibir a expressão das sequências alvos de codificação e não codificação nas células de uma praga coleóptera e/ou hemíptera para fornecer um efeito protetor de planta.

FUNDAMENTOS [0003] A larva da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de larva da raiz do milho mais devastadores na América do Norte e é uma preocupação especial em áreas produtoras de milho do Meio-Oeste dos Estados Unidos. A larva da raiz do milho do norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie estritamente relacionada que co-habita em grande quantidade na mesma faixa como a WCR. Existem várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: a larva da raiz do milho mexicana (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a larva da raiz do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Manne

71/263

2/169 rheim. O United States Department of Agriculture estima que as larvas da raiz do milho provocam $ 1 bilhão em receitas perdidas a cada ano, incluindo $ 800 milhões em perda de produtividade e $ 200 milhões em custos de tratamento.

[0004] Os ovos tanto da WCR quanto da NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante o inverno. Os ovos são oblongos, brancos, e menores do que 0,004 polegadas (0,010 cm) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou início de junho, com o momento preciso de eclosão do ovo que varia de ano para ano devido às diferenças de temperatura e localização. As larvas recém-nascidas são larvas brancas que são menores do que 0,125 polegadas (00,3175 cm) de comprimento. Assim que chocadas, as larvas começam a se alimentar de raízes do milho. As larvas da raiz do milho passam por três estágios larvais. Após a alimentação durante várias semanas, as larvas mudam para o estágio de pupa. Elas entram em estado de pupa no solo, e depois surgem do solo como adultas em julho e agosto. As larvas da raiz adultas são ao redor de 0,25 polegadas (0,635 cm) de comprimento.

[0005] As larvas da raiz do milho completam o desenvolvimento no milho e em várias outras espécies de gramíneas. As larvas criadas no rabo da raposa amarelo surgem mais tarde e possuem um tamanho de cápsula superior menor como adultos do que as larvas criadas no milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634. As WCR adultas se alimentam da seda do milho, pólen e grãos nas pontas das espigas expostas. Se as WCR adultas surgirem antes que os tecidos reprodutivos do milho estejam presentes, elas podem alimentar-se do tecido da folha, atrasando assim o crescimento da planta e ocasionalmente matam a planta hospedeira. No entanto, os adultos irão mudar rapidamente para sedas e pólen preferidos quando eles se tornam disponíveis. As NCR adultas também se alimentam de tecidos repro

72/263

3/169 dutivos da planta de milho, mas ao contrário raramente se alimentam das folhas do milho.

[0006] A maior parte dos danos da larva da raiz no milho é provocada pela alimentação das larvas. As larvas da raiz recém-nascidas inicialmente se alimentam dos cabelos radiculares finos do milho e fazem toca nas extremidades da raiz. Quando as larvas crescem mais, elas se alimentam das raízes primárias e fazem toca nelas. Quando as larvas da raiz do milho são abundantes, a alimentação das larvas muitas vezes resulta na poda das raízes por todo o caminho até a base do caule do milho. A lesão grave da raiz interfere com a capacidade da raiz de transportar água e nutrientes para dentro da planta, reduz o crescimento da planta, e resulta na produção reduzida de grãos, reduzindo assim muitas vezes drasticamente o rendimento total. A lesão grave da raiz também muitas vezes resulta no alojamento das plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e ainda diminui o rendimento. Além disso, a alimentação de adultos nos tecidos reprodutivos do milho pode resultar na poda das sedas na ponta da espiga. Se este recorte de seda for grave o suficiente durante o derrame do pólen, a polinização pode ser interrompida.

[0007] O controle de larvas da raiz do milho pode ser obtido pela rotação de culturas, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva de formação de esporos, Bacillus thuringiensis), plantas transgênicas que expressam as toxinas Bt, ou uma combinação destes. A rotação de culturas sofre da desvantagem de colocar restrições indesejáveis após o uso de terras agrícolas. Além do mais, a oviposição de algumas espécies de larva da raiz pode ocorrer nos campos de cultura diferentes do milho ou a diapausa prolongada resulta na eclosão do ovo durante muito tempo, diminuindo assim a eficácia da rotação de culturas praticada com o milho e a soja.

[0008] Os inseticidas químicos são os mais expressivamente re

73/263

4/169 corridos da estratégia para se obter o controle da larva da raiz do milho. O uso de inseticida químico, de qualquer forma, é uma estratégia de controle de larva da raiz do milho imperfeita; mais de $ 1 bilhão pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano devido à larva da raiz do milho, quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano da larva da raiz que pode ocorrer não obstante ao uso dos inseticidas. Populações elevadas de larvas, as fortes chuvas e aplicação indevida dos inseticidas podem todos resultar no controle inadequado da larva da raiz do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar espécies de larva da raiz resistentes a inseticidas, assim como ressuscitar preocupações ambientais significativas devido à toxicidade de muitas delas para as espécies não alvo. [0009] Os percevejos (Hemíptera: Pentatomidae) compreendem outro complexo de praga agrícola importante. Em todo o mundo, mais de 50 espécies estritamente relacionadas de percevejos são conhecidas de provocar danos nas culturas. McPherson & McPherson, R.M. (2000) Stink bugs of economic importance in América north of México CRC Press. Estes insetos estão presentes em um grande número de culturas importantes, incluindo milho, soja, frutas, hortaliças e cereais. O percevejo marrom neotropical, Euschistus heros, o percevejo de faixa vermelha, Piezodorus guildinii, o percevejo marrom, Halyomorpha halys, e o percevejo verde do sul, Nezara virídula, são de particular interersse.

[0010] Os percevejos passam por vários estágios de ninfa antes de atingir a fase adulta. O tempo de desenvolvem a partir de ovos até adultos é ao redor de 30 a 40 dias. Várias gerações ocorrem em climas quentes o que resulta na pressão significativa de insetos.

[0011] Tanto as ninfas quanto os adultos se alimentam da seiva dos tecidos macios em que eles também injetam enzimas digestivas que provocam digestão e necrose do tecido extra-oral. A matéria vege

74/263

5/169 tal digerida e os nutrientes são depois ingeridos. A depleção de água e nutrientes do sistema vascular da planta resulta em danos nos tecidos vegetais. O dano ao desenvolvimento de grãos e sementes é o mais significativo quando a produção e germinação são significativamente reduzidas.

[0012] O atual controle dos percevejos conta com o tratamento de inseticida sobre uma base individual de campo. Portanto, estratégias de controle alternativas são urgentemente necessárias para minimizar as perdas progressivas de culturas.

[0013] A interferência de RNA (RNAi) é um processo que utiliza as vias celulares endógenas, por meio das quais uma molécula de RNA interferente (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para a totalidade, ou qualquer parte de tamanho adequado, de um gene alvo, resulta na degradação do mRNA assim codificado. Nos últimos anos, o RNAi foi utilizado para executar o silenciamento do gene em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, embriões de insetos e células na cultura de tecido. Ver, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747.

[0014] O RNAi executa a degradação do mRNA por meio de uma via endógena incluindo o complexo de proteína DICER. O DICER cliva as moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominados RNA de pequena interferência (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de filamento único: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado, e o filamento guia é incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). As moléculas de ácido micro ribonucléico (miRNA) podem ser similarmente incorporados no RISC. O silenciamento do gene pós-transcricional ocorre quando o filamento guia

75/263

6/169 se liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz a divagem por Argonaute, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido de se espalhar sistemicamente a todo o organismo, apesar das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA tais como plantas, nematóides, e alguns insetos.

[0015] Apenas os transcritos complementares para o siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados, e assim o silenciamento da expressão de mRNA é específica da sequência. Nas plantas, os vários grupos funcionais de genes DICER existem. O efeito de silenciamento do gene de RNAi persiste durante dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio na abundância do transcrito alvo de 90 % ou mais, com a consequente redução nos níveis da proteína correspondente. Em insetos, existem pelo menos dois genes DICER, onde DICER1 facilita a degradação direcionada pelo miRNA por Argonaute1. Lee et al. (2004) Cell 117 (1):69-81. DICER2 facilita a degradação direcionada pelo siRNA por Argonaute2.

[0016] A Patente U.S. N² 7.612.194 e as Publicações de Patente U.S. N— 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 divulgam uma biblioteca de 9112 seqüências de rótulo de sequência expressa (EST) isoladas de pupas de D. v. Virgifera LeConte. Sugere-se na Patente U.S. N² 7.612.194 e Publicação de Patente U.S. No. 2007/0050860 operativamente se ligar a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma das várias sequências parciais particulares de D. v. Virgifera tipo vacuolar H⁺-ATPase (V-ATPase) aqui divulgadas para a expressão de RNA antisentido nas células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere a ligação de maneira operável de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não divulgada (a sequência

76/263

7/169 parcial é mencionada de ser 58 % idêntica ao produto genético C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antisentido nas células vegetais. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere a ligação de maneira operável de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes de subunidade beta coatomer de D. v. virgifera para a expressão de RNA antisentido nas células vegetais. Além disso, a Patente U.S. N² 7.943.819 divulga uma biblioteca de 906 sequências de rótulo de sequência expressa (EST) isoladas de D. v. virgifera LeConte, larvas, pupas e intestinos intermediários dissecados e sugere a ligação de maneira operável de um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene da proteína 4b de corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão do RNA de filamento duplo nas células vegetais.

[0017] Nenhuma outra sugestão é fornecida na Patente U.S. N²7.612.194 e nas Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para o uso de qualquer sequência particular das mais do que nove mil sequências nelas listadas com relação à interferência de RNA, diferentes das várias sequências parciais particulares de V-ATPase e das sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma da Patente U.S. N² 7.612.194 e Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 fornece qualquer orientação a respeito de que outras das mais de nove mil sequências fornecidas seriam letais, ou mesmo de outra forma úteis, nas espécies de larva da raiz do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. N²7.943.819 não fornece nenhuma sugestão de uso de qualquer sequência particular das mais de novecentas sequências nela listadas com relação à interferência de RNA, diferente da sequência parcial

77/263

8/169 particular de um gene da proteína 4b de corpo multivesicular carregado. Além disso, a Patente U.S. N² 7.943.819 não fornece nenhuma orientação quanto as quais outras das mais de novecentas sequências fornecidas seriam letais, ou mesmo de outra forma úteis, nas espécies de larva da raiz do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. A Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2013/040173 e a Publicação de Pedido PCT No. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada de um gene Snf7 de Diabrotica virgifera para a interferência de RNA no milho. (Também divulgado em Bolognesi et al. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi:10.1371/journal.pone.0047534). [0018] A esmagadora maioria das sequências complementares para os DNAs da larva da raiz do milho (tal como a anterior) não é letal em espécies de larva da raiz do milho quando utilizada como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007 Nature Biotechnology 25:1322-1326) descrevem os efeitos de inibição dos vários alvos genéticos de WCR através do RNAi. Estes autores relataram que 8 dos 26 genes alvos que eles testaram não foram capazes de fornecer mortalidade da praga coleóptera experimentalmente significativa em uma concentração de iRNA muito elevada (por exemplo, dsRNA) de mais do que 520 ng/cm². Consequentemente, existe uma necessidade de descobrir e identificar novas sequências de iRNA (por exemplo, dsRNA) que eficazmente infra-regulam e inibem os genes em pragas de inseto para impedir que estas pragas de plantas infestem e destruam as culturas.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO [0019] Aqui divulgadas são as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs), e os seus métodos de uso, para o controle de pragas de inseto, incluindo, por exemplo, as pragas coleópteras, tais como D. v. virgifera LeConte (larva da raiz do milho ocidental, WCR); D. barberi

78/263

9/169

Smith and Lawrence (larva da raiz do milho do norte, NCR); D. u. howardi Barber (larva da raiz do milho do sul, SCR); D. v. zeae Krysan and Smith (larva da raiz do milho mexicana, MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella', D. speciosa Germar, e D. u. undecimpunctata Mannerheim; e pragas hemípteras, inluindo, por exemplo, Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo Marrom Neotropical, “BSB”); Nezara viridula (L.) (Percevejo Verde do Sul); Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo de faixas vermelhas); Halyomorpha halys (Stâl) (Percevejo Marrom); Chinavia hilare (Say) (Percevejo Verde); Euschistus servus (Say) (percevejo marrom); Dichelops melacanthus (DalIas); Dichelops furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor(F.) (Percevejo de Espáduas Vermelhas Neotropical); Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Besouro do Algodão); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (DalIas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Besouro de Planta Manchado Ocidental); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois). Nos exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico exemplares são divulgadas que podem ser homólogas a pelo menos uma parte de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0020] Nestes e outros exemplos, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene alvo, o produto do qual pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento de larvas/ninfas. Em alguns exemplos, a inibição pós-transcricional da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo um homólogo de polinucleotídeo para esse, pode ser letal em pragas coleópteras e/ou hemípteras, ou resultar na redução do crescimento e/ou desenvolvimento. Nos exemplos específicos, um gene que pertence à família de Rab

79/263

10/169

GTPases pequenas que controlam o tráfico de membrana dentro da identidade da célula e organela (aqui referidos como rab5) pode ser selecionado como um gene alvo para o silenciamento póstranscricional. Nos exemplos particulares, um gene alvo útil para a inibição pós-transcricional é o novo gene aqui referido como rab5. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo de rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78); o complemento de rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 78); e fragmentos de qualquer um dos anteriores é, portanto, aqui divulgada.

[0021] As sequências de ribonucleotídeo transcritos são ainda aqui incluídas, as moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo uma sequência de nucleotídeo de rab5 (SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, and SEQ ID NO: 105); o complemento de rab5 (SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, e SEQ ID NO: 105); e fragmentos de qualquer um dos anteriores são divulgados. Como tais, as sequências de ribonucleotídeo transcritas de rab5; SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, e SEQ ID NO: 105 podem ser incluídas em algumas formas de realização, como um filamento de RNA sentido. Além disso, as sequências complementares, os filamentos de RNA antisentido destas sequências, são aqui incluídas e incluem as SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, e SEQ ID NO: 113. Estas sequências complementares podem ser fornecidas como sequências individuais ou ligadas para formar um RNA de filamento duplo mediante a ligação a um filamento de RNA sentido.

[0022] Também são divulgadas as moléculas de ácido nucleico

80/263

11/169 compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 85 % idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de um produto genético alvo (por exemplo, o produto de um gene referido como RAB5). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85 % idêntico à uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 78 (proteína RAB5). Nos exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85 % idêntico à uma sequência de aminoácido dentro de um produto de RAB5. Além disso são divulgadas as moléculas de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeo que é o complemento inverso de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85 % idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um produto genético alvo.

[0023] Também são divulgados as sequências de cDNA que podem ser utilizadas para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene alvo de pragas coleópteras e/ou hemípteras, por exemplo: rab5. Nas formas de realização particulares, dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Nos exemplos particulares, as moléculas de cDNA são divulgadas as quais podem ser utilizadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte de rab5 (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5; e SEQ ID NO: 78). [0024] Em algumas formas de realização, métodos para controlar uma população de uma praga coleóptera compreende fornecer à praga coleóptera uma molécula de iRNA que compreende a totalidade ou

81/263

12/169 parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 98; o complemento de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; o complemento de SEQ ID NO: 99; SEQ ID NO: 100; o complemento de SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 101; o complemento de SEQ ID NO: 101; SEQ ID NO: 102; o complemento de SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103; o complemento de SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104; o complemento de SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 105; o complemento de SEQ ID NO: 105; um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo rab5 nativo de uma praga coleóptera (por exemplo, WCR); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza com um polinucleotídeo rab5 nativo de uma praga de coleóptera.

[0025] São ainda divulgados meios para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera e/ou hemíptera, e meio para proteger uma planta de pragas coleópteras e/ou hemípteras. Um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera e/ou hemíptera é uma molécula de RNA de filamento único ou duplo consistindo de pelo menos da SEQ ID NO: 7 (Diabrotica rab5 região 1, aqui às vezes referido como rab5 regí) ou SEQ ID NO: 8 (Diabrotica rab5 região 2, aqui às vezes referido como rab5 reg2) ou SEQ ID NO: 9 (Diabrotica rab5 região 3, aqui às vezes referido como rab5 reg3) ou SEQ ID NO: 10 (Diabrotica rab5 versão 1, aqui às vezes referido como rab5 v1), ou SEQ ID NO: 80 (Euschistus heros rab5 região 1, aqui às vezes referido como BSB _rab5 reg 1), ou SEQ ID NO: 81 (Euschistus heros rab5 versão 1, aqui às vezes referido como BSB _rab5 v 1), ou o seu complemento. Os equivalentes funcionais do meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera e/ou hemíptera incluem moléculas de RNA de filamento único ou duplo que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de WCR ou BSB compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78. Um meio para a proteção de uma planta das

82/263

13/169 pragas coleópteras e/ou hemípteras é uma molécula de DNA que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera e/ou hemíptera ligada de maneira operacional a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta de soja e/ou de algodão.

[0026] São divulgados métodos para controlar uma população de uma praga coleóptera e/ou hemíptera, compreendendo o fornecimento à uma praga coleóptera e/ou hemíptera uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que funciona após ser absorvida pela praga coleóptera e/ou hemíptera para inibir uma função biológica dentro da praga coleóptera e/ou hemíptera, em que a molécula de iRNA compreende a totalidade ou parte de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e SEQ ID NO: 81; o complemento da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e SEQ ID NO: 81; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) ou organismo hemíptera (por exemplo, BSB) compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e SEQ ID NO: 81; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e SEQ ID NO: 81; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que é

83/263

14/169 transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e SEQ ID NO: 81; e o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e SEQ ID NO: 81.

[0027] A divulgação objeto fornece um RNA de filamento duplo (dsRNA), capaz de infra-regular a expressão de um gene rab5-1 de D. v. Virgifera LeConte que compreende um filamento de RNA sentido e um filamento de RNA antisentido complementar. Em um aspecto desta forma de realização, o filamento de RNA sentido inclui uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 10, ou qualquer combinação destas, incluindo os polinucleotídeos quiméricos incluindo qualquer uma das sequências de polinucleotídeo acima descritas (isto é, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 10). Em outro aspecto desta forma de realização, o filamento de RNA antisentido inclui uma sequência polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 96, ou qualquer combinação destas incluindo os polinucleotídeos quiméricos que incluem qualquer uma das sequências de polinucleotídeo acima descritas (isto é, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 96). Em um outro aspecto

84/263

15/169 desta forma de realização, o dsRNA compreende de 19 a 3710 nucleotídeos. Em uma forma de realização, o gene rab5 é selecionado de um gene raó5-1, rab5-2 ou rab5-3. Nas formas de realização adicionais, o dsRNA é expresso dentro de uma planta transgênica. Consequentemente, o dsRNA provoca a repressão do gene pós-transcricional ou a inibição de um gene rab5 em D. v. Virgifera LeConte quando D. v. Virgifera LeConte se alimenta da planta transgênica. Em uma outra forma de realização, o dsRNA é formado de duas sequências de RNA complementares separadas. Em outra forma de realização, o dsRNA é formado a partir de uma sequência de RNA isolada com sequências internamente complementares.

[0028] A divulgação objeto refere-se a um cassete de expressão do gene capaz de inibir ou infra-regular a expressão de um gene rab5 de D. v. Virgifera LeConte, em que o cassete de expressão do gene compreende um promotor ligado de maneira operável a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de RNA que formas um RNA de filamento duplo. Em um aspecto desta forma de realização, a primeira sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 10 ou um fragmento destas. Em um outro aspecto desta forma de realização, a segunda sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com uma sequência complementar da SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 96 ou um fragmento destas. Em um aspecto adicional desta forma de realização, o RNA transcrito a partir do cassete de expressão do gene é compreendido de um fragmento que atravessa de 19 a 3710 nucleotídeos. Em uma forma de realização, o cassete de expressão do gene é transformado em uma planta. Em outra forma de realização, o dsRNA expresso pelo cassete de ex

85/263

16/169 pressão do gene provoca a repressão do gene de pós-transcricional ou a inibição do gene rab5 em D. v. Virgifera LeConte quando a D. v. Virgifera LeConte se alimenta da planta. Em outras formas de realização, o dsRNA é formado de duas sequências de RNA complementares separadas. Em outra forma de realização, o dsRNA é formado a partir de uma única sequência de RNA com sequências complementares internamente. Consequentemente, a sequência de RNA isolada compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA através do segundo segmento de RNA, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento inverso do primeiro segmento de RNA, tal que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo. Em uma forma de realização adicional, o gene rab5 é selecionado do grupo que consiste emum gene raó5-1, rab5-2 ou rab5-3.

[0029] A divulgação objeto refere-se a um RNA de filamento duplo (dsRNA) que compreende um ácido nucleico que codifica um RNA autocomplementar para silenciar um ou mais genes alvo de uma praga ou o agente patogênico de uma planta, o RNA autocomplementar que compreende uma região de filamento duplo tendo um comprimento de pelo menos 19, 20 ou 21 nucleotídeos, em que um filamento de dita região de filamento duplo é obtido a partir de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste emSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 10. Em uma forma de realização, o um ou mais genes alvo é um gene rab5. Em uma forma de realização adicional, o gene rab5 é selecionado do grupo que consiste emum gene raó5-1, rab5-2 ou rab5-3. Em uma outra forma de realização, a praga ou o agente patogênico de

86/263

17/169 uma planta é D. v. Virgifera LeConte. Em outras formas de realização, o dsRNA é expresso dentro de uma planta transgênica. Consequentemente, o dsRNA provoca a repressão pós-transcricional do gene ou a inibição do gene rab5 em D. v. Virgifera LeConte quando a D. v. Virgifera LeConte se alimenta da planta transgênica. Em uma forma de realização, o dsRNA compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA através do segundo segmento de RNA, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento inverso do primeiro segmento de RNA, tal que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo.

[0030] Também são aqui divulgados os métodos em que o dsRNA, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser fornecidos à uma praga coleóptera e/ou hemíptera em um ensaio à base de dieta, ou nas células vegetais geneticamente modificadas que expressam os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nestes e em outros exemplos, os dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos pelas larvas da praga coleóptera e/ou ninfa da praga hemíptera. A ingestão de dsRNAs, siRNA, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs da divulgação pode resultar então em RNAi nas larvas, que por sua vez pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga coleóptera e/ou hemíptera e levando finalmente à mortalidade larval. Assim, os métodos são divulgados em que as moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de ácido nucleico exemplares úteis para o controle de pragas coleópteras e/ou hemípteras são fornecidas à uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Nos exemplos particulares, a praga coleóptera e/ou hemíptera controlada através do uso de moléculas de ácido nucleico da divulgação po

87/263

18/169 de ser WCR, NCR, SCR, MCR, Euschistus heros, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, e/ou Lygus lineolaris. A precedente e outras características irão tornar-se mais evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada das diversas formas de realização, que prossegue com referência às Figuras anexas 1 e 2.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0031] A Figura 1 é uma representação pictórica de uma estratégia para a geração de dsRNA a partir de um modelo de transcrição único. [0032] A Figura 2 é uma representação pictórica de uma estratégia para a geração de dsRNA a partir de dois modelos de transcrição. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0033] As sequências de ácido nucleico registradas na listagem de sequências anexa são mostradas utilizando abreviaturas com letras padrão para bases de nucleotídeo, como definido no 37 C.F.R. §

1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar e o filamento complementar inverso são compreendidos como incluídos por qualquer referência ao filamento apresentado. Na listagem de sequências anexa:

a SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de DNA que compreende rab5-1 de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 2 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína RAB5-1 de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA que compreende rab5-2 de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 4 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína RAB5-2 de Diabrotica virgifera-,

88/263

19/169 a SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA que compreende rab5-3 de Diabrotica virgifera;

a SEQ ID NO: 6 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína RAB5-3 de Diabrotica virgifera;

a SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de DNA de rab5 reg1 (região

1) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas);

a SEQ ID NO: 8 mostra uma sequência de DNA de rab5 reg2 (região

2) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas);

a SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência complementar reversa de DNA de rab5 reg3 (região 3) de Diabrotica virgifera que foi utilizada para a síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas);

a SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de DNA de rab5 v1 (versão

a SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência de DNA de um promotor de fago T7;

a SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência de DNA de um seguimento da região de codificação YFP que foi utilizada para a síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas);

as SEQ ID NOs: 13 a 20 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as partes de uma sequência de subunidade de rab5 de Diabrotica virgifera que compreende rab5 reg1, rab5 reg2, e rab5 reg3;

a SEQ ID NO: 21 mostra uma sonda IDT Custom Oligo e rab5 PRB

89/263

20/169

Set1, rotulada com FAM e duplamente extinta com extintores Zen and lowa Black;

a SEQ ID NO: 22 mostra uma sequência de DNA da Anexina região 1; a SEQ ID NO: 23 mostra uma sequência de DNA da Anexina região 2; a SEQ ID NO: 24 mostra uma sequência de DNA de Beta espectrina 2 região 1;

a SEQ ID NO: 25 mostra uma sequência de DNA de Beta espectrina 2 região 2;

a SEQ ID NO: 26 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 1;

a SEQ ID NO: 27 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 2;

as SEQ ID NOs: 28 a 55 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as regiões do gene de YFP, Anexina, Beta espectrina 2, e mtRPL4 para a síntense de dsRNA;

a SEQ ID NO: 56 mostra uma sequência de DNA do milho que codifica uma proteína semelhante a TIP41;

a SEQ ID NO: 57 mostra uma sequência de DNA de oligonucleotídeo T20NV;

as SEQ ID NOs: 58 a 62 mostram sequências de iniciadores e sondas utilizadas para medir os níveis de transcrição do milho;

a SEQ ID NO: 63 mostra uma sequência de DNA de uma parte de uma região de codificação SpecR utilizada para a detecção da cadeia principal do vetor binário;

a SEQ ID NO: 64 mostra uma sequência de DNA de um parte de uma região de codificação AAD1 utilizada para a análise do número de cópias genômicas;

a SEQ ID NO: 65 mostra uma sequência de DNA de um gene da invertase do milho;

as SEQ ID NOs: 66 a 74 mostram sequências de iniciadores e sondas

90/263

21/169 utilizadas para as análises do número de cópias de gene;

as SEQ ID NOs: 75 a 77 mostram sequências de iniciadores e sondas utilizadas para a análise de expressão do milho;

a SEQ ID NO: 78 mostra uma sequência de DNA exemplar do transcrito BSB rab5 de um Percevejo Marrom Neotropical (Euschistus herosy, a SEQ ID NO: 79 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína de Euschistus heros RAB5;

a SEQ ID NO: 80 mostra uma sequência de DNA de BSB_rab5 regí (região 1) de Euschistus heros que foi utilizada para a síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não mostradas);

a SEQ ID NO: 81 mostra uma sequência de DNA de BSB_rab5 v1 (versão 1) de Euschistus heros que foi utilizada para a síntese de dsRNA in vitro (sequências de promotor T7 nas extremidades 5’ e 3’ não mostradas);

as SEQ ID NOs: 82 a 85 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as partes de uma sequência de Euschistus heros rab5 que compreende BSB_rab5 regí e BSB_rab5 v1;

a SEQ ID NO: 86 é o filamento sentido de dsRNA direcionado por YFP: YFPv2;

as SEQ ID NOs: 87 a 88 mostram os iniciadores utilizados para amplificar as partes de um dsRNA direcionado por YFP: YFPv2;

a SEQ ID NO: 89 apresenta a sequência grampo de cabelo de YFP (YFP v2-1). As bases em letras maiúsculas são o filamento sentido de YFP (isto é, pares de base 1 a 123), as bases em letras minúsculas com fontes itálicas compreendem um íntron RTM1, não itálicas (isto é, pares de base 124 a 287), bases em letras minúsculas são o filamento antisentido de YFP (isto é, pares de base 288 a 410). O filamento sentido de YFP e o filamento antisentido de YFP complementar são completamente idênticos entre si;

91/263

22/169

ATGTCATCTGGAGCACTTCTCTTTCATGGGAAGATTCCTTACGTTGTGGAGATGGAAGGGAATGTTGATGGCCACACCTTTAGCATACGTGGGAAAGGCTACGGAGATGCCTCAGTGGGAAAGtccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttctccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataacttaatatgtg atttg gacccagcagatagagctcattactttcccactg agg catctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagag aagtg ctccagatgacat a SEQ ID NO: 90 mostra uma sequência de DNA complementar que compreende rab5-1 (esta sequência é o complemento inverso para a SEQ ID NO: 1);

a SEQ ID NO: 91 mostra uma sequência de DNA complementar de rab5-2 (esta sequência é o complemento inverso para a SEQ ID NO:

3);

a SEQ ID NO: 92 mostra uma sequência de DNA complementar de rab5-3 (esta sequência é o complemento inverso para a SEQ ID NO: 5);

a SEQ ID NO: 93 mostra uma sequência de DNA complementar de rab5 Reg1 (esta sequência é o complemento inverso para a SEQ ID NO: 7);

a SEQ ID NO: 94 mostra uma sequência de DNA complementar de rab5 Reg2 (esta sequência é o complemento inverso para a SEQ ID NO: 8);

a SEQ ID NO: 95 mostra uma sequência de DNA de rab5 Reg3 (SEQ ID NO: 9 é complementar à SEQ ID NO: 95);

a SEQ ID NO: 96 mostra uma sequência de DNA complementar de rab5 v1 (esta sequência é o complemento inverso para a SEQ ID NO: 10);

a SEQ ID NO: 97 mostra uma sequência de DNA complementar de rab5 de Euschistus heros (esta sequência é o complemento inverso

92/263

23/169 para a SEQ ID NO: 78);

a SEQ ID NO: 98 mostra uma sequência de RNA que compreende rab5-1 de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 99 mostra uma sequência de RNA que compreende rab5-2 de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 100 mostra uma sequência de RNA que compreende rab5-3 de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 101 mostra uma sequência de RNA de rab5 regí (região 1) de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 102 mostra uma sequência de RNA de rab5 reg2 (região 2) de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 103 mostra uma sequência complementar inversa de RNA de rab5 reg3 (região 3) de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 104 mostra uma sequência de RNA de rab5 v1 (versão

1) de Diabrotica virgifera-, a SEQ ID NO: 105 mostra uma sequência exemplar de RNA de BSB rab5 de um Percevejo Marrom Neotropical (Euschistus herosy a SEQ ID NO: 106 mostra uma sequência de RNA complementar que compreende rab5-1-, a SEQ ID NO: 107 mostra uma sequência de RNA complementar de rab5-2-, a SEQ ID NO: 108 mostra uma sequência de RNA complementar de rab5-3-, a SEQ ID NO: 109 mostra uma sequência de RNA complementar de rab5 Regí;

a SEQ ID NO: 110 mostra uma sequência de RNA complementar de rab5 Reg2;

a SEQ ID NO: 111 mostra uma sequência de RNA de rab5 Reg3;

a SEQ ID NO: 112 mostra uma sequência de RNA complementar de rab5 v1;

93/263

24/169 a SEQ ID NO: 113 mostra uma sequência de RNA complementar de rab5 de Euschistus heros] a SEQ ID NO: 114 mostra uma sequência de RNA complementar de BSB_rab5 regí (região 1) de Euschistus heros] a SEQ ID NO: 115 mostra uma sequência de RNA complementar de BSB_rab5 v1 (versão 1) de Euschistus heros] a SEQ ID NO: 116 mostra um polinucleotídeo ligante exemplar, que forma um “loop” quando transcrito em uma transcrição de RNA para forma uma estrutura de grampo de cabelo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

I. Visão geral das várias formas de realização [0034] Desenvolvemos a interferência de RNA (RNAi) como uma ferramenta para o controle de pragas de inseto, utilizando uma das espécies-alvo de pragas mais prováveis para plantas transgênicas que expressam dsRNA; a larva da raiz do milho ocidental. Até aqui, a maioria dos genes propostos como alvos para a RNAi em larvas da raiz do realmente não alcança os seus propósitos. Aqui, descrevemos o silenciamento mediado por RNAi do rab5 nas pragas de inseto exemplares, a larva da raiz do milho ocidental, besouro do pólen, e percevejo marrom neotropical, o qual é mostrado de ter um fenótipo letal quando, por exemplo, as moléculas de RNAi são liberadas por meio do dsRNA de rab5 ingerido ou injetado. Nas formas de realização contidas neste documento, a capacidade de liberar o dsRNA de rab5 através da alimentação aos insetos confere um efeito de RNAi que é muito útil para o controle de praga de insetos (por exemplo, coleóptera e hemíptera). Através da combinação de RNAi mediado por rab5 com outros alvos de RNAi úteis (por exemplo, alvos de RNAi ROP, como descrito no Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811, alvos de RNAi RNA polimerase 11, como descritos no Pedido de Patente U.S. No. 62/133.214, alvos de RNAi RNA polimerase 11140, como descritos no Pedido de Patente

94/263

25/169

U.S. No. 14/577.854, alvos de RNAi RNA polimerase 11215, como descritos no Pedido de Patente U.S. No. 62/133.202, alvos de RNA1 RNA polimerase 1133, como descritos no Pedido de Patente U.S. No. 62/133.210, alvos de RNAi nem, como descritos no Pedido de Patente U.S. No. 62/095487, alvos de RNAi Dre4, como descritos no Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), o potencial para afetar várias sequências alvo, por exemplo, as larvas da raiz larvais, pode aumentar as oportunidades de desenvolver abordagens sustentáveis para o controle de pragas de inseto envolvendo as tecnologias de RNAi.

[0035] São aqui divulgados os métodos e composições para o controle genético de infestações por pragas coleópteras e/ou hemípteras. Os métodos para identificar um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga coleóptera e/ou hemíptera para uso como um gene alvo para o controle mediado por RNAi de uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras também são fornecidos. Os vetores plasmídeos de DNA que codificam uma molécula de dsRNA podem ser projetados para suprimir um ou mais genes alvo essenciais para o crescimento, sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Em algumas formas de realização, métodos são fornecidos para a repressão pós-transcricional da expressão ou inibição de um gene alvo por meio de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de codificação ou de não codificação do gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e outras formas de realização, uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e/ou hpRNA transcritas a partir da totalidade ou uma parte de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de codificação ou de não codificação de um gene alvo, fornecendo assim um efeito fitoprotetor.

[0036] Assim, algumas formas de realização envolvem a inibição

95/263

26/169 específica da sequência da expressão de produtos genéticos alvos, utilizando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar às sequências de codificação e/ou de não codificação dos genes alvo para conseguir pelo menos o controle parcial de uma praga coleóptera e/ou hemíptera. É divulgado um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, como apresentado em uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 e os seus fragmentos. Em algumas formas de realização, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir desta sequência, seus fragmentos, ou um gene que compreende uma dessas sequências, para o silenciamento pós-transcricional ou inibição de um gene alvo. Em certas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 3. Em mais outras formas de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 5. Em outras formas de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 7. EM ainda outras formas de realização, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 81.

[0037] Algumas formas de realização envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula vegetal) tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Nas formas de realização particulares, as moléculas de dsRNA podem ser produzidas quando ingeridas por uma praga coleóptera e/ou hemíptera para pós-transcricionalmente silenciar ou inibir a expressão de um ge

96/263

27/169 ne alvo na praga coleóptera e/ou hemíptera. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, uma ou mais de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, ou SEQ ID NO: 81; fragmentos de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, ou SEQ ID NO: 81; ou uma sequência parcial de um gene que compreende uma ou mais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, ou SEQ ID NO: 81; ou seus complementos.

[0038] As formas de realização particulares envolvem uma célula hospedeira recombinante que possui no seu genoma uma sequência de DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) que compreende a totalidade ou parte da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ ID NO: 78. Quando ingeridas por uma praga coleóptera e/ou hemíptera, as moléculas de iRNA podem silenciar ou inibir a expressão de um gene alvo compreendendo as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e/ou SEQ ID NO: 78, na praga coleóptera e/ou hemíptera, e desse modo resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0039] Em algumas formas de realização, uma célula hospedeira recombinante tendo no seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de dsRNA pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas formas de realização envolvem plantas transgênicas compreendendo uma tal célula vegetal transformada. Além de tais plantas transgênicas, as plantas progênies de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgê

97/263

28/169 nicas, e produtos vegetais transgênicos, são todos fornecidos, cada um dos quais compreende as sequências de DNA recombinantes. Nas formas de realização particulares, uma molécula de dsRNA da divulgação pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Portanto, nestas e outras formas de realização, uma molécula de dsRNA da divulgação pode ser isolada a partir de uma célula vegetal transgênica. Nas formas de realização particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo que compreende o milho (Zea mays), soja (Glycine max), e plantas da família Poaceae.

[0040] Algumas formas de realização envolvem um método para a modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e noutras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de dsRNA. Nas formas de realização particulares, uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de dsRNA pode ser ligada de maneira operacional a um promotor, e pode também ser ligada de maneira operacional à uma sequência de terminação da transcrição. Nas formas de realização particulares, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera pode compreender: (a) a transformação de uma célula vegetal com um vetor que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de dsRNA; (b) o cultivo da célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) a seleção de uma célula vegetal transformada que integrou o vetor no seu genoma; e (d) a determinação de que a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regene

98/263

29/169 rada a partir de uma célula vegetal que possui o vetor integrado no seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor.

[0041] Assim, também é divulgada uma planta transgênica que compreende um DNA integrado de um vetor tendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de dsRNA integrada no seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Nas formas de realização particulares, a expressão de uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma praga coleóptera e/ou hemíptera que entra em contato com a planta transformada ou célula vegetal, por exemplo, através da alimentação da planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal. As plantas transgênicas aqui divulgadas podem apresentar resistência e/ou tolerância reforçada contra as infestações de pragas coleópteras e/ou hemípteras. As plantas transgênicas particulares podem apresentar resistência e/ou tolerância reforçada a uma ou mais pragas coleópteras e/ou hemípteras selecionadas do grupo que consiste de: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella', D. u. undecimpunctata Mannerheim; Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara virídula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus.

[0042] Também são aqui divulgados os métodos para a liberação de agentes de controle, tais como uma molécula de RNAi (por exemplo, dsRNA), à uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Tais agentes de controle podem provocar, direta ou indiretamente, na cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na praga coleóptera e/ou hemíptera. Por exemplo, a praga coleóptera e/ou hemíptera pode experimentar debilitamento na capacidade da praga coleóptera e/ou hemíptera de se alimentar, crescer, ou de outra forma

99/263

30/169 provocar danos em um hospedeiro como uma consequência de ser exposta aos agentes de controle. Em algumas formas de realização, é fornecido um método que compreende a liberação de uma molécula de dsRNA estabilizada à uma praga coleóptera e/ou hemíptera para suprimir pelo menos um gene alvo na praga coleóptera e/ou hemíptera, reduzindo assim ou eliminando os danos nas plantas por uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização, um método de inibir a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode resultar na cessação do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0043] Em algumas formas de realização, as composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidas as quais compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da divulgação para uso nas plantas, animais e/ou no meio ambiente de uma planta ou animal para conseguir a eliminação ou redução de uma infestação de pragas coleópteras ou hemípteras. Nas formas de realização particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento para ser alimentada na praga coleóptera e/ou hemíptera. Algumas formas de realização compreendem a preparação da composição nutricional ou fonte de alimento disponível para a praga coleóptera e/ou hemíptera. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da praga coleóptera e/ou hemíptera, o que pode por sua vez resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene alvo nas células da praga coleóptera e/ou hemíptera. A ingestão ou dano a uma planta ou célula vegetal por uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode ser limitado ou eliminado ou em qualquer tecido do hospedeiro ou ambiente no qual a praga coleóptera e/ou hemíptera está presente, através do fornecimento de uma ou mais composições compreenden

100/263

31/169 do uma molécula de iRNA da divulgação no hospedeiro da praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0044] Iscas de RNAi são formadas quando o dsRNA é misturado com o alimento ou um atrativo ou ambos. Quando as pragas comem a isca, elas também consomem o dsRNA. As iscas podem tomar a forma de grânulos, géis, pós fluidos, líquidos ou sólidos. Em outra forma de realização, o rab5 pode ser incorporado em uma formulação de isca, tal como aquela descrita na Patente U.S. N² 8.530.440 que é aqui incorporada por referência. Geralmente, com as iscas, as iscas são colocadas no ou ao redor do meio ambiente da praga de inseto, por exemplo, a WCR pode entrar em contato com, e/ou ser atraída, a isca. [0045] As composições e métodos aqui divulgados podem ser utilizados em conjunto com as combinações com outros métodos e composições para o controle de danos por pragas coleópteras ou hemípteras. Por exemplo, uma molécula de iRNA como aqui descrita para a proteção de plantas contra pragas coleópteras e/ou hemípteras, pode ser utilizada em um método que compreende o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga coleóptera e/ou hemíptera, biopesticidas eficazes contra uma tal praga coleóptera e/ou hemíptera, rotação de cultura, ou técnicas genéticas recombinantes que apresentam características diferentes das características dos métodos mediados pelo RNAi e composições de RNAi da divulgação (por exemplo, produção recombinante de proteínas nas plantas que são prejudiciais à uma praga coleóptera e/ou hemíptera de inseto (por exemplo, toxinas Bt)).

II. Abreviações dsRNA ácido ribonucleico de filamento duplo

Gl inibição do crescimento

NCBI National Center for Biotechnology Information gDNA ácido desoxirribonucléico genômico

101/263

32/169 iRNA ácido ribonucleico inibidor

ORF estrutura de leitura aberta

RNAi interferência de ácido ribonucleico miRNA ácido ribonucleico micro shRNA ácido ribonucleico grampo de cabelo pequeno siRNA ácido ribonucleico inibidor pequeno hpRNA ácido ribonucleico grampo de cabelo

UTR região não transladada

WCR larva da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)

NCR larva da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi

Smith e Lawrence)

MCR larva da raiz do milho mexicana (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith)

PCR reação em cadeia da polimerase

RISC complexo de silenciamento induzido por RNA

SCR larva da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)

BSB percevejo marrom neotropical (Euschistus heros Fabricius)

YFP proteína fluorescente amarela

SEM erro padrão da média

III. Termos [0046] Na descrição e tabelas que se seguem, vários termos são utilizados. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a esses termos, as seguintes definições são fornecidas:

Praga coleóptera: Como aqui utilizado, o termo praga coleóptera refere-se aos insetos do gênero Diabrotica, que se alimentam de milho e outras gramíneas verdadeiras. Nos exemplos particulares,

102/263

33/169 uma praga coleóptera é selecionada a partir de uma lista que compreende D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella', e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

Praga hemíptera: Como aqui utilizado, o termo praga hemíptera refere-se aos insetos da família Pentatomidae, que se alimentam de uma ampla faixa de plantas hospedeiras e possuem partes da boca perfurantes e sugadoras. Nos exemplos particulares, uma praga hemíptera é selecionada da lista compreendendo Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo Marrom Neotropical), Nezara viridula (L.) (Percevejo Verde do Sul), Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo de Faixas Vermellhas), Halyomorpha halys (Percevejo Marrom), Acrosternum hilare (Percevejo Verde), e Euschistus servus (Percevejo Marrom).

Contato (com um organismo): Como aqui utilizado, o termo contato com ou captação por um organismo (por exemplo, uma praga coleóptera e/ou hemíptera), no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico dentro do organismo, por exemplo, e sem limitação: a ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, através da alimentação); o contato do organismo com uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico; e absorção de organismos com uma solução que compreende a molécula de ácido nucleico.

Contígua: Como aqui utilizado, o termo contígua refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos derivados de uma única fonte genética.

Planta de milho: Como aqui utilizado, o termo planta de milho refere-se a uma planta da espécie Zea mays (milho).

Codificação de um dsRNA: Como aqui utilzado, o termo “codificação de um dsRNA” inclui um gene cujo produto da transcrição

103/263

34/169 de RNA é capaz de formar uma estrutura de dsRNA intramolecular (por exemplo, um grampo de cabelo) ou estrutura de dsRNA intermolecular (por exemplo, através da hibridização em uma molécula de RNA alvo).

Expressão: Como aqui utilizado, expressão de uma sequência de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, muitas vezes incluindo a síntese de uma proteína. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, a exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte da via do DNA para RNA para a proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam sobre a transcrição, translação, transporte de RNA e processamento, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou por meio da ativação, desativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas após terem sido produzidas, ou através das suas combinações. A expressão do gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, northern blot (RNA), RT-PCR, western blot (imune), ou ensaios de atividade da proteína in vitro, in situ ou in vivo.

Material genético: Como aqui utilizado, o termo material genético inclui todos os genes e as moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.

Inibição: Como aqui utilizado, o termo inibição, quando utilizado para descrever um efeito sobre uma sequência de codificação

104/263

35/169 (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir da sequência de codificação e/ou peptídeo, polipeptídeo ou produto protéico da sequência de codificação. Em alguns exemplos, a expressão de uma sequência de codificação pode ser inibida de modo que a expressão seja aproximadamente eliminada. Inibição específica refere-se à inibição de uma sequência de codificação alvo sem consequentemente afetar a expressão de outras sequências de codificação (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo executada.

Isolado: Um componente biológico isolado (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido sem considerar, ou purificado fora de, outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA e RNA cromossômico e extra-cromossômico, e proteínas). As moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram isoladas incluem as moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão. O termo também abrange os ácidos nucléicos e proteínas preparadas pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como as moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

Molécula de ácido nucleico: Como aqui utilizado, o termo molécula de ácido nucleico pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotideos, a qual pode incluir filamentos tanto sentidos quanto antisentidos de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados do acima. Um nucleotídeo pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico aqui utilizada é sinônimo com ácido nucleico e polinucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico é geralmente pelo menos 10 bases de comprimento, a não ser que de outra maneira especificada. Por convenção, a

105/263

36/169 sequência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é lida a partir da extremidade 5' para a 3' da molécula. O complemento de uma sequência de nucleotídeo refere-se à sequência de 5’ a 3’, das nucleobases que formam pares de bases com as nucleobases da sequência de nucleotídeo (isto é, A-T/U e G-C). O “complemento reverso” de uma sequência de ácido nucéico refere-se à sequência, de 3’ a 5’, das nucleobases que formam pares de bases com as nucleobases da sequência de nucleotídeo.

[0047] Algumas formas de realização incluem ácidos nucléicos que compreendem um DNA modelo que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas formas de realização, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação 5' para 3', de tal modo que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção de 5' para 3') irá transcrever um ácido nucleico a partir do complemento que pode hibridizar com a molécula de mRNA. A não ser que expressamente mencionado de outra maneira, ou fique claro de ser de outro modo a partir do contexto, o termo complemento, portanto, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases, de 5' para 3', que pode formar pares de base com as nucleobases de um ácido nucleico de referência.

De modo semelhante, a menos que seja explicitamente mencionado de ser de outra maneira (ou fique claro de ser de outro modo a partir do contexto), o complemento reverso de um ácido nucleico refere-se ao complemento na orientação inversa. O precedente é demonstrado na ilustração que se segue:

ATGATGATG	polinucleotídeo
TACTACTAC	complementar do polinucleotídeo
CATCATCAT	complemento reverso do polinucleotídeo

Algumas formas de realização da divulgação podem incluir moléculas de RNAi formadoras de RNA grampo de cabelo. Nestas moléculas de

106/263

37/169

RNAi, tanto o complemento de um ácido nucleico a ser direcionado pela interferência de RNA quanto o complemento reverso podem ser encontrados na mesma molécula, de tal modo que a molécula de RNA de filamento único pode dobrar-se e hibridizar em si mesmo ao longo da região compreendendo os polinucleotídeos complementares e complementares reversos.

[0048] Moléculas de ácido nucleico incluem as formas de DNA de filamento único e duplo; formas de filamento único de RNA; e formas de filamento duplo de RNA (dsRNA). O termo sequência de nucleotídeo ou sequência de ácido nucleico refere-se aos filamentos tanto sentidos quanto antisentidos de um ácido nucleico como filamentos únicos individuais ou em dúplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) é inclusivo de iRNA (RNA inibidor), dsRNA (RNA de filamento duplo), siRNA (RNA de interferência pequeno), mRNA (RNA mensageiro), shRNA (RNA grampo de cabelo pequeno), miRNA (microRNA), hpRNA (RNA grampo de cabelo), tRNA (RNA de transferência, quer carregado quer descarregado com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo ácido desoxirribonucléico (DNA) é inclusivo de cDNA, DNA genômico, e híbridos de DNA-RNA. Os termos polinucleotídeo e ácido nucleico e seus fragmentos, ou de uma forma mais geral “segmentos”, serão entendido por aqueles da técnica como um termo funcional que inclui tanto as sequências genômicas, sequências de RNA ribossômicos, sequências de RNA de transferência, sequência de RNA mensageiros, sequências de óperon, quanto as sequências de nucleotídeo planejadas menores que codificam ou podem ser adaptadas para codificar, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[0049] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados através da divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou atra

107/263

38/169 vés da polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Os sintetizadores automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de bases de comprimento. Visto que os oligonucleotídeos podem ligar-se a uma sequência de nucleotídeo complementar, eles podem ser utilizados como sondas para a detecção de DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos por DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser utilizados na PCR, uma técnica para a amplificação de DNA e RNA (transcrito reverso em um cDNA). Na PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um iniciador, que permite uma DNA polimerase prolongar o oligonucleotídeo e replicar o filamento complementar.

[0050] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir cada um ou ambos os nucleotideos de ocorrência natural e modificados ligados entre si através de ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas química ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, como será facilmente observado por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotideos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídicas (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; componentes pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.). O termo molécula de ácido nucleico também inclui qualquer conformação topológica, incluindo as conformações de filamento único, filamento duplo, parcialmente em dúplex, em tríplex, em grampo de cabelo, circular e em cadeado.

108/263

39/169 [0051] Como aqui utilizado no que diz respeito ao DNA, o termo sequência de codificação, sequência de nucleotídeo estrutural ou molécula de ácido nucleico estrutural refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é em última análise transladado em um polipeptídeo, através da transcrição e mRNA, quando colocado sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. No que diz respeito ao RNA, o termo polinucleotídeo de codificação refere-se a um polinucleotídeo que é transladado em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de início da translação no terminal 5' e um códon de interrupção da translação no terminal 3'. Os polinucleotídeos de codificação incluem, mas não são limitados a estes: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeo recombinantes.

[0052] Como aqui utilizado, polinucleotídeo de não codificação transcrito refere-se aos segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR, e os segmentos de íntron que não são transladados em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Além disso, polinucleotídeo de não codificação transcrito refere-se a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) como exemplificado por rRNA 5S, rRNA 5.8S, rRNA 16S, rRNA 18S, rRNA 23S e rRNA 28S, e outros mais); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5, U6, e outros mais. Os polinucleotídeos de não codificação transcritos incluem, por exemplo, e sem limitação, pequenos RNAs (sRNA), cujo termo é frequentemente utilizado para descrever RNAs de não codificação bacterianos pequenos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs; RNAs de interferência pequenos (siRNA); RNAs de interação Piwi (piRNA); e RNAs de não codificação longos. Ainda mais, polinucleotídeo de não codificação transcrito refere-se a um polinucleotídeo que pode existir de forma nativa como um ligante

109/263

40/169 intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito dentro de uma molécula de RNA.

[0053] Genoma: Como aqui utilizado, o termo genoma refere-se ao DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula, e também se refere ao DNA de organelas encontrados dentro dos componentes subcelulares da célula. Em algumas formas de realização da divulgação, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal, de tal modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da célula vegetal. Nestas e outras formas de realização, a molécula de DNA pode ser integrada no DNA nuclear da célula vegetal, ou integrada no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo genoma, quando se aplica a bactérias, refere-se tanto ao cromossoma quanto aos plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas formas de realização da divulgação, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de tal modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nestas e outras formas de realização, a molécula de DNA pode ser cromossomicamente integrada ou localizada como ou em um plasmídeo estável.

[0054] Identidade de sequência: O termo identidade de sequência ou identidade, como aqui utilizado no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para uma correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada.

[0055] Como aqui utilizado, o termo porcentagem de identidade de sequência pode referir-se ao valor determinado pela comparação de duas sequências alinhadas de forma ideal (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências polipeptídeo) através de uma janela de comparação, em que a parte da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas)

110/263

41/169 em relação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições nas quais o resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para obter o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em todas as posições em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100 % idêntica à sequência de referência, e vice-versa.

[0056] Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8: 155-165; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331; Tatiana etal. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174: 247250. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento da sequência e dos cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul etal. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.

[0057] O National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este

111/263

42/169 programa está disponível na internet sob a seção ajuda para BLAST™. Para comparações das sequências de ácido nucleico, a função Blast 2 sequences do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada utilizando a matriz BLOSUM62 default definida para os parâmetros default. As sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as sequências de referência irão apresentar identidade percentual crescente quando avaliadas por este método.

[0058] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Como aqui utilizados, os termos Especificamente hibridizáveis e Especificamente complementares são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade de tal modo que a ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento anti-paralelo entre as sequências de ácido nucleico das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondente no filamento oposto para formar uma molécula dúplex que, se for suficientemente estável, é detectável utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100 % complementar à sua sequência alvo a ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para a hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização utilizadas.

[0059] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de rigor irão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e do comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na⁺e/ou Mg⁺⁺) da hibridização irá determinar o rigor da hibridização. A resistência iônica do tampão de lavagem e a temperatura de lavagem

112/263

43/169 também influenciam o rigor. Os cálculos relativos às condições de hibridização requeridas para alcançar graus particulares de rigor são conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica, e são debatidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2^nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11, and updates; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Outras instruções e orientações detalhadas no que diz respeito à hibridização de ácidos nucléicos podem ser observadas, por exemplo, em Tijssen, Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bioloqy- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Bioloqy, Chapter 2, Greene Publishing and WileyInterscience, NY, 1995, e atualizações.

[0060] Como aqui utilizado, as condições de rigor abrangem as condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se existir mais do que 80 % de compatibilidade de sequência entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico alvo. As condições de rigor incluem outros níveis particulares de rigor. Assim, como aqui utilizado, as condições de rigor moderado são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 80 % de compatibilidade de sequência (isto é, tendo menos de 20 % de incompatibilidade) irão hibridizar; as condições de rigor elevado são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 90% de compatibilidade (isto é, tendo menos do que 10 % de incompatibilidade) irão hibridizar; e as condições de rigor muito elevado são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 95 % de compatibilidade (isto é, tendo menos de 5 % de incompatibilidade) irão hibridizar.

[0061] O que se segue são as condições de hibridização represen113/263

44/169 tativas não limitativas.

[0062] As condições de elevado rigor (detecta sequências que compartilham pelo menos 90 % de identidade de sequência): Hibridização em tampão SSC 5x a 65 O durante 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x na temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65 Ό d urante 20 minutos cada.

[0063] A condição de rigor moderado (detecta sequências que compartilham pelo menos 80 % da identidade de sequência): Hibridização em tampão SSC 5x-6x a 65-70 Ό durante 16 a 2 0 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x na temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x em 55 a 70Ό durante 30 minutos cada.

[0064] Condição de controle de não rigor (sequências que compartilham pelo menos 50 % de identidade de sequência irão hibridizar): Hibridização em tampão SSC 6x na temperatura ambiente a 55 Ό durante 16 a 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x3x na temperatura ambiente a 55Ό durante 20 a 30 m inutos cada.

[0065] Como aqui utilizado, o termo substancialmente homólogo ou homologia substancial, no que diz respeito a uma sequência de ácido nucleico contígua, refere-se a uma sequência de nucleotídeo contígua que são geradas por moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições de rigor com uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico tendo sequências que são substancialmente homólogos a uma sequência de ácido nucleico de referência da SEQ ID NO: 1 são aquelas moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições de rigor (por exemplo, as condições de rigor moderado apresentadas, supra) com as moléculas de ácido nucleico tendo a sequência de ácido nucleico de referência SEQ ID NO: 1. As sequências

114/263

45/169 substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80 % de identidade de sequência. Por exemplo, as sequências substancialmente homólogas podem ter de cerca de 80 % a 100 % de identidade de sequência, tal como ao redor de 81 %; ao redor de 82 %; ao redor de 83 %; ao redor de 84 %; ao redor de 85 %; ao redor de 86 %; ao redor de 87 %; ao redor de 88 %; ao redor de 89 %; ao redor de 90 %; ao redor de 91 %; ao redor de 92 %; ao redor de 93 %; ao redor de 94 %; ao redor de 95 %; ao redor de 96 %; ao redor de 97 %; ao redor de 98 %; ao redor de 98,5 %; ao redor de 99 %; ao redor de 99,5 %; e ao redor de 100 %. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com a hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico às sequências não alvo sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização rigorosa.

[0066] Como aqui utilizado, o termo ortólogo refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu a partir de uma sequência de nucleotídeo ancestral comum, e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

[0067] Como aqui utilizado, as duas moléculas de sequência de ácido nucleico são ditas de apresentar complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma sequência lida na direção 5' para 3' é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3' para 5'. Uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo de referência irá apresentar uma sequência idêntica ao complemento reverso da sequência de nucleotídeo de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles de habilidade prática na técnica.

115/263

46/169 [0068] Ligado de maneira operacional: uma primeira sequência de nucleotídeo é ligada de maneira operacional com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma conexão funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Quando produzidos de forma recombinante, as sequências de ácido nucleico ligadas de maneira operacional são geralmente contíguas, e, onde necessário, duas regiões de codificação de proteínas podem ser unidas na mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF fundida de modo translacional). No entanto, os ácidos nucléicos não precisam ser contínuos para serem ligados de maneira operacional.

[0069] O termo ligado de maneira operacional, quando utilizado com referência a uma sequência reguladora e uma sequência de codificação, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência de codificação ligada. Sequências reguladoras, ou elementos de controle, referem-se às sequências de nucleotídeo que influenciam o tempo e nível/quantidade de transcrição, processamento de RNA ou estabilidade, ou translação da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências condutoras de translação; íntrons; intensificadores; estruturas em alça peduncular; sequências de ligação do repressor; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação, etc. As sequências de regulação particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação ligada de maneira operacional a estes. Da mesma forma, as sequências reguladoras particulares ligadas de maneira operacional a uma sequência de codificação podem estar localizadas no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.

[0070] Promotor: Como aqui utilizado, o termo promotor refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcri

116/263

47/169 ção, e que pode estar envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser ligado de maneira operacional a uma sequência de codificação para a expressão em uma célula, ou um promotor pode ser ligado de maneira operacional a uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de sinal que pode ser ligada de maneira operacional a uma sequência de codificação para a expressão em uma célula. Um promotor vegetal pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição nas células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em determinados tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídeos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como preferidos do tecido. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como específicos do tecido. Um promotor específico do tipo da célula principalmente impulsiona a expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ou folhas. Um promotor induzível pode ser um promotor que pode estar sob controlo ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem as condições anaeróbicas e a presença de luz. Os promotores específicos do tecido, preferidos do tecido, específicos do tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecido ou célula.

[0071] Qualquer promotor induzível pode ser utilizado em algumas formas de realização da invenção. Ver Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Os promotores induzíveis exemplares incluem, mas não são limitados a estes: promotores

117/263

48/169 do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde aos protetores de herbicida de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene do hormônio esteróide, a atividade de transcrição dos quais pode ser induzida por uma hormônio de glicocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425).

[0072] Os promotores constitutivos exemplares incluem, mas não são limitados a estes: promotores de vírus vegetais, tais como o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotores dos genes da actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 do milho; e o promotor de ALS, fragmento Xba1/Ncol 5' para o gene estrutural Brassica napus ALS3 (ou uma sequência de nucleotídeo semelhante ao dito fragmento Xba1/Ncol) (Patente U.S. N² 5.659.026).

[0073] Adicionalmente, qualquer promotor específico do tecido ou preferível do tecido pode ser utilizado em algumas formas de realização da divulgação. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação ligada de maneira operacional a um promotor específico do tecido podem produzir o produto da sequência de codificação exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico. Os promotores específicos do tecido ou preferíveis do tecido exemplar incluem, mas não são limitados a estes: um promotor preferido das sementes, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico da folha e induzida pela luz tal como aquele de cab ou rubisco', um promotor específico da antera, tal como aquele de LAT52\ um promotor específico do pólen tal como aquele de Zm13\ e um promotor preferido do micrósporo tal como aquele de apg.

[0074] Planta de soja: Como aqui utilizado, o termo planta de soja refere-se a uma planta da espécie Glycine', por exemplo, Glycine.

118/263

49/169 max.

[0075] Transformação: Como aqui utilizado, o termo transformação ou transdução refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico para dentro de uma célula. Uma célula é transformada por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pelas células, através da incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou através da replicação epissômica. Como aqui utilizado, o termo transformação abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados a estes: a transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmídeos; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:74137417); microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-585); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-4807); absorção direta de DNA; e bombardeamento de microprojéteis (Klein etal. (1987) Nature 327:70).

[0076] Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um ou ambos filamentos de uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Em outros exemplos, um transgene pode ser uma sequência de ácido nucleico antisentido, em que a expressão da sequência de ácido nucleico antisentido inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Em mais outros exemplos, um transgene pode ser uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência a herbicida, um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica uma característica agrícola desejável).

119/263

50/169

Nestes e noutros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras ligadas de maneira operacional a uma sequência de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).

[0077] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico quando introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem a replicação na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a estes: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta o DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode ser uma molécula de RNA. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, sequências antisentido, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo assim com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento da proteína, etc.).

[0078] Rendimento: um rendimento estabilizado de cerca de 100 % ou maior em relação ao rendimento das variedades verificadas no mesmo local de crescimento que crescem ao mesmo tempo e nas mesmas condições. Nas formas de realização particulares, rendimento melhorado ou melhora do rendimento significa um cultivar tendo um rendimento estabilizado de 105 % a 115 % ou maior em relação ao rendimento das variedades verificadas no mesmo local de crescimento contendo densidades significativas de pragas coleópteras e/ou hemípteras que são prejudiciais para esta cultura em desenvolvimento ao mesmo tempo e nas mesmas condições.

[0079] A não ser que especificamente indicado ou implicado, os termos um uma o e a significam pelo menos um como aqui

120/263

51/169 utilizado.

[0080] A não ser que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como normalmente compreendido por aqueles de habilidade prática na técnica à qual pertence esta divulgação. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin’s Genes X, Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Bioloqv, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqv and Biotechnoloqv: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 156081-569-8). Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solventes são em volume a não ser que de outra maneira mencionada. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.

IV. Moléculas de Ácido nucleico compreendendo uma Sequência de Praga Coleóptera e/ou Hemíptera

A. Visão Geral [0081] Aqui descritas são as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas coleópteras e/ou hemípteras. As moléculas de ácido nucleico descritas incluem as sequências alvos (por exemplo, genes nativos, e sequências de não codificação), dsRNAs, siRNAs, hpRNAs, shRNAs e miRNAs. Por exemplo, as moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas formas de realização que podem ser especificamente complementares na totalidade ou parte de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e outras formas de realização, as sequências de ácido nucleico nativo podem ser um ou mais genes alvo, o produto dos quais pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido no desenvolvimento larval. As mo

121/263

52/169 léculas de ácido nucleico aqui descritas, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico nativo para o qual as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar a RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão das sequências de ácido nucleico nativo. Em alguns exemplos, a redução ou eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência especificamente complementar a esta pode ser letal nas pragas coleópteras e/ou hemípteras, ou resultar na redução do crescimento e/ou reprodução.

[0082] Em algumas formas de realização, pelo menos um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende uma sequência de nucleotídeo compreendendo rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78). Em exemplos particulares, um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera é selecionado, em que o gene alvo compreende uma nova sequência de nucleotídeo que compreende rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78).

[0083] Em algumas formas de realização, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85 % idêntica (por exemplo, ao redor de 90 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 %, ao redor de 100 %, ou 100 % idêntica) à sequência de aminoácido de um produto de proteína de rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 78). Um gene alvo pode ser qualquer sequência de ácido nucleico em uma praga coleóptera e/ou hemíptera, a inibição póstranscricional do qual tem um efeito prejudicial sobre a praga coleópte

122/263

53/169 ra e/ou hemíptera, ou fornecer um benefício de proteção contra a praga coleóptera e/ou hemíptera à uma planta. Nos exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85 % idêntica, ao redor de 90 % idêntica, ao redor de 95 % idêntica, ao redor de 96 % idêntica, ao redor de 97 % idêntica, ao redor de 98 % idêntica, ao redor de 99 % idêntica, ao redor de 100 % idêntica ou 100 % idêntica à sequência de aminoácido de um produto de proteína da nova sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 78.

[0084] Fornecido de acordo com a divulgação estão as sequências de nucleotídeo, a expressão das quais resulta em uma molécula de RNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar na totalidade ou em parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma sequência de codificação em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização, após a ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga coleóptera e/ou hemíptera, a infra-regulação da sequência de codificação nas células da praga coleóptera e/ou hemíptera pode ser obtida. Nas formas de realização particulares, a infra-regulação da sequência de codificação nas células da praga coleóptera e/ou hemíptera pode resultar em um efeito prejudicial no crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0085] Em algumas formas de realização, as sequências alvos incluem as sequências de RNA de não codificação transcritas, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; sequências condutoras unidas; sequências de íntron; sequências de outron (por exemplo, RNA 5'UTR subsequentemente modificado na trans união); sequências de donatron (por exemplo, RNA de não codificação requerido para fornecer sequências doadoras

123/263

54/169 para a trans união); e outro RNA transcrito de não codificação de genes da praga coleóptera e/ou hemíptera alvo. Tais sequências podem ser derivadas dos genes tanto mono-cistrônicos quanto policistrônicos.

[0086] Assim, também aqui descrito em relação com algumas formas de realização são as moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNAs, shRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar na totalidade ou em parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização uma molécula de iRNA pode compreender sequências de nucleotídeo que são complementares à totalidade ou em parte de uma pluralidade de sequências alvos; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sequências alvos. Nas formas de realização particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Também são divulgados as sequências de cDNAs que podem ser utilizadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares na totalidade ou em parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Ainda descritas são as construções de DNA recombinante para uso no alcance da transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Os alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA a partir das construções de DNA recombinante. Portanto, é também descrito um vetor de transformação de plantas compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo ligado de maneira operacional a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão das sequências de nucleotídeo resulta em uma molécula de RNA que

124/263

55/169 compreende uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à totalidade ou parte de uma sequência alvo de uma praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0087] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas coleópteras ou hemípteras podem incluir: a totalidade ou parte de uma sequência de ácido nucleico nativo isolada a partir de Diabrotica ou um hemíptero compreendendo rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78); sequências de nucleotídeo que quando expressas resultam e uma molécula de RNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à totalidade ou parte de uma molécula de RNA nativo que é codificada por rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs e hpRNAs); que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar na totalidade ou em parte de rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78); sequências de cDNA que podem ser utilizadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares na totalidade ou em parte de rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78); e construções de DNA recombinante para uso no alcance da transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas da ácido nucleico precedentes.

B. Moléculas de Ácido Nucleico [0088] A presente divulgação fornece, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que inibem a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma

125/263

56/169 praga coleóptera e/ou hemíptera; e moléculas de DNA capazes de ser expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou um microorganismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0089] Algumas formas de realização da divulgação fornecem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, ou mais) sequências de nucleotídeo selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 78; o complemento de SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotideos contínuos (por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos contínuos) de qualquer um de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotideos contínuos de qualquer um da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo coleóptero e/ou hemíptero (por exemplo, WCR e BSB) que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo coleóptero e/ou hemíptero compreendendo a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 78; uma sequência de não codificação nativa de um organismo coleóptero ou hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo coleóptero ou hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e

126/263

57/169

SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo coleóptero ou hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo coleóptero ou hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a totalidade ou parte de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo coleóptero ou hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo coleóptero ou hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78. Nas formas de realização particulares, o contato com ou a absorção de uma praga coleóptera e/ou hemíptera da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera e/ou hemíptera.

[0090] Em algumas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico da divulgação pode compreender pelo menos uma (por exemplo, um, dois, três, ou mais) sequência de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Tais sequências de DNA podem ser ligadas de modo operacional a uma sequência promotora que funciona em uma célula compreendendo a molécula de DNA

127/263

58/169 para iniciar ou intensificar a transcrição do RNA codificado capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em uma forma de realização, a pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, ou mais) sequência de DNA pode ser derivada de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, e SEQ ID NO: 78. Derivados de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78 incluem fragmentos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78. Em algumas formas de realização, um tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contínuos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78, ou um complemento deste. Assim, um tal fragmento pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos contínuos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78, ou um complemento deste. Nestas e em outras formas de realização, um tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78, ou um complemento deste. Assim, um fragmento da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78 pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ao redor de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), ao redor de 30, ao redor de 40 (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 e 45), ao redor de 50, ao redor de 60, ao redor de 70, ao redor de 80, ao redor de 90, ao redor de 100, ao redor de 110, ao redor de 120, ao redor de 130, ao redor de 140, ao redor de 150, ao redor de 160, ao redor de 170, ao redor de 180, ao redor de 190, ao redor de 200 ou mais nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 78, ou um complemento deste [0091] Algumas formas de realização compreendem a introdução

128/263

59/169 de moléculas de dsRNA parcial ou totalmente estabilizadas em uma praga coleóptera e/ou hemíptera para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera e/ou hemíptera. Quando expressas como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) e absorvidas por uma praga coleóptera e/ou hemíptera, as sequências de ácido nucleico compreendendo um ou mais fragmentos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 78 podem provocar uma ou mais de morte, inibição do crescimento, mudança na relação sexual, redução no tamanho da ninhada, cessação de infecção, e/ou interrupção da alimentação por uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Por exemplo, em algumas formas de realização, uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeo incluindo cerca de 15 a cerca de 300 ou cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogos a uma sequência do gene alvo da praga coleóptera e/ou hemíptera e compreendendo um ou mais fragmentos de uma sequência de nucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 78 é fornecida. A expressão de uma tal molécula de dsRNA pode, por exemplo, levar à mortalidade e/ou inibição do crescimento de uma praga coleóptera e/ou hemíptera que absorve a molécula de dsRNA.

[0092] Em certas formas de realização, as moléculas de dsRNA fornecidas pela divulgação compreendem sequências de nucleotídeo complementares a um gene alvo compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78 e/ou as sequências de nucleotídeo complementares a um fragmento da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78, a inibição deste gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera resulta na redução ou remoção de uma proteína ou agente de sequência de nucleotídeo que é essencial para o crescimento da praga coleóptera e/ou hemípte129/263

60/169 ra, o desenvolvimento, ou outra função biológica. Uma sequência de nucleotídeo selecionada pode apresentar de cerca de 80 % a cerca de 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78; um fragmento contínuo da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78; ou o complemento de qualquer um dos precedentes. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo selecionada pode apresentar ao redor de 81 %; ao redor de 82 %; ao redor de 83 %; ao redor de 84 %; ao redor de 85 %; ao redor de 86 %; ao redor de 87 %; ao redor de 88 %; ao redor de 89 %; ao redor de 90 %;

ao redor de 91 %; ao redor de 92 %; ao redor de 93 %; ao redor de94 %, ao redor de 95 %; ao redor de 96 %; ao redor de 97 %; ao redorde %; ao redor de 98,5 %; ao redor de 99 %; ao redor de 99,5 %;ou ao redor de 100 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78; um fragmento contínuo da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78; ou o complemento de qualquer um dos precedentes.

[0093] Em algumas formas de realização, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene alvo pode compreender uma sequência de nucleotídeo isolada que é especificamente complementar na totalidade ou em parte de uma sequência de ácido nucleico nativa encontrado em um ou mais espécies de praga coleóptera e/ou hemíptera alvo, ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade de tais sequências especificamente complementares.

[0094] Em outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda sequência de nucleotídeo separadas por uma sequência espaçadora. Uma se

130/263

61/169 quência espaçadora pode ser uma região que compreende qualquer sequência de nucleotídeo que facilite a formação da estrutura secundária entre a primeira e a segunda sequências de nucleotídeo, onde isso for desejado. Em uma forma de realização, a sequência espaçadora é parte de uma sequência de codificação sentido ou antisentido com relação ao mRNA. A sequência espaçadora pode alternativamente compreender qualquer combinação de nucleotideos ou seus homólogos que são capazes de serem ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.

[0095] Por exemplo, em algumas formas de realização, a molécula de DNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais moléculas de iRNA diferentes, em que cada uma das diferentes moléculas de iRNA compreende uma primeira sequência de nucleotídeo e uma segunda sequência de nucleotídeo, em que a primeira e a segunda sequências de nucleotídeo são complementares entre si. A primeira e a segunda sequências de nucleotídeo podem ser conectadas dentro de uma molécula de RNA através de uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode constituir parte da primeira sequência de nucleotídeo ou da segunda sequência de nucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA que compreende a primeira e a segunda sequências de nucleotídeo pode levar à formação de uma molécula de dsRNA da presente divulgação, através do emparelhamento de base específico da primeiro e da segunda sequências de nucleotídeo. A primeira sequência de nucleotídeo ou a segunda sequência de nucleotídeo pode ser substancialmente idêntica a uma sequência de ácido nucleico nativa de uma praga coleóptera e/ou hemípterapeuticamente (por exemplo, um gene alvo, ou sequência de não codificação transcrita), um seu derivado, ou uma sequência complementar a isto.

[0096] As moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem

131/263

62/169 filamentos duplos de sequências de ribonucleotídeos polimerizados, e podem incluir modificações à cadeia principal de fosfato-açúcar ou ao nucleosídeo. As modificações na estrutura do RNA podem ser adaptadas para permitir a inibição específica. Em uma forma de realização, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo de modo que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNAase III, tal como DICER em eucariotas, in vitro ou in vivo. Ver Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; e Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952. DICER ou enzimas RNase III funcionalmente equivalentes clivam os filamentos maiores de dsRNA e/ou as moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais é de cerca de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas possuem 2 a 3 projeções de nucleotídeos 3', e fosfato 5' e terminais de hidroxila 3'. As moléculas de siRNA geradas pelas enzimas RNAase III são desenroladas e separadas no RNA de filamento único na célula. As moléculas de siRNA depois especificamente hibridizam com as sequências de RNA transcritas a partir de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo de degradação do RNA celular inerente. Este processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz da sequência de RNA codificada pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento póstranscricional do gene alvo. Em algumas formas de realização, as moléculas de siRNA produzidas pelas enzimas RNAase III endógenas a partir de moléculas de ácido nucleico heterólogas podem eficientemente mediar a infra-regulação dos genes alvos nas pragas coleópteraa e/ou hemípteras.

[0097] Em algumas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico da divulgação pode incluir pelo menos uma sequência de nu

132/263

63/169 cleotídeo de ocorrência não natural que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de filamento único capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através da hibridização intermolecular. Tais sequências de dsRNA tipicamente se auto-agrupam, e podem ser fornecidas a uma praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, na fonte de nutrição de uma praga coleóptera e/ou hemíptera) para alcançar a inibição pós-transcricional de um gene alvo. Nas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico da divulgação pode compreender pelo menos uma sequência de nucleotídeo de ocorrência não natural, a qual é especificamente complementar a um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Quando uma tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA em uma praga coleóptera e/ou hemíptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão do gene alvo na praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e em outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico da divulgação pode compreender duas sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural diferentes, cada uma das quais é especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Quando uma tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA em uma praga coleóptera e/ou hemíptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes na praga coleóptera e/ou hemíptera.

C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico [0098] Uma variedade das sequências nativas nas pragas coleópteras e/ou hemípteras pode ser utilizada como sequências alvos para a concepção de moléculas de ácido nucleico, tais como moléculas de iRNA e DNA que codificam os iRNAs. A seleção de sequências nativas não é, contudo, um processo direto. Apenas um pequeno número de sequências nativas na praga coleóptera e/ou hemíptera serão alvos eficazes. Por exemplo, não se pode prever com certeza se uma se

133/263

64/169 quência nativa particular pode ser eficazmente infra-regulada pelas moléculas de ácido nucleico da divulgação, ou se a infra-regulação de uma sequência nativa particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera e/ou hemíptera. A grande maioria das sequências de praga coleóptera e hemíptera nativas, tais como as ESTs isoladas (por exemplo, como listadas na Patente U.S. N² 7.612.194 e Patente U.S. N² 7.943.819), não possui um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera e/ou hemíptera, tal como WCR, NCR, SCR, BSB, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacanthus, Dichelops furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Chinavia marginatum, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e Lygus lineolaris.

[0099] Não é previsível que as sequências nativas que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga coleóptera e/ou hemíptera sejam capazes de serem utilizadas em técnicas recombinantes para expressar as moléculas de ácido nucleico complementares a tais sequências nativas em uma planta hospedeira e fornecer o efeito prejudicial sobre a praga coleóptera e/ou hemíptera após a alimentação sem provocar dano à planta hospedeira.

[00100] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico da divulgação (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira de uma praga coleóptera e/ou hemíptera) são selecionadas para direcionar as sequências de cDNA que codificam as proteínas ou partes das proteínas essenciais para a sobrevivência da praga coleóptera e/ou hemíptera, tais como as sequências de aminoácido envolvidas nas vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, di

134/263

65/169 gestão, reconhecimento da planta hospedeira, e outros mais. Fornecido dentro da divulgação está a liberação das composições contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento do qual é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo da praga alvo, em um organismo alvo, resultando assim na morte ou outra inibição do organismo alvo. Com aqui descrito, a ingestão das composições por um organismo alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento do qual é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo da praga alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Uma sequência de nucleotídeo, DNA ou RNA, derivada de uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode ser utilizada para construir células vegetais resistentes à infestação pelas pragas coleópteras e/ou hemípteras. A planta hospedeira da praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais sequências de nucleotídeo derivadas da praga coleóptera e/ou hemíptera como aqui fornecidas. A sequência de nucleotídeo transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se formam em uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando assim o dsRNA disponível se/quando a praga coleóptera e/ou hemíptera forma uma conexão nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga coleóptera e/ou hemíptera, e finalmente a morte ou inibição do seu crescimento ou desenvolvimento.

[00101] Assim, nas formas de realização particulares, um gene é direcionado o qual está essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Outros genes alvo para uso na presente invenção podem incluir, por

135/263

66/169 exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes na viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, capacidade de infecção, e estabelecimento de locais de alimentação e reprodução. Um gene alvo pode, portanto, ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Adicionalmente, uma sequência de polinucleotídeo de praga coleóptera e/ou hemíptera nativa para uso na presente divulgação também pode ser derivada de um homólogo (por exemplo, um ortólogo) de um gene vegetal, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é conhecida daqueles de habilidade na técnica, e a sequência de nucleotídeo da qual é especificamente hibridizável com um gene alvo no genoma da praga coleóptera e/ou hemíptera alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeos conhecida através da hibridização são conhecidos daqueles de habilidade na técnica.

[00102] Em algumas formas de realização, a divulgação fornece métodos para a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA). Uma forma de realização compreende: (a) a análise de um ou mais genes alvo para a sua expressão, função e fenótipo após a supressão do gene mediada por dsRNA em uma praga coleóptera e/ou hemíptera; (b) a sondagem de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo a totalidade ou uma parte de uma sequência de nucleotídeo ou um homólogo desta a partir de uma praga coleóptera e/ou hemíptera alvo que apresenta um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) a identificação de um clone de DNA que hibridiza especificamente com a sonda; (d) o isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) o sequenciamento do fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa

136/263

67/169 (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende todo ou uma parte substancial da sequência de RNA ou um homólogo desta; e (f) a sintetização química da totalidade ou uma parte substancial de uma sequência genética, ou um siRNA ou miRNA ou shRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00103] Em outras formas de realização, um método para a obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produzir uma parte substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) inclui: (a) sintetizar o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeo especificamente complementar a uma parte de uma sequência de nucleotídeo nativa a partir de uma praga coleóptera e/ou hemíptera alvo; e (b) amplificar uma inserção de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem utilizando o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma parte substancial de uma molécula de siRNA ou shRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

[00104] Os ácidos nucléicos da divulgação podem ser isolados, amplificados ou produzidos por várias abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) pode ser obtida através da amplificação por PCR de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, um gene alvo ou uma sequência de não codificação transcrita alvo) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou suas partes. O DNA ou o RNA pode ser extraído a partir de um organismo alvo, e as bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir dele utilizando métodos conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica. As bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo alvo podem ser utilizadas para a amplificação por PCR e sequenciamento dos genes alvos. Um produto da PCR confirmado pode ser utilizado como um modelo para a

137/263

68/169 transcrição in vitro para gerar o RNA sentido e antisentido com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer uma de várias técnicas (Ver, por exemplo, Ozaki etal. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal etal. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de um sintetizador automático de DNA (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) model 392 or 394 DNA/RNA Synthesizer), utilizando a química padrão, tal como a química do fosforamidito. Ver, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S. N— 4.415.732, 4.458.066, 4.725.677, 4.973.679 e 4.980.460. As químicas alternativas resultantes em grupos de cadeia principal não natural, tais como fosforotioato, fosforamidato, e outros mais, também podem ser empregadas.

[00105] Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA da presente divulgação pode ser produzida química ou enzimaticamente por uma pessoa versada na técnica através de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA. O RNA também pode ser produzido através da síntese orgânica parcial ou total, qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido através da síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase bacteriófaga (por exemplo, RNA polimerase T3, RNA polimerase T7 e RNA polimerase SP6). As construções de expressão úteis para a clonagem e expressão de sequências de nucleotídeo são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.593.874, 5.693.512, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou pela síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em

138/263

69/169 uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura através da extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia, ou uma combinação destas. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou pela síntese enzimática in vitro podem ser utilizadas sem qualquer purificação ou com um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar as perdas devido ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secadas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o temperamento, e/ou a estabilização dos filamentos dúplex da molécula de dsRNA.

[00106] Nas formas de realização, uma molécula de dsRNA pode ser formada por um único filamento de RNA autocomplementar ou de dois filamentos de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula podem mediar a transcrição do um ou dois filamentos de RNA in vivo, ou a RNA polimerase clonada pode ser utilizada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode ser direcionada ao hospedeiro através da transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, através do uso de um promotor específico do tecido); a estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, através do uso de um promotor induzível que é sensível à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou o planejamento da transcrição em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, mediante o uso de um promotor específico do estágio de desenvolvimento). Os filamentos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, quer transcrito in vitro quer in vivo, podem ou não ser poliadenilados, e podem ou não ser capaz de serem transladados em um polipeptídeo por um

139/263

70/169 mecanismo de translação da célula.

D. Vetores Recombinantes e Transformação da Célula Hospedeira [00107] Em algumas formas de realização, a divulgação também fornece uma molécula de DNA para a introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que, após a expressão no RNA e a ingestão por uma praga coleóptera e/ou hemíptera, alcança a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera e/ou hemíptera. Assim, algumas formas de realização fornecem uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) em uma célula vegetal para inibir a expressão do gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. De modo a iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender uma ou mais sequências reguladores, cujas sequências reguladores podem ser ligadas de maneira operacional à sequência de ácido nucleico capaz de ser expressa como um iRNA. Os métodos para expressar uma molécula de supressão de gene nas plantas são conhecidos, e podem ser utilizados para expressar uma sequência de nucleotídeo da presente divulgação. Ver, por exemplo, a Publicação PCT Internacional No. WO 06/073727; e Publicação de Patente U.S. No. 2006/0200878 A1).

[00108] Nas formas de realização específicas, uma molécula de DNA recombinante da divulgação pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar as moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão dos genes alvo endógenos em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera após a ingestão. Em muitas

140/263

71/169 formas de realização, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura de grampo de cabelo, haste e circuito.

[00109] Nestas e em outras formas de realização, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeo que consiste daa SEQ ID NO: 1; os complementos da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3, o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 19 nucleotideos contínuos das SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contínuos das SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende as SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo as SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer as SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo as SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; um fragmento de pelo menos 19 nucleotideos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo as SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotideos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 1, 3 ou 5; um fragmento de pelo menos 19 nucleotideos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 1, 3 ou 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19

141/263

72/169 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 1,3 ou 5.

[00110] Em outras formas de realização, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeo que consiste da SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 78; uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer a SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 78; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 78.

142/263

73/169 [00111] Nas formas de realização particulares, uma molécula de DNA recombinante que codifica uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos dois segmentos de sequência de nucleotídeo dentro de uma sequência transcrita, tais sequências dispostas de tal modo que a sequência transcrita compreende um primeiro segmento de sequência de nucleotídeo em uma orientação de sentido, e um segundo segmento de sequência de nucleotídeo (que compreende o complemento do primeiro segmento de sequência de nucleotídeo) está em uma orientação antisentido, em relação a pelo menos um promotor, em que o segmento de sequência de nucleotídeo sentido e o segmento de sequência de nucleotídeo antisentido estão ligados ou conectados por um segmento de sequência espaçadora, por exemplo, de cerca de cinco (~5) a cerca de mil (~1000) nucleotídeos. Geralmente, espaçador não apresenta sequências que são complementares entre si, embora em algumas formas de realização as muitas extremidades 5’ e 3’ do espaçador podem apresentar algum nível de complementaridade. Como tal, o segmento de sequência espaçadora pode formar um circuito entre os segmentos de sequência sentido e antisentido. O segmento de sequência de nucleotídeo sentido ou o segmento de sequência de nucleotídeo antisentido pode ser substancialmente homólogo à sequência de nucleotídeo de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78) ou seu fragmento. Em algumas formas de realização, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar uma molécula de dsRNA sem uma sequência espaçadora. Nas formas de realização, uma sequência de codificação sentido e uma sequência de codificação antisentido podem ser diferentes nos comprimentos.

[00112] Em outras formas de realização particulares, uma molécula de DNA recombinante que codifica uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos dois segmentos de sequência de nucleotí

143/263

74/169 deo separados. E uma tal forma de realização, a primeira sequência de nucleotídeo compreende um primeiro segmento de sequência de nucleotídeo em uma orientação de sentido. Comparativamente, a segunda sequência de nucleotídeo compreende um segundo segmento de sequência de nucleotídeo em uma orientação antisentido. Ambas as sequências são substancialmente complementares entre si (por exemplo, compartilha pelo menos ao redor de 80 %, ao redor de 85 %, ao redor de 87,5 %, ao redor de 90 %, ao redor de 92,5 %, ao redor de 95 %, ao redor de 97,5 %, ao redor de 99 %, ao redor de 99,9 %, ao redor de 100 % ou 100% de identidade de sequência) de tal modo que as sequências podem ser quimicamente ligadas para formar um dsRNA. Cada sequência pode ser ligada de de maneira operacional a pelo menos um promotor, tal que o segmento de sequência de nucleotídeo sentido e o segmento de sequência de nucleotídeo antisentido são expressos dentro de uma célula (por exemplo, célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula vegetal) ou sinteticamente produzido. As sequências podem ser co-expressas em uma célula, em que elas se associam dentro da célula para formar uma molécula de dsRNA. Em outros exemplos, as sequências podem ser sintetizadas ou expressas separadamente em diferentes células, em que as sequências são isoladas, purificadas e combinadas para se associarem e formar uma molécula de dsRNA. O segmento de sequência de nucleotídeo sentido ou o segmento de sequência de nucleotídeo antisentido pode ser substancialmente homólogo à sequência de nucleotídeo de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78) ou seu fragmento. Nas formas de realização, uma sequência de codificação sentido e uma sequência de codificação antisentido podem ser diferentes nos comprimentos.

[00113] As sequências identificadas como tendo um efeito deletério

144/263

75/169 sobre as pragas coleópteras e/ou hemípteras ou um efeito fitoprotetor no que diz respeito às pragas coleópteras e/ou hemípteras, podem ser facilmente incorporadas nas moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da divulgação. Por exemplo, tais sequências podem ser expressas como uma estrutura grampo de cabelo com haste e circuito por tomar um primeiro segmento que corresponde a uma sequência do gene alvo (por exemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 78, e seus fragmentos); a ligação desta sequência à uma segunda região espaçadora do segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e a ligação desta a um terceiro segmento, em que pelo menos uma parte do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Uma construção forma uma estrutura de haste e circuito através do emparelhamento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de circuito forma e compreende o segundo segmento. Ver, por exemplo, as Publicações de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e as Publicações PCT Internacionais Nos. WO 94/01550 e WO 98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo tal como uma estrutura de alça penducular (por exemplo, grampo de cabelo), através da qual a produção de siRNA direcionado a uma sequência de praga coleóptera e/ou hemíptera é aumentada pela co-expressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo, sobre um cassete expressível da planta adicional, que leva à produção aumentada de siRNA, ou reduz a metilação para impedir o silenciamento do gene transcricional do promotor grampo de cabelo do dsRNA.

[00114] As formas de realização da divulgação incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente divulga145/263

76/169 ção em uma planta (isto é, transformação) para alcançar níveis inibidores da praga coleóptera e/ou hemíptera da expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. As sequências de ácido nucleico da divulgação podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para impulsionar a expressão de uma sequência de codificação ligada ou outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e na célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira particular com a qual é compatível.

[00115] Para conferir resistência contra praga coleóptera e/ou hemíptera a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga e especificamente hibridizável com uma sequência de nucleotídeo transcrita correspondente dentro de uma praga coleóptera e/ou hemíptera que pode provocar danos às espécies de plantas hospedeiras. A praga coleóptera e/ou hemíptera pode entrar em contato com a molécula de iRNA que é transcrita nas células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, através da ingestão de células ou flui

146/263

77/169 dos da planta hospedeira transgênica que compreende a molécula de iRNA. Assim, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de pragas coleópteras e/ou hemípteras que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas formas de realização, a supressão da expressão do gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera alvo pode resultar na planta sendo resistente contra o ataque pela praga.

[00116] A fim de permitir a liberação das moléculas de iRNA à uma praga coleóptera e/ou hemíptera em uma conexão nutricional com uma célula vegetal que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da divulgação, a expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula vegetal é requerida. Assim, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo da divulgação ligada de maneira operacional a uma ou mais sequências reguladores, tais como uma sequência promotora heteróloga que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.

[00117] Os promotores adequados para uso nas moléculas de ácido nucleico da divulgação incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Os exemplos não limitativos que descrevem tais promotores incluem as Patentes U.S. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor de actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (promotor CaMV 35S); 6.433.252 (promotor da oleosina do milho L3); 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz, e íntron da actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores

147/263

78/169 induzíveis pela luz); 6.140.078 (promotores induzíveis pelo sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis pela deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Publicação de Patente U.S. No. 2009/757089 (promotor da aldolase do cloroplasto de milho). Os promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-5749) e os promotores da octopina sintase (OCS) (os quais são transportados em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); os promotores caulimovírus tais como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 19S; (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324); o promoter do CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; o promoter do vírus do mosaico da escrofulária 35S (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-6628); o promoter da sacarose sintase (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148); o promotor do complexo genético R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183); o promotor do gene da proteína de ligação da clorofila a/b; CaMV 35S (Patentes U.S. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV 35S (patentes U.S. 5.378.619 e 6.051.753), um promotor PC1SV (Patente U.S. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. 6.677.503); e promotores AGRTU.nos (GenBank™ Accession No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187).

[00118] Nas formas de realização particulares, as moléculas de ácido nucleico da divulgação compreendem um promotor específico do tecido, tal como um promotor específico das raízes. Os promotores específicos das raízes acionam a expressão das sequências de codificação ligadas de maneira operacional exclusiva ou preferencialmente nos tecidos da raiz. Exemplos de promotores específicos da raiz são

148/263

79/169 conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; and Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas formas de realização, uma sequência de nucleotídeo ou fragmento para o controle de pragas coleópteras e/ou hemípteras de acordo com a divulgação pode ser clonada entre dois promotores específicos da raiz orientados em direções transcricionais opostas em relação à sequência de nucleotídeo ou fragmento, e que são operáveis em uma célula vegetal transgênica e nela expressos para produzir moléculas de RNA na célula vegetal transgênica que subsequentemente podem formar moléculas de dsRNA, como descrito, supra. As moléculas de iRNA expressas nos tecidos vegetais podem ser ingeridas por uma praga coleóptera e/ou hemíptera de modo que a supressão da expressão do gene alvo seja alcançada.

[00119] Os elementos reguladores adicionais que podem opcionalmente ser ligados de maneira operacional a uma molécula de ácido nucleico de interesse incluem íntrons e/ou 5'UTRs que funcionam como uma sequência condutora da translação localizada entre uma sequência promotora e uma sequência de codificação. A sequência condutora da translação está presente no mRNA totalmente processado, e pode afetar o processamento do transcrito primário, e/ou a estabilidade do RNA. Exemplos de sequências condutoras da translação incluem condutores de proteína de choque térmico do milho e petúnia (Patente U.S. N² 5.362.865), condutores de proteína de revestimento do vírus da planta, condutores da rubisco da planta, e outros. Ver, por exemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitativos de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. N²5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. N² 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank™ Accession No. V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7). Os

149/263

80/169 exemplos não limitativos de íntrons incluem o íntron do fator de despolimerização da actina do milho (Patente U.S. N^o 7.071.385); um íntron de Arabidopsis thaliana (Patente U.S. N^o 8.673.631); um íntron de hsp70 (Patente U.S. N^o 5.593.874); um íntron do arroz (Patente U.S. N^o 8.088.971); e o íntron da actina 2 do arroz (Patente U.S. N^o6.429.357).

[00120] As sequências reguladoras adicionais que opcionalmente podem ser ligadas de maneira operacional a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem sequências não transladadas 3', regiões de terminação da transcrição 3', ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeo, e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou o processamento de mRNA. As funções do sinal de poliadenilação nas plantas provocam a adição de nucleotídeos poliadenilados na extremidade 3' do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes de plantas, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitativo de uma região de terminação da transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de diferentes regiões não transladadas 3' é fornecido em Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação incluem aquele de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank™ Accession No. E01312).

[00121] Algumas formas de realização podem incluir um vetor de transformação de plantas que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos uma das sequências de regulação acima descritas ligadas de maneira operacional a uma ou mais sequências de nucleotídeo da presente divulgação. Quando ex

150/263

81/169 pressas, as uma ou mais sequências de nucleotídeo resultam em uma ou mais moléculas de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar na totalidade ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Assim, as sequências de nucleotídeo podem compreender um segmento que codifica a totalidade ou parte de uma sequência de ribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA da praga coleóptera e/ou hemíptera alvo, e podem compreender repetições invertidas de toda ou uma parte de um transcrito de praga coleóptera e/ou hemíptera alvo. Um vetor de transformação da planta pode conter sequências especificamente complementares para mais do que uma sequência alvo, permitindo assim a produção de mais do que um dsRNA para a inibição da expressão de dois ou mais genes nas células de uma ou mais populações ou espécies de pragas coleópteras e/ou hemípteras alvo. Os segmentos da sequência de nucleotídeo especificamente complementar para as sequências de nucleotídeo presentes em diferentes genes podem ser combinados em uma molécula isolada de ácido nucleico compósito para a expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contínuos ou separados por uma sequência espaçadora.

[00122] Em algumas formas de realização, um plasmídeo da presente divulgação já contendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de sequências de nucleotídeo adicionais no mesmo plasmídeo, em que as sequências de nucleotídeo adicionais são ligadas de maneira operacional aos mesmos elementos reguladores como o original a pelo menos uma sequência de nucleotídeo. Em algumas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser designada para a inibição de múltiplos genes alvos. Em algumas formas de realização, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos das mesmas espécies de

151/263

82/169 praga coleóptera e/ou hemíptera, o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras formas de realização, os genes podem ser derivados de diferentes pragas coleópteras e/ou hemípteras, o que pode ampliar a faixa de pragas coleópteras e/ou hemípteras contra as quais os agentes são eficazes. Quando múltiplos genes são direcionados para a supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado.

[00123] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente divulgação pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável sobre uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis também podem ser utilizados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da divulgação. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticin (G418), bleomicina, higromicina, etc.), ou tolerância a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a estes: um gene neo que codifica resistência a canamicina e pode ser selecionado para uso da canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica resistência a bialafos; um gene da EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene nitrilase que confere resistência a bromoxinila; um gene da acetolactato sintase mutante (ALS) que confere tolerância a imidazolinona ou sulfoniluréia; e um gene DHFR resistente a metotrexato. Vários marcadores selecionáveis estão disponíveis que conferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e outras mais. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

152/263

83/169 [00124] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor da presente divulgação também pode incluir um marcador detectável. Os marcadores detectáveis podem ser utilizados para monitorar a expressão. Os marcadores detectáveis exemplares incluem uma βglucuronidase ou gene uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene R-lócus, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. In 18^th Stadler Genetics Svmposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual diversos substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene da tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa a melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.

[00125] Em algumas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico recombinantes, como descrito, supra, podem ser utilizadas nos métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucléicos heterólogos nas plantas para preparar plantas transgênicas que apresentam uma reduzida sensibilidade às pragas coleópteras e/ou hemípteras. Os vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, através da inserção de moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de iRNA nos vetores de

153/263

84/169 transformação de plantas e a sua introdução nas plantas.

[00126] Métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA possa ser introduzido em uma célula, tal como através da transformação de protoplastos (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.508.184), através da absorção de DNA mediada pela dessecação/inibição (ver, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), através da eletroporação (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.384.253), através da agitação com fibras de carboneto de silício (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), através da transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; e 6.384.301) e através da aceleração de partículas revestidas com DNA (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865), etc. As técnicas que são particularmente úteis para a transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.591.616, 7.060.876 e 7.939.328. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de praticamente qualquer espécie podem ser transformadas de forma estável. Em algumas formas de realização, o DNA transformador é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma destas técnicas pode ser utilizada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

[00127] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão nas plantas baseia-se no sistema de transformação natural de espécies Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo, patogênicas da planta, que geneticamen

154/263

85/169 te transformam as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam os genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indutores de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para as plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região do T-DNA é delimitada por repetições terminais. Nos vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram eliminados e as funções da região Vir são utilizadas para transferir o DNA estranho delimitado pelas sequências limites do T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente das células e plantas transgênicas, e um sítio de clonagem múltiplo para a inserção de sequências para a transferência tal como um ácido nucleico de codificação do dsRNA.

[00128] Assim, e algumas formas de realização, um vetor de transformação de plantas é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, e 5.501.967; e Patente Européia No. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Os vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos anteriores. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhizobium que interagem com as plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de genes nas várias plantas diversificadas. Estas bactérias simbióticas associadas com a planta podem se tornar competentes para a transferência de genes mediante a aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de um vetor binário adequado.

155/263

86/169 [00129] Após fornecer DNA exógeno às células receptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para posterior cultura e regeneração de plantas. A fim de melhorar a capacidade de identificar as células transformadas, pode ser desejável empregar um gene marcador selecionável ou detectável, como anteriormente apresentado, com o vetor de transformação utilizado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é utilizado, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas através da exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador detectável é utilizado, as células podem ser submetidas a triagem com relação à característica desejada do gene marcador.

[00130] As células que sobreviveram à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de rastreio, podem ser cultivadas em meio que suporta a regeneração das plantas. Em algumas formas de realização, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado através da inclusão de outras substâncias, tais como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores do crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniciar os esforços de regeneração da planta, ou seguir os ciclos repetidos de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, tipicamente ao redor de 2 semanas), depois transferido para o meio conducente para a formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que a formação de broto suficiente tenha ocorrido. Assim que os brotos são formados, eles são transferidos para o meio conducente para a formação de raízes. Assim que as raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para posterior crescimento e maturação.

156/263

87/169 [00131] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA que codifica uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão do gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera) nas plantas de regeneração, uma variedade de ensaios pode ser executada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como southern e northern blotting, PCR, e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos tais como a detecção da presença de um produto protéico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou immuno blot) ou através da função enzimática; ensaios de parte da planta, tais como ensaios de folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta inteira regenerada.

[00132] Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, através do uso de amplificação por PCR, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem por PCR é compreendida de incluir, mas não ser limitada, a amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) do derivado de DNA genômico a partir do tecido caloso da planta hospedeira isolada previsto de conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido pela clonagem padrão e análise de sequência de produtos de amplificação da PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo as culturas de células.

[00133] Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação dependente de Agrobacterium tipicamente contém uma única sequência de DNA recombinante inserida em um cromossoma. A sequência de DNA recombinante única é referida como um evento transgênico ou evento de integração. Tais plantas transgênicas são

157/263

88/169 heterozigóticas com relação à sequência exógena inserida. Em algumas formas de realização, uma planta transgênica homozigótica no que diz respeito a um transgene pode ser obtida por acasalamento sexual (autopolinização) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência de gene exógena em si mesma, por exemplo, uma planta T_o, para produzir a semente Um quarto da semente T₁ produzida será homozigótico em relação ao transgene. A germinação da semente Ή resulta em plantas que podem ser testadas quanto a heterozigocidade, tipicamente utilizando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que leva em conta a distinção entre os heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigocidade).

[00134] Nas formas de realização particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes que possuem um efeito inibidor de praga coleóptera e/ou hemíptera são produzidas em uma célula vegetal. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir dos várias sequências de ácido nucleico introduzidas em diferentes eventos de transformação, ou a partir de uma única sequência de ácido nucleico introduzida em um único evento de transformação. Em algumas formas de realização, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um único promotor. Em outras formas de realização, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de vários promotores. As moléculas iRNA individuais podem ser expressas que compreendem múltiplas sequências de ácido nucleico que são cada uma homóloga em locais diferentes dentro de uma ou mais pragas coleópteras e/ou hemípteras (por exemplo, o local definido pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78), ambas em diferentes populações da mesma espécie de praga coleóptera e/ou hemíptera, ou em diferentes espécies de praga coleóptera e/ou hemíptera.

158/263

89/169 [00135] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparados através do cruzamento de uma primeira planta que possui pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta que carece de um evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem vegetal que é receptiva à transformação para produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem vegetal para incorporar a sequência de nucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem vegetal.

[00136] A divulgação também inclui podutos de consumo contendo uma ou mais das sequências como aqui divulgadas. As formas de realização incluem os produtos de consumo produzidos a partir de uma planta recombinante ou semente contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente divulgação. Um produto de consumo contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente divulgação incluem, mas não são limitados a estes, refeições, óleos, grãos ou sementes triturados ou inteiros de uma planta, e qualquer alimento ou produto alimentar de animal que compreende qualquer refeição, óleo ou grão triturado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências da presente divulgação. A detecção de uma ou mais das sequências da presente divulgação em uma ou mais mercadoria ou produtos de consumo é de facto evidência de que a mercadoria ou o produto de consumo é produzido a partir de uma planta transgênica designada para expressar uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente divulgação para o propósito de controlar as pragas de planta coleópteras e/ou hemípteras utilizando os métodos de supressão do gene mediados pelo dsRNA.

159/263

90/169 [00137] Em um aspecto, as sementes e os podutos de consumo produzidos por plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas são incluídos, em que as sementes ou os produtos de consumo compreendem uma quantidade detectável de uma sequência de ácido nucleico da divulgação. Em algumas formas de realização, tais produtos de consumo podem ser produzidos, por exemplo, através da obtenção de pantas transgênicas e da preparação de alimento e ração a partir delas. Os produtos de consumo compreendendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo da divulgação incluem, por exemplo, e sem limitação: refeições, óleos, grãos ou sementes triturados ou inteiros de uma planta, e qualquer produto alimentar que compreende qualquer refeição, óleo ou grão triturado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante compreendendo uma ou mais das sequências da divulgação. A detecção de uma ou mais das sequências da divulgação em uma ou mais mercadoria ou produtos de consumo é de facto evidência de que a mercadoria ou o produto de consumo é produzido a partir de uma planta transgênica designada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da divulgação para o propósito de controlar as pragas coleópteras e/ou hemípteras.

[00138] Em algumas formas de realização, uma planta ou semente transgênica que compreende uma molécula de ácido nucleico da divulgação também pode compreender pelo menos outro evento transgênico no seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA que direciona um lócus em uma praga coleóptera e/ou hemíptera diferente daquela definida pelas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 78, tal como, por exemplo, um ou mais locais selecionados do grupo que consiste emCaf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S.

160/263

91/169

No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811), RNA polimerase I1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.214), RNA polimerase II140 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854), RNA polimerase II215 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.202), RNA polimerase II33 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 62/133.210), ncm (Pedido de Patente U.S. No. 62/095.487), Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), COPI alpha (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gamma (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), e COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216), snap25 (Pedido de Patente U.S. No. 62/193.502), fator de alongamento da transcrição spt5 (Pedido de Patente U.S. No. 62/168.613), e fator de alongamento da transcrição spt6 (Pedido de Patente U.S. No. 62/168.606); uma evento transgênico a partir da qual é transcrita uma molécula de iRNA que direciona um gene em um organismo diferente de uma praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, um nematódeo parasítico de plantas); um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, tal como, por exemplo, Cry34Ab1 (Patentes U.S. N— 6.127.180, 6.340.593, e 6,624,145), Cry35Ab1 (Patentes U.S. N— 6.083.499, 6.340.593 e 6,548,291), uma combinação de “Cry34/35Ab1” em um único evento(por exemplo, evento no milho DAS-59122-7; Patente U.S. N^o 7.323.556), Cry3A (por exemplo, Patente U.S. N^o 7.230.167), Cry3B (por exemplo, Patente U.S. N^o8.101.826), Cry6A (por exemplo, Patente U.S. N^o 6.831.062), e suas combinações (por exemplo, Pedidos de Patente U.S. Nos.

161/263

92/169

2013/0167268, 2013/0167269, e 2013/0180016); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene que fornece tolerância ao glifosato, glufosinato, dicamba ou 2,4-D (por exemplo, Patente U.S. N²7.838.733)); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como rendimento aumentado, metabolismo de ácido graxo alterado, ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática. Nas formas de realização particulares, as sequências que codificam as moléculas de iRNA da divulgação podem ser combinadas com outro controle de insetos ou com características de resistência a doenças em uma planta para alcançar as características desejadas para um controle intensificado de danos provocados por insetos e doenças de planta. A combinação das características de controle de insetos que empregam os distintos modos-de-ação pode fornecer plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior sobre plantas que abrigam uma única característica de controle, por exemplo, por causa da reduzida probabilidade de que a resistência às características irá se desenvolver no campo.

V. Supressão do Gene Alvo em uma Praga Coleóptera e/ou Hemíptera

A. Visão Geral [00139] Em algumas formas de realização da divulgação, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras e/ou hemípteras pode ser fornecida a uma praga coleóptera e/ou hemíptera, em que a molécula de ácido nucleico leva ao silenciamento do gene mediado por RNAi na praga coleóptera e/ou hemíptera. Nas formas de realização particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser fornecida a um praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras e/ou hemípteras pode ser fornecida a uma praga coleóptera e/ou hemíptera através do contato da molécula de ácido nucleico com

162/263

93/169 a praga coleóptera e/ou hemíptera. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras e/ou hemípteras pode ser fornecida em um substrato de alimentação da praga coleóptera e/ou hemíptera, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas coleópteras ou hemípteras pode ser fornecida através da ingestão de matéria vegetal que compreende a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga coleóptera e/ou hemíptera. Em certas formas de realização, a molécula de ácido nucleico está presente na matéria vegetal através da expressão de uma sequência de ácido nucleico recombinante introduzida na matéria vegetal, por exemplo, através da transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico recombinante e a regeneração de uma matéria vegetal ou planta inteira a partir da célula vegetal transformada.

B. Supressão do Gene Alvo mediada pelo iRNA [00140] Nas formas de realização, a divulgação fornece moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que podem ser designadas para direcionar as sequências de nucleotídeo nativas essenciais (por exemplo, genes essenciais) na transcriptoma de uma praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, WCR, NCR, MCR, BSB, Nezara virídula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Acrosternum hilare, e Euschistus servus), por exemplo, através da concepção de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos um filamento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à sequência alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim designada pode ser idêntica à sequência alvo, ou pode incorporar ligações imperfeitas que não impedem a hibridização específica entre a molécula de iRNA e a sua sequência alvo. [00141] As moléculas de iRNA da divulgação podem ser utilizadas

163/263

94/169 nos métodos para a supressão do gene em uma praga coleóptera e/ou hemíptera, reduzindo assim o nível ou a incidência de danos provocados pela praga em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida que compreende uma molécula de iRNA). Como aqui utilizado, o termo supressão do gene refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para a redução dos níveis de proteína produzida como um resultado da transcrição do gene ao mRNA e a subsequente translação do mRNA, incluindo a redução da expressão da proteína a partir de um gene ou uma sequência de codificação incluindo a inibição pós-transcricional da expressão e supressão da transcrição. A inibição pós-transcrição é mediada pela homologia específica entre a totalidade ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene direcionado para a supressão e pela a molécula de iRNA correspondente utilizada para a supressão. Adicionalmente, a inibição póstranscrição refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para a ligação por ribossomos.

[00142] Nas formas de realização em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotideos de comprimento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada pela atividade DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de filamento único; o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro pode ser degradado, e o filamento guia pode ser incorporado em RISC. A inibição póstranscricional ocorre através da hibridização específica do filamento guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e subsequente divagem pela enzima, Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).

[00143] Nas formas de realização da divulgação, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser utilizada. Aqueles de habilidade na técnica

164/263

95/169 irão entender que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis do que são as moléculas de RNA de filamento único, durante a preparação e durante a etapa de fornecer a molécula de iRNA à uma célula e também são tipicamente mais estáveis em uma célula. Assim, embora as moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em algumas formas de realização, uma molécula de dsRNA pode ser selecionada devido à sua estabilidade.

[00144] Nas formas de realização particulares, uma molécula de ácido nucleico é fornecida a qual compreende uma sequência de nucleotídeo, cuja sequência de nucleotídeo pode ser expressa in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por uma sequência de nucleotídeo dentro do genoma de uma praga coleóptera e/ou hemíptera. Em certas formas de realização, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de alça penducular. Depois que uma praga coleóptera e/ou hemíptera entra em contato com a molécula de iRNA transcrita in vitro, a inibição pós-transcricional de um gene alvo na praga coleóptera e/ou hemíptera (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

[00145] Em algumas formas de realização da divulgação, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de nucleotídeo que é utilizada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga coleóptera, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID

165/263

96/169

NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transfrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. Em certas formas de realização, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80 % idêntica (por exemplo, ao redor de 80 %, ao redor de 81 %, ao redor de 82 %, ao redor de 83 %,

166/263

97/169 ao redor de 84 %, ao redor de 85 %, ao redor de 86 %, ao redor de 87 %, ao redor de 88 %, ao redor de 89 %, ao redor de 90 %, ao redor de 91 %, ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de 94 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 %, ao redor de 100 %, e 100 %) com qualquer um dos anteriores pode ser utilizada. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa a qual especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga coleóptera.

[00146] Em algumas formas de realização da divulgação, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de nucleotídeo é utilizada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga hemíptera, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero da SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 78; uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transfrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero que com

167/263

98/169 preende a SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78. Em certas formas de realização, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, ao redor de 80 %, ao redor de 81 %, ao redor de 82 %, ao redor de 83 %, ao redor de 84 %, ao redor de 85 %, ao redor de 86 %, ao redor de 87 %, ao redor de 88 %, ao redor de 89 %, ao redor de 90 %, ao redor de 91 %, ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de 94 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 %, ao redor de 100 %, e 100 %) com qualquer um dos anteriores pode ser utilizada. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa a qual especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga hemíptera.

[00147] Em algumas formas de realização, a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de nucleotídeo pode ser utilizada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga coleóptera, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:

168/263

99/169 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5. Em certas formas de realização, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80 % idêntica (por exemplo, 80 %, ao redor de 81 %, ao redor de 82 %, ao redor de 83 %, ao redor de 84 %, ao redor de 85 %, ao redor de 86 %, ao redor de 87

169/263

100/169 %, ao redor de 88 %, ao redor de 89 %, ao redor de 90 %, ao redor de 91 %, ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de 94 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 %, ao redor de 100 %, e 100 %) com qualquer um dos anteriores pode ser utilizada. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa a qual especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga coleóptera. Nos exemplos particulares, uma tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:

5.

[00148] Em algumas formas de realização da divulgação, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de nucleotídeo é utilizada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma praga hemíptera, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero da SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 78; uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transfrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo a SEQ ID NO: 78;

170/263

101/169 um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero que compreende a SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrito em uma molécula de RNA nativa que compreende a SEQ ID NO: 78. Em certas formas de realização, a expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, 80 %, ao redor de 81 %, ao redor de 82 %, ao redor de 83 %, ao redor de 84 %, ao redor de 85 %, ao redor de 86 %, ao redor de 87 %, ao redor de 88 %, ao redor de 89 %, ao redor de 90 %, ao redor de 91 %, ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 %, ao redor de 100 %, e 100 %) com qualquer um dos anteriores pode ser utilizada. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa a qual especificamente hibridiza com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga hemíptera. Nos exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 78.

[00149] É uma característica importante de algumas formas de realização da divulgação que o sistema de inibição pós-transcricional do RNAi é capaz de tolerar variações de sequência entre os genes alvos que podem ser esperados devido à mutação genética, polimorfismo da cepa, ou divergência evolutiva. A molécula de ácido nucleico introduzi

171/263

102/169 da pode não necessitar de ser absolutamente homóloga a um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável a um produto de transcrição primária ou um mRNA completamente processado do gene alvo. Além do mais, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser de comprimento total, em relação a um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado do gene alvo.

[00150] A inibição de um gene alvo utilizando a tecnologia de iRNA da presente divulgação é específica da sequência; isto é, as sequências de nucleotídeo substancialmente homólogas às moléculas de iRNA são direcionadas para a inibição genética. Em algumas formas de realização, uma molécula de RNA que compreende uma sequência de nucleotídeo idêntica à uma parte de um gene alvo pode ser utilizada para inibição. Nestas e outras formas de realização, uma molécula de RNA que compreende uma sequência de nucleotídeo com uma ou mais inserção, anulação e/ou mutações pontuais em relação a um sequência de nucleotídeo alvo pode ser utilizada. Nas formas de realização particulares, uma molécula de iRNA e uma parte de um gene alvo podem dividir, por exemplo, pelo menos em torno de 80 %, pelo menos em torno de 81 %, pelo menos em torno de 82 %, pelo menos em torno de 83 %, pelo menos em torno de 84 %, pelo menos em torno de 85 %, pelo menos em torno de 86 %, pelo menos em torno de 87 %, pelo menos em torno de 88 %, pelo menos em torno de 89 %, pelo menos em torno de 90 %, pelo menos em torno de 91 %, pelo menos em torno de 92 %, pelo menos em torno de 93 %, pelo menos em torno de 94 %, pelo menos em torno de 95 %, pelo menos em torno de 96 %, pelo menos em torno de 97 %, pelo menos em torno de 98 %, pelo menos em torno de 99 %, pelo menos em torno de 100 %, e 100 % de identidade de sequência. Alternativamente, a região dúplex de

172/263

103/169 uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma parte de um transcrito do gene alvo. Nas moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência menor do que o comprimento total que apresenta uma maior homologia compensa uma sequência maior menos homóloga. O comprimento da sequência de nucleotídeo de uma região dúplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma parte de um transcrito do gene alvo pode ser, pelo menos, ao redor de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos ao redor de 1000 bases. Em algumas formas de realização, uma sequência maior do que 15 a 100 nucleotídeos pode ser utilizada. Nas formas de realização particulares, uma sequência maior do que cerca de 200 a 300 nucleotídeos pode ser utilizada. Nas formas de realização particulares, uma sequência maior do que cerca de 500 a 1000 nucleotídeos pode ser utilizado, dependendo do tamanho do gene alvo.

[00151] Em certas formas de realização, a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera pode ser inibida em pelo menos 10 %; pelo menos 33 %; pelo menos 50 %; ou pelo menos 80 % dentro de uma célula da praga coleóptera e/ou hemíptera, de tal modo que uma inibição significativa ocorra. Inibição significativa referese à inibição sobre um limite que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, interrupção do crescimento, interrupção da alimentação, interrupção do desenvolvimento, mortalidade induzida, etc.), ou uma diminuição detectável no RNA e/ou no produto genético que corresponde ao gene alvo que é inibido. Embora em certas formas de realização da divulgação a inibição ocorra em todas as células da praga coleóptera e/ou hemíptera substancialmente, em outras formas de realização a inibição ocorre apenas em um subconjunto das células que expressam o gene alvo.

[00152] Em algumas formas de realização, a supressão da transcri

173/263

104/169 ção em uma célula é mediada pela presença de uma molécula de dsRNA que apresenta identidade de sequência substancial com uma sequência de DNA promotor ou o seu complemento para efetuar o que é referido como trans-supressão do promotor. A supressão de gene pode ser eficaz contra os genes alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera que pode ingerir ou entrar em contato com tais moléculas de dsRNA, por exemplo, através da ingestão ou do contato da matéria vegetal contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para uso na trans-supressão do promotor podem ser especificamente designadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da praga coleóptera e/ou hemíptera. A supressão do gene pós-transcricional pelo RNA orientado antisentido ou sentido para regular a expressão do gene nas células vegetais é divulgada nas Patentes U.S. Nos. 5.107.065, 5.231.020, 5.283.184 e 5.759.829.

C. Expressão das Moléculas de iRNA Fornecidas a uma Praga Coleóptera e/ou Hemíptera [00153] A expressão de moléculas de iRNA para a inibição do gene mediada por RNAi em uma praga coleóptera e/ou hemíptera, pode ser realizada em qualquer um dos muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser fornecidas a uma praga coleóptera e/ou hemíptera, por exemplo, através do contato das moléculas de iRNA com a praga, ou por fazer com que a praga ingira ou de outra forma internalize as moléculas de iRNA. Algumas formas de realização incluem plantas hospedeiras transformadas de uma praga coleóptera e/ou hemíptera, células vegetais transformadas, e progênie de plantas transformadas. As células vegetais transformadas e as plantas transformadas podem ser planejadas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para fornecer um efeito protetor contra as pragas coleópteras

174/263

105/169 e/ou hemípteras. Assim, quando uma planta ou célula vegetal transgênica for consumida por uma praga coleóptera e/ou hemíptera durante a alimentação, a praga pode ingerir as moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. As sequências de nucleotídeo da presente divulgação também podem ser introduzidas em uma ampla variedade de hospedeiros de microrganismo procariótico e eucariótico para a produção de moléculas de iRNA. O termo microrganismo inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como as bactérias e fungos.

[00154] A modulação da expressão do gene pode incluir a supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra forma de realização, um método para a supressão da expressão do gene em uma praga coleóptera e/ou hemíptera compreende fornecer no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade supressora do gene de pelo menos uma molécula de dsRNA formada após a transcrição de um polinucleotídeo como aqui descrito, pelo menos um segmento do qual é complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da praga coleóptera e/ou hemíptera. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA, ingerida por uma praga coleóptera e/ou hemíptera de acordo com a divulgação, pode ser pelo menos ao redor de 80 %, ao redor de 81 %, ao redor de 82 %, ao redor de 83 %, ao redor de 84 %, ao redor de 85 %, ao redor de 86 %, ao redor de 87 %, ao redor de 88 %, ao redor de 89 %, ao redor de 90 %, ao redor de 91 %, ao redor de 92 %, ao redor de 93 %, ao redor de 94 %, ao redor de 95 %, ao redor de 96 %, ao redor de 97 %, ao redor de 98 %, ao redor de 99 %, ao redor de 100 %, ou 100 % idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 78. As moléculas de ácido nucleico isoladas e

175/263

106/169 substancialmente purificadas incluindo, mas não limitadas a estas, sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural e construções de DNA recombinantes para fornecer moléculas de dsRNA da presente divulgação, são, portanto, fornecidas, que suprimem ou inibem a expressão de uma sequência de codificação endógena ou uma sequência de codificação do alvo na praga coleóptera e/ou hemíptera quando nela introduzido.

[00155] As formas de realização particulares fornecem um sistema de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera de plantas e controle de uma população da praga coleóptera e/ou hemíptera de plantas. Em algumas formas de realização, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula vegetal transgênica hospedeira ou conteúdo da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas e outras formas de realização, uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica é criada de modo que contenha uma construção de DNA recombinante que fornece uma molécula de dsRNA estabilizada da divulgação. As células vegetais transgênicas e as plantas transgênicas compreendendo sequências de ácidos nucléicos que codificam uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas através do emprego de tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidos na técnica) para construir um vetor de transformação de plantas compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA da divulgação (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar a célula vegetal transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

[00156] Para conferir resistência contra a praga coleóptera e/ou hemíptera a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombi

176/263

107/169 nante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de hpRNA. Em algumas formas de realização, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma tal molécula de dsRNA pode ser constituída em parte por uma sequência de nucleotídeo que é idêntica a uma sequência de nucleotídeo correspondente transcrita a partir de ums sequência de DNA dentro de uma praga coleóptera e/ou hemíptera de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene de alvo dentro da praga coleóptera e/ou hemíptera é suprimida pela molécula de dsRNA ingerida, e a supressão da expressão do gene alvo na praga coleóptera e/ou hemíptera resulta, por exemplo, na cessação da alimentação pela praga coleóptera e/ou hemíptera, com um resultado final sendo, por exemplo, que a planta transgênica é protegida de outra dano pela praga coleóptera e/ou hemíptera. Os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA foram mostrados de ser aplicáveis a uma variedade de genes expressos nas pragas, incluindo, por exemplo, os genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo os genes de manutenção; fatores de transcrição; genes relacionados com a muda; e outros genes que codificam os polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.

[00157] Para a transcrição de um transgene in vivo ou uma construção de expressão, uma região de regulação (por exemplo, promotor, intesificador, silenciador, e o sinal de poliadenilação) pode ser utilizada em algumas formas de realização para transcrever o filamento de RNA (ou filamentos). Portanto, em algumas formas de realização, como apresentadas, supra, uma sequência de nucleotídeo para uso na pro177/263

108/169 dução de moléculas de iRNA pode ser ligada de maneira operacional a uma ou mais sequências de promotor funcionais em uma célula hospedeira da planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. A sequência de nucleotídeo da presente divulgação, sob o controle de uma sequência promotora ligado de maneira operacional, pode ainda ser flanqueada pelas sequências adicionais que vantajosamente afetam a sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais sequências podem estar localizados a montante do promotor ligado de maneira operacional, a jusante da extremidade 3' da construção de expressão, e podem ocorrer tanto a montante do promotor quanto a jusante da extremidade 3' da construção de expressão.

[00158] Algumas formas de realização fornecem métodos para a redução dos danos a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho), provocados por uma praga coleóptera e/ou hemíptera que se alimenta da planta, em que o método compreende fornecer na planta hospedeira uma célula vegetal transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da divulgação, em que a molécula de ácido nucleico funciona após ser tomada pela praga coleóptera e/ou hemíptera para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera e/ou hemíptera, cuja inibição da expressão resulta na mortalidade, redução do crescimento e/ou reprodução reduzida da praga coleóptera e/ou hemíptera, reduzindo assim os danos à planta hospedeira, provocados pela praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende as moléculas de dsRNA. Nestas e outras formas de realização, a molécula de ácido nucleico compreende as moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula da praga coleóptera e/ou hemíptera.

178/263

109/169

Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico consiste emuma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera.

[00159] Em outras formas de realização, um método para aumentar o rendimento de uma cultura (por exemplo, cultura de milho) é fornecido, em que o método compreende a introdução em uma planta (por exemplo, planta de milho) de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da divulgação; o cultivo da planta (por exemplo, planta de milho) para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico inibe o crescimento da praga coleóptera e/ou hemíptera e/ou o dano da praga coleóptera e/ou hemíptera, reduzindo ou eliminando assim uma perda de rendimento devido à infestação da praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras formas de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera. Em alguns exemplos, a molécula de ácido nucleico consite de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera.

[00160] Em algumas formas de realização, um método para a modulação da expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera e/ou hemíptera é fornecido, o método compreendendo: a transformação de uma célula vegetal com um vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma molécula de ácido nuclei

179/263

110/169 co da divulgação, em que a sequência de nucleotídeo está ligada de maneira operacional a um promotor e uma sequência de terminação da transcrição; o cultivo da célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais que inclui uma pluralidade de células vegetais transformadas; a seleção para as células vegetais transformadas que integraram a molécula de ácido nucleico nos seus genomas; a triagem das células vegetais transformadas para a expressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada; a seleção de uma célula vegetal transgênica que expressa a molécula de iRNA; e a alimentação da célula vegetal transgênica selecionada pela praga coleóptera e/ou hemíptera. As plantas também podem ser regeneradas a partir das células vegetais transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas formas de realização, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras formas de realização, as moléculas de ácido nucleico compreendem as moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais do que uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico consiste emuma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga coleóptera e/ou hemíptera.

[00161] As moléculas de iRNA da divulgação podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), como um produto de expressão de um gene recombinante incorporado em um genoma das células vegetais, ou incorporadas em um revestimento ou tratamento de semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula vegetal compreendendo um gene recombi

180/263

111/169 nante é considerada de ser um evento transgênico. Também incluídos nas formas de realização da divulgação são os sistemas de liberação para a liberação das moléculas de iRNA nas pragas coleópteras e/ou hemípteras. Por exemplo, as moléculas de iRNA da divulgação podem ser diretamente introduzidas nas células de uma praga. Os métodos para a introdução podem incluir a mistura direta de iRNA com o tecido vegetal de um hospedeiro pela praga coleóptera e/ou hemíptera, assim como a aplicação de composições que compreendem moléculas de iRNA da divulgação no tecido vegetal do hospedeiro. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre uma superfície da planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microrganismo, e o microrganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzida em uma raiz ou caule por um meio físico tal como uma injeção. Como debatido, supra, uma planta transgênica também pode ser geneticamente planejada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas coleópteras e/ou hemípteras conhecidas de infestar a planta. As moléculas de iRNA produzidas pela síntese química ou enzimática, também podem ser formuladas de uma forma consistente com as práticas agrícolas comuns, e utilizadas como produtos de pulverização ou isca para controlar os danos na planta por uma praga coleóptera e/ou hemíptera. As formulações podem incluir adesivos e umectantes apropriados requeridos para a cobertura foliar eficiente, assim como protetores de UV para proteger as moléculas de iRNA (por exemplo, as moléculas de dsRNA) dos danos pela UV. Tais aditivos são comumente utilizados na indústria de bioinseticida, e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações inseticidas de pulverização (biologicamente baseadas ou de outra forma) para intensificar a proteção da planta contra as pragas coleópteras e/ou hemípteras.

181/263

112/169 [00162] Todas as referências, incluindo as publicações, patentes e pedidos de patente, aqui citadas, são aqui incorporadas por referência na medida em que não sejam incompatíveis com os detalhes explícitos desta divulgação, e são, por isso, incorporadas na mesma medida como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fosse apresentada na sua totalidade neste documento. As referências aqui examinadas são fornecidas exclusivamente para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito de antecipar esta divulgação em virtude da invenção anterior.

[00163] Os seguintes EXEMPLOS são fornecidos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes EXEMPLOS não devem ser interpretados de modo a limitar a divulgação nas características ou aspectos particulares descritos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Bioensaios da Dieta do Inseto [00164] Preparação da amostra e bioensaios: Várias moléculas de dsRNA (incluindo aquelas que correspondem à rab5 regí (SEQ ID NO: 7), rab5 reg2 (SEQ ID NO: 8), rab5 reg3 (SEQ ID NO: 9), e rab5 ver1 (SEQ ID NO: 10)) foram sintetizadas e purificadas utilizando um kit de RNAi MEGASCRIPT® ou HiScribe® T7 In Vitro Transcription Kit. As moléculas de dsRNA purificadas foram preparada em tampão TE, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle que consiste deste tampão, o qual serviu como uma verificação da experiência com relação à mortalidade ou inibição do crescimento da WRC (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

182/263

113/169 [00165] As amostras foram testadas quanto à atividade de insetos nos bioensaios conduzidos com larvas de inseto neonatas em dieta artificial de inseto. Os ovos de WCR foram obtidos da CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).

[00166] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 reservatórios projetadas especificamente para os bioensaios de inseto (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada reservatório continha aproximadamente 1,0 ml de uma dieta artificial designada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pl da amostra de dsRNA foi liberada através de uma pipeta sobre a superfície da dieta de cada reservatório (40 μΙ/cm²). As concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm²) de área de superfície (1,5 cm²) no reservatório. As bandejas tratadas foram mantidas em uma coifa de exaustão até que o líquido na superfície da dieta evaporou ou tenha sido absorvido na dieta.

[00167] Dentro de algumas horas de eclosão, as larvas individuais foram reunidas com uma escova de pêlo de camelo umedecida e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por reservatório). Os reservatórios infestados das bandejas de plástico de 128 reservatórios foram então lacrados com folhas adesivas de plástico transparente, e ventilados para permitir a troca de gás. As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28 Ό, ~40 % de Umidade Relativa, 16:8 (luz:escuro)) durante 9 dias, após cujo tempo o número total de insetos expostos em cada amostra, o número de insetos mortos, e o peso de insetos sobreviventes foram registrados. A mortalidade percentual média e a inibição média de crescimento foram calculadas para cada tratamento. A inibição do crescimento (Gl) foi calculada como se segue:

Gl = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)],

183/263

114/169 onde TWIT é o peso total de insetos vivos no tratamento;

TNIT é o número total de insetos no tratamento;

TWIBC é o peso total dos insetos vivos na verificação da experiência (controle de tampão); e

TNIBC é o número total de insetos na verificação da experiência (controle de tampão).

[00168] A análise estatística foi realizada utilizando o software JMP™ (SAS, Cary, NC).

[00169] A LC₅₀ (concentração letal) é definida como a dose em que 50 % dos insetos de teste são mortos. A GI₅₀ (inibição do crescimento) é definida como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é 50 % do valor médio visto nas amostras de verificação da experiência.

[00170] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão das amostras particulares resultou em uma mortalidade surpreendente e inesperada e inibição do crescimento das larvas da raiz do milho.

EXEMPLO 2:

Identificação dos Genes Alvo Candidatos [00171] Vários estágios de desenvolvimento da WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise de transcriptoma reunida para fornecer sequências do gene alvo candidato para o controle através da tecnologia de resistência de inseto de plantas transgênicas com RNAi.

[00172] Em uma exemplificação, o RNA total foi isolado em torno de 0,9 g das primeiras larvas WCR instar inteiras; (4 a 5 dias após a eclosão, mantidas a 16 Ό), e purificado utilizando o seguinte método baseado em fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH).

[00173] As larvas foram homogeneizadas na temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 ml com 10 ml de TRI REAGENT® até

184/263

115/169 que uma suspensão homogênea fosse obtida. Após 5 min de incubação na temperatura ambiente, o homogeneizado foi dispensado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 ml por tubo), 200 pl de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi vigorosamente agitada durante 15 segundos. Após deixar a extração em repouso na temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12.000 x g a 4 Ό. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 ml) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de 1,5 ml esterilizado, e um volume igual de isopropanol na temperatura ambiente foi adicionado. Após a incubação na temperatura ambiente durante 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min em 12.000 x g (4 Ό ou 25 Ό).

[00174] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e o grânulo de RNA foi lavado duas vezes com vórtice com 75 % de etanol, com a recuperação por centrifugação durante 5 min a 7500 x g (4Ό ou 25Ό) após cada lavagem. O etanol foi cuida dosamente removido, o grânulo foi deixado secar ao ar livre durante 3 a 5 minutos, e depois foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada através da medição da absorvência (A) em 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas rendeu mais de 1 mg de RNA total, com uma relação A₂₆₀/A₂₈₀ de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80 Ό até qu e processado mais adiante.

[00175] A qualidade do RNA foi determinada mediante a operação de uma alíquota através de um gel de agarose a 1 %. A solução de gel de agarose foi preparada utilizando 10x tampão TAE submetido a autoclave (Tris-acetato EDTA; a concentração 1x é de 0,04 M Trisacetato, 1 mM de EDTA (sal de sódio de ácido etilenodiamina tetraacético), pH 8,0) diluída com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente submetido a autoclave. 1x TAE foi utilizado como o tampão de operação. Antes do uso, o tanque de eletrofore

185/263

116/169 se e o pente de formação de reservatório foram limpos com RNaseAway™ (INVITROGEN INC., Carlsbad, CA). Dois pl de amostra de RNA foram misturados com 8 μΙ de tampão TE (10 mM Tris HCI pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 μΙ de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catalog No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70 Ό durante 3 min, esfriada para a temperatura ambiente, e 5 μΙ (contendo 1 μg a 2 μg de RNA) foram carregados por reservatório. Os marcadores de peso molecular do RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente operados nos reservatórios separados para comparação do tamanho molecular. O gel foi operado em 60 volts durante 2 h.

[00176] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total de larvas por um prestador de serviço comercial (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), utilizando iniciação aleatória. A biblioteca de cDNA de larvas normalizada foi sequenciada em escala de placa através da série química GS FLX 454 Titanium™ na EUROFINS MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento médio de leitura de 348 pb. 350.000 leituras foram reunidas em mais de 50.000 sequências contíguas. Tanto as leituras não reunidas quando as sequências contíguas foram convertidas em bases de dados BLASTable utilizando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível da NCBI).

[00177] As bibliotecas de RNA total e cDNA normalizadas foram preparadas de modo semelhante a partir de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento da WCR. Uma biblioteca de transcriptoma reunida para a triagem do gene alvo foi construída através da combinação de membros da biblioteca de cDNA que representam as diferentes fases de desenvolvimento.

[00178] Os genes candidatos para o direcionamento de RNAi foram selecionados utilizando a informação com respeito aos efeitos letais do

186/263

117/169

RNAi dos genes particulares em outros insetos tais como Drosophila e Tríbolium. Estes genes foram hipotetizados de serem essenciais para a sobrevivência e crescimento nos insetos coleópteros. Os homólogos do gene alvo selecionados foram identificados na base de dados da sequência de transcriptoma como descrito abaixo. As sequências de comprimento total ou parciais dos genes alvo foram amplificadas por PCR para preparar modelos para a produção de RNA de filamento duplo (dsRNA).

[00179] As pesquisas TBLASTN utilizando as sequências de codificação da proteína candidata foram operadas contra os bancos de dados BLASTable contendo as leituras de sequência de Diabrotica não reunidas ou as sequências contíguas montadas. Sucessos significativos para uma sequência de Diabrotica (definida como melhor do que o e'²⁰ para as homologias de sequência contígua e melhor do que e'¹⁰para as homologias de leietura da sequência não reunida) foram confirmados utilizando BLASTX contra o banco de dados NCBI não redundante. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências do gene candidato homólogo de Diabrotica identificadas na pesquisa por TBLASTN de fato compreendiam os genes de Diabrotica, ou foram o melhor sucesso para a sequência do gene candidato não Diabrotica presente nas sequências de Diabrotica. Na maioria dos casos, os genes candidatos de Tríbolium que foram explicados como codificando uma proteína, apresetariam uma homologia de sequência não ambígua à uma sequência ou sequências nas sequências de transcriptoma de Diabrotica. Em alguns casos, ficou claro que algumas das sequências contíguas de Diabrotica ou leituras de sequência não reunidas selecionadas por homologia com um gene candidato não Diabrotica se sobrepuseram, e que a reunião das sequências contíguas tinha falhado em juntar estas sobreposições. Nesses casos, Sequencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml) foi utili

187/263

118/169 zado para reunir as sequências em sequências contíguas mais longas. [00180] Um gene alvo candidato que codifica rab5 de Diabrotica (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5) foi identificado como genes que pode levar à mortalidade das pragas coleópteras, inibição do crescimento, inibição do desenvolvimento, e/ou inibição da reprodução da WCR.

[00181] As sequências das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5 são novas. Estas sequências não são fornecidas nas bases de dados públicas e não são divulgadas na WO 2011/025860; Pedido de Patente U.S. No. 20070124836; Pedido de Patente U.S. No. 2010019226; ou Patente U.S. N² 7612194.

[00182] Os transgenes de dsRNA rab5 podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para fornecer direcionamento de RNAi redundante e efeitos de RNAi não esperados (por exemplo, efeitos sinérgicos de RNAi). Os eventos de milho transgênicos que expressam o dsRNA que direciona rab5 são úteis para a prevenção de danos de alimentação da raiz através da larva da raiz do milho. Os transgenes de dsRNA rab5 representam novos modos de ação para combinar com a tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis em pirâmides (ou pilhas) do gene de controle de resistência do inseto para mitigar contra o desenvolvimento das populações de larva da raiz resistentes a qualquer uma destas tecnologias de controle da larva da raiz.

[00183] Clones de comprimento total ou parciais de sequências de um gene candidato de Diabrotica, aqui referodo como rab5, foram utilizados para gerar os fragmentos amplificados da PCR para a síntese do dsRNA.

[00184] A SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de DNA de 3710 bp de Diabrotica rab5-1.

[00185] A SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA de 1005 bp

188/263

119/169 de Diabrotica rab5-2.

[00186] A SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA de 544 bp de Diabrotica rab5-3.

[00187] A SEQ ID NO: 7 mostra uma sequência de DNA de 444 bp de rab5 reg1.

[00188] A SEQ ID NO: 8 mostra uma sequência de DNA de 491 bp de rab5 reg2.

[00189] A SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de DNA de 474 bp de rab5 reg3.

[00190] A SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de DNA de 128 bp de rab5 v1.

EXEMPLO 3

Amplificação dos Genes Alvo para produzir dsRNA [00191] Os iniciadores foram designados para amplificar as partes das regiões de codificação de cada um dos genes alvo por PCR. Ver a Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; SEQ ID NO: 11) foi incorporada nas extremidades 5' dos filamentos sentido ou antisentido amplificados. Ver a Tabela 1. O RNA total foi extraído das WCR, e o cDNA de primeiro filamento foi utilizando como modelo para as reações PCR utilizando iniciadores opostos posicionados para amplificar a totalidade ou parte da sequência do gene alvo nativo. O dsRNA também foi amplificado a partir de um clone de DNA que compreende a região de codificação para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 12; Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50).

Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar partes das regiões de codificação do gene alvo rab5 exemplar e gene de controle negativo YFP.

	Gene ID	Iniciador ID	SEQ ID NO:	Sequência
Par 1	rab5 reg1	rab5-F1T7	13	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAC-

189/263

120/169

			CATGGCGTTAAAGAACCAAG
rabõ-RIT/	14	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGG- TGGTGGCACAAGGTACT
Par 2	rab5 reg2	rab5-F2T7	15	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAC- TCGACCGAGGTTTCGAC
rab5-R2T7	16	TTAATACGACTCACTATAGGGAGA- TAACTGAAGGTTGGCGATGGTC
Par 3	rab5 reg3	rab5-F377	17	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAC- CATGGGCTCCAGCGGCGCCC
rab5-R3T7	18	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGA- TCTTGAAGGCGCTCTTCAGG
Par 4	rab5 v1	rab5 v1_F	19	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAA- TGCAATGGTACAGTATCACG
rab5 v1_R	20	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTT- TAAACCCATTGAATTCAGCT
Par 5	YFP	YFP-F_T7	28	TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAC- CATGGGCTCCAGCGGCGCCC
YFP-R_T7	31	TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGA- TCTTGAAGGCGCTCTTCAGG

EXEMPLO 4:

Construções de RNAi

Preparação do modelo através da PCR e síntese de dsRNA [00192] Uma estratégia utilizadas para fornecer modelos específicos para rab5 e produção de dsRNA da YFP é mostrada na Figura. 1. Os DNAs modelos destinados para uso na síntese de dsRNA de rab5 foram preparados pela PCR utilizando os pares de iniciador da Tabela 1 e (como modelo da PCR) cDNA de filamento único preparado a partir do RNA total isolado de larvas de primeiro instar da WCR. Para cada região do gene alvo rab5 e YFP selecionada, amplificações de PCR introduziram uma sequência promotora T7 nas extremidades 5' dos filamentos sentido e antisentido amplificados (o segmento de YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região de codificação de YFP). Os produtos da PCR tendo uma sequência promotora T7 nas suas extremidades 5’ de filamentos tanto sentido quanto antisentido

190/263

121/169 foram utilizados como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a Figura 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificados com os pares de iniciadores particulares foram: SEQ ID NO: 7 (rab5 regí), SEQ ID NO: 8 (rab5 reg2), SEQ ID NO: 9 (rab5 reg3), SEQ ID NO: 10 (rab5 v1), and YFP (SEQ ID NO: 12). O RNA de filamento duplo para o bioensaio de insetos foi sintetizado e purificado utilizando um kit de AMBION® MEGASCRIPT® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) ou HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs). As concentrações de dsRNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

Construção de vetores de transformação de plantas [00193] Vetores de entrada que abrigam uma construção do gene alvo para a formação de grampo de cabelo compreendendo segmentos de rab5 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5) são reunidos utilizando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação grampo de cabelo intramolecular através de transcritos primários de RNA é facilitada pela disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento de uma sequência do gene alvo rab5 em orientação oposta entre si, os dois segmentos sendo separados por um polinucleotídeo ligante (por exemplo, um circuito (tal como a SEQ ID NO: 116) e uma sequência de íntron ST-LS1; Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)). Assim, a transcrição primária de mRNA contém as duas sequências de segmento do gene rab5 como grandes repetições invertidas entre si, separadas pela sequência ligante. Uma cópia de um promotor (por exemplo, ubiquitina de milho 1, Patente U.S. N²5.510.474; 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotor

191/263

122/169 de bacilliform Badnavirus (ScBV) da cana; promotores dos genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; promotor de ALS; promotor do gene da faseolina; cab', rubisco', LAT52; Zm13] e/ou apg) é utilizada para acionar a produção do transcrito grampo de cabelo do mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' (por exemplo, um gene da peroxidase 5’ do milho (ZmPerõ 3'UTR v2; Patente U.S. N²6.699.984), AtUbilO, AtEfl, ou StPinll) é utilizado para terminar a transcrição do gene de expressão do RNA grampo de cabelo.

[00194] Os vetores de entrada são utilizados nas reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico para produzir os vetores de transformação da expressão de RNA grampo de cabelo de rab5 para as transformações do embrião de milho mediadas por Agrobacterium.

[00195] O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente U.S. N² 7.838.733 (B2), e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação de um promotor operável da planta (por exemplo, promotor de bacilliform badnavirus da cana de açúcar (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) ou ZmUbil (Patente U.S. N² 5.510.474)). Um 5'UTR e ligante estão posicionados entre a extremidade 3' do segmento promotor e o códon de partida da região de codificação de AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de um gene da lípase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. N² 7.179.902) é utilizado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.

[00196] Um vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico e vetor de entrada. O vetor de destino binário compreen

192/263

123/169 de um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (como acima) sob a regulação de expressão de um promotor de ubiquitina do milho 1 (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de um gene da lípase do milho (ZmLip 3'UTR, como acima). O vetor de entrada compreende uma região de codificação da YFP sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina do milho 1 (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de um gene da peroxidase 5 do milho (como acima).

EXEMPLO 5:

Triagem dos Genes Alvos Candidatos [00197] O dsRNA sintético designado para inibir as sequências do gene alvo identificadas no EXEMPLO 2 provocou a mortalidade e Inibição do crescimento quando administrado à WCR em ensaios à base de dieta. O rab5 regí e o rab5 v1 foram observados de apresentar eficácia grandemente aumentada neste ensaio sobre outros dsRNAs submetidos a triagem [00198] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivadas da regí de rab5 regí e rab5 v1 resultou na mortalidade e/ou inibição do crescimento das larvas da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados de bioensaios de alimentação à base de dieta das larvas WCR após a exposição de 9 dias ao dsRNA, assim como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparado a partir de uma região de codificação da proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 12).

Tabela 2. Resultados dos ensaios de alimentação de dieta de dsRNA de rab5 obtidos com larvas da raiz do milho ocidental após 9 dias de alimentação. A análise ANOVA encontrou diferenças significativas na Mortalidade % Média e na Inibição do Crescimento % Média (Gl). As

193/263

124/169 médias foram separadas utilizando o teste de Tukey-Kramer.

Nome do Gene	Dose (ng/cm2)	No. de Fileiras	Média (Mortalidade %) ± SEM*	Média (Gl) ± SEM
rab5 regí	500	8	97,06 ± 2,94 (A)	0,99 ± 0,01 (A)
rab5 v1	500	8	97,8 ±1,55 (A)	1,0 ±0 (A)
	0	14	5,25 ±1,37 (B)	-0,09 ± 0,04 (C)
ÁGUA	0	14	7,25 ±1,93 (B)	-0,12 ±0,07 (C)
YFP***	500	14	14,78 ± 5,16 (B)	0,19 ±0,08 (B)

SEM = erro padrão da média. As letras entre parênteses designam níveis estatísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (P < 0,05).

**TE = Tris HCI (1 mM) acrescido de tampão de EDTA (0,1 mM), pH

7,2.

***YFP = Proteína Fluorescente Amarela

Tabela 3. Resumo da potência oral do dsRNA de rab5 nas larvas WCR (ng/cm²).

Nome Gene	do	Ι-θ50 (ng/cm²)	Faixa	GI50 (ng/cm²)	Faixa
rab5-1 v1	7,84	6,42 9,55	1,04	0,78 1,40

Ό0199] Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para o controle de insetos mediado por RNAi. Ver a Publicação de Patente U.S. No. 2007/0124836, que divulga as 906 sequências, e a Patente U.S. N² 7.612.194, que divulga as 9112 sequências. No entanto, foi determinado que muitos genes sugeridos de ter utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Também foi determinado que a sequência de rab5 regí e rab5 v1 fornece um surpreendente e inesperado controle superior de Diabrotica, em comparação com outros ge

194/263

125/169 nes sugeridos de ter utilidade para o controle de insetos mediado por RNAi.

[00200] Por exemplo, Anexina, beta espectrina 2, e mtRP-L4 foram cada uma sugerido na Patente U.S. N² 7.612.194 de serem eficazes no controle de insetos mediado por RNAi. A SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA da região 1 de Anexina (Reg 1) e a SEQ ID NO: 23 é a sequência de DNA da região 2 de Anexina (Reg 2). A SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2 (Reg 1) e a SEQ ID NO: 25 é a sequência de DNA da região 2 de beta espectrina 2 (Reg 2). A SEQ ID NO: 26 é a sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4 (Reg 1) e a SEQ ID NO: 27 é a sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4 (Reg 2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO: 12) também foi utilizada para produzir dsRNA como um controle negativo.

[00201] Cada uma das sequências acima mencionadas foi utilizada para produzir dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia utilizada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA é mostrada na FIG. 2. Os DNAs modelos destinados para uso na síntese de dsRNA foram preparados pela PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 4 e (como modelo da PCR) o cDNA de filamento único preparado a partir do RNA total isolado das larvas de primeiro instar de WCR. (A YFP foi amplificada a partir de um clone de DNA.) Para cada região do gene alvo selecionado, duas amplificações de PCR separadas foram executadas. A primeira amplificação de PCR introduziu uma sequência promotora T7 na extremidade 5' dos filamentos sentido amplificados. A segunda reação incorporou a sequência do promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos antisentido. Os dois fragmentos amplificados pela PCR para cada região dos genes alvo foram depois misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi utilizada como modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Ver a Figura 2. O RNA de filamento duplo foi sintetizado e purificado utili

195/263

126/169 zando um kit de RNAi AMBION® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNAs foram cada um testado pelos mesmos métodos de ensaio biológico à base de dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores utilizados para produzir as moléculas de dsRNA da YFP, Regí de Anexina, Reg2 de Anexina, Regí de beta espectrina 2, Reg2 de beta espectrina 2, Regí de mtRP-L4 e Reg2 de mtRP-L4. As sequências de YFP para uso no método representado na Figura 2 também são listadas na Tabela 4. A Tabela 5 apresenta os resultados dos bioensaios de alimentação à base de dieta das larvas WCR após a exposição de 9 dias destas moléculas de dsRNA. Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsRNAs não resultou em nenhuma mortalidade ou inibição do crescimento das larvas da raiz do milho ocidental acima que foi observada com as amostras de controle de tampão TE, água ou proteína YFP.

Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar as partes das regiões de codificação dos genes.

	Gene (Região)	Iniciador ID	SEQID NO:	Sequência
Par 6	YFP	YFP-F_T7	28	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GACACCATGGGCTCCAGCGG- CGCCC
YFP-R	29	AGATCTTGAAGGCGCTCTT- CAGG
Par 7	YFP	YFP-F	30	CACCATGGGCTCCAGCGGCG- CCC
YFP-R_T7	31	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAAGATCTTGAAGGCGCTCTT- CAGG
Par 8	Anexina (Reg 1)	Ann-F1_T7	32	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAGCTCCAACAGTGGTTCCT-

196/263

127/169

				TATC
Anexina (Reg 1)	Ann-R1	33	CTAATAATTCTTTTTTAATGTT- CCTGAGG
Par 9	Anexina (Reg 1)	Ann-F1	34	GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC
Anexina (Reg 1)	Ann-R1_T7	35	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GACTAATAATTCTTTTTTAATG- TTCCTGAGG
Par 10	Anexina (Reg 2)	Ann-F2_T7	36	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GATTGTTACAAGCTGGAGAAC- TTCTC
Anexina (Reg 2)	Ann-R2	37	CTTAACCAACAACGGCTAA- TAAGG
Par 11	Anexina (Reg 2)	Ann-F2	38	TTGTTACAAGCTGGAGAACTT- CTC
Anexina (Reg 2)	Ann-R2T7	39	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GACTTAACCAACAACGGCTAA- TAAGG
Par 12	Beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-F1_T7	40	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAAGATGTTGGCTGCATC- TAGAGAA
Beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-R1	41	GTCCATTCGTCCATCCACTGCA
Par 13	Beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-F1	42	AGATGTTGGCTGCATC- TAGAGAA
Beta-spect2 (Reg 1)	Betasp2-R1_T7	43	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAGTCCATTCGTCCATCCAC- TGCA
Par 14	Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-F2_T7	44	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAGCAGATGAACACCAG- CGAGAAA
Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-R2	45	CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC
Par 15	Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-F2	46	GCAGATGAACACCAGCGAGAAA
Beta-spect2 (Reg 2)	Betasp2-R2_T7	47	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GACTGGGCAGCTTCTTGTTT- CCTC

197/263

128/169

Par 16	mtRP-L4 (Reg 1)	L4-F1_T7	48	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAAGTGAAATGTTAGCAAATA- TAACATCC
mtRP-L4 (Reg 1)	L4-R1	49	ACCTCTCACTTCAAATCTTGAC- TTTG
Par 17	mtRP-L4 (Reg 1)	L4-F1	50	AGTGAAATGTTAGCAAATATAA- CATCC
mtRP-L4 (Reg 1)	L4-R1_T7	51	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GAACCTCTCACTTCAAA- TCTTGACTTTG
Par 18	mtRP-L4 (Reg 2)	L4-F2_T7	52	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GACAAAGTCAAGATTTGAAG- TGAGAGGT
mtRP-L4 (Reg 2)	L4-R2	53	CTACAAATAAAACAAGAAGGA- CCCC
Par 19	mtRP-L4 (Reg 2)	L4-F2	54	CAAAGTCAAGATTTGAAG- TGAGAGGT
mtRP-L4 (Reg 2)	L4-R2_T7	55	TTAATACGACTCACTATAGGGA- GACTACAAATAAAACAAGAAG- GACCCC
Tabela 5: Resultac	os dos ensaios de alimentação de dieta obtidos

com as larvas da raiz do milho ocidental após 9 dias

Nome do Gene	Dose 2 (ng/cm )	Peso Médio da Larva Viva (mg)	Moralidade % Média	Inibição Média do Crescimento
Anexina-Reg 1	1000	0,545	0	-0,262
Anexina-Reg 2	1000	0,565	0	-0,301
Beta espectrina2 Reg 1	1000	0,340	12	-0,014
Beta espectrina2 Reg 2	1000	0,465	18	-0,367
mtRP-L4 Reg 1	1000	0,305	4	-0,168
mtRP-L4 Reg 2	1000	0,305	7	-0,180
Tampão TE*	0	0,430	13	0,000
Água	0	0,535	12	0,000
YFP**	1000	0,480	9	-0,386

*TE = Tris HCl (10 mM) acrescido de tampão de EDTA (1 mM), pH 8.

198/263

129/169 **YFP = Proteína Fluorescente Amarela

EXEMPLO 6:

Produção de Tecidos de Milho Transgênicos compreendendo dsRNAs Grampo de Cabelo Inseticidas [00202] Transformação mediada por Agrobacterium. As células, tecidos e plantas de milho transgênicas que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA insecticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene que compreende rab5-1 (SEQ ID NO: 1); rab5-2 (SEQ ID NO: 3); rab5-3 (SEQ ID NO: 5); rab5 regí (SEQ ID NO: 7); rab5 reg2 (SEQ ID NO: 8); rab5 reg3 (SEQ ID NO: 9); rab5 v1 (SEQ ID NO: 10); BSB_rab5 (SEQ ID NO: 78); BSB_rab5 regí (SEQ ID NO: 80); ou BSB_rab5 v1 (SEQ ID NO: 81)) através da expressão de um gene quimérico integrado de forma estável no genoma da planta são produzidas seguindo a transformação mediada por Agrobacterium. Os métodos de transformação do milho que empregam vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N² 8.304.604, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os tecidos transformados são selecionados pela sua capacidade para crescer em meio contendo Haloxyfop e são submetidos à triagem com relação à produção de dsRNA, conforme apropriado. As partes de tais culturas de tecido transformadas podem ser apresentadas às larvas da raiz do milho neonatos para o bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 1.

[00203] Iniciação da Cultura de Agrobacterium. Matéria-prima de glicerol de células DAt13192 da cepa de Agrobacterium (WO 2012/016222A2) que abriga um vetor de transformação binário descrito acima (EXEMPLO 4) é colocada em camadas em placas de meio mínimo AB (Watson, et al. (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo antibióticos apropriados, e são cultivadas a 20 Ό durante 3 dias. As

199/263

130/169 culturas são então colocadas em camadas nas placas de YEP (g/L: extrato de levedura, 10; peptona, 10; NaCI, 5) contendo os mesmos antibióticos e são incubadas a 20 °C durante 1 dia.

[00204] Cultura de Agrobacterium. No dia de uma experiência, uma solução de matéria-prima de Meio de Inoculação e acetossiringona é preparada em um volume apropriado para o número de construções na experiência e medida com pipeta dentro de um frasco de 250 ml descartável estéril. O Meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T.

A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341) contém: 2,2 gm/L de sais de MS; 1X ISU Vitaminas MS Modificadas (Frame et al., ibid.) 68,4 g/L de sacarose; 36 g/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; em pH 5,4. Acetossiringona é adicionada ao frasco contendo o Meio de Inoculação até uma concentração final de 200 μΜ a partir de uma solução de matéria-prima 1 M em 100 % de dimetil sulfóxido, e a solução é bem misturada.

[00205] Para cada construção, 1 ou 2 alças completas de inoculação de Agrobacterium a partir da placa de YEP são colocadas em suspensão em 15 ml de Meio de Inoculação/solução de matéria-prima de acetossiringona em um tubo de centrífuga estéril descartável de 50 ml, e a densidade ótica da solução em 550 nm (OD₅₅₀) é medida em um espectrofotômetro. A suspensão é depois diluída na OD₅₅₀ de 0,3 a 0,4, utilizando misturas adicionais de Meio de Inoculação/acetossiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium é depois colocado horizontalmente sobre um conjunto agitador de plataforma ao redor de 75 rpm na temperatura ambiente e agitado durante 1 a 4 horas enquanto que a dissecação do embrião é executada.

[00206] Esterilização da espiga e isolamento do embrião. Os embri

200/263

131/169 ões imaturos de milho são obtidos de plantas da linhagem congênita de Zea mays B104 (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:14051406), cultivados na estufa e auto- ou sib-polinizados para produzir espigas. As espigas são colhidas aproximadamente 10 a 12 dias após a polinização. No dia da experiência, as espigas descascadas são esterilizadas na superfície através da imersão em uma solução a 20 % de água sanitária comercial (ULTRA CLOROX® Germicidal Bleach,

6,15 % hipoclorito de sódio; com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas durante 20 a 30 min, seguido por três enxágües com água deionizada estéril em uma coifa de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) são dissecados assepticamente a partir de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo 2,0 ml de uma suspensão de células de Agrobacterium apropriadas no Meio de Inoculação líquido com acetossiringona 200 μΜ, em que 2 pl de tensoativo BREAK-THRU® S233 a 10 % (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Germany) são adicionados. Para uma dada série de experiências, os embriões das espigas reunidas são utilizados para cada transformação.

[00207] Cocultivo de Agrobacterium. Após isolamento, os embriões são colocados sobre uma plataforma oscilante durante 5 minutos. Os conteúdos do tubo são então despejados sobre uma placa de meio de co-cultivo, que contém 4,33 g/l de sais de MS; 1X ISU Vitaminas Modificadas MS; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2metoxibenzóico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L hidrolisado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgNO₃; 200 μΜ de acetossiringona em DMSO; e 3 g/L de GELZAN™, em pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium é removida com uma pi peta de transferência estéril descartável. Os embriões são então orientados com o escutelo virado para cima utilizando fórceps estéril, com o auxílio de um microscópio.

201/263

132/169

A placa é fechada, selada com esparadrapo médico 3M™ MICROPORE™, e colocada em uma incubadora a 25 Ό com luz contínua em aproximadamente 60 pmol de m'²s'¹ de Photosynthetically Active Radiation (PAR).

[00208] Seleção e Regeneração de Calo de Eventos Transgênicos. Após o período de co-cultivo, os embriões são transferidos para o Meio de Repouso, que é composto de 4,33 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas Modificadas MS; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimática de Caseína; 15 mg/L de AgNO₃; 0,5 g/L de MES (monoidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L Carbenicillin; e 2,3 g/L GELZAN™; em pH 5,8. Não mais do que 36 embriões são transferidos para cada placa. As placas são colocadas em uma caixa de plástico transparente e incubadas a 27 Ό com luz contí nua em aproximadamente 50 pmol m-²s'¹ PAR durante 7 a 10 dias. Os embriões calosos são então transferidos (<18/placa) para o meio de seleção I, o qual é composto de meio de repouso (acima) com 100 nM ácido RHaloxyfop (0,0362 mg/L; para a seleção de calos que abrigam o gene AAD-1). As placas retornam para as caixas transparentes e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol de m'²s'¹ PAR durante 7 dias. Os embriões calosos são então transferidos (<12/placa) para o Meio de Seleção II, que é composto de meio de repouso (acima) com 500 nM ácido R-Haloxyfop (0,181 mg/L). As placas retornam para as caixas transparentes e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m'²s'¹ PAR durante 14 dias. Esta etapa de seleção permite o calo transgênico proliferar e diferenciar ainda mais.

[00209] Na proliferação, os calos embrionários são transferidos (<9/placa) para o meio de pré-regeneração. O meio de pré

202/263

133/169 regeneração contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU Vitaminas Modificadas MS; 45 g/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO₃; 0,25 g/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicillin; 2,5 g/L de GELZAN™; e 0,181 mg/L de ácido Haloxyfop; em pH 5,8. As placas são armazenadas em caixas transparentes e incubadas a 27 Ό com luz contínua em aproximadamente 50 pmol m-²s'¹ PAR durante 7 dias. Os calos em regeneração são então transferidos (<6/placa) para o Meio de Regeneração em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28 Ό com 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia (em aproximadamente 160 pmol m'²s'¹ PAR) durante 14 dias ou até que os brotos e as raízes se desenvolvam. O Meio de Regeneração contém 4,33 g/L de sais de MS; 1X ISU Vitaminas Modificadas MS; 60 g/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicillin; 3 g/L de goma GELLAN™; e 0,181 mg/L de ácido R-Haloxyfop; em pH 5,8. Pequenos brotos com raízes primárias são então isolados e transferidos para o Meio de Alongamento sem seleção. O Meio de Alongamento contém

4,33 gm/l de sais de MS; 1X ISU Vitaminas Modificadas MS; 30 g/L de sacarose; e 3,5 g/L de GELRITE™: em pH 5,8.

[00210] Os brotos da planta transformados selecionados pela sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxyfop são transplantados de PHYTATRAYS™ para pequenos vasos cheios com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), cobertos com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e depois carregado em uma câmara de crescimento CONVIRON (27 Ό d ia/24 Ό à noite, fotoperíodo de 16 horas, 50 a 70 % de RH, 200 pmol m'²s'¹PAR). Em alguns casos, as plântulas transgênicas putativas são analisadas com relação ao número de cópias relativas do transgene atra

203/263

134/169 vés de ensaios de PCR quantitativa em tempo real utilizando iniciadores designados para detectar o gene de tolerância ao herbicida AAD1 integrado no genoma do milho. Além disso, ensaios de qPCR são utilizados para detectar a presença da sequência ligante e/ou alvo nos transformantes putativos. As plântulas transformadas selecionadas são então transferidas para uma estufa para crescimento e teste adicionais.

[00211] Transferência e estabelecimento de plantas T_o na estufa para bioensaios e produção de sementes. Quando as plantas atingem o estágio V3-V4, elas são transplantadas para dentro da mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e cultivadas para floração na estufa (Light Exposure Type: Photo or Assimilation; High Light Limit: 1200 PAR; 16 horas de duração do dia; 27Ό dia/24O à noite).

[00212] As plantas a serem utilizadas para os bioensaios de inseto são transplantadas de pequenos vasos para TINUS™ 350-4 ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canada;) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após o transplante para ROOTRAINERS®, as plantas são infestadas para o bioensaio.

[00213] As plantas da geração T₁ são obtidas através da polinização das sedas de plantas transgênicas T_o com pólen coletado de plantas de linhagem congênita não transgênica B104 ou outros doadores de pólen apropriados, e plantação das sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos são executados quando possível.

EXEMPLO 7

Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transgênico [00214] As análises moleculares (por exemplo, RT-qPCR) de tecidos de milho são executadas em amostras de folhas coletadas de plantas cultivadas em estufa no mesmo dia que o dano de alimentação

204/263

135/169 da raiz é avaliado.

[00215] Os resultados dos ensaios RT-qPCR para o gene de interesse são utilizados para validar a expressão dos transgenes. Os resultados dos ensaios RT-qPCR para a sequência de ligante (que é essencial para a formação de moléculas de dsRNA grampo de cabelo) nos RNAs expressos também podem ser utilizados para validar a presença de transcritos grampo de cabelo. Os níveis de expressão de RNA transgene são medidos em relação aos níveis de RNA de um gene de milho endógeno.

[00216] As análises qPCR do DNA para detectar uma parte da região de codificação de AAD1 no gDNA são utilizadas para estimar o número de cópias de inserção do transgene. As amostras para estas análises são coletadas de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados são comparados com os resultados da qPCR do DNA de ensaios designados para detectar uma parte de um gene nativo de cópia única, e eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes de rab5) são avançados para estudos posteriores na estufa.

[00217] Adicionalmente, os ensaios qPCR designados para detectar uma parte do gene de resistência à espectinomicina (SpecR; abrigado nos plasmídeos do vetor binário fora do T-DNA) são utilizados para determinar se as plantas transgênicas continham sequências estranhas da cadeia principal do plasmídeo.

[00218] Nível de expressão do transcrito de RNA: qPCR alvo. Eventos celulares de calo ou plantas transgênicas são analisados pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR) da sequência alvo para determinar o nível de expressão relativa do transcrito grampo de cabelo de comprimento total, em comparação com o nível de transcrição de um gene do milho interno (SEQ ID NO: 56, GENBANK Accession No. BT069734), que codifica uma proteína semelhante a TIP41 (isto é, um homólogo de milho de GENBANK Accession No. AT4G34270; tendo

205/263

136/169 uma pontuação tBLASTX de 74 % de identidade). O RNA é isolado utilizando Norgen BioTek™ Total RNA Isolation Kit (Norgen, Thorold, ΟΝ). O RNA total é submetido a um tratamento On Column DNasel SIGMA-ALDRICH) de acordo com o protocolo sugerido pelo kit. O RNA é então quantificado em um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração é normalizada para 50 ng/μΙ. O cDNA de primeiro filamento é preparado utilizando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 μΙ com 5 μΙ de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo é ligeiramente modificado para incluir a adição de 10 μΙ de T20VN oligonucleotídeo 100 μΜ (IDT) (SEQ ID NO: 57; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, onde V é A, C, ou G, e N é A, C, G, ou T/U) dentro do tubo de 1 ml de iniciador aleatório da mistura de matéria-prima, a fim de preparar uma matéria-prima de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.

[00219] Após a síntese de cDNA, as amostras são diluídas 1:3 com água livre de nuclease, e armazenadas a -20 Ό até que experimentadas.

[00220] Os ensaios de PCR em tempo real separados com relação ao gene alvo e transcrição semelhante a TIP41 são executados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volumes de reacção de 10 μΙ. Para o ensaio do gene alvo, as reações são operadas com Primers rab5 (F) (SEQ ID NO: 58) e rab5 (R) (SEQ ID NO: 59), e uma sonda IDT Custom Oligo rab5 PRB Set1, rotuladas com FAM e extintas duplamente com extintores Zen and lowa Black (SEQ ID NO: 21). Para o ensaio do gene de referência semelhante a TIP41, iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO: 60) e TIPmxR (SEQ ID NO: 61), e Probe HXTIP (SEQ ID NO: 60) marcados com HEX (hexaclorofluoresceína) são utilizados.

206/263

137/169 [00221] Todos os ensaios incluem controles negativos sem modelo (apenas mistura). Para as curvas padrão, um espaço vazio (água na fonte) também é incluído na placa de origem para verificar a contaminação cruzada da amostra. As sequências de iniciador e sonda são apresentadas na Tabela 6. As receitas de componentes da reação para a detecção dos vários transcritos são divulgadas na Tabela 7, e as condições de reação PCR são resumidas na Tabela 8. O componente fluorescente de FAM (6-carbóxi fluoresceína amidita) é estimulado com 465 nm e a fluorescência é medida em 510 nm; os valores correspondentes para o componente fluorescente de HEX (hexaclorofluoresceína) são 533 nm e 580 nm.

Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeo para análises moleculares de níveis de transcrição no milho transgênico.

Alvo	Oligonucleotídeo	SEQ ID NO.	Sequência
rab5	rab5 (F)	58	GCAGACGTATGCTGACGAA
rab5	rab5 (R)	59	TTGTTCATTCTTGGGCAGTTTC
rab5	raõ5(Sonda)	21	CTTCCGCAAAGACGGCAA- TGAACG
TIP41	TIPmxF	60	TGAGGGTAATGCCAACTGGTT
TIP41	TIPmxR	61	GCAATGTAACCGAGTGTCTCT- CAA
TIP41	HXTIP (HEX-Sonda)	62	TTTTTGGCTTAGAGTTGATGG- TGTACTGATGA

*proteína semelhante a TIP41.

Tabela 7. Receitas da reação PCR para a detecção de transcritos.

	Gene Alvo	Gene semelhante a TIP
Componente	Concentração Final
Roche Buffer	1 X	1X

207/263

138/169

rab5 (F)	0,4 μΜ	0
rab5 (R)	0,4 μΜ	0
rab5 (FAM)	0,2 μΜ	0
HEXtipZM F	0	0,4 μΜ
HEXtipZM R	0	0,4 μΜ
HEXtipZMP (HEX)	0	0,2 μΜ
cDNA (2.0 μΙ_)	NA	ΝΑ
Água	Para 10 μΙ_	Para 10 μΙ_

Tabela 8. Condições do termociclador para a qPCR de RNA.

Detecção do Gene Alvo e Gene Semelhante a TIP41

Processo	Temp.	Tempo	No. de Ciclos
Ativação do Alvo	95 Ό	10 min	1
Desnaturar	95 Ό	10 seg	40
Ampliar	60 Ό	40 seg
Adquirir FAM ou HEX	72 Ό	1 seg
Esfriar	40 Ό	10 seg	1

[00222] Os dados são analisados utilizando o LIGHTCYCLER™ Software v1.5 mediante a quantificação relativa que utiliza um segundo algoritmo máximo derivado para o cálculo de valores Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para as análises de expressão, os valores de expressão são calculados utilizando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que conta com a comparação das diferenças de valores Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 a sendo selecionado sob a suposição de que, para as reações PCR otimizadas, o produto duplica a cada ciclo.

[00223] Tamanho e integridade do transcrito grampo de cabelo: Ensaio de Northern Blot. Em alguns casos, a caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida através do uso da análise de Northern Blot (mancha de RNA) para determinar o tamanho mole

208/263

139/169 cular do RNA grampo de cabelo de rab5 nas plantas transgênicas que expressam um dsRNA de rab5.

[00224] Todos os materiais e equipamentos são tratados com RNASEZAP (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. As amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos SAFELOCK EPPENDORF de 2 ML, divididas com um pulverizador tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA), com três esferas de tungstênio em 1 ml de TRIZOL (INVITROGEN) durante 5 min, depois incubadas na temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas durante 10 min a 4 Ό em 11000 rpm e o sobrenadante é transferido para dentro de um novo tubo de 2 mL SAFELOCK EPPENDORF. Depois 200 pl de clorofórmio são adicionados ao homogeneizado, o tubo é misturado por inversão durante 2 a 5 min, incubado na RT durante 10 minutos, e centrifugado a 12.000 x g durante 15 min a 4 Ό. A fase superior é transferid a para dentro de um tubo de EPPENDORF de 1,5 ml esterilizado, 600 μΙ de isopropanol a 100 % são adicionados, seguido pela incubação na RT durante 10 min a 2 h, e em seguida centrifugada a 12.000 x g durante 10 min em 4 Ό a 25 Ό. O sobrenadante é descartado e o grânulo de RNA é lavado duas vezes com 1 ml de etanol a 70 %, com centrifugação a 7500 x g durante 10 min em 4 Ό a 25 Ό entre as lavagens. O etanol é descartado e o grânulo é secado ao ar livre com brevidade durante 3 a 5 min antes de colocar novamente em suspensão com 50 μΙ de água livre de nuclease.

[00225] O RNA total foi quantificado utilizando o NANODROP8000® (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas para 5 pg/10 μΙ. 10 μΙ de glioxal (AMBION/INVITROGEN) são depois adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura marcadora padrão de RNA DIG (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) são dispensados e adicionados a um volume igual de glioxal. As amostras e os RNAs

209/263

140/169 marcadores são desnaturadas a 50 Ό durante 45 min e armazenadas em gelo até que uma carga em um gel de agarose SEAKEM GOLD A

1,25 % (LONZA, Allendale, NJ) com tampão de operação de glioxal NORTHERNMAX 10 X (AMBION/INVITROGEN). Os RNAs são separados por eletroforese a 65 volts/30 mA durante 2 horas e 15 minutos. [00226] Após a eletroforese, o gel é enxaguado em 2X SSC durante 5 min e representado em uma estação GEL DOC (BIORAD, Hercules, CA), depois o RNA é passivamente transferido para uma membrana de náilon (MILLIPORE) durante a noite na RT, utilizando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste emcloreto de sódio 3 M e citrato trissódico 300 mM, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é enxaguada em 2X SSC durante 5 minutos, o RNA é reticulado por UV na membrana (AGILENT/STRATAGENE), e a membrana é deixada secar na temperatura ambiente durante 2 dias.

[00227] A membrana é pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB™ (AMBION/INVITROGEN) durante 1 a 2 horas. A sonda consiste emum produto amplificado pela PCR contendo a sequência de interesse, marcada com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridização em tampão recomendado é realizada durante a noite em uma temperatura de 60 Ό em tubos de hibridização. Após a hibridização, a mancha é submetida a lavagens com DIG, embrulhada, exposta à película durante 1 a 30 minutos, depois a película é desenvolvida, tudo pelos métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.

Determinação do número de cópias do transgene.

[00228] Pedaços de folhas de milho aproximadamente equivalentes a 2 punções de folha são coletadas em placas de coleta de 96 reservatórios (QIAGEN). A dilaceração do tecido é executada com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um BIOS

210/263

141/169

PRINT96 PLANT KIT; QIAGEN) com uma esfera de aço inoxidável. Após a maceração dos tecidos, o DNA genômico (gDNA) é isolado no formato de alto rendimento utilizando um BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô extração BIOSPRINT96. O DNA genômico é diluído 1:3 DNA:água antes da configuração da reação qPCR.

[00229] Análise da qPCR. A detecção de transgene através do ensaio de sonda de hidrólise é executada por PCR em tempo real utilizando um sistema LIGHTCYCLER®480. Os oligonucleotídeos a serem utilizados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar o gene alvo, a sequência de ligação (por exemplo, a alça), e/ou para detectar uma parte do gene SpecR (isto é, o gene de resistência a espectinomicina gerado nos plasmídeos de vetor binário; SEQ ID NO: 63; SPC1 oligonucleotídeos na Tabela 9), são projetados utilizando LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Além disso, os oligonucleotídeos a seren utilizados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância a herbicida AAD-1 (SEQ ID NO: 64; oligonucleotídeos GAAD1 na Tabela 9) são projetados utilizando o software PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e sondas. Os ensaios são multiplexados com reagentes para um gene cromossômico do milho endógeno (invertase (SEQ ID NO: 65; GENBANK Accession No: U16123; aqui referido como IVR1), que serve como uma sequência de referência interna para garantir que o gDNA esteja presente em cada ensaio. Para a amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (ROCHE APPLIED SCIENCE) é preparada na concentração final 1x em uma reação multiplex de 10 μΙ em volume contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação de duas etapas é executada como delineado na Tabela 11. A ativação e emissão fluoróforo para as sondas marcadas com FAM e HEX são como descritas acima; os conjugados Cy5 são estimulados

211/263

142/169 no máximo em 650 nm e fluorescência no máximo em 670 nm.

[00230] As pontuações Cp (o ponto em que o sinal de fluorescência atravessa o limiar de segundo plano) são determinadas a partir dos dados da PCR em tempo real utilizando o algoritmo de ajuste de pontos (liberação de LIGHTCYCLER® SOFTWARE 1.5) e o módulo Relative Quant (baseado no método DDCt). Os dados são manipulados como descrito anteriormente (acima; qPCR do RNA).

Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) para a determinação do número de cópias do gene e detecção da cadeia principal do plasmídeo de vetor binário.

Nome	SEQ ID
NO:	Sequência
Loop- F	75	GGAACGAGCTGCTTGCGTAT
Loop- R	76	CACGGTGCAGCTGATTGATG
Loop-P (FAM)	77	TCCCTTCCGTAGTCAGAG
GAAD1-F	66	TGTTCGGTTCCCTCTACCAA
GAAD1-R	67	CAACATCCATCACCTTGACTGA
GAAD1-P (FAM)	68	CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA
IVR1-F	69	TGGCGGACGACGACTTGT
IVR1-R	70	AAAGTTTGGAGGCTGCCGT
IVR1-P (HEX)	71	CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC
SPC1A	72	CTTAGCTGGATAACGCCAC
SPC1S	73	GACCGTAAGGCTTGATGAA
TQSPEC (CY5*)	74	CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA

CY5 = Cianina-5

212/263

143/169

Tabela 10. Componentes de reação para as análises do número de cópias do gene e detecção da cadeia principal do plasmídeo.

Componente	Amt. (pL)	Matériaprima	Conc. Final
2x Tampão	5,0	2x	1χ
Iniciador Direto Apropriado	0,4	10 μΜ	0,4
Iniciador Reverso Apropriado	0,4	10 μΜ	0,4
Sonda Apropriada	0,4	5 μΜ	0,2
IVR1-Iniciador Direto	0,4	10 μΜ	0,4
IVR1-Iniciador Reverso	0,4	10 μΜ	0,4
IVR1-Sonda	0,4	5 μΜ	0,2
H2O	0,6	NA*	NA
gDNA	2,0	ND**	ND
Total	10,0

*NA = Não Aplicável **ND = Não Determinado

Tabela 11. Condições do termociclador para a qPCR do DNA.

Análises genômicas do número de cópias
Processo	Temp.	Tempo	No. de Ciclos
Ativação do Alvo	95 °C	10 min	1
Desnaturar	95 °C	10 seg	40
Ampliar & Adquirir FAM, HEX, ou CY5	60 °C	40 seg
Esfriar	40 °C	10 seg	1

EXEMPLO 8

Bioensaio do Milho Transgênico [00231] Bioensaios de Inseto in vitro. A bioatividade do dsRNA da presente divulgação produzida nas células vegetais é demonstrada através de métodos de bioensaio. Ver, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. Se é capaz de demonstrar a

213/263

144/169 eficácia, por exemplo, através da alimentação de vários tecidos vegetais ou pedaços de tecido derivados de uma planta que produz um dsRNA inseticida para os insetos alvos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados a partir de vários tecidos vegetais derivados de uma planta que produz o dsRNA inseticida, e os ácidos nucléicos extraídos são dispensados além das dietas artificiais para os bioensaios como aqui anteriormente descrito. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com os bioensaios conduzidos de forma semelhante, que empregam tecidos de controle apropriados a partir de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida, ou a outras amostras de controle.

[00232] Bioensaios de Insetos com Eventos de Milho Transgênico. Duas larvas da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) chocadas de ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada reservatório da bandeja de bioensaio. Os reservatórios são depois cobertos com uma cobertura de adesivos PULL Ν' PEEL (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocados em uma incubadora a 28 Ό com um ciclo de 18 h/6 h luz/escuro. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, a qual é calculada como a porcentagem de insetos mortos fora o número total de insetos em cada tratamento. As amostras de inseto são congeladas a -20 Ό durante dois dias, depois a larvas de inseto de cada tratamento são reunidas e pesadas. A porcentagem de inibição de crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pela média do peso médio dos dois tratamentos de reservatório de controle. Os dados são expressos como uma inibição de crescimento percentual (dos controles negativos). Os pesos médios que excedem o peso médio de controle são normalizados para zero.

[00233] Bioensaios de insetos na estufa. Os ovos da larva da raiz

214/263

145/169 do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) são recebidos no solo de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Os ovos de WCR são incubados a 28 °C durante 10 a 11 dias. Os ovos são lavados do solo, colocados em uma solução de ágar a 0,15 %, e a concentração é ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por 0,25 ml de alíquota. Uma placa planejada é configurada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovos para monitorar as taxas de incubação.

[00234] O solo ao redor das plantas de milho que crescem em ROOTRANERS® é infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos são deixados alimentar durante 2 semanas, após o que a Avaliação da Raiz é dada a cada planta. A Node-Injury Scale é utilizada para a classificação, essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol. 98:1-8. As plantas que passaram este bioensaio são transplantadas para vasos de 5 galões para a produção de sementes. Os transplantes são tratados com inseticida para evitar mais danos com a larva da raiz e liberação de insetos nas estufas. As plantas são polinizadas manualmente para a produção de sementes. As sementes produzidas por essas plantas são guardadas para avaliação no T1 e para as gerações subsequentes das plantas.

[00235] As plantas de controle negativo transgênicas são geradas por transformação com vetores que abrigam os genes designados para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP). Os bioensaios são conduzidos com controles negativos em cada conjunto de matérias vegetais. Algumas construções forneceram proteção de raiz da WCR (Tabela 12).

215/263

146/169

Tabela 12. Resultados do bioensaio em estufa e análises moleculares de plantas de milho de expressão de rab5 e plantas de controle de YFP

Amostra ID	Gene de Interesse	ssRNA	dsRNA	Avaliação da Raiz
Eventos de rab5
126163[1 ]-001	rab5			1
126163[1 ]-002	rab5	0,693	4,438	1
126163[1]-003	rab5	0,457	2,790	1
126163[1 ]-008	rab5	0,415	4,857	1
126163[1]-011	rab5	4,113	24,252	0,05
126163[1 ]-012	rab5	1,636	7,728	0,1
126163[1 ]-015	rab5	2,621	11,876	0,25
126163[1 ]-016	rab5	1,079	8,225	0,5
126163[1 ]-019	rab5	2,412	9,254	1
126163[1 ]-020	rab5	0,933	3,945	1
126163[1 ]-021	rab5	2,81	12,996	0,25
126163[1 ]-023	rab5	1,266	6,105	0,75
126163[1 ]-025	rab5			0,05
126163[1 ]-026	rab5	1,717	9,580	0,5
Eventos de YFP
126944[5]-026	YFPv2			1
126944[6]-031	YFPv2			1
126944[7]-038	YFPv2			1
126944[7]-051	YFPv2			1
126944[7]-052	YFPv2			1
EXEMPLO 9: Zea mays Transgênico compreendend	o as Sequências

de Praga Coleóptera

216/263

147/169 [00236] Dez a 20 plantas Zea mays transgênicas T_o são geradas como descrito no EXEMPLO 6. Uma outra linhagem independente de Zea mays 10-20 T₁ que expressa o dsRNA grampo de cabelo para uma construção de RNAi é obtida para o desafio com a larva da raiz do milho. O dsRNA grampo de cabelo pode ser derivada compreendendo uma parte da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5. Os dsRNA grampo de cabelo adicionais podem ser derivados, por exemplo, das sequências de praga de coleóptera tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2013/0097730), ROP (Pedido de Patente U.S. No. 14/577.811), RNA polimerase 11140 (Pedido de Patente U.S. No. 14/577.854), RNA polimerase 11 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133.214), RNA polimerase 11215 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133.202), RNA polimerase 33 (Pedido de Patente U.S. No. 62/133.210), nem (Pedido de Patente U.S. No. 62/095.487), Dre4 (Pedido de Patente U.S. No. 14/705.807), COPI alpha (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.203), COPI gamma (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.192), ou COPI delta (Pedido de Patente U.S. No. 62/063.216). Estes são confirmadas através da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA totais a partir das linhagens T₁ independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RT-PCR com iniciadores designados para se ligarem no ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada uma das construções de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em uma

217/263

148/169 construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada planta Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA grampo de cabelo dos genes alvo em siRNA é subsequentemente de forma opcional confirmado nas linhagens transgênicas independentes utilizando as hibridizações da mancha de RNA.

[00237] Além do mais, as moléculas de RNAi tendo sequências de ligação imperfeita com mais do que 80 % de identidade de sequência com os genes alvo afetam as larvas da raiz do milho de uma forma semelhante àquela observada com as moléculas de RNAi tendo 100 % de identidade de sequência com os genes alvo. O emparelhamento da sequência de ligação imperfeita com sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo na mesma construção de RNAi libera os siRNAs processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade das pragas coleópteras na alimentação.

[00238] A liberação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA que corresponde aos genes alvo e a subsequente absorção pelas pragas coleópteras através da alimentação resulta na infra-regulação dos genes alvo na praga coleóptera através do silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga coleóptera é afetada, e no caso de pelo menos um das WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella, e

D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva ao fracasso de infestar, alimentar, desenvolver e/ou reproduzir com sucesso, ou leva à morte da praga coleóptera. A escolha dos genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então utilizadas para controlar as pragas coleópteras.

[00239] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transgêni

218/263

149/169 cas e Zea mays não transformada. Os genes de pragas coleópteras alvos ou as sequências selecionadas para a criação de dsRNA grampo de cabelo não possuem nenhuma semelhança com qualquer sequência de gene de plantas conhecidas. Em consequência, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) através de construções que direcionam estes genes ou sequências de pragas coleópteras terá qualquer efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com as plantas não transformadas, assim como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio não tendo nenhum gene de expressão grampo de cabelo. As características da raiz, broto, folhagem e reprodução da planta são comparadas. As características de broto da planta tais como a altura, número de folhas e tamanho, tempo de floração, tamanho floral e aparência, são registradas. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 10

Zea mays Transgênica compreendendo uma Sequência de Praga Coleóptera e Construções de RNAi Adicionais [00240] Um planta Zea mays transgênica que compreende uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita para uma molécula de iRNA que direciona um organismo diferente de uma praga coleóptera, é secundariamente transformada através das metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticida (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID

219/263

150/169

NO: 5). Os vetores plasmídeos de transformação da planta preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados por meio de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ nas células em suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos de uma planta Zea mays Hi II ou B104 transgênica, compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona um organismo diferente de uma praga coleóptera.

EXEMPLO 11

Zea mays Transgênica compreendendo uma Construção de RNAi e Sequências Adicionais de Controle de Praga Coleóptera [00241] Um planta Zea mays transgênica que compreende uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita para uma molécula de iRNA que direciona um organismo de praga coleóptera (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA que direciona um gene compreendendo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5) é secundariamente transformada através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (ver Petolino and Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de proteína inseticida, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3 ou Cry34/Cry35Ab1. Os vetores plasmídeos de transformação de planta preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados por meio de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ nas células em suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos de uma planta Zea mays transgênica B104, compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que direciona um organismo de praga coleóptera. As plantas duplamente transformadas são obtidas as quais produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de

220/263

151/169 pragas coleópteras.

EXEMPLO 12

Mortalidade de Percevejo Marrom Neotropical (Euschistus heros) após injeção de RNAi de rab5 [00242] Colônia de Percevejo Marrom Neotropical (BSB; Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora a 27 Ό, em umidade relativa de 65 %, com ciclo de 16:8 horas luz:escuro. Um grama de ovos coletados ao longo de 2 a 3 dias foram semeadas em recipientes de 5 L com discos de papel filtro na parte inferior; os recipientes foram cobertos com malha #18 para ventilação. Cada recipiente de criação rendeu aproximadamente de 300 a 400 BSB adultos. Em todos os estágios, os insetos foram alimentados com feijão verde fresco três vezes por semana, um sache de mistura de sementes que continha sementes de girassol, soja e amendoim (3:1:1 em relação de peso) foi substituído uma vez por semana. A água foi fornecida em frascos com tampões de algodão como pavios. Após as duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para um novo recipiente uma vez por semana.

[00243] Dieta artificial para BSB; dieta artificial para BSB foi preparada como se segue (utilizada dentro de duas semanas da preparação). Feijão verde liofilizado foi misturado em um pó fino com um misturador MAGIC BULLET®, enquanto que amendoins em estado natural (orgânicos) foram misturados em um misturador separado MAGIC BULLET®. Os ingredientes secos misturados foram combinados (porcentagens em peso: feijão verde, 35 %; amendoim, 35 %; sacarose, 5 %; complexo vitamínico (por exemplo, Vanderzant Vitamin Mixture para insetos, SIGMA-ALDRICH, Catalog No. V1007), 0,9 %); em um grande misturador MAGIC BULLET®, o qual foi tampado e bem agitado para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos misturados foram então adicionados a uma tigela de mistura. Em um recipiente

221/263

152/169 separado, água e agente anti-fúngico de benomila (50 ppm; 25 pl de uma solução de 20000 ppm/50 ml de solução de dieta) foram bem misturados e depois adicionados na mistura de ingredientes seco. Todos os ingredientes foram misturados à mão até que a solução foi totalmente misturada. A dieta foi moldada em tamanhos desejados, embrulhada frouxamente em folha de alumínio, aquecida durante 4 horas a 60O, depois esfriada e armazenada a 4Ό.

[00244] Montagem de transcriptoma de BSB. Seis estágios de desenvolvimento de BSB foram selecionados para a preparação da biblioteca de mRNA. O RNA total foi extraído de insetos congelados a 70Ό e homogeneizado em 10 volumes de tampão de Lise/Ligação em tubos de 2 ml de Lysing MATRIZ A (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) em um FastPrep®-24 Instrument (MP BIOMEDICALS). O mRNA total foi extraído utilizando um mirVana™ miRNA Isolation Kit (AMBION; INVITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequenciamento de RNA utilizando um sistema illumina® HiSeq™ (San Diego, CA) forneceu sequências do gene alvo candidato para uso na tecnologia de controle de inseto por RNAi. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra utilizando o software assembler TRINITY™ (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). Os transcritos montados foram combinados para gerar uma transcriptoma reunida. Esta transcriptoma reunida de BSB continha 378.457 sequências.

[00245] Identificação ortóloga do rab5 de BSB. Uma busca tBLASTn da transcriptoma reunida de BSB foi executada utilizando como consulta a isoforma A da proteína rab5 de Drosophila através das sequências I: GENBANK Accession Nos. NP_722795, NP_722796, NP_722797, NP_722798, NP_523457, NP_722799, NP_001259925, NP_001259926, e NP_001259927. O rab5 de BSB

222/263

153/169 (SEQ ID NO: 78) foi identificado como um produto do gene alvo candidato de Euschistus heros com a sequência de peptídeo prevista SEQ ID NO: 79.

[00246] Preparação modelo e síntese de dsRNA. O cDNA foi preparado a partir do RNA de BSB total extraído de um único inseto adulto jovem (cerca de 90 mg) utilizando TRIzol® Reagent (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizado na temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 200 μΙ de TRIzol®, utilizando um pilão de grânulos (FISHERBRAND Catalog No. 12-141-363) e Pestle Motor Mixer (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Após a homogeneização, um adicional de 800 μΙ de TRIzol® foi adicionado, o homogeneizado foi submetido a vórtice, e depois incubado na temperatura ambiente durante cinco minutos. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Seguinte ao protocolo de extração com TRIzol® recomendado pelo fabricante para 1 ml de TRIzol®, o grânulo de RNA foi secado na temperatura ambiente e colocado novamente em suspensão em 200 μΙ de Tris Buffer de um GFX PCR DNA AND GEL EXTRACTION KIT (illustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) utilizando Elution Buffer Type 4 (isto é, 10 mM Tris-HCI; pH 8,0). A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).

[00247] Amplificação de cDNA. O cDNA foi transcrito reverso a partir de 5 pg de modelo de RNA total de BSB e iniciador de oligo dT, utilizando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ para a RT-PCR (INVITROGEN), seguindo o protocolo recomendado pelo fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi levado a 100 μΙ com água livre de nuclease.

[00248] Os iniciadores BSB_ rab5-1-For (SEQ ID NO: 82) e BSB_ raó5-1-Rev (SEQ ID NO: 83) foram utilizados para amplificar

223/263

154/169

BSB_rab5-1 região 1, também referido como modelo BSB_rab5 regí. Os iniciadores de BSB_raô5-v1-For (SEQ ID NO: 84) e BSB_rab5-v1Rev (SEQ ID NO: 85) foram utilizados para amplificar BSB_rab5-1 versão 1, também reerido como BSB_rab5-1 v1 modelo. O modelo de DNA foi amplificado pela PCR de aterragem (temperatura de recozimento reduzida de 60 Ό para 50 Ό, em uma diminuiç ão de 1 O/ciclo) com 1 pl de cDNA (acima) como o modelo. O fragmento que compreende um segmento de 283 pb de BSB_raô5-1 regí (SEQ ID NO: 80) e um segmento de 121 bp de BSB_raô5-1 v1 (SEQ ID NO: 81) foi gerado durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima também foi utilizado para amplificar um modelo de controle negativo de 301 pb YFPv2 (SEQ ID NO: 87), utilizando iniciadores de YFPv2-F (SEQ ID NO: 88) e YFPv2-R (SEQ ID NO: 86). Os iniciadores de BSB_ rab5 e YFPv2 continham uma sequência de promotor de fago T7 (SEQ ID NO: 11) nas suas extremidades 5', e assim permitiu o uso de fragmentos de DNA de YFPv2 e BSB_rab5 para a transcrição do dsRNA.

[00249] Síntese de dsRNA. O dsRNA foi sintetizado utilizando 2 μΙ do produto da PCR (acima) como o modelo com um kit MEGAscript™ RNAi (AMBION) utilizado de acordo com as instruções do fabricante. (Ver a FIG. 1). O dsRNA foi quantificado em um espectrofotômetro NANODROP™ 8000, e diluído a 500 ng/μΙ em tampão 0,1X TE livre de nuclease (1 mM Tris HCI, 0,1 mM EDTA, pH 7,4).

[00250] Injeção de dsRNA no hemocelo de BSB. BSB foram criados com uma dieta de feijão verde e sementes, como a colônia, com uma incubadora a 27Ό em 65 % de umidade relativa e fotoperíodo de luz:escuro de 16:8. As ninfas de segundo instar (cada uma pesando de 1 a 1,5 mg) foram suavemente manipuladas com uma escova pequena para evitar lesões, e foram colocadas em uma placa de Petri sobre gelo para acalmar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de uma solução de dsRNA de 500 ng/μΙ (isto é, 27,6 ng de

224/263

155/169 dsRNA; dose de 18,4 a 27,6 pg/g de peso corporal). As injeções foram executadas utilizando um injetor NANOJECT™ II (DRUMMOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA), equipado com uma agulha de injeção puxada a partir de um capilar de vidro Drummond de 3,5 polegadas #3-000203-G/X. A ponta da agulha foi quebrada, e o capilar foi preenchido com óleo mineral leve e depois suprido com 2 a 3 pl de dsRNA. O dsRNA foi injetado no abdômen das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por ensaio), e os testes foram repetidos em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por reservatório) foram transferidos para dentro de bandejas com 32 reservatórios (Bio-RT-32 Rearing Tray; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo um grânulo de dieta artificial para BSB, e cobertas com adesivos Pull-N-Peel™ (BIO-CV-4; BIOSERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 ml de água em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com uma mecha de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5 °C, 60 % de umidade e fotoperíodo de 16:8 horas luz:escuro. As contagens de viabilidade e os pesos foram tomados no dia 7 após as injeções.

[00251] Injeções identificadas rab5 de BSB como um alvo letal de dsRNA; o dsRNA que direciona o segmento da região de codificação de YFP, a YFP foi utilizada como um controle negativo em experiências de injeção em BSB. Como resumido na Tabela 13, 27,6 ng de dsRNA de BSB_rab5 regí no hemocelo de ninfas de BSB de 2- instar produziram mortalidade dentro de sete dias. A mortalidade provocada por dsRNA de BSB_rab5 regí foi significativamente diferente daquela observada com a mesma quantidade de dsRNA de YFPv2 injetado (controle negativo), com p = 0,00263 (teste t de Student).

Tabela 13. Resultados da injeção de dsRNA de BSB_rab5 regí no hemocele de ninfas de percevejo marrom de 2- instar sete dias após a injeção.

225/263

156/169

Tratamento*	N Ensaios	Mortalidade % Média ± SEM**	valor p teste t
BSB rab5-1 regí	3	89 ± 6,4	2,63E-03
Não injetado	3	3 ±3,3	5,61 E-01
dsRNA de YFPv2	3	10± 10	—

*Dez insetos injetados por ensaio para cada dsRNA.

**Erro padrão da media

EXEMPLO 13

Zea mays Transgênica compreendendo Sequências de Praga Hemíptera [00252] Dez a 20 plantas Zea mays transgênicas T_o que abrigam vetores de expressão para ácidos nucléicos que compreendem as SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 e/ou SEQ ID NO: 81 são geradas como descrito no EXEMPLO 7. Mais 10 a 20 linhagens independentes de Zea mays Ή que expressam o dsRNA grampo de cabelo para uma construção de RNAi são obtidas para desafio de BSB. O dsRNA grampo de cabelo pode ser derivado como apresentado na SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, ou de outra maneira ainda compreendendo a SEQ ID NO: 78. Estes são confirmadas por meio da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA totais a partir das linhagens Ή independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RT-PCR com iniciadores designados para se ligar no ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada uma das construções de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em uma construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção dos mRNA pré-processados requeridos para a produção de siRNA in planta. A amplificação das

226/263

157/169 faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada planta Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA grampo de cabelo dos genes alvo no siRNA é subsequentemente de forma opcional confirmado nas linhagens transgênicas independentes utilizando as hibridizações de RNA.

[00253] Além do mais, as moléculas de RNAi tendo sequências de ligação imperfeita com mais do que 80 % de identidade de sequência com os genes alvo afetam os vermes da raiz de um modo semelhante àquele observado com as moléculas de RNAi tendo 100 % de identidade de sequência com os genes alvo. O emparelhamento da sequência de ligação imperfeita com as sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo na mesma construção de RNAi libera siRNAs processados na planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pragas hemípteras na alimentação.

[00254] A liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA ou miRNA que corresponde aos genes alvo e a absorção subsequente por pragas hemípteras através da alimentação resulta em infra-regulação dos genes alvo na praga hemíptera através do silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução da praga hemíptera é afetado, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus leva ao fracasso para infestar, alimentar, desenvolver e/ou reproduzir com sucesso, ou leva à morte da praga hemíptera. A escolha dos genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então utilizadas para controlar as pragas hemípteras.

[00255] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays não transformada. Os genes de praga hemíptera alvo ou sequências selecionadas para a criação de dsRNA grampo de ca

227/263

158/169 belo não possuem nenhuma semelhança com qualquer sequência conhecida de genes de plantas. Portanto, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) através de construções que direcionam esses genes ou sequências de praga hemíptera terá qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com as plantas não transformadas, assim como aquelas das linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio não tendo nenhum gene de expressão grampo de cabelo. A raiz, broto, folhagem da planta e as características reprodução são comparadas. Não há nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento e crescimento da raiz de plantas transgênicas e não transformadas. As características de broto da planta tais como altura, número e tamanho das de folhas, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 14

Glycine Max Transgênica compreendendo Sequências de Praga Hemíptera [00256] Dez a 20 plantas transgênicas T_o de Glycine max que abriga os vetores de expressão para ácidos nucléicos compreendendo as SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 e/ou SEQ ID NO: 81 são geradas como é conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, através da transformação mediada por Agrobacterium, como se segue. Sementes de soja maduras (Glycine max) são esterilizadas durante a noite com gás de cloro durante dezesseis horas. Após a esterilização com gás de cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma coifa de fluxo LAMINAR™ para dissipar o gás de cloro. Logo depois, as se

228/263

159/169 mentes esterilizadas são embebidas com H₂O estéril durante dezesseis horas no escuro utilizando uma caixa preta a 24 Ό.

[00257] Preparação de soja com semente dividida. A semente de soja dividida compreendendo uma parte de um protocolo de eixo embrionário requer a preparação do material de semente de soja que é cortado longitudinalmente, utilizando uma lâmina de #10 afixada a um bisturi, ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento da semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédones. Atenção especial é feita para remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 a 1/3 do eixo do embrião permanece ligado à extremidade nodal do cotilédone.

[00258] Inoculação. As sementes de soja divididas compreendendo uma parte parcial dos eixos embrionários são então imersas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo um plasmídeo binário compreendendo a SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80 e/ou SEQ ID NO: 81. A solução de Agrobacterium tumefaciens é diluída para uma concentração final de λ = 0,6 OD₆₅₀ antes da imersão dos cotilédones que compreendem o eixo do embrião.

[00259] Cocultivo. Após a inoculação, a semente de soja dividida é deixada co-cultivar com a cepa de Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias em meio de co-cultivo (Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2.

1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel filtro.

[00260] Indução de brotos. Após 5 dias de co-cultivo, as sementes de soja divididas são lavadas em meio líquido de indução de brotos (SI) que consiste emsais B5, vitaminas B5, 28 mg/L de ferrosos, 38 mg/L de Na₂EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então culti

229/263

160/169 vadas no meio de indução de brotos I (SI I) que consiste emsais B5, vitaminas B5, 7 g/L de ágar Noble, 28 mg/L de terrosos, 38 mg/L de Na₂EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 50 mg/L TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone voltado para cima e a extremidade nodal do cotilédone embutida no meio. Após 2 semanas de cultivo, os explantes da semente de soja dividida transformada são transferidos para o meio de indução de brotos II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (LIBERTY®).

[00261] Alongamento do broto. Após 2 semanas de cultivo em meio SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma esponja de broto nivelada que contém o eixo embrionário é cortada por fazer um corte na base do cotilédone. A esponja de broto isolada do cotilédone é transferida para o meio de Alongamento de Broto (SE). O meio SE consiste emsais de MS, 28 mg/L de ferrosos, 38 mg/L de Na₂EDTA, 30 g/l de sacarose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 0,1 mg/L de IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de ribosídeo de zeatina, 50 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato, e 7 g/L de ágar Noble, (pH 5,7). As culturas são transferidas para o meio SE novo a cada 2 semanas. As culturas são desenvolvidas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24 Ό com um fotoperíodo de 18 h em uma intensidade luminosa de 80 a 90 pmol/m²seg.

[00262] Enraizamento. Os brotos alongados que se desenvolveram a partir da esponja de broto cotilédone são isolados através do corte do broto alongado na base da esponja de broto cotilédone, e imersão do broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido indol 3-butírico) durante 1 a 3 minutos para promover o enraizamento. Depois disso, os brotos alongados são transferidos para meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, 28 mg/L de ferrosos, 38 mg/L de Na₂EDTA, 20 g/L de

230/263

161/169 sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 7 g/L de ágar Noble, pH 5,6) em bandejas de phyta.

[00263] Cultivo. Após o cultivo em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24 Ό, fotoperíodo de 18 h, durante 1 a 2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de solo em um copo de sundae coberto e colocados em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) sob condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuridão) em uma intensidade de luz de 120 a 150 mmol/m²seg sob temperatura (22 Ό) e umidade (40 a 50 %) constantes para aclimatação das plantinhas. As plantinhas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes que elas sejam transferidas para a estufa para posterior aclimatização e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.

[00264] Mais de 10 a 20 linhagens independentes de Glycine max Ή expressando o dsRNA grampo de cabelo para uma construção de RNAi são obtidas para o desafio de BSB. O dsRNA grampo de cabelo pode ser o derivado como apresentado nas SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, ou de outra maneira ainda compreendendo a SEQ ID NO: 78. Estes são confirmados por meio da RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA totais a partir das linhagens Ϊ! independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para a RT-PCR com iniciadores designados para se ligar no ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada uma das construções de RNAi. Além disso, os iniciadores específicos para cada gene alvo em uma construção de RNAi são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA de pré-processado requerido para a produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas de

231/263

162/169 sejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada planta Glycine max transgênica. O processamento do dsRNA grampo de cabelo dos genes alvo em siRNA é subsequentemente de modo opcional confirmado nas linhagens transgênicas independentes utilizando hibridizações da mancha de RNA.

[00265] Além do mais, as moléculas de RNAi tendo sequências de ligação imperfeita com mais do que 80 % de identidade de sequência com os genes alvo afetam os vermes da raiz do milho de um modo semelhante àquele observado com as moléculas de RNAi tendo 100 % de identidade de sequência com os genes alvo. O emparelhamento da sequência de ligação imperfeita com as sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo na mesma construção de RNAi, libera os si RN As processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade das pragas hemípteras na alimentação.

[00266] Na liberação in planta de dsRNA, siRNA, shRNA ou miRNA que corresponde aos genes alvo e a absorção subsequente pelas pragas hemípteras através da alimentação resulta na infra-regulação dos genes alvo na praga hemíptera através do silenciamento do gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução da praga hemíptera são afetados, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara virídula, Acrosternum hilare e Euschistus servus leva ao fracasso de infestar, alimentar, desenvolver e/ou reproduzir com sucesso, ou leva à morte da praga hemíptera. A escolha dos genes alvo e a aplicação bem sucedida do RNAi são então utilizadas para controlar as pragas hemípteras.

[00267] Comparação fenotípica das linhagens de RNAi transgênicas e Glycine Max não transformada. Os genes da praga hemíptera

232/263

163/169 alvo ou as sequências selecionadas para a criação de dsRNA grampo de cabelo não possuem nenhuma semelhança com qualquer sequência conhecida de genes de plantas. Portanto, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) através de construções que direcionam esses genes ou sequências de praga hemíptera terá qualquer efeito deletério sobre as plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, assim como aquelas das linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio não tendo nenhum gene que expressão grampo de cabelo. Raiz, broto, folhagens e características de reprodução da planta são comparadas. Não existe nenhuma diferença observável nos padrões de comprimento e crescimento da raiz das plantas transgênicas e não transformadas. As características de broto da planta tais como altura, número e tamanho das folhas, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológica observável entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e no solo na estufa.

EXEMPLO 15 Bioensaios de E. heros na Dieta Artificial.

[00268] Nos ensaios de alimentação com dsRNA na dieta artificial, bandejas de 32 reservatórios são configuradas com um grânulo de ~18 mg de dieta artificial e água, como para as experiências de injeção (ver o EXEMPLO 12). O dsRNA em uma concentração de 200 ng/μΙ é adicionado ao grânulo de alimento e amostra de água; 100 μΙ a cada um dos dois reservatórios. Cinco ninfas de E. heros de 2- instar são introduzidas em cada reservatório. As amostras de água e dsRNA que direciona um transcrito de YFP são utilizadas como controles negativos. As experiências são repetidas em três dias diferentes. Os insetos so

233/263

164/169 breviventes são pesados, e as taxas de mortalidade são determinadas após 8 dias de tratamento.

EXEMPLO 16

Arabidopsis thaliana Transgênica compreendendo Sequências de Praga hemíptera [00269] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo uma construção de gene alvo para a formação grampo de cabelo compreendendo segmentos de rab5 (SEQ ID NO: 78) são gerados utilizando métodos moleculares padrão semelhantes ao EXEMPLO 4. A transformação de Arabidopsis é executada utilizando procedimentos à base de Agrobacterium padrão. As sementes T₁ são selecionadas com o marcador selecionável de tolerância ao glufosinato. As plantas de Arabidopsis Ϊ! transgênicas são geradas e as plantas transgênicas T₂ de cópia isolada homozigotas são geradas para estudos de inseto. Os bioensaios são executados no crescimento de plantas Arabidopsis com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados em cada planta e monitorados com relação à sobrevivência dentro de 14 dias.

[00270] Construção de vetores de transformação de Arabidopsis. Clones de entrada com base em um vetor de entrada que abriga uma construção de gene alvo para a formação grampo de cabelo que compreende um segmento de rab5 (SEQ ID NO: 78) são montados utilizando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação grampo de cabelo intramolecular através de transcritos primários de RNA é facilitada pela disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento de gene alvo em orientações opostas, os dois segmentos sendo separados por uma sequência ligante (por exemplo, um circuito (tal como a SEQ ID NO: 116) or uma sequência de íntron ST-LS1 (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2): 245-50)). Assim, o transcrito de mRNA pri

234/263

165/169 mário contém as duas sequências de segmento de gene rab5 como grandes repetições invertidas entre si, separadas pela sequência ligante. Uma cópia de um promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493) é utilizada para acionar a produção do transcrito grampo de cabelo de mRNA primário, e um fragmento que compreende uma região não transladada 3’ da estrutura de leitura aberta 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; Patente U.S. N² 5.428.147) é utilizado para terminar a transcrição do gene de expressão do RNA grampo de cabelo.

[00271] Os clones grampo de cabelo dentro de um vetor de entrada descrito acima são utilizados na reação de recombinação padrão GATEWAY® com um vetor de destino binário típico para produzir vetores de transformação da expressão de RNA grampo de cabelo para a transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium.

[00272] O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicida, DSM-2v2 (Publicação de Patente U.S. No. 2011/0107455), sob a regulação de um promotor do vírus do mosaico da veia da Mandioca (CsVMV Promotor v2, Patente U.S. N² 7.601.885; Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139). Um fragmento compreendendo uma região não transladada 3’ de estrutura de leitura aberta 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORFI 3' UTR v6; Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822) é utilizado para terminar a transcrição do mRNA DSM2v2.

[00273] Uma construção binária de controle negativo que compreende um gene que expressa um RNA grampo de cabelo da YFP, é construída por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico e um vetor de entrada. A construção de entrada compreende uma sequência grampo de cabelo de YFP (hpYFP v2-1, SEQ ID NO: 89) sob o controle de expressão de um

235/263

166/169 promotor da ubiquitina 10 de Arabidopsis (como acima) e um fragmento que compreende uma região não transladada 3’ ORF23 de Agrobacterium tumefaciens (como acima).

[00274] Produção de Arabidopsis transgênica compreendendo os RNAs grampo de cabelo inseticidas: transformação mediada por Agrobacterium. Plasmídeos binários contendo sequências grampo de cabelo são submetidos a eletroporação na cepa de Agrobacterium GV3101 (pMP90RK). Os clones de Agrobacterium recombinantes são confirmados pela análise de restrição de preparações de plasmídeo das colônias de Agrobacterium recombinantes. Um Qiagen Plasmid Max Kit (Qiagen, Cat# 12162) é utilizado para extrair os plasmídeos das culturas de Agrobacterium seguindo o protocolo recomendado da fabricação.

[00275] Transformação de Arabidopsis e Seleção T^ Doze a quinze plantas de Arabidopsis (c.v. Columbia) são cultivadas em vasos de 4 na estufa com intensidade de luz de 250 pmmol/m², 25 Ό, e condições de 18:6 horas de luz:escuridão. Os caules primários da flor são cortados uma semana antes da transformação. Inóculos de Agrobacterium são preparados através da incubação de 10 μΙ de matéria-prima de glicerol de Agrobacterium recombinante em 100 ml de caldo LB (Sigma L3022) + 100 mg/L de espectinomicina + 50 mg/L de canamicina a 28 Ό e agitação em 225 rpm durante 72 horas. As células de Agrobacterium são colhidas e colocadas em suspensão em 5 % sacarose + 0,04 % Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat # VIS-02) + 10 pg/L de solução de benzamino purina (BA) em OD₆₀₀ 0,8~1,0 antes da imersão floral. As partes da planta acima do solo são mergulhadas na solução de Agrobacterium durante 5 a 10 minutos, com agitação suave. As plantas são então transferidas para a estufa para o crescimento normal com rega regular e fertilização até que a semente se estabeleça. EXEMPLO 17

236/263

167/169

Crescimento e Bioensaios de Arabidopsis Transgênica [00276] Seleção de Arabidopsis T₁ transformada com construções de RNAi grampo de cabelo. Até 200 mg de sementes T₁ de cada transformação são estratificadas em solução de agarose a 0,1 %. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (10,5 x 21 x 1;. T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) com media de claridade #5. Os transformantes são selecionados com relação a tolerância a Ignite® (glufosinato) em 280 g/ha em 6 e 9 dias após o plantio. Eventos selecionados são transplantados dentro de vasos de 4 de diâmetro. A análise da cópia de inserção é executada dentro de uma semana do transplante através da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) por hidrólise utilizando Roche LightCycler480™. Os iniciadores da PCR e sondas de hidrólise são projetados contra o marcador selecionável DSM2v2 utilizando LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche). As plantas são mantidas a 24 Ό, com um fotoperíodo de 16:8 horas luz:escuro sob luzes fluorescentes e incandescentes na intensidade de 100 a 150 mE/m²s.

[00277] Bioensaio de alimentação da planta E. heros. Pelo menos eventos de quatro cópias baixas (1 a 2 inserções), quatro cópias médias (2 a 3 inserções) e quatro cópias elevadas (> 4 inserções) são selecionados para cada construção. As plantas são cultivadas em um estágio de florescência (plantas contendo flores e síliquas). A superfície do solo é coberta com ~50 ml de volume de areia branca para facilitar a identificação de insetos. Cinco a dez ninfas de E. heros de 2instar são introduzidas em cada planta. As plantas são cobertas com tubos de plástico que são de 3 de diâmetro, 16 de altura, e com espessura de parede de 0,03 (Item No. 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de náilon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob condições normais de temperatura, luz e rega em um conviron. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; a

237/263

168/169 mortalidade percentual assim como a inibição do crescimento (1 - tratamento de peso/controle de peso) são calculadas. As plantas de expressão grampo de cabelo de YFP são utilizadas como controles. [00278] Geração de sementes de Arabidopsis T₂ e bioensaios T₂. A semente T₂ é produzida a partir de eventos selecionados de cópia baixo (1 a 2 inserções) para cada construção. As plantas (homozigotas e/ou heterozigotas) são submetidas ao bioensaio de alimentação de E. heros, como descrito acima. A semente T₃ é colhida de homozigotas e armazenada para análise futura.

EXEMPLO 18: Transformação de Espécies de Cultivo Adicionais [00279] O algodão é transformado com rab5 (com ou sem um peptídeo de transito de cloroplastos) para fornecer o controle de insetos hemípteros mediante o uso de um método conhecido daqueles de habilidade na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas descritas anteriormente no EXEMPLO 14 da Patente U.S. N²7.838.733, ou no Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.

EXEMPLO 19 dsRNA de rab5 no Controle de Insetos [00280] Os transgenes de dsRNA de Rab5 são combinados com outras moléculas de dsRNA nas plantas transgênicas para fornecer o direcionamento redundante de RNAi e efeitos sinérgicos de RNAi. As plantas transgênicas incluindo, por exemplo, e sem limitação, milho, soja e algodão que expressam o dsRNA que direciona o rab5 são úteis para a prevenção de danos de alimentação por insetos coleópteros e hemípteros. Os transgenes de dsRNA de Rab5 também são combinados nas plantas com tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis para representar novos modos de ação nas pirâmides genéticas de controle de resistência do inseto. Quando combinado com outras moléculas de dsRNA que miram as pragas de inseto e/ou com as

238/263

169/169 proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis, nas plantas transgênicas, um efeito inseticida não esperado (por exemplo, efeito inseticida sinérgico) é observado que também atenua o desenvolvimento de populações de insetos resistentes. Da mesma forma, os transgenes de dsRNA de Rab5 são combinados em plantas com tecnologia de proteína inseticida Photorhabdus ou Xenorhabdus para representar novos modos de ação em pirâmides genéticas de controle de resistência do inseto. Quando combinado com outras moléculas de dsRNA que direcionam as pragas de inseto, e/ou com as proteínas inseticidas Photorhabdus ou Xenorhabdus, em plantas transgênicas, um inesperado efeito insecticida (por exemplo, efeito inseticida sinérgico) atenua o desenvolvimento das populações de inseto resistentes.

[00281] Embora a presente divulgação possa ser susceptível a várias modificações e formas alternativas, as formas de realização específicas foram aqui descritas por meio de exemplo com detalhes. No entanto, deve ficar entendido que a presente divulgação não se destina a ser limitada pelas formas particulares divulgadas. Em vez disso, a presente divulgação cobre todas as modificações, equivalentes e alternativas que estiverem dentro do escopo da presente divulgação como definido pelas seguintes reivindicações anexas e seus equivalentes legais.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Ácido nucleico isolado compreendendo pelo menos um polinucleotídeo ligado de maneira operável a um promotor heterólogo, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em:

SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 ou SEQ ID NO: 10; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 ou SEQ ID NO: 10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 ou SEQ ID NO: 10; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 ou SEQ ID NO: 10;

SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma da SEQ ID NO: 8; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma da SEQ ID NO: 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma da SEQ ID NO: 8; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação

240/263
2/19 nativa de um organismo Diabrotica que compreende qualquer uma da SEQ ID NO: 8;

SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 9; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 9; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica que compreende a SEQ ID NO: 9;

SEQ ID NO: 78; o complemento da SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 81; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 81; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus que compreende a SEQ ID NO: 80 ou SEQ ID NO: 81.

2. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID

241/263
3/19

NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10.

3. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, e os complementos de qualquer um dos anteriores.
4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado do grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Gemar e D. u. undecimpunctata Mannerheim.
5. Vetor de transformação de planta, caracterizado pelo fato

242/263

4/19 de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação

1.
6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA) caracterizada por ser transcrita a partir do polinucleotídeo como definido na reivindicação

1.
7. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo caracterizada por ser produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
8. Molécula de ácido ribonucleico de filameneto duplo de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência de polinucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero inibe ou infra-regula a expressão de uma sequência de nucleotídeo endógena de rabõ especificamente complementar ao polinucleotídeo.
9. Molécula de ácido ribonucleico de filameneto duplo de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato da dita molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero neutraliza ou inibe o crescimento, viabilidade e/ou alimentação do inseto.
10. RNA de filamento duplo de acordo com a reivindicação 7, compreendendo um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, caracterizado pelo fato de que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA pelo segundo segmento de RNA, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, de tal modo que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo.
11. RNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em uma molécu

243/263

5/19 la de ácido ribonucleico de filamento duplo e de uma molécula de ácido ribonucleico de filamento único entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
12. Vetor de transformação da planta que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal.
13. Célula, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
14. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula procariótica.
15. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.
16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula vegetal.
17. Planta, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
18. Semente da planta como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o polinucleotídeo.
19. Produto de consumo produzido a partir da planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto de consumo compreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo.
20. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.
21. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de Zea mays.
22. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta é Zea mays.

244/263

6/19
23. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar a pelo menos um polinucleotídeo quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.
24. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um polinucleotídeo adicional que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene de inseto endógeno.
25. Vetor de transformação da planta que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os polinucleotídeos adicionais são ligados cada um de maneira operacional a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal.
26. Método para controlar uma população de pragas coleópteras ou hemípteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona após o contato com a praga para inibir uma função biológica dentro da praga, em que o RNA é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 102; um transcrito de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 a 10, 78, e 80 a 81; o complemento de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 a 10, 78, e 80 a 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID

245/263

7/19

NOs: 1, 3, 5, 7 a 10, 78, e 80 a 81; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7 a 10, 78, e 80 a 81.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o RNA do agente é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 92 e 93; o complemento da SEQ ID NO: 92 ou 93; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NO: 92 ou 93; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos da SEQ ID NOs: 92 ou 93; um transcrito das SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; o complemento de um transcrito das SEQ ID NOs: 1, 3 ou 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito das SEQ ID NOs: 1 ou 3; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito das SEQ ID NOs: 1,3 ou 5.
28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de filamento duplo.
29. Método para controlar uma população de pragas coleópteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona após o contato com a praga coleóptera para inibir uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que apresenta cerca de 90 % a cerca de 100 % de identidade de sequência a cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizado com a segunda sequência de polinucleotídeo.
30. Método para controlar uma população de pragas hemíp

246/263

8/19 teras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona após o contato com a praga hemíptera para inibir uma função biológica dentro da praga hemíptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que apresenta cerca de 90 % a cerca de 100 % de identidade de sequência a cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada com a segunda sequência de polinucleotídeo.
31. Método para controlar uma população de pragas coleópteras, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer em uma planta hospedeira de uma praga coleóptera uma célula vegetal transformada compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona após o contato com uma praga coleóptera que pertence à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera e resulta na diminuição do crescimento e/ou sobrevivência da praga coleóptera ou população de pragas, em relação à reprodução das mesmas espécies de pragas em uma planta da mesma espécie da planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.
33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a popolulação de praga coleóptera é reduzida em relação a uma população da mesma espécie de praga que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie da planta hospedeira que carece da célula vegetal transformada.

247/263

9/19
34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a popolulação de praga coleóptera é reduzida em relação a uma população de praga coleóptera que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie que carece da célula vegetal transformada.
35. Método de controle da infestação por pragas coleópteras em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende fornecer na dieta de uma praga coleóptera um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em:

SEQ ID NOs: 92 a 97;

o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97;

um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97;

o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 92 a 97;

um transcrito da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5;

o complemento de um transcrito da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5;

um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula vegetal transformada para expressar o polinucleotídeo.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.

248/263

10/19
38. Método de controle da infestação por pragas coleópteras em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma praga hemíptera com um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em:

SEQ ID NOs: 98 a 102;

o complemento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102;

um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102;

o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 98 a 102;

um transcrito da SEQ ID NO: 78;

o complemento de um transcrito da SEQ ID NO: 78;

um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito da SEQ ID NO: 78; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de um transcrito da SEQ ID NO: 78.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o contato da praga hemíptera com o RNA compreende a pulverização da planta com uma composição que compreende o RNA.
40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável está compreendido em uma molécula de RNA de filamento duplo.
41. Método para melhorar o rendimento de uma cultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

a introdução do ácido nucleico como definido na reivindicação 1 em uma planta de cultura para produzir uma planta de cultura transgênica; e o cultivo da pranta de cultura para permitir a expressão de pelo menos

249/263

11/19 um polinucleotídeo; em que a expressão de pelo menos um polinucleotídeo inibe a reprodução ou o crescimento da praga de inseto e a perda do rendimento devido à infecção da praga de inseto;

em que a planta de cultivo é o milho, a soja ou o algodão.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de inseto que foi colocada em contato com uma parte da planta de cultura.
43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e os complementos de qualquer uma das anteriores.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga de insetos coleópteros que é colocado em contato com uma parte da planta de milho.
45. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1;

cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal que compreende uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram pelo menos um polinucleotídeo nos seus genomas;

submeter a triagem as células vegetais transformadas com relação à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada

250/263

12/19 através de pelo menos um polinucleotídeo; e selecionar uma célula vegetal que expressa o RNA.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 1; o complemento da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento da SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento da SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contínuos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 10.
47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de filamento duplo.
48. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 46; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada

251/263

13/19 através de pelo menos um polinucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que entra em contato com a planta transformada.
49. Método para a produção de uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um meio para fornecer proteção contra a praga coleóptera à uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram o meio para fornecer proteção contra as pragas coleópteras à uma planta nos seus genomas;

submeter a triagem as células vegetais transformadas para a expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera; e selecionar uma célula vegetal que expressa o meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera.
50. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga coleóptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 49; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão do meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que entra em contato com a planta transformada.
51. Método para a produção de uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

252/263

14/19 transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um meio para fornecer proteção contra a praga hemíptera à uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para levar em conta o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar as células vegetais transformadas que integraram o meio para fornecer proteção contra a praga hemíptera à uma planta nos seus genomas;

submeter a triagem as células vegetais transformadas para a expressão de um meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera; e selecionar uma célula vegetal que expressa o meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera.
52. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga hemíptera, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 51; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão do meio para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga hemíptera que entra em contato com a planta transformada.
53. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, ou um polipeptídeo PIP-1.
54. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de

B. thuringiensis que é selecionado de um grupo que compreende Cry3,

253/263

15/19

Cry34 e Cry35.
55. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1.
56. Célula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo que compreende Cry3, Cry34 e Cry35.
57. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1.
58. Planta de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo que compreende Cry3, Cry34 e Cry35.
59. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal transformada compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis ou um polipeptídeo PIP-1.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo que compreende Cry3, Cry34 e Cry35.
61. RNA de filamento duplo (dsRNA) capaz de infra-regular a expressão de um gene rab5-1 de D. v. virgifera LeConte, caracterizado pelo fato de que compreende um filamento de RNA sentido e um filamento de RNA antisentido complementar, em que o filamento de RNA sentido é selecionado do grupo que consiste em uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID

254/263

16/19

NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 10, em que o filamento de RNA antisentido é selecionado do grupo que consiste em uma sequência de polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 96, e em que o dito dsRNA compreende de 19 a 3.710 nucleotídeos.
62. dsRNA de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o gene rab5 é selecionado do grupo que consiste em um gene raó5-1, rab5-2 ou rab5-3.
63. dsRNA de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é expresso dentro de uma planta transgênica.
64. dsRNA de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o dsRNA provoca a repressão ou a inibição do gene pós-transcricional de um gene rab5 em D. v. virgifera LeConte quando a D. v. virgifera LeConte alimenta-se da planta transgênica.
65. dsRNA de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é formado de duas sequências de RNA complementares separadas.
66. dsRNA de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é formado de uma sequência de RNA individual com sequências internamente complementares.
67. Cassete de expressão do gene capaz de inibir ou infraregular a expressão de um gene rab5 de D. v. virgifera LeConte, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão do gene compreende um promotor ligado de maneira operacional à uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de RNA que forma um RNA de filamento duplo, a molécula de ácido nucleico compreende:

255/263

17/19 (i) uma primeira sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 95 , SEQ ID NO: 10 ou um fragmento destas; e (ii) uma segunda sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com uma sequência complementar da SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 96 ou um fragmento destas, em que dito fragmento destas compreende de 19 a 3.710 nucleotídeos.
68. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão do gene é transformado em uma planta.
69. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dsRNA provoca repressão ou inibição do gene de pós-transcricional do gene rab5 em D. v. virgifera LeConte quando D. v. virgifera LeConte alimenta-se da planta.
70. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é formado de duas sequências de RNA complementares separadas.
71. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é formado de uma única sequência de RNA com sequências internamente complementares.
72. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA através do segundo segmento de RNA, e em que o terceiro segmento de RNA é

256/263

18/19 substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, tal que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo.
73. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o gene rab5 é selecionado do grupo que consiste em um gene rab5-1, rab5-2 ou rab5-3.
74. RNA de filamento duplo (dsRNA), caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica para um RNA autocomplementar para o silenciamento de um ou mais genes alvo de uma praga ou agente patogênico de uma planta, o RNA autocomplementar compreendendo uma região de filamento duplo tendo um comprimento de pelo menos 19, 20 ou 21 nucleotídeos, em que um filamento da dita região de filamento duplo é obtido a partir de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 95 ou SEQ ID NO: 10.
75. dsRNA de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes alvo é um gene rab5.
76. dsRNA de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o gene rab5 é selecionado do grupo que consiste em um gene rab5-1, rab5-2 ou rab5-3.
77. dsRNA de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a praga ou o agente patogênico de uma planta é D. v. virgifera LeConte.
78. dsRNA de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o dsRNA é expresso dentro de uma planta transgênica.
79. dsRNA de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o dsRNA provoca repressão ou inibição do gene pós

257/263

19/19 transcricional do gene rab5 em D. v. virgifera LeConte quando D. v. virgifera LeConte alimenta-se da planta transgênica.
80. dsRNA de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmentos de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA através do segundo segmento de RNA, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, tal que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de filamento duplo.