KR20030032997A

KR20030032997A - 항진균성 및/또는 항균성 펩타이드, 이의 제조방법 및이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20030032997A
Application number: KR10-2003-7000370A
Authority: KR
Inventors: 장-뤼크 디마르크; 미쉘 르그랭; 메닌로레
Original assignee: 앙또메 에스아
Priority date: 2000-07-13
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2003-04-26
Also published as: CA2415481A1; ATE323104T1; FR2811666A1; US20030208035A1; CN1441809A; EP1299416A2; IL153635A0; NZ523497A; DE60118746D1; RU2003104278A; FR2811666B1; EP1299416B1; BR0112299A; WO2002006324A2; JP2004537960A; AU2002222936A1; WO2002006324A3

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표현되는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 헬리오마이신(Heliomicine)으로 부터 유도된 펩타이드에 관한것으로 : X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀

X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄여기서 X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃은 산성 아미노산, X₁₆, X₄₄는 작은 극성 아미노산, X₁₉는 큰 극성 아미노산, X₃₆은 작거나 약한 소수성 아미노산, X₃₈은 약한 소수성또는 아미노산이며, 상기 치환은 X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃중에서 적어도 하나가 염기성 또는 극성 아미노산이며 바람직하게는 큰 극성 아미노산이며, 및/또는 X₁₆, X₄₄중에서 적어도 하나가 염기성 아미노산 또는 큰 극성 아미노선이며, 및/또는 X₁₉는 염기성 아미노산이며, 및/또는 X₃₆, X₃₈중에서 적어도 하나는 강한 소수성 아미노산이며, 나머지 아미노산 (X)은, X₁₃, X₃₇, X₃₉이 큰 극성 아미노산을 나타내고, X₆, X₁₅, X₃₄이 작은 극성 아미노산을 나타내고, X₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₈, X₃₁이 염기성 아미노산을 나타내고, X₃, X₄, X₈, X₁₂이 소수성 아미노산을 나타내고, X₉, X₁₄, X₂₇, X₃₅, X₄₁이 방향족 소수성 아미노산을 나타내고, X₅, X₁₀, X₁₁, X₂₀, X₂₆, X₂₉, X₃₀, X₃₃이 작은 아미노산을 나타내고, C₇, C₁₈, C₂₂, C₃₂, C₄₀, C₄₂는 시스테인을 나타낸다.

Description

항진균성 및/또는 항균성 펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물{Antifungal and/or antibacterial peptides, preparation methods and compositions containing same}

종래 기술에 있어서, 자연 유래의 다양한 물질을 기술하고 있는데, 특히 항 균성 특징, 보다 구체적으로는 살균성 및 살진균성을 갖는 특별한 펩타이드를 기술한다. 이러한 펩타이드들은 식물 및 인간의 진균성 질병들을 치료하는데 사용할 수있다(De Luccaet al., 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43, 1-11). 인간의 건강에 있어서, 최근 수년간 통성병원 진균의 감염 빈도가 급격하게 증가해 왔음을 상기할 수 있다. 침입성 사상균증은 면역기능이 약화된 사람에게 병원성으로 작용하는 자연계에 존재하는 진균류에 의해 야기되는 매우 심각한 감염이다. 면역억제는 다양한 원인의 결과일수 있는데: 코르티코(cortico)요법, 화학요법, 장기이식, HIV 감염 등이다. 통성병원 진균의 감염은 인간의 높은 사망율에 대한 일반적인 이유이다. 상기 감염은 효모, 주로 캔디다(Candida) 타입, 또는 선상 진균, 주로아스퍼질러스(Aspergillus) 타입에 의해 야기될 수있다. 면역 억제 환자에 있어서, 독성, 예를 들어 암포테리신 B를 이용한 치료, 또는 내성 진균의 발현, 예를 들어 질소 유도체에 대한캔디다 알비칸(Candida albicans)의 내성등의 이유로 항진균성 치료의 실패가 종종 관찰된다. 따라서 혁신적인 분자로 부터 유도된 새로운 항진균성 의약품의 개발이 필수적이다.

매우 다양한 동물 및 식물 종들에 있어, 항균성 펩타이드의 생산은 감염에 대한 면역 방어의 중요한 기작을 의미한다. 특히, 곤충들은 세균 및 진균류에 대해 매우 효과적인 내성을 보여준다. 이러한 반응은 넓은 범위 항균성 펩타이드의 다수 과(family)의 신속한 합성에 주로 기인한다 (Buletet al.(1999) Dev. Comp. Immunol. 23, 329-344). 상기 합성은 패혈성 상처 또는 미량의 세균 주입을 통해 유도된다(Hoffmannet al. (1999) Science 284, 1313-1318). 오늘날, 곤충의 항균성 펩타이드는 예를 들어 쌍시류, 인시류, 초시류와 같은 성장기간 동안 완전변태를 하는 곤충으로 부터의 것으로 특히 특징지워 진다. 상기 곤충에서 유도되는 항-균성 펩타이드는 하기의 네개 군으로 구별지을 수 있다:

- 두 개의 양수성 α-나선을 형성하는 4 kDa 양이온성 펩타이드. 이 군은 특히 세크로핀(cecropines)을 포함한다.

- 예를 들어 드로소신(drosocine), 피로코리신(pyrrhocoricine) 및 레보신(lebocines)으로 글리코실화되거나, 또는 아피다이신(apidaecines) 및 메탈니코윈(metalnikowines)으로 비-글리코실화될 수 있는 2 kDa 내지 4 kDa의 크기를 갖는 프롤린이 풍부한 양이온성 펩타이드.

- 뚜렷한 별개의 다수의 폴리펩타이드. 예를 들면 아타신(attacines), 사르코톡신(sarcotoxines) II, 디프테리신(diptericines) 및 콜레옵테리신(coleoptericine)과 같은 대부분 양이온성이며 종종 글리신 잔기가 풍부한 8 내지 27 kDa의 분자량을 갖는 다수의 분리된 폴리펩타이드.

- 분자내 이황화 브리지를 함유하는 펩타이드. 이 군은 곤충 디펜신(defensines) (4 kDa, 3 이황화 브리지), 드로소마이신(drosomycin)(4 kDa, 4 이황화 브리지) 및 타나틴(thanatin)(2 kDa, 1 이황화 브리지)를 함유한다.

상술한 내용 중 , 본 발명은 특히 CSαβ구조라고도 불리는 하나의 α-나선 및 세 개의 이황화 브리지로 연결된 역평행의 β스트랜드(strand)를 함유하는 타입의 삼차원 구조의 펩타이드에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 인간, 동물 및 식물에 있어서 실험용 감염에 유용한 항진균성 활성을 갖는다. 본 발명은 특히 인시류인 헬리오디스 바이레신(Heliothis virescens)의 헤모림프로 부터 분리한 펩타이드인 헬리오마이신(heliomycine)에 관한 것이다. 헬리오마이신의 서열 및 특징은 국제 특허출원 PCT 공개번호 제WO 9953053호에 기술되어 있다.

하술된 펩타이드 서열에서, 아미노산을 한-글자 코드로 나타낸다. 그러나 하기의 명명법에 따라 세개-글자 코드로도 또한 나타낸다.

AAla알라닌(Alanine)

CCys시스테인(Cysteine)

DAsp아스파르트산(Aspartic acid)

EGlu글루타민산(Glutamic acid)

FPhe페닐알라닌(Phenylalanine)

GGly글리신(Glycine)

HHis히스티딘(Histidine)

IIle이소류신(Isoleucine)

KLys리신(Lysine)

LLeu류신(leucine)

MMet메티오닌(Methionine)

NAsn아스파라긴(Asparagine)

PPro프롤린(Proline)

QGln글루타민(Glutamine)

RArg아르기닌(Arginine)

SSer세린(serine)

TThr트레오닌(Threonine)

VVal발린(Valine)

WTrp트립토판(Tryptophane)

YTyr티로신(Tyrosine)

헬리오마이신은 CSαβ타입의 삼차원 구조를 갖는 호양성 펩타이드이다. SEQ ID NO : 1 하의 서열 목록상에 주어진 헬리오마이신의 아미노산 서열은 하기와 같다:

1 10 20 30

D K L I G S C V W G A V N Y T S D C N G E C K R R G Y K G G

40

H C G S F A N V N C W C E T (SEQ ID NO : 1)

본 출원인은 인시류 아키오프레포나 데모푼(Archeoprepona demophoon)의 면역된 유충의 헤모림프로 부터 헬리오마이신 동종을 분리하였다. Ard1이라 불리는 펩타이드는 서열 분석 및 질량 측정을 통해 특징화하였다. Ard1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 서열 목록으로 나타내었다.

1 10 20 30

D K L I G S C V W G A V N Y T SNC NAE C K R R G Y K G G

40

H C G S F A N V N C W C E T (SEQ ID NO : 2)

Ard1의 서열은 두 위치가 헬리오마이신과 다르다: 헬리오마이신 17번 위치상의 아스파르트산(Asp)이 아스파라긴(Asn)으로 치환되었고, 20번 위치의 글리신(Gly)이 알라닌(Ala)으로 치환되었다. 헬리오마이신의 발현 벡터 pSEA2상에서 상응하는 코돈(codon)이 변경되어 효모에스. 세레비지아(S. cerevisiae)를 통해 Ard1 펩타이드가 생성 및 분비되었다.

pSEA2는 MFα1 프로모터(promoter) 및 BGL2의 프리 서열 및 배양 배지로 상기 펩타이드의 분비를 가능하게 하는 MFα1의 프로 서열을 운반하는 효모 발현 벡터이다(Lamberty et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 9320-9326).

HPLC 정제후, Ard1의 항진균성 활성(항-캔디아 알비칸 및 항-아스퍼질러스퍼미가터스(Aspergillus fumigatus) 활성)을 헬리오마이신의 활성과 비교하였다. Ard1의 항-캔디다 알비칸 활성은 헬리오마이신의 활성보다 4 내지 8배 높다. Ard1의 항-아스퍼질러스 퍼미가터스 활성은 헬리오마이신의 활성보다 2배 높다.

본 출원인은 헬리오마이신 및 Ard1 펩타이드의 전하 및 소수성을 분석하였다. 첨부된 도1에서 보여지는 소수성 그래프는 키트(Kyte) 및 둘리틀(Doolittle)의 방법(1982, J. Mol. Biol., 157, 105-132)에 따라 제작되었다.

헬리오마이신 및 이의 동종 Ard1은 보다 친수성인 부분과 분리된 소수성의 두 부분을 갖는다. N 및 C 말단은 어느정도 친수성이다. 또한, 친수성의 중심부는 최종 양전하를 갖는다. 도 1은 헬리오마이신 서열상의 아미노산의 전하를 나타낸다.

헬리오마이신의 아스파르틴산의 자연 동종 Ard1상에서 아스파라긴(17 지점)으로의 치환은 상기 펩타이드의 양이온성 특징을 증가시킨다(헬리오마이신과 비교하여 +1). 헬리오마이신 및 이의 동종 Ard1상에 양전한 및 소수성을 증가시키기 위한 다른 돌연변이를 PCR에 의한 직접 돌연변이 유발 또는 합성 단편의 클로닝(cloning)을 통해 제작하였다.

본 발명의 목적은 항균성 및 항진균성 특징을 갖는 새로운 펩타이드이다. 본 발명은 또한 농업 및 인간 또는 동물의 치료에 사용할 수 있는 상기 펩타이드 및 이를 함유하는 조성물의 제조에 관한 것이다.

도 1은 키트 및 둘리틀의 방법(1982, J. Mol. Biol., 157, 105-132)을 사용한 헬리오마이신 펩타이드의 소수성 특징을 나타내는 그래프이다.

도 2는 파종성 캔디다 알비칸의 감염 모델에 대한 헬리오마이신 펩타이드 및 Ard1의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 생존율).

도 3은 파종성 캔디다 알비칸의 감염 모델에 대한 헬리오마이신 펩타이드 및 Ard 1의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 사망률 수치).

도 4는 파종성 알비칸의 감염 모델에 대한 펩타이드 pEM24, pEM30, pEM31 및 pEM35의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 생존율).

도 5는 파종성 캔디다 알비칸의 감염 모델에 대한 펩타이드 pEM24, pEM30, pEM31 및 pEM35의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 사망률의 수치).

도 6은 파종성 캔디다 알비칸의 감염 모델에 대한 펩타이드 pEM31, pEM35, pEM46 및 pEM51의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 생존율).

도 7은 파종성 캔디다 알비칸의 감염 모델에 대한 펩타이드 pEM31, pEM35, pEM46 및 pEM51의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 사망률의 수치).

도 8은 파종성 캔디다 알비칸의 감염 모델에 대한 펩타이드 pEM35의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 생존율).

도 9는 파종성세도스포리움 인플라텀(Scedosporium inflatum)의 감염 모델에 대한 pEM35 및 pEM51의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 생존율).

도 10은 파종성세도스포리움 인플라텀(Scedosporium inflatum)의 감염 모델에 대한 pEM35 및 pEM51의 활성을 나타내는 그래프이다(감염 후 일수에 따른 사망률의 수치).

도 11은 펩타이드 pEM51를 처리한 건강한 생쥐의 시간에 따른 중량 변화를 나타내는 그래프이다.

도 12는 펩타이드 pEM35 및 pEM51를 처리한 건강한 생쥐의 시간에 따른 중량의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 13은 캔디다 알비칸 IHEM 8060에 대한 펩타이드 pEM35 및 pEM51의 살진균성 동역학을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 좀더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

따라서 본 발명에 따른 연구는 펩타이드의 소수성, 전하를 띤 부분상에 특히 돌연변이를 제작하여 호양성적인 특성의 변형없이 또는 향상을 통해 펩타이드의 전하 및/또는 소수성을 증가시키며, 이러한 방법으로 헬리오마이신에 비해 향상된 항진균성 및/또는 항균성을 갖는 펩타이드를 생산하는 것으로 이루어졌다.

상기 목적은 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 하기 SEQ ID No. 1로 표시된 헬리오마이신으로 부터 유도된 펩타이드에 의해 이루어졌다.

SEQ ID No. 1

DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

본 발명의 펩타이드들은 "X" 는 하나의 아미노산을 나타내는 하기 화학식 I에 의한다:

X₁X₂X₃X₄X₅X₆C₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇C₁₈X₁₉X₂₀

X₂₁C₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁C₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈

X₃₉C₄₀X₄₁C₄₂X₄₃X₄₄

여기서 :

- X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃은 산성 아미노산,

- X₁₆, X₄₄는 작은 극성 아미노산,

- X₁₉는 큰 극성 아미노산,

- X₃₆은 작거나 약한 소수성 아미노산,

- X₃₈은 약한 소수성이거나 작은 아미노산이며,

상기 치환은:

- X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃중에서 적어도 하나가 염기성 또는 극성 아미노산이며, 바람직하게 큰 극성 아미노산 및/또는

- 아미노산 X₁₆, X₄₄의 적어도 하나가 염기성 아미노산 또는 큰 극성 아미노선, 및/또는

- X₁₉는 염기성 아미노산, 및/또는

- 아미노산 X₃₆, X₃₈의 적어도 하나는 강한 소수성 아미노산이며 여기서, 나머지 아미노산(X)은:

- X₁₃, X₃₇, X₃₉는 큰 극성 아미노산을 나타내고,

- X₆, X₁₅, X₃₄는 작은 극성 아미노산을 나타내며,

- X₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₈, X₃₁은 염기성 아미노산을 나타내고,

- X₃, X₄, X₈, X₁₂는 소수성 아미노산을 나타내며,

- X₉, X₁₄, X₂₇, X₃₅, X₄₁은 방향족 소수성 아미노산을 나타내고,

- X₅, X₁₀, X₁₁, X₂₀, X₂₆, X₂₉, X₃₀, X₃₃은 작은 아미노산을 나타내며,

- C₇, C₁₈, C₂₂, C₃₂, C₄₀, C₄₂는 시스테인을 나타낸다.

따라서, 화학식I의 본 발명에 따른 펩타이드에 있어서,

- X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃의 모두 또는 일부가 염기성 또는 극성, 바람직하게 큰 극성 아미노산이 아닐 때, 이것 또는 이들은 산성 아미노산 또는 산성 아미노산들이며,

- X₁₆, X₄₄의 모두 또는 일부가 염기성 또는 큰 극성 아미노산이 아닐 때, 이것 또는 이것들은 작은 극성 아미노산이며,

- X₁₉가 염기성 아미노산이 아닐 때, 이것은 큰 극성 아미노산이며,

- X₃₆이 강한 소수성 아미노산이 아닐 때, 이것은 작은 아미노산 또는 매우 약한 소수성 아미노산이며,

- X₃₈이 강한 소수성의 아미노산이 아닐 때, 이것은 매우 약한 소수성 또는 작은 산이다.

본 발명의 펩타이드는 상기 치환이 시스테인 C₇, C₁₈, C₂₂, C₃₂, C₄₀, C₄₂을 고려하지 않기 때문에 헬리오마이신의 CSαβ구조를 갖는다.

본 발명에 따른 펩타이드의 첫번째 바람직한 군은 X_1,X_17,X₄₃의 적어도 하나가 염기성 또는 극성, 바람직하게 큰 극성, 아미노산이고, X₂₁은 염기성 아미노산인 X₂₃, X₂₄, 및 X₂₅의 적어도 하나와 이온 결합을 이룰 수 있는 산성 아미노산인 군이다. 상기 결합은 본 발명에 따른 펩타이드의 CSαβ구조의 안정화에 관여할 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드의 두 번째 바람직한 군은, X₃₆및 X₃₈의 적어도 하나가 비-방향성 강한 소수성 아미노산인 군이다.

본 발명에 따른 펩타이드의 세 번째 바람직한 군은 X₁₇이 아스파라긴 또는 아르기닌이고, X₄₃이 글루타민산 및 여기서:

- X₃₆은 류신 또는 이소류신, 및/또는

- X₁₉는 아르기닌, 및/또는

- X₁₆은 아르기닌인 군이다.

본 발명에 따른 펩타이드의 네 번째 바람직한 군은 X₁₇이 아스파르트산, X₄₃이 글루타민산 및 여기서:

- X₃₆은 류신 또는 이소류신, 및/또는

- X₁₉는 아르기닌, 및/또는

- X₁₆은 아르기닌인 군이다.

본 발명에 따른 펩타이드의 다섯 번째 바람직한 군은 X₄₃이 글루타민, X₁₇이 아스파라긴, 및 여기서 :

- X₃₆는 류신 또는 이소류신, 및/또는

- X₁₉는 아르기닌인 군이다.

본 발명에 따른 펩타이드의 여섯 번째 바람직한 군은 X₄₃이 글루타민 및 X₁₇이 아스파르틴산인 군이다.

본 발명에 따른 펩타이드의 일곱 번째 바람직한 군은 X₄₃이 글루타민, X₁₇이 아스파르틴산 및 여기서:

- X₁이 아스파라긴, 및/또는

- X₃₆이 류신 또는 이소류신인 군이다.

하기의 단어:

- 염기성 아미노산 : 아르기닌, 리신 또는 히스티딘으로 주어진다.

- 소수성 아미노산 :

ㆍ비방향성 : 메티오닌, 발린, 류신, 이소류신, 류신 및 이소류신은 강한 소수성 아미노산이고, 메티오닌 및 발린은 매우 약한 소수성 아미노산이며,

ㆍ방향성 : 강한 소수성 아미노산인 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판이고,

- 산성 아미노산 : 아스파르틴산 또는 글루타민산,

- 큰 극성 아미노산 : 글루타민 또는 아스파라긴,

- 작은 극성 아미노산 : 세린 또는 트레오닌,

- 극성 아미노산 : 작고 큰 극성 아미노산,

- 작은 아미노산 : 글리신 또는 알라닌이다.

본 발명에 따른 펩타이드는 당분야의 당업자들에게 잘 널리 알려진 기술을 사용한 화학 합성 또는 유전공학을 통해 제작할 수 있다.

특히 세 가지 타입의 변이인:

- Asp1이 Asn 변이, Asp17이 Asn, Glu43이 Gln와 같이 산성 아미노산이 극성 아미노산으로 치환되었고, 및

- Asn13이 Arg, Ser16이 Arg, Asn17이 Arg(Ard1), Asn19가 Arg, Thr 44가 Arg으로의 변이와 같이 극성, 바람직하게 큰 극성, 아미노산이 염기성 아미노산으로 치환되었다.

- Gly10이 Leu, Ala36이 Leu 또는 Ile 및 Va138이 Ile으로의 변이와 같이, 소수성을 증가시키기 위한 변이가 또한 생성되었다.

본 발명에 따른 헬리오마이신으로부터 유도된 바람직한 펩타이드는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

Helio : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

Ard1 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM37 :NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM43 : DKLIGSCVWGAVNYTTDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM42 : DKLIGSCVWGAVNYTRDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM44 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCRGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM22 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCET

pEM23 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANINCWCET

pEM25 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCET

pEM24 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCET

pEM7 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCER

pEM21 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM39 :NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM61 :NDKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT

pEM62 :NDKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCQT

본 발명에 따른 Ard1으로부터 유도된 바람직한 펩타이드는 하기 아미노산 서열을 갖는다:

Ard1 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM40 :NKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM50 : DKLIGSCVWGAVNYTRNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM56 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM52 : DKLIGSCVWGAVNYTSRCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM51 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCRAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM32 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCET

pEM33 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANINCWCET

pEM34 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCET

pEM35 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCET

pEM31 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM30 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCER

pEM46 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT

pEM47 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCQT

pEM48 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCER

pEM49 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCER

pEM54 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCET

pEM57 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM55 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT

본 발명은 또한 상기 펩타이드의 기능적 유사체에 관한 것이다. 예를 들면 상기 펩타이드의 단편 또는 지질 또는 당과 결합된, 뉴클레오티드와의 결합된 글리코실화와 같은 전사 후 과정으로 부터 생긴 변형 또는 아미드화, 아세틸화, 아실화와 같은 화학적 변형이 있다.

기능적 유사체는 또한 하나 이상의 아미노산이 에난티오머(enantiomer), 다이아스테로이소머(diasteroisomer), D 형의 자연 아미노산, 희소 아미노산 특히 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 메틸리신(methyllysine), 디메실리신(dimethyllysine), 및 합성 아미노산 특히 오르니틴(ornithine), 노류신(norleucine), 사이클로헥실알라닌(cyclohexylalanine) 및 오메가-아미노산(omega-aminoacide)인 본 발명의 펩타이드를 포함한다. 본 발명은 또한 레트로펩타이드(retropeptide)및 레트로-인벌소펩타이드(retro-inversopeptide)에 관한것이다.

화학식I의 펩타이드는 또한 그 N- 또는 C- 말단 중의 어느 한 쪽에 화학식I의 구조를 손상시키지 않는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명은 분명히 헬리오마이신과 같이 하나의 α-나선 및 세 개의 이황화 브리지로 연결된 역평행 β스트랜드를 함유하는 타입의 삼차원 구조를 갖는 펩타이드에 관한것이다.

하기 표 1은 헬리오마이신의 1, 6, 13, 16, 19, 36, 38, 43 및 44 위치에서 아미노산상에 제작된 변이, 및 얻어진 펩타이드의씨. 알비칸(C. albicans) (C. a)및에이. 퍼미가터스(A. fumigatus) (A. f)에 대한 항진균 활성을 나타낸다.

위치	1	6	13	16	19	36	38	43	44
헬리오마이신	D	S	N	S	N	A	V	E	T	활성⁺
돌연변이체										C.a	A.f
pEM37	N									2	-
pEM38		T								1	1
pEM45			R							0,5	<<<1
pEM43				T						1	2
pEM42				R						8	1
pEM44					R					8	2
pEM22						I				1-8	4-8
pEM23							I			1	2
pEM25						L				10	6
pEM24						L	T			4	8
pEM7									R	4-8	1
pEM21								Q		2	10-20
pEM39	N							Q		2	4-8
pEM61	N						L	Q		5-10	3-6
pEM62	N						I	Q		3-6	2-4

+ 헬리오마이신에 대한 상대적인 활성

하기 표 2는 Ard1 펩타이드의 1, 10, 16, 17, 19, 36, 38, 43, 44 위치의 아미노산에 제작된 변이, 및 얻어진 펩타이드의씨. 알비칸(C. a) 및에이. 퍼미가터스(A. f)에 대한 항진균 활성을 나타낸다.

위치	1	10	16	17	19	36	38	43	44
Ard1	D	G	S	N	N	A	V	E	T	활성⁺
변종										C.a	A.f
pEM40	N									2	-
pEM50			R							1-2	2
pEM56		L								1-2	0.5
pEM52				R						1-2	0.5
pEM51					R					2-4	1
pEM32						I				1	2
pEM33							I			1	1
pEM34						L	I			4	4
pEM35						L				4	2-4
pEM31								Q		2	4-8
pEM30									R	4	0.5-1
pEM46						L		Q		4-8	6-8
pEM47						I		Q		2-4	8
pEM48						L			R	6-12	1-2
pEM49						I			R	3	1-2
pEM54		L				L				1	1
pEM57		L						Q		1	8
pEM55		L				L		Q		1-2	2-7

+Ard1에 대한 상대적인 활성

다른 돌연변이체를 에스. 세레비지아 효모 내에서 생산하였고, HPLC로 정제하고 항진균성 활성(씨. 알비칸및에이. 퍼미가터스)을 헬리오마이신 또는 Ard1의 활성과 비교하였다.

상기 표 1 및 표2는 변종 Asn 13에서 Arg로의 변이(pEM45)만을 제외한 양전하의 증가를 보이는 모든 돌연변이체에 대해 두 개의 실험 진균류의 적어도 하나에 대해서 활성을 얻음을 보여준다. 나머지 돌연변이체는 모두 친수성 부분에 위치한다. 돌연변이체들의 대부분은씨. 알비칸(Ser16에서 Arg, Asn 17에서 Arg (Ard1), Asn 19에서 Arg, Thr44에서 Arg)에서의 활성이 증가하였다.에이. 퍼미카터스에 대해서는 오직 하나의 돌연변이체(Glu43에서 Gln)만이 현저한 활성 증가를 제공하였다.

소수성의 증가한 돌연변이의 경우, Ala36에서 Leu로의 변형(pEM35)은씨. 알비칸및에이. 퍼미가터스에 대해 가장 뛰어난 활성 증가를 주었다. Gly10에서 Leu및 Val38에서 Ile로의 변형은 헬리오마이신 및 Ard1의 항진균성 활성상에 상당한 효과를 갖지 않는다.

소수성상의 가장 활성적인 증가를 갖는 돌연변이는 증가된 전하를 갖는 돌연변이와 관련이 있었다. 축적된 효과를 관찰할 수 있었다.

본 발명의 목적은 또한 인간 및 동물 및 식물에 대한 진균성 및/또는 세균성 감염을 억제 및 치료하는 것이다. 따라서 본 발명의 목적은 바람직하게는 허용가능한 담체와 결합된 전술한 적어도 하나의 펩타이드를 활성제로 함유하는 조성물로, 보다 바람직하게는 항진균성 및/또는 항세균성 약제학적 조성물이다. 상기 담체는 약제학적 또는 작물학적 목적에 대한 조성물의 적용 타입에 따라 선택된다.

본 발명은 특히 상기 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물을 인간 및 동물내에 대해 약학적으로 적용하는 것에 관한 것이며, 또한 작물학적인 적용에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 질명, 특히 진균성 및 세균성 질병에 대해 식물이 내성을 갖도록 사용할 수 있다. 작물학적 적용의 일 실시예는 펩타이드 또는 이를 함유하는 조성물의 효과적인 양을 식물에 적용하는 것으로 이루어진다. 작물학적 적용의 두번째 실시예는 본 발명의 펩타이드를 발현할 수 있는 핵선 서열로 식물 세포 및 식물을 형질전환하여 식물에 질병 내성 부여하는 것으로 이루어진다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 인시류 에이. 데모푼의 면역화된 유충으로 부터 얻은 헤모림프로부터 Ard1의 분리

1) 에이. 데모푼의 헤모림프내에서 항진균성 물질의 생물학적 합성 유도.

인시류 에이. 데모푼의 제 4기의 성숙한 유충을 그람-양성균(엠. 루테우스(M. luteus) 및에스. 아우레우스(S. aureus)), 그람-음성균(피. 애루지노사(P. aeruginosa)), 선상 진균류(에이. 퍼미가터스)의 포자 및 효모(씨. 알비칸)을 함유하는 20 ㎕ PBS 용액으로 두 번 주사하여 면역화하였다. 세균은 루리아-벌타니(Luria-Bertani) 배지에서 37℃에서 12시간 동안 배양한 배양액으로 부터제조하였다. 효모는 사브로(Sabouraud) 배지에서 30℃에서 12시간 동안 배양하여 제조하였다.에이. 퍼미가터스의 포자를 -90℃에 냉동된 저장물에서 얻었다. 상기 방법으로 감염된 동물들은 통풍이 되는 곳에서 그들의 숙주 식물상에 24시간 동안 유지되었다. 헤모림프를 분리하기 전에 유충들은 얼음상에서 냉각하였다.

2) 플라즈마의 제조

헤모림프(유충 당 160㎕, 총 81개 표본)는 복부 맹장을 절개하여 회수하고 얼음에서 냉각 및 프로테아제 억제제인 아프로티닌(최종 농도 20㎍/㎖) 및 멜라닌화 억제제인 페닐티오우레아(최종 농도 40μM)를 함유한 1.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로-원심분리 튜브에 넣는다. 면역화한 유충으로부터 회수한 헤모림프(13㎖)를 혈구를 제거하기 위해 4℃에서 1분간 8000 rpm으로 원심분리하였다. 상기 원심분리로 부터의 상층액을 12000 rpm으로 원심분리하였다. 혈액 세포를 제거한 헤모림프는 사용까지 -80℃에서 보관하였다.

3) 플라즈마 산성화

급속하게 해동한 후, 에이. 데모푼의 플라즈마를 아프로티닌(최종 농도 20㎕) 및 페닐티오우레아(최종 농도 40μM)를 함유하는 트리플루오로아세트산의 1% (부피/부피) 용액으로 pH3까지 산성화하였다. 산성 조건하에서의 펩타이드의 추출을 얼음 물 통에서 가볍게 흔들면서 30분 동안 수행하였다. 상기 추출물은 4℃에서 30분 동안 10000g로 원심분리하였다.

4) 펩타이드 정제

a) 고체상 추출을 통한 정제

헤모림프 5㎖과 동일한 양의 추출물을 카트리지 형태로 산업적으로 이용가능한 2g 역상 캐리어(carrier)(산성화 물(0.05% TFA)로 평형화한 Sep-Pak^™C₁₈, 수분 결합제(Water Associateds)상에 놓는다. 친수성 분자들을 산성화된 물로 간단한 세척을 통해 제거하였다. 펩타이드의 추출은 0.05% TFA로 제조된 아세토니트릴(acetonitrille)의 60% 용액을 사용하여 이루어진다. 60% 아세토니트릴에서 추출된 분획은 아세토니트릴과 TFA를 제거하기 위해 진공상태에서 건조하였고, 첫번째 정제 단계 전에 살균한 산성화 물(0.05% TFA)로 재구성하였다.

b) 역상 칼럼(column) 상에서 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 정화

- 제1단계 : 펩타이드를 함유한 분을 제조 칼럼(column)인 Aquapore RP-300 C₈(Brownlee^™, 220 X 10 mm, 300 Å) 상의 역상 크로마토그래피에 의해 분석하였고,추출은 2.5㎖/분의 일정한 속도로 총 125동안 0.05% TFA내에서 5분간 2% 내지 10%, 30분간 10 내지 25%, 및 40분간 25% 내지 35%, 그리고 나서 50분간 35% 내지 60%의 아세토니트릴 농도구배상에서 수행되었다. 상기 분획을 225 nm에서의 흡수성의 변화에 따라 수동으로 회수하였다. 회수한 분획을 진공 건조하여 초고순도 물로 재구성하고 하술된 실험에 사용하여 항진균성 활성을 분석하였다.

- 제2단계 : 상기 펩타이드에 상응하는 27% 아세토니트릴에서 추출된 항진균성 분획은 0.8㎖/분의 일정한 속도로 0.05% TFA내에서 분당 2% 내지 23%, 50분간 23 내지 31%의 아세토니트릴 이상성 선형 농도구배를 사용하여 역상 분석칼럼(column) Aquapore RP-300 C₈(Brownlee^™, 220 X 4.6 mm, 300 Å)상에서 분석하였다. 상기 분획은 225 nm에서의 흡수성 변화에 따라 수동적으로 회수하였다. 회수한 분획은 진공 건조하고, 초고순도 물로 재구성하고 하술된 조건하에서 항진균성 활성을 분석하였다.

- 제3단계 : 상기 펩타이드를 함유한 항진균성 분획을 30℃로 조절된 온도에서 0.25㎖/min의 일정한 속도로 0.05% TFA 에서, 5분간 2% 내지 22%, 50분간 22% 내지 30%의 아세토니트릴 이상성 선형 구배를 사용한 역상 칼럼인 Narrowbore Delta-Pak^™HPI C₁₈(수분 결합제, 150 X 2 mm) 상에서 균질이 될 때까지 정제하였다. 상기 분획은 225 nm에서의 흡수성 변화에 따라 수동적으로 회수하였다. 상기 회수된 분획은 진공 건조하여, 초고순도 물로 재구성하고 하술된 조건하에서 항진균성 활성을 분석하였다.

실시예 2: Ard1 펩타이드의 구조 특성화

1) 말디-토프(MALDI-TOF) (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)를 통한 순도 확인

양성 선형 모드(mode)인 말디-토프 브루커 비플렉스(Bruker Biflex) (독일, 브레멘)상에서 순도 확인을 수행하였다(하기 3번 참조).

2) 시스테인의 수 결정 : 환원 및 S-피리딜에틸화(pyridylethylation)

시스테인 잔기의 수를 환원 및 S-피리딜에틸화를 통해 원래 펩타이드상에서결정하였다. 원래 펩타이드 400pmole을 2㎕의 디티오트레이톨(dithiothreitol)존재하에서 2mM EDTA 및 6M 구아니디니움(guanidinium) 염화물을 함유하는 pH7.5의 0.5M Tris/HCI 완충용액 40㎕하에서 환원하였다. 상기 반응 배지를 질소 대기하에 두었다. 암실에서 60분간 반응시킨 후, 2㎕의 곧바로 증류한 4-비닐피리딘(vinylpyridine)을 반응액에 첨가하고 암실 및 질소 대기하에서 45℃로 10분간 반응하였다. 0.05% TFA 존재하에서 70분간 2% 내지 52%의 아세토니트릴의 선형 구배를 사용한 Aquapore RP-300 C8 역상 분석 칼럼 (Brownlee^TM, 220 x 4.6 mm, 300Å) 상에서 역상 크로마토그래피를 사용하여 pyridylethine화 된 펩타이드를 반응을 보이는 배지의 성분으로부터 분리한다.

3)말디-토프(MALDI-TOF)(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight)를 통한 원래 펩타이드, S-피리딜에틸화 펩타이드 및 단백질 분해된 단편들의 질량 결정

양성 선형 모드인 말디-토프 브루커 비플렉스 질량 분광계(독일, 브레멘)상에서 질량 측정을 하였다. 질량의 범위는 각각 2199.5Da, 3046.4Da, 4890.5 Da인 m/z로 알려진 펩타이드의 표준 혼합물을 사용하여 외부에서 조정하였다. 분석할 다른 생성물들은 아세톤내에 포화된 용액의 빠른 증발을 통해 얻은 α-사이아노-4-하이드록시시나민산 결정의 얇은 층상에 놓았다. 약한 진공에서 건조한 후 상기 샘플을 질량 분광계상에 놓기 전 0.1% 트리플루오로아세트산 한 방울로 씻어주었다.

4)에드만 분해를 통한 서열분석

원래 펩타이드 및 S-피리딜에틸화 펩타이드 및 다른 단백질 분해 절단 조작후 얻은 다양한 단편들의 에드만 분해 및 페닐티오하이단토인(phenylthiohydantoin) 유도체의 검출을 통한 자동 서열 분석은 ABI473A 서열 분석기(퍼킨 엘머사의 PEApplied Biosystems division)상에서 수행하였다.

5)단백질 절단

C-말단부상의 펩타이드 서열 확인: 공급자가 추천하는 조건에 따라(0.01% Tween 20 존재하의 10mM Tris-HCl,pH9) 200pmole의 환원된, S-피리딜에틸화 펩타이드를 5pmole의 엔도프로테나제(endoproteinase)-Lys-C (아크로모박터(Acromobacter) 프로테아제(protease) I, C-말단상의 리신 잔기의 특이적인 절단(Takara, Otsu))와 함께 반응시켰다.

1% TFA를 넣어 반응을 중지한 후 상기 펩타이드 단편들은 0.05% TFA에서 0.2㎖/분의 속도로 80분 간 2% 내지 60%의 아세토니트릴 선형 농도 구배 및 37℃의 일정한 온도로 사용된 Narrowbore Delta-Pak^TMHPIC₁₈(수분 결합제, 150 X 2 mm) 타입의 칼럼(column)상에서 역상 HPLC에 의해 분리하였다. 얻은 상기 단편들은 말디-토프 질량 분광계를 통해 분석하였고 C- 말단 단편에 상응하는 펩타이드를 에드만 분해를 통해 서열 분석하였다.

실시예 3: 에스. 세레비지아 효모에서의 Ard1 펩타이드의 생성

1) 에스. 세레비지아 효모를 통한 유사 Ard1의 발현 및 분비를 가능하게 하는pEM2 벡터의 제작

코돈 Asp17을 Asn으로, Gly20을 Ala로 변형하기 위한 PCR을 통해 직접적인 돌연변이 유발을 수행한 램버티(Lamberty)등 (1999, J. Biol. Chem., 274, 9320-9326)에 의해 기술된 헬리오마이신 발현 벡터 pSEA2의 사용하였다. MFα1 프로모터, 프리 BGL2 및 프로 MFα1 서열 및 올리고뉴클레오타이드 EM72 및 EM89를 이용해 PCR을 통해 증폭한 SacII 위치를 갖는 헬리오마이신을 코딩하는 서열를 운반하는 단편을 갖는다. 코돈 17 및 20의 변형은 올리고뉴클레오타이드 EM89내에 삽입되었다.

EM725' GTAAATGCATGTATACTAAACTCACA 3'

SacII

EM895' TTTTTTCC GCG GCG CTT GCA CTCGGCGTT GCAGTTACT

(3' CGC CGC GAA CGR GAGCCGCAA CGTCAATGA

Arg Arg Lys Cys GluAlaAsn CysAsnSer

AGT GTA GTT GAC GGC GC 3'

TCA CAT CAA CTG CCG CG 5')

Thr Tyr Asn Val Ala

상기 PCR-증폭 단편은 제한효소 Sph I 및 Sac II로 분해하여 동일 효소로 분해하고 알카라인 포스파타제를 처리한 pSEA2 플라즈미드로 클로닝하였다. 상기 pEM2는 제한 효소 분석 및 서열분석을 통해 확인하였다.

2) 플라즈미드 pEM2에 의한 효모 균주 에스. 세레비지아 의 형질전환

효모 균주 TGY48.1(MATα, ura3-Δ5, his, pra1, prb1, prc1, cps1, 라이슈하트(Reichhart)등, 1992 Invert. Reprod. Dev. 21, 15-24)는 플라즈미드 pEM2를 사용하여 형질전환하였다. 상기 형질전환체는 0.5%의 카사미노(casamino) 산을 보충한 선택 배지 YNBG 상에서 선별하였다.

실시예 4: 헬리오마이신 유사 pEM22, pEM24, pEM30, pEM31, pEM34, pEM35, pEM37, pEM46,및 pEM48의 제조

1)pEM22 및 pEM24 벡터의 제작

미리 하이브리드화(100℃까지 가열한 후에 25℃까지 천천히 식힘)한 올리고뉴클레오타이드 EM25 및 EM26으로 구성된 합성 단편은 BamHI 및 SalI으로 분해한 pSEA2 벡터로 클로닝하였다(헬리오마이신에 대한 코딩 서열의 3' 말단의 코돈 Ser34를 정지 코돈으로 치환). 상기 합성 단편 BamHI-SalI는 제한 효소 위치 XhoI및 Nhe1을 함유한다. 상기 최종 pEGO1 벡터는 제한 효소 분석 및 서열분석을 통해 확인하였다.

EM25 : 5' GATCCACTCGAGTGCTAGCG 3'

Xho I Nhe I

EM26 : 5' TCGACGCTAGCACTCGAGTG 3'

Nhe I Xho I

미리 하이브리드화한 올리고뉴클레오타이드 EM119 및 EM120으로 구성된 합성 단편 BamHI-SalI은 pEGO1 벡터내로 클로닝하였다. 결합 반응은 합성 EM119/EM120 단편 내로 삽입하지 않은 플라즈미드를 제거하기 위해 XhoI으로 분해하였다. 상기최종 pEM22 플라즈미드는 제한 효소 분석 및 서열 분석을 통해 확인하였다. 올리고뉴클레오타이드 쌍 EM127 및 EM128을 사용하여 pEM24를 구성하는데는 동일한 클로닝 전략을 사용하였다.

EM119 5'GA TCC TTCATTAAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA ACC TGA TAG G 3'

Ser PheIleAsn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr

EM120 5'TC GAC CTA TCA GGT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT AAT GAA G 3'

EM127 5'GA TCC TTCTTGAAC ATT AAC TGT TGG TGT GAA ACC TGA TAG G 3'

Ser PheLeuAsn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr

EM128 5'TC GAC CTA TCA GGT TTC ACA CCA ACA GTT AAT GTT CAA GAA G 3'

2) 벡터 pEM30, pEM31, pEM34, pEM35, pEM46, pEM48의 제작

미리 하이브리드화(100℃까지 가열한 후에 25℃까지 천천히 식힘)한 올리고뉴클레오타이드 EM25 및 EM26으로 구성된 합성 단편을 BamHI 및 SalI으로 분해한 pEM2 벡터내로 클로닝하였다(Ard1을 코딩하는 서열의 3' 말단, 코돈 Ser34를 정지코돈으로 치환). 상기 합성 단편 BamHI-SalI는 제한 효소 위치 XhoI 및 Nhe1을 함유한다. 상기 pEM16 벡터는 제한 효소 분석 및 서열 분석을 통해 확인하였다.

미리 하이브리드화한 올리고뉴클레오타이드 EM135 및 EM136으로 구성된 합성 단편 BamHI-SalI은 pEM16 벡터내로 클로닝하였다. 결합 반응은 합성 EM119/EM120 단편 내로 삽입하지 않은 플라즈미드를 제거하기 위해 XhoI으로 분해하였다. 상기 pEM30 플라즈미드는 제한 효소 분석 및 서열 분석을 통해 확인하였다. pEM31(EM117/EM118), pEM34 (EM127/EM128), pEM35(EM129/EM130),pEM46(EM158/EM159), pEM48(EM162/EM163)을 제작하기 위해 동일한 클로닝 전략을 사용하였다.

EM117 5'GA TCC TTC GCT AAC GTT AAC TGT TGG TGTCAAACC TGA TAG G 3'

Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp CysGlnThr . .

EM118 5'TC GAC CTA TCA GGT TTG ACA CCA ACA GTT AAC GTT AGC GAA G 3'

EM129 5'GA TCC TTCTTGAAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA ACC TGA TAG G 3'

Ser PheLeuAsn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr . .

EM130 5'TC GAC CTA TCA GGT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT CAA GAA G 3'

EM135 5'GA TCC TTC GCT AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAAAGATGA TAG G 3'

Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys GluArg. .

EM136 5'TC GAC CTA TCA TCT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT AGC GAA G 3'

EM158 5'GA TCC TTCTTGAAC GTT AAC TGT TGG TGTCAAACC TGA TAG G 3'

Ser PheLeuAsn Val Asn Cys Trp CysGlnThr . .

EM159 5'TC GAC CTA TCA GGT TTG ACA CCA ACA GTT AAC GTT CAA GAA G 3'

EM162 5'GA TCC TTCTTGAAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA AGA TGA TGA G 3'

Ser PheLeuAsn Val Asn Cys Trp Cys GluArg. .

EM163 5'TC GAC CTA TCA TCT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT CAA GAA G 3'

3) 발현 벡터pEM37의 제작

헬리오마이신 pSEA2의 발현 벡터로 부터 코돈 Asp1을 Asn으로 변형시키기 위한 PCR을 이용한 직접 돌연변이 유발을 수행하였다. MFα1의 pro 서열의 말단 및헬리오마이신을 코딩하는 서열을 운반하는 단편이 올리고뉴클레오타이드 EM137 및 EM53을 이용하여 PCR을 통해 증폭되었다. 코돈 Asp1에서 Asn으로의 변이를 올리고뉴클레오타이드 EM137내에 삽입하였다.

EM53 5' CCTGGCAATTCCTTACCTTCCA 3'

HindIII

EM137 5' TTTTTTA AGC TTG GAT AAA AGA AAC AAG TTG ATT GGC AG 3'

Ser Leu Asp Lys Arg Asn Lys Leu Ile Gly

상기 PCR-증폭 단편은 제한 효소HindIII및SalI에 의해 분해되고 동시에SphI및SalI로 분해되어 알카라인 포스파타제를 처리한 pTG4812 벡터(미쇼드(Michaud)등, 1996, FEBS Lett., 395, 6-10)내의 MFα1 프로모터, BGL2의 프리 서열 및 MFα1의 pro 서열를 지니는HindIII위치까지의 1, 2 kb의 SphI-HindIII단편내로 동시에 클로닝하였다. 상기 최종 pEM37 플라즈미드는 제한 효소 분석 및 서열 분석을 통해 확인하였다.

실시예 5 : 헬리오마이신 유사체에 대해 스크리닝 실험

1)배양

헬리오마이신 및 이의 유사체의 발현 벡터로 형질전환된 효모 클론(clone)을 선택 배지(YNBG 50㎖ + 0.5% 카사미노산)에서 29℃에서 72시간 동안 진탕배양하였다.

4℃에서 30분간 4000g으로 원심분리 한 후 상층액을 아세트산을 이용해 pH3으로 산성화하였다.

상기 상층액은 산성화 물(0.05% TFA)로 평형화한 360㎎의 역상 캐리어 Sep-Pak^TMC₁₈(수분 결합제)상에 놓았다. 산성화 물로 간단히 씻어주어 친수성 분자를 제거하였다. 펩타이드는 0.05% TFA에서 제조된 60%의 아세토니트릴 용액으로 추출하였다. 상기 60% 아세토니트릴에서 추출한 분획은 아세토니트릴 및 TFA를 제거하기 위해 진공 건조하여 정제 전에 1㎖ 0.05% TFA로 재구성하였다.

2) 역상 칼럼상에서 고압 액상 크로마토그래피를 통한 정제

획득된 각 유사체에 대해 획득된 생산 수준에 따라, Aquapore RP-300 C₈(Brownlee^TM, 220 X 7 mm, 300Å) 세미-제조 칼럼상의 역상 크로마토그래피를 통해 조정제 상층액의 5 내지 20㎖의 당량을 분석하였다. 추출 작업은 분간 22% 이소크래틱(isocratic) 후에 0.05% TFA에서 1.4 ㎖/분의 일정한 속도로, 25분간 2% 내지 22%, 다음은 30분간 22% 내지 40%의 아세토니트릴 농도 구배상에서 수행되었다. 27% 내지 38% 아세토니트릴에서 추출된 분획을 225 nm에서 흡수성 변화에 따라 수동으로 회수하였다.

3) 유사체의 질량 분석

주요 분획의 1㎕를 0.05% TFA로 산성화된 물로 2번 희석하고 말디-토프 질량 분광계를 통해 분석하였다. 이론적 질량과 상응하는 측정 질량을 갖는 분획을 진공 건조하고 하기에 기술바와 같이 산출된 부피의 초고순도물을 첨가하여 재구성하였다.

4)활성 테스트를 위한 유사체의 정량

세미-제조 Aquapore RP-300 C₈칼럼의 보정 곡선을 5, 10, 20, 25㎎ 헬리오마이신을 주사하여 제작하였다. 밀레니엄 소프트웨어(워터스)를 사용하여 직선의 면적 및 기울기를 계산하여 적분하였다. 따라서 유사체의 정량(㎍ 단위)을 상기 소프트웨어를 사용하여 유사체에 상응하는 크로마토그램 점의 자동 적분을 통해 산출하였다. 증발후 샘플의 수축 부피를 펩타이드 농도 1㎍/㎕로 조절하여 얻은 정량에 대해 계산하였다.

5) 항- 캔디다 알비칸 및 항- 아스퍼질러스 퍼미터스 활성 테스트

다른 유사체들의 항-캔디다 알비칸및 항-아스퍼질러스 퍼미터스활성을 96-웰(well) 마이크로플레이트내의 액체 배지내에서 성장 억제 테스트를 사용하여 평가하였다. 정제된 펩타이드의 활성을 각 펩타이드의 다른 희석물에 대해 테스트하였고 동일한 조건하에서 정량된 헬리오마이신 및 Ard1의 활성과 비교하였다.

- 항-캔디다 알비칸테스트

본 활성 테스트는 15%의 글리세롤을 함유한 사브로 배지에서 -80℃로 동결된 보존 균주로 부터 유래된 효모상에 직접 수행하였다. 보존 균주상의 효모의 밀도는 600 nm에서 1.4 OD의 광학 밀도로 조절하엿다. 상온에서 천천히 해동한 후, 상기 효모 현탁액을 사브로 배지에서 600nm에서 1 OD의 광학 밀도로 희석하였고,상기 희석액 90㎕를 테스트 샘플 10㎕ 존재하의 마이크로측정 플레이트의 웰에 넣었다. 대조구 샘플은 상기 샘플 10㎕ 대신 멸균수 10㎕로 교체하였다. 배지 멸균은 90㎕의배지 존재하에서 10㎕의 멸균수를 배양하여 조절하였다. 상기 샘플을 약한 진탕하에서 40시간동안 30℃에서 배양하였고 항진균성 활성은 600nm에서의 광학밀도를 측정하여 정량하였다.

- 항-아스퍼질러스 퍼미가터스테스트

아스퍼질러스 퍼미가터스의 포자들은 25% 글리세롤 용액에서 10⁷포자/㎖을 함유하는 -80℃에서 동결된 보관 균주로 부터 유래하였다. 상온에서 천천히 해동한 후, 상기 포자들은 PDB 배양 배지속에 현탁하였다(탈광물질화된 물 1ℓ당 12g의 포테이토 덱스트로즈 용액 배지). 포자를 함유한(최종 농도는 1000 포자/웰) 테트라사이클린 (100㎍/㎖) 및 세포탁심(cefotaxime)(1㎍/㎖)을 보강한 90㎕ PDB 배양 배지의 존재하에서 마이크로측정 플레이트에 각 샘플의 10㎕를 넣었다. 대조구 샘플은 상기 샘플 10㎕ 대신 멸균수 10㎕로 교체하였다. 배지 멸균은 90㎕의 배지 존재하에서 10㎕의 멸균수를 배양하여 조절하였다. 상기 샘플은 37℃로 습윤 대기에서 24시간 내지 48시간 동안 배양하였고 항진균성 활성을 발아 근거에 따라 0 내지 9의 수로 정량하였다: 균사의 크기 및 형태는 쌍안 현미경하에서 결정하였다. 최소 저해 농도(MIC)는 4이다.

6) 정량의 조절

활성 테스트에 사용된 펩타이드의 용액은 HPLC하에서 2, 5, 7.5, 10㎍으로 미리 보정된 Narrowbore Delta-pack^TMHPI C₁₈칼럼에 10㎕를 주입하여 정량 조절에 체계적으로 도입되었다. 효과적으로 웰상에 넣어진 펩타이드의 양은 필요할 경우결과의 해석을 위해 재조절하였다.

실시예 6: 생체내의 효율성

1) 방법 - 캔디다 알비칸 감염 모델

헬리오마이신 및 이의 유사체를 생쥐에게 치명적인캔디다 알비칸으로 감염된 모델에서 생체 내 항진균성 활성에 대해 테스트하였다. 병원성캔디다 알비칸(IHEM 8060 균주)를 2.5 x 10⁶CFU/생쥐의 투여량으로 정맥 내(i. v.)를 통해 접종하였다. 상기 펩타이드를 감염 후 6시간, 24시간, 48시간, 72시간의 4번에 걸쳐 정맥 내로 투입하였다. 활성에 대한 평가 기준은 7일째의 생존율 및 사망률의 값이었다. 일반적인 건강상태(털, 운동성, 수화작용 상태등)로 평가되는 사망률 값은 하기와 같이 정의된 0 내지 5 범위의 값으로 각 생쥐에 대해 결정하였다: 0 = 죽음, 1 = 빈사상태, 2 = 위독함, 3 = 병이 있음, 4 = 경미한 병이 있음, 5 = 건강함. 개별적인 점수의 합을 각 군에 대해 산출하였고, 10마리 생쥐군에 대해 50점은 모든 생쥐가 건강한 것을 의미한다.

2) 칸디다증 감염 모델에서의 Ard 1 및 헬리오마이신의 활성 비교

표준 실험안에 따라서 무게가 12g인 10마리 Swiss OF1 수컷 생쥐 군을 i.v.을 통해 2.5 × 10⁶CFU/생쥐의 투여량으로 감염시켰다. 헬리오마이신 및 Ard1을 감염 후 6시간, 24시간, 48시간, 및 72시간에 4번에 걸쳐 i.v.을 통해 투여하였다. 각 펩타이드에 대해, 2가지 투여량을 테스트하였다: 10㎎/㎏ 및 30㎎/㎏. 위약 군은 0.9% 염화나트륨 펩타이드 용매를 주사하였다.

첨부된 도 2 및 도 3은 각각 감염 후 날수에 따른 생존율 및 사망률(생쥐 10마리)을 나타낸다.

매우 심각한 감염 모델에 있어서, 감염 후 4일째에 100%의 치사율이었고, 위약군에서 60%의 생쥐가 감염 후 1일 째에 죽었다.

위약 군의 상대적 곡선보다 항상 위에 곡선이 존재함에도 불구하고, 10㎎/㎏ 및 30㎎/㎏으로 투여한 헬리오마이신은 생존율상에 큰 효과를 보이지 않았다. 10 및 30㎎/㎏ 헬리오마이신의 투여량을 처리한 군에서 발생한 평균 사망률은 각각 감염 후 48시간과 60시간에 발생하였고, 사망률은 7일째에 0/50 및 5/50이었다.

상기 조건하에서 30㎎/㎏의 투여량으로 투여한 펩타이드 Ard1은 24시간까지 첫번째 죽음을 지연하였다. 10마리 중 5마리의 생쥐가 7일째까지 살아있었으며 사망률 점수는 16/50이었다. 로그랭크(loglank) 통계학적 테스트를 사용한 생존 곡선(Meier-Kaplan)의 비교는 위약 군 및 Ard1 30㎎/㎏을 처리한 군간의 상당한 차이를 나타내었다(p<0.001).

10㎎/㎏의 투여량으로 Ard1를 투여하는 것은 생쥐의 생존율 및 일반적 상태를 향상시키지 않고, 50%의 생쥐가 감염 후 2일 째에 사망하였다.

3) 칸디다증 감염 모델에서의 Ard1 및 유사체 pEM24, pEM30, pEM31, pEM35의 활성 비교

첨부된 도 4 및 5는 각각 감염 후 일수에 따른 생쥐 10마리의 생존율 및 사망률을 나타낸다.

본 실험에서, 2.5 × 10⁶CFU/생쥐의 분량을 접종한 생쥐는 위약 치료를 받은 군에서 5일째 50%의 치사율이었다. 첫 번째 죽음은 감염후 2.5일째에 발생하였고, 감염 후 5일째에 평균 사망율이 발생하였다.7일째에는,5마리의 생쥐가 살아있었고사망률은 15/50이었다.

10㎎/㎏의 투여량으로 Ard1 투여하면 첫 번째 죽음이 1.5일 지연되었다. 감염 후 7일째에는 8마리의 생쥐가 살아있었다. 그러나 생존 곡선은 위약 군과 통계적으로 다르지 않았다 (p = 0.2516).

10㎎/㎏의 투여량으로 테스트한 4 종류의 펩타이드 pEM24 (H5), pEM30 (A1), pEM31 (A2), pEM35 (A6)는 Ard1보다 활성이 좋았다: 각각 1^st죽음이 발생한 시점 및 7일째 살아남은 생쥐의 수는 pEM24 (H5)의 경우 3일 및 7마리, pEM30(A1)은 4일및 7마리, pEM31 (A2)는 5.5일 및 8마리, pEM35 (A6)는 7일 및 9마리이다. 각 펩타이드는 처음 3일 동안 생쥐들을 양호한 건강상태로 유지하였고, 사망률 점수는 3일 째에 위약을 받은 군의 22/50에 비해 42/50에서 48/50을 나타내었다. 생쥐의 상태는 4^th주입 후 24시간에 쇠약해졌다. 단지 pEM31을 투여한 군만이 5일간 40/50 보다 높은 사망률을 유지하였다.

위약군에 대한 생존 곡선의 통계학적 비교는 p 가 0.041로 pEM35를 처리한 군에 대해 상당한 차이를 보였다.

위약군에 대한 생존 곡선의 통계학적 비교는 p 가 0.0195인 8일째상의 pEM31을 처리한 군에 대해 상당한 차이를 보였다.

상기 펩타이드의 상대적 활성은 하기와 같다 :pEM31≥pEM35〉pEM30〉pEM24≥Ard1.

4) 칸디다증 감염 모델에서 5㎎/㎏로 투여한 Ard1 및 유사체 pEM31, pEM35, pEM37, pEM46, pEM51의 활성 비교

첨부된 도 6 및 도 7은 각각 감염 후 일수에 따른 생존율과 사망률이다.

본 실험에서,캔디다 알비칸3 ×10⁶CFU로 접종한 무게가 15g인 Swiss OF1 생쥐는 위약을 처리한 군에서 감염 후 4일째에 50%의 사망률을 보였다. 첫 번째 죽음은 감염후 2.5일에 발생하였고 5.5일에는 100%의 생쥐가 죽었다.

5㎎/㎏ 투여량으로 i.v.주사를 통해 세번 투여된 Ard1 및 pEM31 및 pEM46의 처리는 위약 처리와 비교하여 쥐의 생존율을 상당히 증가시키지 못하였다. 그러나, pEM46의 처리는 위약군의 생쥐에 대해 9/50의 사망률과 비교하여 감염후 3일 째에 31/5의 사망률을 갖으며 생쥐의 건강 상태의 악화를 지연하였다.

상기 투여량에서, pEM51 및 pEM35의 처리는 첫 번째 죽음의 발생을 1.5일 지연하였다; 평균 사망률은 pEM51 및 pEM35를 처리한 군에 대해 각각 5일 및 6일째에 발생하였다. 통계적학으로, 제 7일째의 생존 곡선의 분석은 pEM51를 처리한 군에 대해 p 가 0.015이며 pEM35를 처리한 군에 대해 p가 0.0004로 위약 군에 대해 상당한 차이를 나타내었다. pEM51을 받았던 쥐에 대해 11/50의 점수이고 위약을 받은 쥐에 대해 1/50인 것과 비교하여 감염 후 5일까지 28/50의 사망률을 유지하면서, 다른 치료를 받은 생쥐들보다 pEM35을 처리한 생쥐의 건강의 일반적인 상태가 보다좋았다.

일반적으로, 상기 칸디다증 감염 모델에서, pEM35의 항진균성 활성은 pEM46의 활성보다 높은 활성을 갖는 pEM51의 활성보다 높았다. 5㎎/㎏의 사용된 투여량에서, Ard1 및 pEM31분자는 효과적이지 않았다.

5) 칸디다증 감염모델에서 유사체 pEM35의 활성

첨부된 도 8은 감염 후 일수에 따른 10마리 생쥐의 생존율을 나타낸다. 본 실험에서, 생쥐에 2.5 ×10⁶CFU/생쥐로 접종된 쥐는 위약군에서 5일째에 50% 및 8일째에 100%의 치사율이었다. 첫번째 죽음은 감염 후 3일째에 발생하였다. 사망률 은 30/50 이하로 급속히 감소하였다(2.5일째는 25/50).

4일간 날마다 3번씩, 1회에 10 내지 30㎎/㎏의 투여량으로 펩타이드 pEM35를 투여하였다(제 0일에는 감염 후 1시간, 5시간, 10시간에, 감염 후 제 1, 2, 3일에는 8시, 14시, 20시에);즉, 하루 전체 투여량은 30 내지 90㎎/㎏이다.

상기 투여 계획으로, pEM35는 두 가지 투여량에서 모두 첫번째 죽음의 발생을 4.5일 지연시켰다. 감염 후 8일 째에, 매일 30 및 90mg/kg/일의 투여량으로 처리한 생쥐에 대해 각각 80% 및 90%의 생존율을 관찰할 수 있었다. 상기 생쥐들은 40/50 이상의 사망률을 유지하면서 7일까지에 좋은 건강 상태를 유지하였다. 8일째에, 상기 점수가 30/50으로 떨어졌다. pEM35를 30mg/kg/일의 낮은 투여량으로 처리한 군 및 90mg/kg/일의 강한 투여량으로 처리한 군간의 큰 차이점이 관찰되지 않았다.

pEM35를 처리한 군과 비교한 생존 곡선은 위약 군의 곡선과 통계적학적으로 다르다(두 가지 투여량에 대해 p〈0.001).

6)방법 - 세도스포리움 인플라텀 감염 모델

무게 22g의 Swiss OF1 생쥐에 정맥 내(i.v.)를 통해 치명적 투여량의세토스포리움 인플라텀을 감염시켰다(균주 FSSP 7908은 말트 아가 겔로스(Malt Agar gelose)상에서 37℃로 7일간 배양하였다). 감염 투여량은 생쥐 당 7 ×10⁶포자로, 측면 꼬리 혈관을 통해 100㎕를 주입하였다.

펩타이드 pEM35 및 pEM51은 복막 내에 삽입된 ALZET 1003D 삼투압 펌프(유속 : 0.97㎕/h ; 부피: 100㎕ ; 지속시간 : 4일) 및 1007D 펌프 (유속 : 0.97㎕/h ; 용적: 100㎕ ; 주입시간 : 8.5일)를 통해 연속적으로 투여하였다.

감염된 8마리 생쥐 군들은 하기와 같이 처리하였다:

a) 위약 : 복막 내(i.p.)에 삽입된 1007D 펌프를 통한 0.9% NaC1;

b) 처리하지 않음;

c) 0.3㎍/㎖의 이론적인 평형 플라즈마 농도에 상응하는, 8일 동안 30mg/kg의 투여량으로 1007D 펌프를 통해 i.p.로 pEM51을 투여;

d) 0.6㎍/㎖의 이론적인 평형 플라즈마 농도에 상응하는, 4일 동안 60mg/kg의 투여량으로 1003D 펌프를 통해 i.p.로 pEM51을 투여;

e) 0.35㎍/㎖의 이론적인 평형 플라즈마 농도에 상응하는, 4일 동안 35mg/kg의 투여량으로 1003D 펌프를 통해 i.p.로 pEM35을 투여하였다.

7)세도스포리오스증 감염 모델내로의 연속적인 주입하에서 투여한 유사체 pEM35 및 pEM51의 활성

첨부된 도 9 및 도 10은 각각 감염 후의 생존율 및 사망률(생쥐 8마리)을 나타낸다.

본 침입성 세도스포리오스증 모델에 있어서,세도스포리움 인플라텀의 7 ×10⁶포자의 투여량으로 접종하여 감염 후 7일 째에 50%의 치사율이었다. 대조군(감염은 시키되 치료는 하지 않음) 및 위약군(감염시킨 다음 Alzet 펌프를 삽입)에 대한 첫 번째 죽음은 각각 감염 후 5일째 및 6일째에 발생하였다. 대조군에서는 11일째에 100%의 사망률을 관찰하였고, 위약군에서는 20일째에 75%의 사망률을 관찰하였다. 생쥐의 일반적인 건강 상태는 두 군 모두에서 감염 후 3일째부터 급속하게 악화되었고 감염 후 3일째는 각각 28/40 및 34/40이었던 사망률이 7일째는 6/40 및 7/40이었다. 감염 후 4일째에는 뇌염의 징후가 발생하였다.

30mg/kg의 투여량으로 pEM51을 8일간 처리한 경우 첫번째 죽음의 발생이 9일로 지연되었다. 20일째에는 8 마리 중 5 마리가 살았다. 사망률은 감염 후 4일부터 뇌염의 발생과 함께 감소하였고(28/40), 5일부터 14일까지는 24/40로 안정화되었다. 생쥐의 상태는 20일째는 11/40의 점수로 점차적으로 악화되었다. 사망률 곡선은 대조군 및 위약군의 사망률 곡선과 통계적학적으로 다르다(로그랭크: p =0.0027).

60mg/kg의 투여량으로 pEM51을 4일간 처리한 경우 첫번째 죽음의 발생이 4일로 지연되었다.감염 후 12일째에 50%의 치사율이 관찰되었는데, 이는 대조군 및 위약군과 비교하여 5일이 지연된 것이다. 20일째는 8 마리 중에서 3 마리가 살았다. 사망률은 감염 후 5일부터 뇌염의 증상을 동반하여 30/40으로 감소하였고 14일째는 6/40으로 점차적으로 감소하였다. 대조군의 사망률 곡선 및 위약군의 사망률 곡선은 통계적학적으로 다르다(로그랭크 : p =0.0176).

35mg/kg의 투여량으로 pEM35를 4일간 처리한 경우 첫번째 죽음의 발생이 5일로 지연되었다.감염 후 15일째에 50%의 치사율이 관찰되었는데, 이는 대조군 및 위약군과 비교하여 8일이 지연된 것이다. 20일째에 8 마리 중에서 1 마리가 살았다. 사망률은 감염 후 5일 째부터 뇌염의 증상을 동반하여 감소하였고(28/40) 15일째에는 8/40으로 점차적으로 감소하였다. 대조군의 사망률 곡선 및 위약군의 사망률 곡선은 통계적학적으로 다르다(로그랭크 : p = 0.0177).

상기 모델에 있어서, pEM51을 30mg/kg의 투여량으로 8일간 투여한 경우는 생존율에 있어서 매우 높은 임상학적 효율성을 나타내었다. 2배 짧은 기간에 대해 2배 높은 투여량(60mg/kg)을 투여한 경우는 pEM51의 효율성을 완전하게 감소하였다.그러나, 치료를 시작한 첫 4일 동안 30mg/kg의 투여량을 처리한 군의 사망률은 60mg/kg의 투여량을 처리한 군보다 실질적으로 낮았다. 8일 동안 60mg/kg의 투여량의 투여는 pEM51의 임상학적 효율성을 더욱 개선할 수 있을 것이다.

35mg/kg의 투여량으로 pEM35를 4일동안 투여하는 것은 pEM51 60mg/kg를 4일동안 투여한 것과 동일한 효율성을 나타내었다. 상기 세도스포리오스증모델에서 pEM35의 임상학적 활성은 적어도 pEM51의 임상학적 활성과 같다.

8)생쥐에서 pEM35 및 pEM51의 급성 독성 테스트

첨부된 도 11 및 도 12는 시간에 따른 치료한 생쥐의 몸무게 변화를 보여준다.

생쥐에 대한 임상학적 효율성 테스트동안, 0.9% NaCl에 용해된 pEM35 및 pEM51을 정맥 내로 3일동안 30mg/kg 3번, 30분 간격으로 연속적으로 주사한 경우 급성 독성이 관찰되지 않았다.

3일 동안 pEM35를 30mg/kg씩 3번 투입한 건강한 생쥐의 몸무게 변화는 0.9% NaCl을 투여한 생쥐와 동일하였다.

정맥 내 투여된 동량의 pEM35 및 pEM51의 독성은 17 내지 18g의 수컷 생쥐 Swiss OF1에게 200, 300, 400mg/kg의 투여량으로 테스트하였다. 상기 펩타이드는 0.9% NaCl 용액에서 용해하였다. 주입 부피는 150㎕로 45초마다 측면 꼬리 혈관을 통해 주입하였다.

모든 생쥐는 피로와 연관있는 혈관확장을 보였다. 생쥐의 건강 상태는 투여량에 따라 주입 후 20 내지 40분후에 정상으로 돌아왔다.

4일간의 몸무게 변화 곡선은 200 및 400mg/kg의 투여량의 pEM35 또는 200 및 300mg/kg의 투여량의 pEM51을 투여한 생쥐에 대해 주입 후 다음 날에 1g의 지연된 성장을 볼 수 있었고; 400mg/kg의 투여량인 pEM51을 투여한 생쥐는 약 2g의 지연된 성장을 나타내었다. 상기 몸무게 곡선은 모든 생쥐에 대해 정상으로 돌아왔다.

실시예 7: Ard1 및 유사체 pEM31, pEM35, pEM46, pEM48, pEM51의 항진균성활성 범위

1) 선상 진균류에 대한 활성 확인을 위한 테스트

항진균성 활성을 액체 배지에서의 성장 억제 테스트를 통해 확인하였다.

선상 진균류(스트라스부르 Civil Hospital의 Dr. H. Koening이 기증한에이. 퍼미가터스, 에이. 플라버스(A. flavus) 및에이. 테레우스(A. terreus); 네덜란드 Nijmegen의 University Hospital, 미생물 학과의 Dr. J. Meis와 J. Mouton이 기증한에스. 플로리피칸(S. prolificans) 및에프. 솔라니(F. solani))는 말트-아가(Malt-Agar) 슬랜트 겔로스(slant gelose)(Biomerieux)에 접종하여 7일 동안 37℃에서 배양하였다.

상기 포자들은 0.05%의 Tween 20을 포함하는 YPG 배지 10㎖과 함께 회수하여 가제를 통해 걸렀다. 상기 포자들을 1700rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상기 찌꺼기는 YPG내로 회수하였다(1리터 당 이스트 추출물 1g, 펩톤(Peptone) 1g, 포도당 3g).

상기 상등액은 커버슬라이드(Coverslide)를 덮어 계산하였고 10⁴포자/㎖로 조절하였다.

펩타이드 희석물 100㎕는(펩타이드 0.097㎍/㎖l에 50의 농도) 마이크로적정플레이트에 놓았다. 그리고 선상 진균류 10⁴포자/㎖ 100㎕, 즉, 포자 1000개를 첨가하였다.

테스트 플레이트를 37℃에서 48시간동안 반응시켰다.

최소 저해 농도(MIC)는 웰내를 덮는 속도를 관찰하였다. 상기 MIC는 50% 웰을 덮는것이다.

2) 항-효모 활성 확인을 위한 테스트

캔디다 효모균(스트라스부르 Civil Hospital의 Dr. H. Koening이 기증한씨. 알비칸, 씨. 글라브라타(C. glabrata),씨. 듀블리엔시스(C. dubliensis),씨. 트로피칼리스(C. tropicalis),씨. 케필(C. kefyr),씨. 크루세이(C. krusei) 및씨. 파라실로시스(C. parapsilosis)), 플루코나졸(fluconazole)에 내성이 있는씨. 알비칸(네덜란드 Nijmegen의 University Hospital, 미생물 학과의 Dr. J. Meis와 J. Mouton이 기증한 n^o245962, n^o2332, n^o246335, n^o3552), 및크립토코커스 네오포르만(Cryptoccocus neoformans)(스트라스부르 Civil Hospital의 Dr. H. Koening이 기증)은 사브로-클로암페니콜 아가(Sabouraud-Cloramphenicol Agar) 슬랜트 겔로스 (Biomerieux)에 접종하여 30℃에서 24시간(캔디다 종), 37℃에서 72시간(크립토코커스 네오포르만) 배양하였다.

2.5×10⁶효모/㎖에 상응하는 600nm 에서 0.1OD의 최종 농도를 얻기위해 몇몇 효모 콜로니는 액상 사브로 배지(Biomerieux)내 현탁액에 놓았다.

효모 현탁액은 사브로 배지에서 5 ×10³효모/㎖로 조절하였다.

펩타이드 희석액 100㎕는(펩타이드 0.097㎍/㎖에 50의 농도) 마이크로적정 플레이트에 놓았다. 5 ×10³효모/㎖ 효모 현탁액 100㎕, 즉 효모 500을 첨가한 후에, 테스트 플레이트를 약하게 진탕하여 30℃에서 24시간(캔티다) 또는 37℃에서 72시간(크립토코커스)동안 배양하였다.

최소 저해 농도(MIC)는 마이크로적정 플레이트를 읽는 분광 광도계를 사용해서 600nm에서 흡수률을 측정하여 결정하였다. 상기 MIC는 50%의 성장 억제율이었다.

3) 식물 병원균에 대한 활성 확인 테스트: 알테나리아 브라시콜라 ( Alternaria brassicola ) 및 뉴로스포라 크라사 ( Neurospora crassa ).

펩타이드 희석물 100㎕는(펩타이드 0.097㎍/㎖에 50의 농도) 마이크로적정 플레이트에 놓았다.

동결시킨에이. 브라시콜라(A. brassicola) 및엔. 크라사(N. crassa)(스트라스부르 IBMC의 Dr. Bullelt가 기증) 10⁴포자/㎖를 100㎕ 첨가한 다음, 테스트 플레이트를 30℃에서 48시간 반응하였다.

하기 표 3은 효모 및 선상 진균류에 대한 Ard1 및 그 유사체들(㎍/㎖)의 MIC를 나타낸다. 하기표 4 및 표 5는 플루코나졸(fluconazole)에 내성을 가진캔디다 알비칸효모 및 선상 진균류에 대한 유사체 pEM35 및 pEM51(㎍/㎖)에 대한 각각의 MIC를 나타낸다.

효모	Ard-1	pEM31	pEM48	pEM51	pEM46	pEM35
씨. 알비칸	3.125-6.25	3.125-6.25	1.56	1.56-3.125	1.56-3.125	1.56
씨. 트로피칼리스	6.25-12.5	6.25	3.125	3.125	3.125	1.56
씨. 글라브라타	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25
씨. 파라실로시스	3.125-6.25	1.56	0.78	0.78-1.56	0.78-1.56	0.78-1.56
씨.듀블리엔시스	1.56-3.125	6.25	1.56-3.125	1.56-3.125	3.125	0.78-1.56
씨. 케필	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25	> 25
씨. 크루세이	3.125	3.125	1.56	1.56	1.56	1.56
씨. 네오포르만	12.5-25	12.5	3.125-6.25	1.56	6.25	6.25
선상 진균류
에이. 퍼미카터스	12.5	6.25-12.5	6.25-12.5	6.25-12.5	3.125	6.25
에이. 플라버스	6.25-12.5	> 25	6.25-12.5	6.25	12.5-25	3.125
에이. 테레우스	1.56-3.125	3.125-6.25	3.125-6.25	3.125	6.25	6.25
에이. 브라시콜라	> 25	> 25	12.5	> 25	25	> 25
엔. 크라사	0.097	<0.048	0.39	0.195	0.195	<0.048

씨. 알비칸	pEM51	pEM35	암포(ampho) B	플루코나졸	이트라코나졸(itraconazole)
N˚245962	0.78-0.39	3.125-1.56	0.125	> 64	1-0.5
N˚2332	1.56	1.56-0.79	0.25	> 64	0.5-0.25
N˚246335	1.56-0.78	3.125-1.56	0.0625	> 64	0.5-0.25
N˚3552	1.56-0.78	3.125-1.56	0.125-0.0625	> 64	1-0.5

선상 진균류	펩타이드	MIC (㎍/㎖)
FASF 5161에이. 퍼미가터스	pEM35pEM51암포 B	6.25-3.1253.125-1.560.5
FASF V02-31에이. 퍼미가터스	pEM35pEM51암포 B	12.5-6.2512.5-6.251-0.5
FSSP 7902에스. 프로리피칸	pEM35pEM51암포 B	0.39-0.190.19-0.09>16
FSSP 7908에스. 프로리피칸	pEM35pEM51암포 B	0.19-0.090.09-0.048>16
FFUS 8591에프. 솔라니	pEM35pEM51암포 B	3.125-1.560.78-0.39>16

실시예 8: 캔디다 알비칸 IHEM 8060에 대한 pEM35 및 pEM51 펩타이드의 살진균성 동역학

첨부된 도 13은캔디다 알비칸IHEM 8060에 대한 pEM35와 pEM51 펩타이드의 살균 동력학을 나타낸다.

상기 테스트는 클렙서(Klepser)등 (Antimicrob Agents Chemother, 1998년 5월, 42(5) :1207-12 "Influence of test conditions on antifungal time-kill curve results : proposal for standardized methods")에 의해 설명된 실험안 따라 수행되었다. 테스트 사용된 캔디다 알비칸 효모는 상기 항-효모 활성 테스트에 사용한 것과 동일하다(스트라스부르 Civil Hospital의 Dr. H. Koening이 기증).

효모는 사프로-클로암페니콜 겔로스 상에 접종하여 30℃에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 일부 효모 콜로니는 4㎖ 액상 사브로 배지(biomerieux)에서 현탁 되어 30℃에서 하룻밤을 진탕 배양하였다.

효모 현탁액은 신선한 사브로 배지에서 1 ×10⁶내지 5×10⁶효모/㎖로 조절하였다. 일정한 양의 pEM35 또는 pEM51펩타이드를 함유하거나 또는 함유하지 않은(대조구)효모 현탁액 1 ㎖ 및 사브로-클로암페니콜(Biomerieux) 9㎖을 첨가한 1:10의 희석액을 준비하였다. 초기 접종의 농도는 1 ×10⁶내지5×10⁶효모/㎖이다.

pEM35 및 pEM51 펩타이드는 1㎍/㎖ 내지 64㎍/㎖까지 일정 농도의 범위에 걸쳐 테스트 하였다. 미리 결정된 시간에 (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24시), 각 용액의 샘플 100㎕를 추출하여 멸균 수에서 연속적으로 10회 희석한다. 그리고 30㎕를 사브로 겔로스 디쉬(dish)(Biomerieux)넣고 콜로니 수를 계산하였다. 측정된 콜로니 수가 1000 효모/㎖ 이하일 때, 테스트 용액에서 30㎕의 샘플을 채취하여 미리 희석하지 않고 사브로 겔로스 디쉬(Biomerieux)에 넣는다. 상기 디쉬는 35℃에서 24시간에서 48시간동안 배양하였다.

암포테리신 B 대조구 테스트 (농도는 MIC의 1배와 16배에 해당함)는 마찬가지로 클렙서등(Antimicrob Agents Chemother 1997년 6월; 41(6) : 1392-1395, "Antifungal pharmacodynamic characteristics of fluconazole and Amphotericin B tested against Cnadida albicans")에 의해 기술된 실험안을 따라 수행하였다.

0.5 Mc 파랜드(Farland) 혼탁도 표준에 적정한 pEM35 또는 pEM51 펩타이드를 갖는 멸균수내에서캔디다 알비칸효모 혼탁액을 제조하여 효모/㎖의 수의 최소 임계를 결정하였다(농도 1 ×10⁶-5×10⁶효모/㎖). 멸균수에서의 희석은 각 100, 50및 30 효모/㎖ 농도의 3가지 현탁액을 얻었다. 각 현탁액은 30㎕씩 추출되어 사브로 겔로스 디쉬(Biomerieux)넣어 콜로니 수를 계산하였다. 상기 디쉬는 35℃에서 24시간에서 48시간동안 배양하였다.

계산된 값들은(log₁₀효모/㎖) 실험에 사용된 pEM35 및 pEM51 펩타이드의 각각의 농도에 대해 미리 정한 시간 범위에 따라 넣었다.

Claims

하기 화학식 I로 표현되는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 아미노산 치환을 통해 헬리오마이신(Heliomicine)으로 부터 유도된 펩타이드:

화학식 I

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀

X₂₁X₂₂X₂₃X₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈X₂₉X₃₀X₃₁X₃₂X₃₃X₃₄X₃₅X₃₆X₃₇X₃₈

X₃₉X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄

여기서:

- X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃은 산성 아미노산,

- X₁₆, X₄₄는 작은 극성 아미노산,

- X₁₉는 큰 극성 아미노산,

- X₃₆은 작거나 또는 매우 약한 소수성 아미노산,

- X₃₈은 매우 약한 소수성이거나 또는 작은 아미노산이며,

상기 치환은:

- X₁, X₁₇, X₂₁, X₄₃의 적어도 하나가 염기성 또는 극성, 바람직하게는 큰 극성, 아미노산 및/또는

- 아미노산 X₁₆, X₄₄의 적어도 하나가 염기성 아미노산 또는 큰 극성 아미노선이며, 및/또는

- X₁₉는 염기성 아미노산, 및/또는

- 아미노산 X₃₆, X₃₈의 적어도 하나는 강한 소수성 아미노산,

및 여기서 나머지 아미노산 (X)은:

- X₁₃, X₃₇, X₃₉는 큰 극성 아미노산을 나타내고,

- X₆, X₁₅, X₃₄는 작은 극성 아미노산을 나타내고,

- X₂, X₂₃, X₂₄, X₂₅, X₂₈, X₃₁은 염기성 아미노산을 나타내고,

- X₃, X₄, X₈, X₁₂는 소수성 아미노산을 나타내고,

- X₉, X₁₄, X₂₇, X₃₅, X₄₁은 방향족 소수성 아미노산을 나타내고,

- X₅, X₁₀, X₁₁, X₂₀, X₂₆, X₂₉, X₃₀, X₃₃은 작은 아미노산을 나타내고,

- C₇, C₁₈, C₂₂, C₃₂, C₄₀, C₄₂는 시스테인을 나타낸다.
제1항에 있어서, 상기 X₁, X₁₇, X₄₃의 적어도 하나가 염기성 또는 극성, 바람직하게는 큰 극성의 아미노산이고 X₂₁은 산성 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 X₃₆, X₃₈의 적어도 하나가 비-방향족 강한 소수성 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 X₁₇은아스파라긴 또는 아르기닌이고 X₄₃은 글루타민 산이며: 여기서

- X₃₆은 류신 또는 이소류신, 및/또는

- X₁₉가 아르기닌, 및/또는

- X₁₆이 아르기닌인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 X₁₇은아르파라틴산이고 X₄₃이 글루타민산이며: 여기서

- X₃₆은 류신 또는 이소류신, 및/또는

- X₁₉가 아르기닌, 및/또는

- X₁₆이 아르기닌인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 X₄₃은 글루타민이고 X₁₇이 아스파라긴이며: 여기서

- X₃₆은 류신 또는 이소류신, 및/또는

- X₁₉가 아르기닌인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 X₄₃은 글루타민이고 X₁₇이 아스파르트산인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 X₄₃은 글루타민이고 X₁₇은 아스파르트산이며: 여기서

- X₁은 아스파라긴, 및/또는

- X₃₆이 류신 또는 이소류신인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산들은 아르기닌, 리신 또는 히스티딘으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 아미노산들은:

- 류신과 이소류신은 강한 소수성 아미노산 및 메티오닌 및 발린은 매우 약한 소수성 아미노산인 메티오닌, 발린, 류신, 이소류신으로 부터 선택된 비-방향족, 또는

- 강한 소수성의 아미노산인 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판으로 부터 선택된 방향족인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 아미노산들은 아스파르트산 또는 글루타민산으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 큰 극성 아미노산들은 글루타민 또는 아스파라긴으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작은 극성 아미노산들은 세린 또는 트레오닌으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작은 산들은 글리신 또는 알라닌으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열 중 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드:

Helio : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

Ard1 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM37 :NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM43 : DKLIGSCVWGAVNYTTDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM42 : DKLIGSCVWGAVNYTRDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM44 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCRGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM22 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCET

pEM23 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANINCWCET

pEM25 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCET

pEM24 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCET

pEM7 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCER

pEM21 : DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM39 :NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM61 :NDKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT

pEM62 :NDKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCQT.
제1항 내지 제14항에 있어서, 하기 서열 중 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드:

Ard1 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM40 :NKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM50 : DKLIGSCVWGAVNYTRNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM56 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM52 : DKLIGSCVWGAVNYTSRCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM51 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCRAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET

pEM32 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCET

pEM33 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANINCWCET

pEM34 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCET

pEM35 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCET

pEM31 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM30 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCER

pEM46 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT

pEM47 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCQT

pEM48 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCER

pEM49 : DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCER

pEM54 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCET

pEM57 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQT

pEM55 : DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩타이드 함유하는 활성제로서, 바람직하게 상기 조성물은 허용 가능한 담체와 결합되는 것을 특징으로 하는 항진균성 및/또는 항세균성 조성물.
제17항에 있어서, 상기 조성물은 인간 또는 동물에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제17항에 있어서, 상기 조성물은 식물에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.