KR20140115774A

KR20140115774A - 지렁이에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항진균용 조성물

Info

Publication number: KR20140115774A
Application number: KR1020130030848A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 윤은영; 김성렬; 남성희; 안미영; 이준하; 김인우; 권용남
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2014-10-01

Abstract

본 발명은 지렁이에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항진균용 조성물에 관한 것이다. 더 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 항균 및 항진균 활성을 갖고 있고, 인간 적혈구 세포에 독성이 없기 때문에 항균용 약학적 조성물, 항진균 약학적 조성물 및 보존제 조성물로 이용하는데 효과적이다.

Description

지렁이에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항진균용 조성물{Antimicrobial or antifungal composition comprising peptide from Lumbricus terrestris}

본 발명은 지렁이(Lumbricus terrestris)에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항진균용 조성물에 관한 것이다. 더 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 항생제는 이런 감염으로부터 치료효과를 갖는 물질이었다. 그러나 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 병원성 미생물의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다.

항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스 (Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다 (Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 상기 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다. 따라서 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발은 시급한 실정이다.

한편, 곰팡이는 농업뿐만 아니라 전 산업분야에서 막대한 손해를 끼치는 것으로 알려져 있다. 특히, 식물에 병을 일으키는 것의 대부분이 곰팡이가 차지하고 있어 농업에서의 중요성이 크다. 이러한 곰팡이는 균사 생장 및 포자생성, 포자의 발아후 식물체를 침입하는 기구인 부착기를 형성하고, 부착기를 도구로 하여 식물체에 침입함으로써 식물에 병을 일으킨다. 따라서 이러한 기작을 저해하는 것이 곰팡이 생육억제와 식물병 방제에 크게 효과가 있다. 곰팡이에 의한 피해 때문에 최근 농약을 비롯하여 많은 곰팡이 살균제 즉, 항진균제가 이용되고 있다. 그러나 이들 화학적 항진균제는 독성이 강해서 식용이나 가축용으로 사용할 수 없으며, 사용자의 안전과 환경보호의 차원에서 바람직하지 못한 것이 현실이다. 따라서 보다 안전하고 인체 및 가축에 무해한 새로운 항진균 물질이 절실히 요구되고 있다.

상기 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 병원성 미생물들에 의한 피해를 막기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 지렁이(Lumbricus terrestris)로부터 유래한 새로운 항생제용 펩타이드를 찾던 중, 항균활성 및 항진균 활성을 갖는 펩타이드를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열(AQQDICWRRNR-NH₂)을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다.

또한 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다.

지렁이(Lumbricus terrestris)로부터 항균 또는 항진균 펩타이드를 분리하기 위해, 먼저 lipopolysaccharide로 면역반응을 유도하여 GeneFishing Technology로 특이적으로 발현된 유전자 마커들을 선별한 다음, Defensin(디펜신) 계열의 하나인 베타-디펜신(β-defensin)과 상동성이 있는 유전자 마커를 선발하였다(실시예 1 참조). 상기 유전자 마커에서 베타-디펜신과 상동성이 있는 11개의 아미노산 서열([도 1]의 네모 참조)을 본 발명의 펩타이드 서열로 선택하였고, 상기 서열로 합성 펩타이드를 제조하여 ‘룸브리쿠신(Lumbricusin)’으로 명명하였다. 룸브리쿠신은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.

천연 항균 펩타이드는 곤충, 양서류, 척추동물 등에서 유래하는데, 디펜신(Defensin)은 척추동물 유래 항균 펩타이드로서 40여개의 아미노산으로 이루어져 있고, 백혈구에서 처음으로 발견되었으며, 그 후 상피세포, 장 등에서도 발견되었다. 피부, 폐, 기관, 신장, 생식기 등의 점막 상피에서 발현되는 디펜신으로서, 베타-디펜신(β-defensin)이 알려져 있다. 현재 인간 베타-디펜신으로는 6종류의 구조가 밝혀졌다. 베타-디펜신은 국소 감염 방어 뿐만 아니라, 수상세포(dendritic cells), T-림프구(Lymphocyte), 단핵세포(monocyte) 등의 세포를 주화성 이동(chemotactic migration) 시킴으로써 후천성 면역(acquired immunity)에도 관여하는 것으로 보고되어 있다(Yang, D. et.al., Science; 286:525,1999 / Territo, M.C. et.al., J. Clin. Invest;84:2017,1989 / Lillard, J.W. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.;96:651,1999 / 나가오카 이사오 등, 임상면역; 제33권, p.577,2000).

합성한 펩타이드 ‘룸브리쿠신’항균 및 항진균 활성을 RDA(radial diffusion assay)로 측정한 결과, 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureu . 그람양성균)와 대장균 O-157(E. coli , 그람 음성균)에 대해서 약 20 ug/mL 농도부터 항균활성을 캔디다 알비칸스(C. albicans, 진균)에 대해서는 약40 ug/mL부터 항진균 활성을 보였다(시험예 1 및 [도 2] 참조). 또한 룸브리쿠신의 인간 적혈구 세포에 대한 독성을 측정한 결과, 모든 농도에서 독성이 없었지만, 대조군으로 쓰인 멜리틴(melittin)은 낮은 농도에서도 매우 큰 독성을 보였다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 정상 세균총의 일부로서 인간의 구강, 음부 및 위장관의 점막 표면에 군집하고 있는 효모균과 같은 이상성 진균이다. 그것은 또한 구내염 및 질염과 같은 국소 점막염을 일으킬 수 있는 기회 감염균이거나, 또는 그것이 침투하여 전신성 감염이 될 수 있다. 상기 결과를 토대로 본 발명의 ‘룸브리쿠신’은 항균 및 항진균 활성을 갖고 있으면서도 독성이 없는 펩타이드임을 알 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항균용 또는 항진균용 약학적 조성물은 본 발명의 펩타이드(룸브리쿠신) 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 항균용 또는 항진균용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 펩타이드의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 펩타이드의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 펩타이드를 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명에 따른 보존제 조성물이란, 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상에 사용될 수 있는 것으로, 세균, 곰팡이 및 효모로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 증식을 억제하거나 살균하여 식품, 사료, 화장품 및 의약품의 변질이나 부패, 화학변화를 방지하여 영양가와 신선도를 유지시키기 위하여 사용되는 첨가물을 의미한다. 좁은 의미로는 세균, 곰팡이, 효모 등의 부패미생물의 발육을 저지하거나 살균할 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 보존제 조성물로서 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다. 본 발명의 ‘룸브리쿠신’은 독성이 없고, 20 내지 40 ug/mL 의 농도에서도 부패미생물의 발육을 저지하므로 보존제 조성물로 적합하다.

본 발명의 펩타이드(룸브리쿠신)가 항균, 항진균 활성을 보이는 미생물에는 그람 양성균, 그람 음성균, 진균류 모두를 포함하고, 더 바람직하게는 스타필로코커스(Staphylococcus) 속 균주, 에셔리키어(Escherichia) 속 균주, 칸디다(Candida) 속 균주에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 대장균 (Escherichia coli), 캔디다 알비칸스(C. albicans) 일 수 있다.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 항균 및 항진균 활성을 갖고 있고, 인간 적혈구 세포에 독성이 없기 때문에 항균용 약학적 조성물, 항진균 약학적 조성물 및 보존제 조성물로 이용하는데 효과적이다.

도 1은 면역 유도된 지렁이에서 분리한 항균 및 항진균 펩타이드 유전자의 부분 cDNA 염기서열 및 상기 염기서열로부터 연역된 상기 펩타이드의 아미노산 서열(네모친 부분)을 나타낸 것이다.
도 2는 룸브리쿠신의 항균 활성 및 항진균 활성을 나타내는 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

면역 유도한 지렁이로부터 유전자 선발

지렁이(Lumbricus terrestris)로부터 항균 펩타이드 유전자를 분리하기 위하여 먼저 지렁이 체강에 Lipopolysacchride를 주사하여 면역을 유도하였다. 면역유도 후 지렁이를 액체질소에서 마쇄하여 트리졸(Trizol)(Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 또한 차별화 발현 유전자를 탐색하기 위해서 면역화 되지 않은 지렁이를 대조구로 사용하였다. 면역 유도된 지렁이에서 특이적으로 나타나는 cDNA 마커를 찾기 위해서 Arbitrary primer를 이용하여 독특하게 발현된 유전자(differentially expressed gene)를 선발하는 GeneFishing Technology를 이용하였고, 그 결과 54개의 후보 cDNA 마커를 찾았다. 상기 마커들의 염기서열을 ABI 370 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems, USA)을 이용하여 결정하였고, Protein Blast를 통해 상기 마커 중 디펜신(Defensin)과 상동성이 높은 유전자(하기 [표 1]의 111번)를 찾았다. Protein Blast 결과는 하기 [표 1]에 표시하였다.

DEG. No	Putative identification	Species	Accession No.	Score(bits)	Identity(%)
3	Kinesin	Trypanosoma cruzi strain CL Brener	XP_814501.1	29.1	9/12 (75%)
8	Secernin-2 isoform 1	Homo sapiens	NP_612364.2	27.8	11/19 (57%)
10	40S ribosomal protein S9	Corbicula fluminea	AAT76788.1	41.6	19/24 (79%)
12	Ribosomeml protein L18	Crassostrea gigas	CAD91422.1	143	67/80 (83%)
13	Rhophilin-2-B	Xenopus laevis	NP_001088054.1	29.9	10/15 (66%)
20	Flagellin	Rhodopseudomonas palustris BisA53	YP_780455.1	29.1	8/9 (88%)
21	Similar to Huntingtin-interacting protein 1-related protein	Equus caballus	XP_001492845.2	33.9	12/21 (57%)
22	Adhesin aidA-I	Granulibacter bethesdensis CGDNIH1	YP_744448.1	26.9	8/10 (80%)
27	Keratin 23 isoform a	Canis familiaris	XP_548125.2	29.9	11/13 (84%)
32	Penicillin-binding protein	Flavobacterium psychrophilum JIP02 /86	YP_001297044.1	29.9	12/17 (70%)
33	Multi antimicrobial extrusion protein MatE	Reinekea sp . MED297	ZP_01113303.1	29.5	8/10 (80%)
36	Ribosomal protein S3	Solea senegalensis	BAF45890.1	65.9	32/51 (62%)
38	Peroxiredoxin 5	Arenicola marina	AAY96293.1	39.3	17/20 (85%)
42	Stromalin	Tribolium castaneum	EFA04673.1	26.1	8/9 (88%)
43	Chaperonin-like protein	Haloferax mediterranei	CAF21908.2	27.8	9/11 (81%)
46	Surfactin synthetase	Bacillus subtilis sub 네	NP_388231.2	27.4	10/13 (76%)
47	Tumor protein p53 binding protein 1	Danio rerio	NP_001073639.1	28.6	9/12 (75%)
47	Flavodoxin	Brachyspira murdochii DSM 12563	ZP_04048920.1	28.6	12/25 (48%)
49	Kleisin	Schizosaccharomyces japonicus yFS275	XP_002172333.1	23.5	7/9 (77%)
52	Prostacyclin receptor	Mus musculus	AAP37444.1	27.8	11/18 (61%)
53	Cytochrome c oxidase subunit 6A1	Nasonia vitripennis	NP_001165814.1	66.2	26/36 (72%)
56	Bacillolysin	Bacillus thuringiensis serovar huazhongensis	ZP_04084264.1	28.6	13/24 (54%)
57	Ribosomal protein S11	Crassostrea gigas	CAD91419.1	45.1	21/27 (77%)
58	Nucleoside diphosphate kinase	Synechococcus sp . JA -2-3 B'a (2-13)	YP_476531.1	87	35/52 (67%)
59	Peptidoglycan recognition protein long form	Biomphalaria glabrata	ABO40830.1	41.6	16/23 (69%)
60	Chagas antigen	Trichomonas vaginalis G3	XP_001312399.1	26.9	8/10 (80%)
61	Apoptosis 1 inhibitor	Drosophila melanogaster	AAC41609.1	27.8	7/7 (100%)
63	Similar to Interleukin-4 induced protein 1 precursor	Canis familiaris	XP_541486.2	27.8	9/13 (69%)
64	Elongation factor-1 gamma	Diguetia canities	ABG88953.1	60.5	26/32 (81%)
65	Apidaecin	Apis cerana cerana	ACH96378.1	24.8	7/7 (100%)
71	Calpain	Trypanosoma brucei gambiense DAL972	CBH15145.1	24.8	9/12 (75%)
72	Disease resistance protein	Arabidopsis thaliana	ABF73845.1	31.6	13/21 (61%)
74	Coelomic cytolytic factor 1	Eisenia fetida	AAC35887.1	60.5	27/33 (81%)
75	Leishmanolysin family protein	Tetrahymena thermophila	XP_001018678.1	28.6	9/13 (69%)
77	Plexin b	Aedes aegypti	XP_001649087.1	26.9	7/10 (70%)
83	Prostacyclin receptor	Mus musculus	AAP37444.1	27.8	11/18 (61%)
85	Disease resistance protein	Arabidopsis thaliana	NP_198969.1	29.1	10/16 (62%)
86	Pyruvate flavodoxin	Nostoc punctiforme PCC 73102	YP_001867453.1	29.5	11/14 (78%)
87	Ferredoxin	Allochromatium vinosum DSM 180	YP_003443948.1	26.5	7/8 (87%)
88	Synapsin Ib	Sus scrofa	ACJ26765.1	30.8	10/21 (47%)
90	Breast cancer susceptibility protein	Gracilinanus microtarsus	ACH88016.1	30.3	11/16 (68%)
92	Anti-HIV gp120 antibody heavy chain variable region	Homo sapiens	AAB28808.1	26.9	9/12 (75%)
95	Antibiotic resistance-related regulatory protein	Flavobacteria bacterium BBFL7	ZP_01203163.1	24.8	7/9 (77%)
97	Similar to Cofilin-1	Cofilin , non - muscle isoform	XP_001118077.1	28.6	9/16 (56%)
100	Subtilisin-like serine protease	Meiothermus ruber DSM 1279	ZP_04040410.1	28.2	9/13 (69%)
102	Fermitin family homolog 3	Bos taurus	NP_001032695.1	24.8	7/9 (77%)
105	Condensin subunit Smc	Arthrospira platensis str . Paraca	ZP_06383512.1	28.6	8/9 (88%)
107	Ribosomal protein S12	Pinctada maxima	ACS72284.1	84.2	25/26 (96%)
108	40S ribosomal protein S10	Lumbricus rubellus	CAA09747.1	103	56/67 (83%)
110	Lumbrokinase	Eisenia fetida	ABW04906.1	48.1	20/27 (74%)
111	Similar to beta-defensin 108	*Ornithorhynchus* *anatinus*	XP _001518669.1	25.7	6/8 (75%)
113	Calpain-2	Hippoglossus hippoglossus	ACY78225.1	27.4	11/23 (47%)
116	Toxin-antitoxin system	Selenomonas sputigena ATCC 35185	ZP_05899280.1	28.2	12/23 (52%)
118	Nicastrin	Chlamydomonas reinhardtii	XP_001701591.1	36.2	12/27 (44%)

이제까지 보고된 항균 단백질들은 구조에 따라 α-나선(helix) 구조를 가진 것, 이황화 결합(disulfide linkage)을 구조 내에 포함하고 있는 것, 프롤린(proline) 아미노산이나 글리신(glycine) 아미노산을 많이 포함하고 있는 것으로 나눌 수 있다. 선발된 마커([표 1]의 DEG No.111)의 구조분석 결과, 베타-디펜신과 상동성이 있는 11개의 아미노산 서열 및 그 아미노산을 암호화하는 부분을 포함하는 유전자 염기서열을 [도 1]에 표시하였다. [도 1]에서 네모 안의 서열이 바로 항균성을 갖는 펩타이드 서열을 나타낸다.

<실시예 2>

선발된 유전자 마커로부터 펩타이드 합성

펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc.; 85: 2149, 1963)을 사용했다. 상기 합성 방법은 Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N_α-amino group의 보호기 (protecting group)로 사용하는 고상법 (solid phase method)이다. 상세하게 설명하자면, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 N-hydroxybenzo- triazole (HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide (DCC)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈 (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄 (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조 (crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배 (acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC (reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μ, 19.0 mm×30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110 ℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 또한 합성된 펩타이드의 시퀀스 (sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법 (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

합성된 펩타이드를 ‘룸브리쿠신(Lumbricusin)’으로 명명했고, 11개의 아미노산으로 구성되어 있다. 룸브리쿠신의 아미노산 서열을 하기 [표 2]에 기재하였다.

펩타이드 명칭	아미노산 서열	서열번호
룸브리쿠신	AQQDICWRRNR-NH₂	1

< 시험예 1>

룸브리쿠신의 항균 및 항진균 활성 조사

룸브리쿠신 펩타이드(서열번호 1)에 대한 항균 및 항진균 활성을 조사하기 위해 RDA(radial diffusion assay)를 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴 (Melittin)을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 항균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

<1-1> 항균 활성 조사

상기 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 먼저 병원성 세균인 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 대장균 0-157 (Escherichia coli 0-157)를 3 %(w/v) trypticase soy broth (TSB)에서 37℃, 200rpm조건으로 18시간 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4 x 10⁶ colony forming units (CFU)/ml 농도가 되도록 2시간 30분간 2차 배양하였다. 그 후 Citrate phosphate buffer (9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH7.4) 와 1 %(w/v) type Ⅰ(low electroendosmosis) agarose, 0.03 % TSB로 구성된 멸균된 underlay gel에다 배양된 세균 (4 X 10⁶colony forming units/ml)을 넣고 혼합해준 뒤 사각플레이트에 붓고, underlay gel이 굳으면 지름 3 mm의 구멍을 내어 1 mg/mL의 농도의 peptide를 5 ㎕씩 구멍에 넣었다. peptide가 확산되도록 37 ℃에서 3시간 배양한 후, Overlay gel ( 6 % TSB, 1 % agarose) 10 mL을 붓고 37 ℃에서 다시 배양하여 CLEAR ZONE의 형성 여부를 확인하였으며 얻어진 결과는 [도 2] 에 나타내었다.

상기 [도 2]에서 펩타이드 룸브리쿠신이 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus, 그람 양성균)와 대장균 O-157(E. coli , 그람 음성균)에 대해서 약 20 ug/mL부터 CLEAR ZONE을 형성함을 확인할 수 있다.

<1-2> 항진균 활성 조사

항진균 활성 측정을 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)를 YPD 배지 (1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % dextrose) 에서 30 ℃, 200 rpm 조건으로 밤새 키운 후, 이를 새 배지에 접종하여 2시간 키워 대수기가 되도록 하였다. 그 후 Citrate phosphate buffer (9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH7.4) 와 1%(w/v) type Ⅰ(low electroendosmosis) agarose, 0.03% TSB로 구성된 멸균된 underlay gel에다 배양된 세균 (4 X 10⁶colony forming units/mL)을 넣고 혼합해준 뒤 사각플레이트에 붓고, underlay gel이 굳으면 지름 3 mm의 구멍을 내어 1 mg/mL의 농도의 peptide를 5㎕씩 구멍에 넣었다. peptide가 확산되도록 37 ℃에서 3시간 배양한 후, Overlay gel ( 6 % TSB, 1 % agarose) 10 mL을 붓고 37 ℃에서 다시 배양하여 CLEAR ZONE의 형성 여부를 확인하였으며 얻어진 결과는 [도 2] 에 나타내었다.

상기 [도 2]에서 본 발명의 룸브리쿠신이 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(C. albicans)에 대해서 약40 ug/mL부터 CLEAR ZONE이 형성됨을 확인할 수 있다.

< 시험예 2>

룸브리쿠신(Lumbricusin)의 인간 적혈구 세포에 대한 독성 측정

인간 적혈구 세포(Human erythrocytes)에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다. 적혈구 세포(Human erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액(pH 7.4, PBS)로 세 번 세척한 후, PBS으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그런 후, 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-well plate에 100 ㎕씩 분주한 후에 룸브리쿠신과 멜리틴을 각각 다양한 농도로 처리하였다. 이어서 모든 well에 total volume이 200 ㎕가 되도록 생리 식염수 (Saline 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 분리하였다.

적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 414 nm의 파장에서 상기 분리한 상등액의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 이때 룸브리쿠신(Lumbricusin)의 파괴능은 하기 식에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 하기 [표 3]에 나타내었다.

파괴능(%) =

X 100

처리 물질	파괴능(%)
룸브리쿠신	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	100	100	92	0
농도(ug/mL)	200	150	100	50	30	0

상기 [표 3]에서 펩타이드 룸브리쿠신은 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았음을 확인할 수 있다. 반면에 강력한 항균펩타이드인 멜리틴은 낮은 농도에서도 세포 독성을 매우 크게 보였다.

본 발명은 지렁이에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 항진균용 조성물에 관한 것이다. 더 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 항균 및 항진균 활성을 갖고 있고, 인간 적혈구 세포에 독성이 없기 때문에 항균용 약학적 조성물, 항진균 약학적 조성물 및 보존제 조성물로 이용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Antimicrobial or antifungal composition comprising peptide from Lumbricus terrestris <130> NP12-0041 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Lumbricusin peptide from Lumbricus terrestris <400> 1 Ala Gln Gln Asp Ile Cys Trp Arg Arg Asn Arg 1 5 10

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균용 약학적 조성물.
제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품, 사료, 화장품 및 의약품으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 대한 보존제 조성물.