JPS63179899A

JPS63179899A - 蛋白質ｐｈｉ及びその製造法

Info

Publication number: JPS63179899A
Application number: JP62012121A
Authority: JP
Inventors: Setsu Toki; 土岐　節
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd; Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp; Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1987-01-21
Filing date: 1987-01-21
Publication date: 1988-07-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、米種子の表皮部を出発物質としである種の操
作を加えることにより均一性のある物質として取得され
た新規な蛋白質に関するものである。

この物質は抗腫瘍活性を示し、生理活性物質として有用
である。

〔従来の技術〕

米ぬかから得られる生理活性な蛋白質としては、血球凝
集作用、細胞の生長促進作用を有するＲＢＡ　（特開昭
５０−７７５１８号公報参照）、赤血球凝集作用を有す
るとともに、リンパ球分裂促進作用も有する米ヌカレク
チンＲＢＰＨＡ　　Ｃエヌ。

ヤマダらザブレティンオブザファカルテイーオブアグリ
カルチ＋　　　（Ｎ、ＹａｌＩｌａｄａ　ｅｔ　ａ＋、
Ｔｈｅ　Ｂｕｌ−１ｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆａｃｕ
ｌｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）　ＭｉｅＵｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎ１１４４．３２Ｌ　１９７２　
）及びＲＢＭ　　Ｃエム、ツダ、ジャーナル、バイオケ
ミストリー（Ｍ、　Ｔｓｕｄａ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
）　８６．１４５１．１９７９）が知られている。ＲＢ
Ａは特定の糖鎖に親和性をもつ分子量１３０００〜１７
０００の糖蛋白質で、１１１７〜１０の等電点をもつこ
とが知られており、例えば米ぬかを食塩水で抽出するこ
とにより得られる。

ＲＢＰＨＡは分子量約１万で２６．８％の糖を結合した
糖蛋白質であり、米ぬかを塩酸酸性水（ｐＨ４，０）で
抽出することにより得られる。またＲＢＭは分子量約３
．７万で１．８％の糖部分を有する糖蛋白質であり、米
ぬかをリン酸緩衝液で抽出して得られる。

一方殻粒などの種子の表層部から抗腫瘍活性物質が採取
できることは、特開昭５３−１３９７１５号公報により
公知である。この公報記載の発明では、原料を加圧加熱
処理してから熱水抽出し、又は熱水可溶部を除去した後
、アルカリ水溶液で抽出を行っている。この発明をふま
えた米ぬかを出発物質とする蛋白質としてＲＢＦ−ＰＭ
　（特開昭５７−１４５３４号公報参照）が知られてい
る。

ＲＢＦ−ＰＭはｐＨ３〜６の等電点をもち、数百〜数百
万の分子量範囲にわたり分子量を有する蛋白質の混合物
であり、米ぬかを加圧加熱処理してから熱水抽出し、熱
水可溶部を除去した後、塩基を用いて抽出し、この塩基
水溶液に有機溶媒を混和させ不溶分を除去後、酸で沈澱
させた沈澱物（以下ＲＢＰ　−Ｐと称す）に極性有機溶
媒を加え、有機溶媒可溶分を除いて得られる。また特開
昭５６−２９５１９号公報及び特開昭６１−１４３３２
３号公報よりＲＢＦ　−Ｐ及びＲＢＦ−Ｐ有機溶媒可溶
部分中の糖蛋白質ＲＢＰ　−ＰＧＰが抗腫瘍活性を示す
ことも知られている。

〔発明の構成〕

本発明者は更にＲＢＦ　−ＰＭ及びＲＢＦ　−ＰＧＰの
活性成分を探究した結果、実験動物移植癌に対し顕著な
抗腫瘍性を示す新物質を発見し、本発明に至った。

本発明の抗腫瘍性蛋白質ＰＨＩは以下に記述する理化学
的性質を有する。

Ｔａｌ　　元素分析Ｃ：　５２．３±２．１％、Ｈ：　８．Ｏ＋０．３％。

Ｎ　：　１０．０±１．０％山）分子量界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下でのゲル
濾過法により、１万３千の構成単位を示す。トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン塩酸（以下、トリス塩酸
緩衝液と略称）、リン酸バッファー等の水系緩衝液中で
３０万〜１０万の会合体を形成する。（ゲル濾過法によ
る）（ｃ１等電点等電点電気泳動により等電点ｐＨ５，０〜５．２＋ｄ）
　　溶解性水、ｐＨ６，５以上または３．０以下の緩衝液又は水溶
液、酢酸、ギ酸、アンモニア水、９０％以下のアルコー
ル水溶液及びピリジンに可溶である。

９５％以上のアルコール、アセトン、酢酸エチル、クロ
ロホルム、及びｐＨ３，５〜６．０の水溶液又は緩衝液
に不溶である。

（ｅ）　　呈色反応ビユレット反応、ローリ−法蛋白呈色反応並び塩酸加水
分解後のニンヒドリンによるアミノ酸の呈色反応はいず
れも陽性である。フェノール硫酸反応、アントロン硫酸
反応による糖の呈色反応はいずれも陰性である。

（ｆｌ　　蛋白質部分蛋白質部分はローリ−法、バイオラド・プロティンアッ
セイ法（牛血清γ−グロブリン換算）で９８％以上であ
る。構成アミノ酸の種類とモル比は次の通りである。

Ｔｇ）　　融点２４０℃付近から褐変し始め、２７０℃付近で分解する
。

（ｈｌ　　紫外部吸収スペクトル第１図に示す通り。

ｉｌｌ　　赤外部吸収スペクトル第２図に示す通り。

以上説明した通り、蛋白質ＰＨＩは糖を含まず、脂肪族
アミノ酸に冨むことを特徴とする新規な蛋白質である。

先に挙げた米ぬかから抽出された生理活性物質のＲＢ八
、　ＲＢＰＩＩＡ、　ＲＢＭとは溶解性、等電点、糖含
有量、アミノ酸組成等が異なり、本発明のＰＨＩがこれ
らの蛋白質と異なる蛋白質であることは明らかである。

また本発明に先立ち見出された抗腫瘍性蛋白質であるＲ
ＢＦ　−ＰＭは幅広い分子量領域に分子量を有する数多
くの蛋白質の混合物であり、ＲＢＰ　−ＰＧＰも糖含量
及び溶解度がＰ旧とは著しく異なっている。更にＲＢＦ
−ＰＭの発明に先立ち特許出願された米ぬかからの抗腫
瘍活性物質の製造法（特開昭５６−２９５１９号公報参
照）に記載された抗腫瘍活性な物質ＲＢＦ−Ｈは脂質を
含有している点で、本発明のＰＨＩとは全く異なってい
る。以上のことからＰＨＩが新規な蛋白質であることは
明らかである。

次に本発明の蛋白質の製法の詳細を説明する。

蛋白質ＰＨＩの原料となるＲＢＦ　−Ｐは、米の表皮部
から塩基を用いて抽出した水溶液を有機溶媒と混和し、
不溶分除去後、酸で沈澱させることにより得られる。

米の表皮部は通常玄米から白米を得た残りの米ぬかとし
て得られるが、玄米など表皮部のっいたままの米自体や
、米ぬか油を抽出した残渣の如き他の有用成分取得の目
的に使用されたあとの米ぬかであっても使用可能である
。米はもちとうるち、ジャポニカ種とインディカ種など
に分かれ、更に多数の品種に分かれるが、特に種類は問
わない。本発明は入手の最も容易なジャポニカ種のうる
ち米のぬかを主として使用した。米ぬかは熱水可溶部中
にも抗腫瘍活性物質を含むが（特開昭６１−５３１２９
号公報参照）、本発明に係るＲＢＦ　−Ｐは熱水不溶部
から得られるので、通常先ず加熱水で処理して熱水可溶
分（主として澱粉などの多糖類）を除去する。熱水可溶
分除去は、米ぬかを５〜２０倍量（重量）の熱水と共に
蒸煮する方法で行うことができる。特開昭５３−１３９
７１３号公報で示された加圧加熱処理をこの工程で併用
することもできる。熱水可溶分を除去した米ぬかは例え
ば１〜１０（重量）％カセイソーダ水溶液の如き塩基性
水溶液で抽出される。炭酸ソーダ、カセイカリ、アンモ
ニアなど他の塩基の水溶液を用いることもできる。

水酸化カルシウムは、不溶性の不純物をつくるので好ま
しくない。塩基の量はカセイソーダの場合米ぬかに対し
て０．１倍量（重Ｎ）程度を用いれば足りる。

塩基性水溶液の濃度、抽出温度、時間はＲＢＦ−Ｐの畳
量や活性に影響がある。５％カセイソーダ水溶液を用い
、５０℃で抽出するとき、抽出時間は５時間から、２０
時間程度で活性の優れたＲＢＦ　−Ｐが得られる。３０
℃以下の温度で抽出する際には、２０時間以上の時間を
かけて抽出することが望ましい。しかし８０℃〜９０℃
の様な極端な高温での抽出は蛋白質の分解が起こるため
好ましくない。塩基濃度についても極端に高濃度でない
１〜１０％がよい。このようにして得られた塩基による
抽出液にまずエタノール、メタノール、アセトン等の水
と混合できる極性有機溶媒を加えると不溶分が沈澱して
くる。この沈澱は有害な成分であり、例えばエタノール
濃度を４０％容量以上とすることで充分に沈澱できる。

この沈澱は遠心分離あるいは濾過により除去することが
できる。塩基による抽出水溶液と混和する有機溶媒は、
水と相溶し混和するものであればよいが、酸性のものは
塩基を中和してしまうので不都合である。有機溶媒の使
用量は溶媒の種類によっても異なるが、水溶液に対して
通常１１５容以上が望ましいが、濃度が高すぎると後で
酸性にした際、ＲＢＦ　−Ｐの沈澱が妨げられる。

例えばエタノールの場合、４０％〜６０％程度の濃度に
することが望ましい。尚、本明細書で用いている％は原
則として重量％であるが、有機溶媒濃度に限り容量％で
ある。

有害成分である沈澱を除去したアルカリ水性有機溶媒に
対し、塩酸、リン酸、酢酸などの酸を加え、中和し沈澱
を得る。これがＲＢＦ　−Ｐである。酸による中和処理
は中和後のｐｉがｐＨ３〜７、特にｐＨ４〜６の範囲に
調節することが望ましい。

本発明の蛋白質Ｐ旧はこの様にして得た沈澱ＲＢＦ−Ｐ
ＳＲＢＦ−Ｐ中のＲＢＦ　−ＰＭ、糖蛋白質部分である
ＲＢＦ　−ＰＧＰを原料として処理することにより新た
に見出されたもので、アルコール中でアルカリと加熱抽
出し、液体クロマトグラフィー分取することにより得ら
れた。ＲＢＦ　−Ｐを原料として用いた際は、脂肪酸を
含んでいるため、脂肪酸の除去操作を加える必要がある
が、抽出以前にエーテル、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒で
脂肪酸を除去しておけば、後の操作が簡単である。

脂肪酸の除去方法としては、有機溶媒による洗浄あるい
は超臨界流体による抽出が有効である。

脂肪酸を除去したＲＢＦ　−ＰあるいはＲＢＰ　−ＰＭ
、ＲＢＦ　−ＰＧＰからのアルカリ性アルコール抽゛出
に使用するものとして、アルカリとしてはカセイソーダ
、カセイカリ等を、アルコールとしては、メタノール、
エタノール、ｎ−プロパツール、イソプロパツール等の
低級アルコール類を使用することができる。使用するア
ルコール類としては可溶分を抽出後、蒸発して分離回収
するのが普通であるから、低沸点のものを用いることが
望ましい。これらは混合溶媒の形でも用いることができ
る。原料に対してアルカリは１０分の１から５分の１程
度、アルコールは２０倍量以上であることが望ましい。

抽出温度は３０℃から７０℃、抽出時間は３０分から１
０時間、望ましくは４０℃から６０℃で２時間から４時
間である。抽出は、空気中で行ってもよいが、窒素その
他の不活性気体で系内を置換しておく方が、より均一な
物質を得る上で望ましい。抽出終了後、不溶物を濾過、
遠心分離等の手段で除き、抽出液中のアルコールを蒸発
除去する。次に、残った固形物に水を加えてとかし、塩
酸、リン酸、硫酸等の酸を加えて中和し、沈澱を生じさ
せる。加える水は固形物に対して５倍以上であればよい
が、後の操作のためには５倍〜２０倍量程度であること
が望ましい。また中和の際のｐＨはｐｎ＝４．ｏ〜６．
０、できればｐＨ＝４．５〜５．５であることが望まし
い。次に生じた沈澱を遠心分離し、水に懸濁させて透析
あるいは限外濾過法により無機イオン及び低分子物質を
除く。この沈澱物は凍結乾燥あるいは噴霧乾燥を行うこ
とにより粉末化しておくと長期間安定である。

次にこの粉末を陰イオンクロマトグラフィーにより分画
する。陰イオン交換クロマトグラフィーの担体としては
、ＤＥＡＥ−）ヨパール（東洋曹達）　、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス、　ＤＥＡ［＋−セファロース等の弱塩基
性の置換基をもつものが使用できる。これらのカラムは
、予めＣＩ＝型にしておき、トリス塩酸緩衝液、リン酸
緩衝液等で平衡化しておき、同じ緩衝液に粉末を溶解さ
せた溶液を添加し、非吸着部分を洗い出す。次に塩化ナ
トリウム、塩化カリウムなどを含む緩衝液を流し、溶出
成分を分離する。これらの条件は用いる担体、緩衝液に
よって異なるが、担体としてＤＥＡＥ−）ヨパールを用
いた場合は、０．０２５〜０．０５Ｍのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０〜８．０）、塩としてＮａＣ１を用
いることが望ましい。この場合には吸着成分は、０．２
５〜０．３５Ｎの食塩を含む上記緩衝液で溶出する成分
■と０．４〜０．５Ｎの食塩を含む上記緩衝液で溶出す
る成分■に分離できる。低濃度のＮａＣ１で溶出される
成分のには抗腫瘍活性は見られないが、高濃度のＮａＣ
］で溶出される成分■は殆どＰ旧から成っており、抗腫
瘍活性もＰＨＩと殆ど変わらない。

次にこの溶出成分を更に疎水クロマトグラフィーで精製
する。疎水クロマトグラフィーの担体としては（蛋白質
を吸着できるものであればよいが）、ブチルトヨパール
（東洋曹達）等の疎水基の小さいものが望ましい。クロ
マトグラフィーの条件はカラム担体によって異なるが、
必要に応じてアルコール等の有機溶媒を混合して移動相
とすることも可能である。ブチルトヨパールを使用する
ときは、予めカラムを０．２Ｍ〜０．５Ｍの硫酸アンモ
ニウムを含む０．０２５〜０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ＝　７．０〜９．０）で平衡化したカラムに、
最終濃度０．２５〜０．５Ｍとなるよう硫酸アンモニウ
ムを加えた成分■の溶液を添加し、吸着させる。平衡化
に使用した緩衝液でカラムを洗い、非吸着部分を洗い出
した後、硫酸アンモニウムを含まない緩衝液を流し、溶
出してくる成分を得る。次に溶出液から透析あるいは限
外濾過法により無機イオン・低分子を除き、凍結乾燥あ
るいは噴霧乾燥して黄褐色粉末が得られる。これが蛋白
質ＰＨＩであり、マウス実験腫瘍に対して著しい抗腫瘍
活性を有する。ＰＨＩの理化学的性質は先に述べた通り
であるが、特にアミノ酸組成としてアラニン、バリン、
ロイシンを多く含む疎水性の強い蛋白質である。ＲＢＦ
−ＰＧＰもロイシンを多く含むが、１０％程度の糖を含
む糖蛋白質であり、本発明のＰＨＩとは明らかに異なる
ものである。Ｐ旧はＲＢＦ　−Ｐからだけでなく　、Ｒ
ＢＦ　−ＰＭ、ＲＢＦ　−ＰＧＰからも同様な処理を行
うことによって分離できる。このＰＨＩはその製法上米
ヌカ中に本来存在する蛋白質ではなく、熱アルカリ処理
により糖鎖の切断が起きて生じる変成蛋白質であり、ア
ミノ酸組成から判断されるように、疎水性の強い酸性蛋
白質であるため、アルカリ性メタノールで効率的に抽出
されるものと考えられる。この抽出物中には活性をもた
ない成分も含まれているが、続いて行う液体クロマトグ
ラフィーによる分離で活性成分のみを分離することがで
き、抗腫瘍活性物質を効率的に得るうえで本発明は極め
て効果的な方法を提供するものである。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳述するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

実施例１兵庫中生新千本から得られた米ぬか５００ｇに対し、水
２．５１を加え、１２０℃で１時間加圧下に蒸煮した後
、５時間１００℃に保ち、熱水可溶部を溶出せしめた。

熱濾過して得られた固型分に対し、５％カセイソーダ水
溶液１１を混合し、５０℃で１０時間攪拌し抽出を行っ
た。抽出液に対し水ＩＩｌを加えた後エタノール２１を
加えエタノール濃度を５０％（容量比）とした。

アルカリ水性エタノール不溶分を遠心分離により除去し
た後、塩酸でｐｕ−ｓ、ｏに調節した。

−夜、５℃で放置後注澱物を分離した後、凍結乾燥によ
り乾燥沈澱物ＲＢＦ−Ｐ　４０ｇを得た。ＲＢＦ−Ｐ４
０ｇに対しメタノール１１を加え、更にＮａＯＨ５ｇを
加えて、７０℃の油浴上で３時間加熱還流した。アルカ
リ性メタノール不溶部を濾過して分離し、濾液を減圧下
で溶媒を留去した後、得られた沈澱を水５００ｍ／を加
えてとかし、この溶液にＨＣＩを加えｐＨ−５，ｏとし
た後、エーテル１１を加え攪拌し、エーテル可溶部を含
むエーテル層を除去する。

沈澱物を含む水層を一夜５℃以下に放置した後、沈澱を
遠心分離した。沈澱は水に懸濁してビスキングチューブ
内に移し、流水中で一夜透析後凍結乾燥して黄褐色粉末
４．８ｇを得た。

次に、予め０．１Ｎ　ＨＣＩ水溶液で洗い、更に０．０
２５Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ−７，０）で平衡化
したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ　（東洋曹達）カラ
ム（φ２．２ｃｍ　Ｘ　５０ｃｍ）に対し、０．０２５
Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）　１００耐にと
かした上記粉末１．０ｇを添加し、吸着させた。

次にこのカラムに０．０２５Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐ
）Ｉ　＝７．０）を流速１．０　ｍＺ／ｍｉｎの割合で
２００ｍＺ流し、非吸着部分を洗い出した。続いて０．
３Ｎ塩化ナトリウムを含む上記緩衝液１５０−を流し溶
出部分を洗い出した後、０．５Ｎ塩化ナトリウムを含む
上記緩衝液を流し、溶出してくる褐色成分を含む溶液１
００−を得た。

次に予め０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）で平衡化したブチル
トヨパール６５０Ｓ（東洋曹達）カラム（φ２．２ｃｍ
　Ｘ　５０ｃｍ）に対し、硫酸アンモニウムを加えて最
終濃度０．５Ｍとした上記褐色溶液を添加し、吸着させ
た。０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液で非吸着部
分を洗い出した後、０．０５Ｍ　　ｌ−リス塩酸緩衝液
（ｐＨ＝８．０）を流し、溶出してくる褐色成分を含む
溶液１００ｍＺを得た。

この溶液をビスキングチューブ内に移し、流水中で一夜
透析した後、凍結乾燥し、黄褐色粉末ＰＨＴ　３５０ｍ
ｇを得た。

この蛋白質Ｐ旧の理化学的諸性質は次の通りであった。

■）元素分析値Ｃ：　５２．４５％　　　　ＩＩ　　：　８．０５％Ｎ
　　：　　１０．８０％２）　分子量Ｇ　３０００　ＳＷカラム（東洋曹達）を用いたゲル濾
過法（溶離液１　／１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ＝６．８））により、約２０万から１０万の分子量範
囲を有した。０．２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む１
／１５Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．８）中
でのＧ　３０００　ＳＷカラムを用いたゲル濾過法では
、分子Ｎ１万３千に相当する均一な構成単位に解離した
。

３）等電点ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動分析法により、
等電点はｐ）Ｉ　５．０〜５．２であった。

４）　紫外部吸収スペクトル第１図に示す通り。

５）赤外部吸収スペクトル第２図に示す通り。

６）溶解性水、食塩水、ｐＨ＝６．ｓ以上のリン酸緩衝液、トリス
−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、アンモニ
ア水、炭酸アンモニウム水、９０％以下のアルコール、
ピリジン及びｐｎ−３，。

以下の酢酸水溶液、リン酸水溶液、ギ酸水溶液、酢酸、
ギ酸に可溶であった。

ｐＨ＝３．ｓ〜６．０のリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩
衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び純アルコール、
アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等に不溶であった
。

７）呈色反応ビユレット反応、ローリ−法蛋白呈色反応並びに塩酸加
水分解後のニンヒドリン反応によるアミノ酸の呈色反応
はいずれも陽性であった。フェノール硫酸反応並びにア
ンスロン硫酸反応による糖の呈色反応はいずれも陰性で
あった。

８）蛋白質部分蛋白質部分はバイオラドプロティンアッセイ法（牛血清
γ−グロブリン換算）で９９％であった。アミノ酸組成
は６Ｎ塩酸で１１０℃、１８時間加水分解し、日立８３
５型アミノ酸分析計で分析した。アミノ酸組成は次の通
りであった。（モル％）八ｓｐ　　　　　８．４　　　　　　　　　　１１ｅ　
　　　　６．３Ｔｈｒ　　　　４．５　　　　　　　　
　Ｌｅｕ　　　１３．０３ｅｒ　　　　４．ＯＴｙｒ　
　　　２．４Ｇｌｕ　　　　８．９　　　　　　　　　
Ｐｈｅ　　　　７．０Ｇ１３１　　　８．７　　　　　
　　　Ｌｙｓ　　　　５．０八Ｉａ　　　　１１．１　
　　　　　　　　１（ｉｓ　　　　　２．０Ｃｙｓ　　
　　１．ＯＡｒｇ　　　　５．５Ｖａｌ　　　１０．３９）融点２４０℃で褐変し、２７０℃で分解した。

実施例２庁内ササニシキ、岩手キヨニシキ、埼玉ニホンバレの混
合米から得られた米ぬか１６ｋｇに対し、水２１６βを
加え１２０℃で１時間加圧下に蒸煮した後、４．５時間
１００℃に保ち、熱水可溶部を溶出せしめた。熱時濾過
して得られた固型分２２．４ｋｇに対し、５％カセイソ
ーダ水溶液４０ｋｇを混合し、５０℃で１０時間攪拌し
抽出を行った。抽出液６０．３ｋｇに対し水６０．３ｊ
！を加えた後、エタノール１２０．６　＃を加えエタノ
ール濃度を５０％（容量比）とした。

アルカリ水性エタノール不溶分を遠心分離により除去し
た後、塩酸でｐＨ＝５．５に調節した。

−夜、１０℃以下に放置後注澱物を分離した後、凍結乾
燥により乾燥沈澱物ＲＢＦ−Ｐ　１．４６ｋｇを得た。

ＲＢＦ−Ｐ　５０ｇに対しエーテル１１を加えて攪拌し
可溶部分を溶出せしめた。エーテル不溶の沈渣部を濾過
して分離・風乾して黄褐色粉末１５ｇを得た。この粉末
１０ｇを５００１１７のメタノール中２ｇのＮａＯＨと
混合し、４０℃の水浴上で１０時間加熱抽出した。

アルカリ性メタノール不溶部を濾過して除き、可溶部を
ロータリーエバポレーターでメタノールを留去すること
により乾固させ、残渣に水１０〇−を加えて溶解せしめ
た。この溶液にｃｏｎｃ、Ｈｃｌを加えｐＨ＝５．０と
し、生じた沈澱を遠心分離した。

この沈澱を０．０５Ｍ　　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ＝
　７．５）に溶かし、この溶液を、予め０．０５Ｍ　　
）リス塩酸バッファー（ｐＨ＝７．５）で平衡化したＤ
ＥＡＥ　）ヨパールカラム（φ２．２　ｃｍｘ５０ｃｍ
）に添加し吸着せしめた。続いて０．３Ｎ塩化ナトリウ
ムを含む上記トリス−塩酸緩衝液２００ｄを流し溶出部
分を洗い出した後、０．５Ｎ塩化ナトリウムを含む上記
トリス−塩酸緩衝液を流し、褐色のバンドとして溶出さ
れる成分を含む溶液１００ｍ＃を得た。

この溶液に硫酸アンモニウムを加え、最終濃度０．５Ｍ
とした後、予め０．２５Ｍの硫酸アンモニウムを含むト
リス−塩酸緩衝液で平衡化したブチルトヨパール６５０
３カラム（φ２．２ｃＩＩＸ５０ｃｍ）に添加し、上記
緩衝液を流して非吸着部分を洗い出した。次に０．０５
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）をカラムに流
し、褐色のバンドとして溶出される成分を含む溶液１０
０ｍ１を得た。

この溶液１００　ｔＩｌｌをビスキングチューブ内に入
れ、流水中で一夜透析した後、凍結乾燥し、ＰＨＩ４１
０ｍｇを得た。

この蛋白質ＰＨＩの理化学的諸性質は次の通りである。

１）元素分析値Ｃ：　　５３．５６％　　　　　Ｈ：　　７．８０　％
Ｎ　　：　　　９．６８％２）分子量、３）等電点、４）紫外部吸収スペクトル、
５）赤外部吸収スペクトル、６）溶解性、７）呈色反応
は実施例１で得たＰＨＩと同じであった。

８）蛋白質部分蛋白質部分はバイオラドプロティンアッセイ法（牛血清
γ−グロブリン換算）で９８％であった。

６Ｎ１１ＣＩで１１０℃、１８時間加水分解して求めた
アミノ酸組成は次の通りであった（モル％）。

Ａｓｐ　　　６．７　　　　　　ＩＩｓ　　　９．７Ｔ
ｈｒ　　　４．２　　　　　　Ｌｅｕ　　１３．７Ｓｅ
ｒ　　　４．５　　　　　　Ｔｙｒ　　　１．６Ｇｌｕ
　　　７．５　　　　　　Ｐｈｅ　　　７．ＩＧｌｙ　
　　８．ＯＬｙｓ　　　５．０Ａｌａ　　１１．７　　
　　　　旧ｓ２．９Ｃｙｓ　　　１．５　　　　　　Ａ
ｒｇ　　　５．９Ｖａｌ　　　１０．０９）融点融点は実施例１で得たＰＨＩと同じであった。

実施例３実施例２と同様な方法で得られたＲＢＦ−Ｐ　１００ｇ
を２１！、のメタノール中で攪拌し、メタノール可溶部
を溶解せしめ、不溶部分を濾別し風乾し、ＲＢＦ　−Ｐ
Ｍとした。

ＲＢＦ　−ＰＨ２０ｇを１１のメタノール中３ｇのカセ
イソーダと混合し、７０℃の油浴上で５時間還流し、ア
ルカリ性メタノール可溶部分を抽出し、不溶部を濾別し
た後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し残
渣に水２００　ｍ７を加えてとかした。この溶液に塩酸
を加えｐｏ−ｓ、ｏとして生じる沈澱を遠心分離し、沈
澱に０．０５Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ・７．５）を
加えて溶かした。この溶液の５分の１量を用い、実施例
２に示す方法で液体クロマトグラフィー分画を行いＰＨ
Ｉ　３３０ｍｇを得た。

制癌作用試験本発明で得られたＰＨＩについて、次の制癌作用の試験
を行った。ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持されている
肉腫Ｓ−１８０細胞３Ｘ１０’個をＩＣＲ雌マウマウス
下に移植して固型腫瘍化した。移植翌日から１日１回連
続１０日間本物質の表１゜２に示す容量を一群７匹のマ
ウスに経口投与及び腹腔内投与した。腫瘍移植２８日後
に腫瘍面積及び腫瘍重量を測定し、本物質投与群及び対
照群（本物質の代わりに滅菌生理食塩水を投与）それぞ
れにおける平均腫瘍重量から腫瘍増殖阻止率を求めた。

結果を表１１表２に示す。

表　　　　１表　　　　２抗腫瘍活性試験１本発明のＰＨＩについて、次の抗腫瘍活性試験を行った
。Ｂａ１ｂｉｃマウスの腹腔内で継代維持されているＭ
ｅｔｈ　−Ａ線維肉腫細胞４Ｘ１０’個をＢａ１ｂｉｃ
雌マウスの皮下に移植して固形腫瘍化した。移植翌日か
ら１０日間、１日１回本物質の表３に示す容量を１群７
匹のマウスに経口投与し移植２９日後に腫瘍を摘出し、
腫瘍増殖阻止率を求めた。結果を表３に示した。

表　　　　　３抗腫瘍活性試験２本発明のＰ）ＩＩにつき、次の抗腫瘍活性試験を実施し
た。Ｃ３Ｈマウスの腹腔内で継代維持されているマウス
腹水肝癌ＭＨ−１３４細胞ｌＸｌ０ｂ個をＣ３Ｈ雌マウ
スの皮下に移植し、固形腫瘍化した。移植翌日から１０
日間、１日１回本物質の表４に示す容量を１群５〜６匹
のマウスに腹腔内投与した。移植２８日目の腫瘍面積（
長径×短径）を測定し、下式により腫瘍増殖阻止率を求
めた。

結果を表４に示した。

表　　　　　４

【図面の簡単な説明】

第１図は蛋白質Ｐ旧の紫外部吸収スペクトル図、第２図
は蛋白質ＰＨＩの赤外部吸収スペクトル図である。

Claims

【特許請求の範囲】１　米の表皮部より得られる蛋白質であって、下記の理
化学的諸性質を示すことを特徴とする蛋白質ＰＨＩ。（ａ）元素分析Ｃ：５２．３±２．１％、Ｈ：８．０±０．３％、Ｎ：
１０．０±１．０％（ｂ）分子量界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下でのゲル濾過により１万３千。水系緩衝液中で３０万〜１０万の会合体を形成。（ｃ）等電点等電点ｐＨ＝５．０〜５．２（ｄ）溶解性水、ｐＨ６．５以上または３．０以下の緩衝液又は水溶
液、酢酸、ギ酸、アンモニア水、９０％以下のアルコール水溶液及びピリジンに可溶であ
る。９５％以上のアルコール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム及びｐＨ３．５〜６．０の水溶液
又は緩衝液に不溶である。（ｅ）呈色反応ビュレット反応、ローリー法蛋白呈色反応並びに塩酸加水分解後のニンヒドリンによるアミノ酸の呈色反応はいずれも陽牲である、フェノール硫酸反応、アントロン硫酸反応による糖の呈色反応はいずれも陰性である。（ｆ）蛋白質部分蛋白質部分はローリー法、バイオラド・プロティンアッセイ法（牛血清γ−グロブリン換算）で９８％以上である。構成アミノ酸の種類と
モル比は次の通りである。アスパラギン酸５〜９　イソロイシン６〜１０スレオニ
ン４〜５　ロイシン１３〜１６セリン４〜５　チロシン１〜４グルタミン酸６〜９　フェニルアラニン６〜８グリシン
８〜１０　リジン４〜５アラニン１１〜１４　ヒスチジン１〜３システイン１〜２　アルギニン５〜６バリン１０〜１３（ｇ）融点２４０℃付近から褐変し始め、２７０℃付近で分解する
。２　米の表皮部より得られる蛋白質であって、下記の理
学的諸性質を示す蛋白質ＰＨＩの製造において、米種子
表皮部あるいは米種子表皮部を熱水抽出した残渣を塩基
性水溶液で抽出し、この抽出液に極性有機溶媒を加え、
上清部を酸で中和して得た沈澱部あるいは沈澱部中の糖
蛋白質部分を、（ａ）アルコール中でアルカリと共に加熱抽出し、抽出
液を乾固して得られた固形物を水に溶解した後、酸で中和して生じる沈澱物を得る工程（ｂ）（ａ）の工程で得られた沈澱物を塩基性イオン交
換樹脂と接触せしめて吸着処理し、続いて濃度の異なる溶離剤を用いて蛋白質を順次溶出させる工程（ｃ）（ｂ）で溶出した蛋白質ＰＨＩを含む溶出液を疎
水クロマトグラフィー担体と接触せしめて吸着処理し、続いて溶離剤により蛋白質を溶離処理する工程によって製造することを特徴とする蛋白質ＰＨＩの製造
法。理学的性質（ａ）元素分析Ｃ：５２．３±２．１％、Ｈ：８．０±０．３％、Ｎ：
１０．０±１．０％（ｂ）分子量界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下でのゲル濾過により１万３千。水系緩衝液中で３０万〜１０万の会合体を形成。（ｃ）等電点等電点ｐＨ＝５．０〜５．２（ｄ）溶解性水、ｐＨ６．５以上または３．０以下の緩衝液又は水溶
液、酢酸、ギ酸、アンモニア水、９０％以下のアルコール水溶液及びピリジンに可溶であ
る。９５％以上のアルコール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム及びｐＨ３．５〜６．０の水溶液
又は緩衝液に不溶である。（ｅ）呈色反応ビュレット反応、ローリー法蛋白呈色反応並びに塩酸加水分解後のニンヒドリンによるアミノ酸の呈色反応はいずれも陽性である。フェノール硫酸反応、アントロン硫酸反応による糖の呈色反応はいずれも陰性である。（ｆ）蛋白質部分蛋白質部分はローリー法、バイオラド・プロティンアッセイ法（牛血清γ−グロブリン換算）で９８％以上である。構成アミノ酸の種類と
モル比は次の通りである。アスパラギン酸５〜９　イソロイシン６〜１０スレオニ
ン４〜５　ロイシン１３〜１６セリン４〜５　チロシン１〜４グルタミン酸６〜９　フェニルアラニン６〜８グリシン
８〜１０　リジン４〜５アラニン１１〜１４　ヒスチジン１〜３システイン１〜２　アルギニン５〜６バリン１０〜１３（ｇ）融点２４０℃付近から褐変し始め、２７０℃付近で分解する
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