JPS5936964B2

JPS5936964B2 - 免疫賦活剤

Info

Publication number: JPS5936964B2
Application number: JP55153782A
Authority: JP
Inventors: 義忠森; 輝一打田; 駿竹尾
Original assignee: DAISERU KAGAKU KOGYO KK; SATSUHORO BIIRU KK
Current assignee: DAISERU KAGAKU KOGYO KK; SATSUHORO BIIRU KK
Priority date: 1980-11-04
Filing date: 1980-11-04
Publication date: 1984-09-06
Also published as: JPS5777622A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は多糖体ＲＢＳ物質を有効成分とする免疫賦活剤
に関する。

本発明は、鋭意研究の結果、米糠由来の多糖体ＲＢＳ物
質が強力な免疫賦活作用を有することが見い出され、そ
の知見に基づいて完成されたものである。

免疫賦活剤は、生体内免疫機能を賦活先進せしめる作用
を有する薬剤として一般には生体の免疫機能が低下した
り、異種抗原認識能が弱い場合などに使用され得る。

従って、特に微生物感染症や悪性腫瘍の治療剤、治療補
強剤または併用剤、予防剤あるいは術後回復促進剤等と
しての薬剤用途が期待されているほか、免疫調節効果と
してアレルギー、リウマチ、喘息、膠原病等の免疫系疾
患に対する治療または予防の薬剤としても使用され得る
場合がある。

本発明に用いる多糖体ＲＢＳ物質は米糠を熱水処理して
得られる抽出液に極性有機溶媒を加えるか、あるいは塩
析剤を加え、生じた沈でんを分取したのち水に溶解し、
次いで必要に応じて精製処理、粉末化処理を行なうこと
によって製造することができる。

本発明に用いられる原料米糠は通常の精米において発生
する米糠であり、当該米糠の発生源である玄米の品種、
産地および精白歩留等を問わないが、この原料米糠から
の多糖体ＲＢＳ物質の抽出、精製に先立って当該原料中
に混在する砕米等は可及的に除去し、洗浄することが望
ましＧ）。

また、米糠油を抽出した後の残渣である脱脂糠等のよう
に、他の目的に使用された後の米糠であっても本発明に
使用することができる。

米糠の抽出液は、米糠を熱水処理することにより得られ
る。

熱水処理は細かく粉砕した米糠に対し約５〜１０倍量（
重量）の蒸留水または精製水を加え、ステンレスタンク
、ホーロー引きタンク、ガラス製タンク、流通式の管状
抽出装置等の容器あるいはこれらの耐圧性容器を用いて
、攪拌しまたは攪拌しないでＯ〜１５ｋｇ／ｉ、好まし
くは０〜５．０ｋｇ／′ｃｆｆｌの圧力、７０〜２０
０℃、好ましくは１００〜１５０℃の温度で１０分乃至
２４時間、好ましくは０．５〜５時間攪拌しながら抽出
を行なう。

実用上は０〜３．０ｋｇ／ｉの圧力、１００〜１４０℃
の温度で１〜５時間の熱水処理が適当である。

なお、含脂米糠の場合は該処理に先立って、酢酸エチル
、四塩化炭素、クロロホルム、エーテルｎ−ヘキサン、
ベンゼン、石油エーテル、アセトン等の有機溶媒によっ
て脂溶性区分の除去を行なうことが望ましい。

前記熱水処理により得られた抽出液は濾過あるいは遠心
分離等の操作によって固形分と分離し、必要に応じて適
当な手段、たとえば減圧濃縮、限外濾過等の手段を単独
もしくは組合せて行ない適当量まで濃縮する。

この抽出液に対して水に可溶な極性有機溶媒もしくは塩
析剤を加え、生じた沈でんを分取することによって多糖
体ＲＢＳ物質を含む画分を得るこ。

とができる。

ここで用いる極性有機溶媒としては、たとえばメタノー
ル、エタノール、プロパツール、アセトン等がある。

極性有機溶媒の使用量は抽出液中における目的物質の含
有量等を考慮して決定するが、エタノールを用いる場合
を例にすると、エタノール濃度が３０〜５０％（Ｖ／Ｖ
）になるように添加すればよい。

なお、生じた沈でんは前記エタノール等の有機溶媒で洗
浄することが好ましい。

一方、塩析剤としては塩化ナトリウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化カリウム等があり、通常は抽出液に対し塩析剤
が飽和度０．５〜１になるまで加えて沈でんを生成せし
める。

本発明では、極性有機溶媒もしくは塩析剤を抽出液に加
える前あるいは上記の如くこれら物質を添加して沈でん
を生成せしめ、次いで水に溶解した後に、必要に応じて
精製処理および粉末化処理を単独であるいは適宜組合せ
て行なうことができる。

精製処理としては種々の操作を適用することができる。

たとえば酵素処理、すなわち多糖体ＲＢＳ物質を含有す
る抽出液に不純物として遊離状態で混在する澱粉、蛋白
質などの高分子物質は澱粉分解酵素および／または蛋白
分解酵素を作用させることにより低分子成分に分解して
除去することができる。

これらの酵素としてたとえばα−アミラーゼ、イソアミ
ラーゼ、プルラナーゼなどの種々のアミラーゼ、パパイ
ン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼなどの種々のプ
ロテアーゼや必要ならば他の酵素も適宜に使用できる。

上記の酵素処理の場合は通常、酵素を基質の１１５００
〜１１５０００の割合で添加し、０．５〜２４時間、好
ましくは１〜１５時間行なう。

この他の酵素処理として、多糖体ＲＢＳ物質の水可溶性
画分の増収、分子量の調整等を目的として多糖体ＲＢＳ
物質の多糖骨格を分解せしめる酵素、たとえばグルカナ
ーゼ等のグルカン分解酵素を使用することができる。

この場合は緩やかな分解条件が望ましく、通常、酵素は
１／１０００〜１／１．００００の割合で添加し、０．
２〜２０時間、好ましくは０．５〜１０時間の処理で目
的を達することができる。

他の精製処理として酸処理、すなわち多糖体ＲＢＳ物質
含有水溶液に氷酢酸、硫酸、塩酸、タンニン酸、トリク
ロル酢酸などの無機酸あるいは有機酸を０．１〜１０係
、好ましくは３〜５係程度加え、生じた沈澱や溶存する
酸、無機イオン、過度低分子成分等の混在不純物を除去
する場合の他に、多糖体ＲＢＳ物質の水可溶性画分の増
収または多糖体ＲＢＳ物質の分子量調整等のために酸加
水分解を目的とする場合がある。

後者の場合の酸処理は、可及的に緩やかな条件で行なう
ことが望ましく、酸は無機酸、有機酸のいずれも使用可
能であるが、一般的には効率的なギ酸、塩酸等で処理す
るのが便利である。

分解条件は０．０５〜５Ｎの酸濃度、６０°Ｃ〜１００
°Ｃで５分〜３時間、好ましくは０．１〜０．５Ｎの酸
濃度、１００℃で１０〜３０分間の処理が妥当である。

これらの酸処理で生成した不要な過度低分子画分、残存
する酸、無機イオン等の不純物は流水または蒸留水中で
セロファン膜、コロジオン膜等の透析膜による透析で除
去精製され得る。

前述の透析の他に精製処理の操作方法として、ダウエッ
クス、アンバーライト、デュオライト、ダイヤイオン等
のカチオン、アニオン交換樹脂を用いて行なうイオン交
換処理、さらに限外濾過、ゲル濾過、遠心分離、珪藻土
濾過、活性炭処理、減圧濃縮等の操作を単独あるいは組
合せて用いて分画精製を行なう。

上記した有機溶媒による洗浄、除蛋白、除澱粉およば／
または加水分解のための酵素処理、酸処理、イオン交換
処理、限外濾過、ゲル濾過、遠心分離、珪藻土濾過、活
性炭処理、減圧濃縮等の精製処理方法は、その操作順序
、組合せ方などを考慮のええ、必要に応じて単独もしく
は２種以上を適宜組合せて使用すればよい。

前記の操作により精製された多糖体ＲＢＳ物質を含む水
溶液を凍結乾燥、噴霧乾燥、極性有機溶媒による沈でん
などを行なって、淡黄褐色乃至灰白色または白色の粉末
状とすることができる。

このようにして得られた多糖体ＲＢＳ物質は次のような
理化学的性質を有している。

透析膜を通過せず、有機酸または有機溶媒、例えば氷酢
酸、アルコール（メタノール、エタノール、プロパツー
ル、ブタノールなど）、アセトン。

ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシ
ド、リグロイン、四塩化炭素、エーテル等に不溶である
が、水には可溶である。

また、本物質の１係水溶液のｐＨは中性である。

本物質は一定の融点を示さず２２０℃で褐変し、２８０
℃で黒変して炭化が起こる。

製造例１で代表される本物質の元素分析の結果は炭素３
８．ＯＯ係、水素６．２５係、酸素５０．５６係、窒
素０．３０％、無機質４．８９％であった。

さらに、本物質の１係水溶液の呈色反応はフェノール硫
酸反応、アンスロン硫酸反応、カルバゾール硫酸反応、
トリプトファン硫酸反応、システィン硫酸反応、クロモ
トロープ硫酸反応、モーリッシュ反応がいずれも陽性で
あり、エルソン・モルガン反応、ヨード反応は陰性であ
る。

また、後記製造例１において得られた本物質の比旋光度
〔α）２０＝＋１４２°〜＋１４５°（Ｈ２Ｏ）であり
、さらに本物質の窒素成分を日立自動アミノ酸分析計で
測定したところ、そのアミノ酸組成はグルタミン酸１７
．３％、アラニン１０．４％、グリシン１０．３％、ア
スパラギン酸９．５％、リジン９．４％、スレオニン５
．９％、セ’）ン５．ｓ％、アルギニン５．６％、バ
リン５．４％、ロイシン５．４％、プロリン４．５
％、ヒスチジン３，１％、イソロイシン２．８％、フ
ェニルアラニン２．２％、チロシン１．３％、メチオニ
ン１．２％、ｌ−リプトファン痕跡量、システィン痕跡
量であった。

次に、無機質については主としてＳｉ、Ｐ、Ｋ。

Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇなどが含まれていることを確認した。

これら元素は、セファロース６Ｂによるゲル濾過で多糖
体ＲＢＳ物質がボイドボリュームに現われることから考
え、無機物として単独で多糖体ＲＢＳ物質に夾雑してい
るのではなく、多糖体ＲＢＳ物質の骨格成分に結合して
存在しているものと推定される。

さらに、本物質の１係水溶液にＩＮ硫酸になるように硫
酸を加え、１００℃で３時間加水分解を行ない、次いで
炭酸バリウムを加えて中和した後の上清液はモーリッシ
ュ反応、アンスロン反応、トリプトファン硫酸反応、シ
スティン硫酸反応、クロモトロープ硫酸反応、ビューレ
ット反応、ニンヒドリン反応、ローリ−フォリン反応は
いずれも陽性であった。

一方、当該分解液の薄層クロマトグラフィーを行なうと
、必ずグルコースを検出した。

また、多糖体ＲＢＳ物質の硫酸およびギ酸による完全加
水分解物の薄層クロマトグラフィーを下記の４種類の展
開溶媒で展開したところ、いずれもグルコース以外の糖
スポットを検出しないので、本物質はグルコースのみを
構成糖とする多糖であることが判明した。

また、本物質は第１図に示す紫外部吸収スペクトルと第
２図に示す赤外部吸収スペクトルおよび第３図に示す１
３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

これらのスペクトルの解析と比旋光度の結果からα結合
の存在が推定される。

以上の分析結果と本物質が透析膜を透過せず、セファロ
ース６Ｂのゲル濾過でボイドボリュームに現われる点か
ら、本物質はグルコースを唯一の糖構成成分とする多糖
体であると認められる。

また、ＲＢＳ物質は過ヨウ素酸酸化実験によりグルコー
ス残基１個当り約１．７モルの過ヨウ素酸を消費し、約
０．８５モルのギ酸を生ずること、スミス分解を行なっ
た溶液をペーパークロマトグラフィーで分析すると多量
のグリセリンを検出すること、メチル化粧のペーパーク
ロマトグラムから少量のテトラメチルグルコース、ジメ
チルグルコースの他に多量の２．３，４− トＩＪメチ
ルグルコースを検出すること等の実験結果から考えてα
−１，６グルコシド結合を主体とする多糖であることが
推定される。

さらに、第３図に示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの解析
結果から、本物質はα−１，６グルコシド結合が主体で
あるが、少量のα−１，４グルコシド結合をも含有し、
その存在比は約１０対１であることが判明した。

一方、ＲＢＳ物質を蛋白分解酵素プロナーゼで分解限度
まで分解させたものおよびセバーグ法にて完全除蛋白し
たサンプルをセファロース６Ｂでゲル濾過すると、処理
前のＲＢＳ物質と同様ボイトホリュームに溶出してくる
ことおよび完全除蛋白したサンプルのリンを含む無機質
含量は除蛋白前後で変化がないことが判明した。

以上の諸解析結果を総合すると、ＲＢＳ物質の構造は次
のように推定される。

すなわち、α−１，４＊６グルコシド結合を主骨格とし
、約１０個のα−１，６結合で結ばれたグルコース残基
に１個の割合でα−１，４結合の枝分かれを持った多糖
で、さらにリン酸基を介して各種の無機元素を結合し、
糖の主骨格の外側にポリペプチドを結合させた構造を持
っている。

本発明により得られる多糖体ＲＢＳ物質は極めて強力か
つ多様な生体免疫賦活作用を有しており、これらの薬理
作用は下記の実験例に示されるように、カーボンクリア
ランステスト、プラークフォーミングセル法、遅延型皮
膚反応法の各試験結果により確認されたものである。

実験例１カーボンクリアランステスト（簡便法）ＩＣＲマウス（４週令、雌）に本物質を２日間腹腔投与
し、３日目にカーボン液（ベリカン製［ファウントイ
ンディア」を生理食塩水で５倍に希釈した液）をマウス
尾静脈に０．２５ｍＡ！注入し、１０分後に眼窩静脈
より０．０２５ｍＡ’採血し、３．５ｍｌの０．ＯＩ
Ｍ−Ｎａ２Ｃ０３溶液に懸濁させ、６５０ｎｍの
吸光度（０，Ｄ、）を測定し、血中カーボン濃度を調
べた。

結果は本物質１０〜１００■／ｋｇの投与により、投与
マウスの網内系機能が充進し、マクロファージの貧食能
が大巾に増強されることが示された。

実験例２プラークフォーミングセル法ＩＣＲマウス（４週令、雌）に本物質を３日間連日腹腔
投与した。

投与後４日目と１１１日目それぞれ羊赤血球４×１０８
個をマウス尾静脈よりミ杉注入し感作せしめ、その４日
後にカニンガムの方法によりマウス牌臓のプラーク数を
測定した。

下表のとおり、本物質は正常マウス（非担癌）における
抗体産生能増強の活性を強く示した。

実験例３遅延型皮膚反応法ＩＣＲマウス（８週令、雌）にザルコーマ１８０腹水型
腫瘍細胞１０５個を腹腔内移植し、その翌日より本物質
を８日間連日経口投与、移植３日月にマウスの刺毛腹部
に５％塩化ピクリルエタノール溶液を塗布して一次感作
し、移植１０日日目１係ピクリルオリーブ油溶液をマウ
ス両耳の表裏に塗布して二次感作し、その２４時間後に
耳厚の増加をゲージで測定し、担癌マウスにおける耳厚
増加＊率（ＤＨＲ）をみた。

一方、ザルコーマ１８０腹水型腫瘍細胞を移植しない正
常マウス（非担癌）でも以下同様の処理をして非担癌マ
ウスの耳厚増加率を調べた。

その結果は下表のとおりで、本物質は担癌マウスおよび
非担癌マウスともに顕著な耳厚増加率を示し、強い細胞
性免疫賦活作用を有することが確認された。

また、多糖体ＲＢＳ物質の急性毒性は雄ラットの経口投
与では物理的投与限界１５ｇ／ｋｇでも死亡例がなく、
体重増加も対照と変らない。

しかも、外観上や剖検上も全く異常が認められなかった
。

したがって、ＬＤ、（、＞１５ｋｇであり、毒性はない
ものと認められる。

以上のとおり、多糖体ＲＢＳ物質は強い免疫賦活作用を
有し、かつ毒性が認められないので、極めて優れた免疫
賦活用薬剤として期待される。

実際の製剤化については、本物質を有効成分として、必
要に応じ各種賦形剤（水、生理食塩水、ポリエチレング
リコール、グリセロゼラチン、カカオ脂、澱粉、デキス
トリン、乳糖など）等添加剤と組合せて水剤、錠剤、散
剤、坐剤、カプセル剤等の剤型にて免疫賦活剤を製造す
ることができる。

毒性がなく、各種疾病に特に補強的効果を期待されてい
る免疫賦活剤は、今後の免疫療法において極めて有用な
薬剤と考えられる。

したがって、免疫賦活剤としての多糖体ＲＢＳ物質が現
在大量に副生されている米糠、脱脂米糠を原料として比
較的簡易な操作の組合せで工業的に効率よく製造できる
ことは本発明の大きな利点である。

次に、本物質の製造を以下の製造例によって説明する。

製造例１市販の米糠１０ｋｇに蒸留水５０１を加え、加熱して１
００℃で５時間攪拌、抽出した後、遠心分離を行なって
４Ｍの上清を得た。

この上清を減圧濃縮して２０１とし、これに結晶α−ア
ミラーゼ２００ＴＩＩ？を加え、７０℃で１時間保持し
た後、１００℃に加温した。

次いで遠心分離を行なって上清１８．５Ａ？を得た。

この上清に濃度３５係となるようにエタノールを加え、
生じた沈でんを分取し、凍結乾燥して黄白色粉末２３８
ｇを得た。

この粉末５ｇを２００ｍ１の水に溶解し、セファロース
６Ｂでゲル濾過し、そのボイドボリューム画分を集めて
凍結乾燥し、白色粉末１．５ｇを得た。

上注により得た多糖体ＲＢＳ物質に関する分析値は第１
表に示す。

製造例２市販の米糠１０ｋｇをヘキサン５０１で還流脱脂したの
ち乾燥した米糠を製造例１と同様の方法で処理して黄白
色粉末２４５ｇを得た。

この粉末を水１１に溶解したのち遠心分離して得た上清
を凍結乾燥することによって黄白色粉末１６５ｇを得た
。

製造例３市販の脱脂糠３ｋｇに水２１を加え攪拌しながら１２０
℃で２時間加圧加熱下で抽出した。

抽出液を減圧濃縮して得た５１１の濃縮液に結晶α−ア
ミラーゼ（長潮産業製）０．：ｌを加えて６０℃で５時
間保持した。

しかる後、１００℃に加温した後、遠心分離して上清４
．９１を得た。

この上清にエタノールを加えてエタノール濃度４０％と
し、生じた沈でんを分取した。

次いで、これを凍結乾燥して淡黄褐色粉末８８ｇを得た
。

製造例４市販の米糠２０ｋｇを３０メツシユの篩でふるって砕米
等の夾雑物を除去した後、イオン交換樹脂で処理した水
道水１００１で洗浄した。

次いで、洗浄した米糠に蒸留水５０１を加え攪拌しなが
ら１１０℃で３時間加圧加熱下で抽出した後、濾過した
。

得られた濾液を減圧濃縮し、さらに遠心分離して上清１
０１を得た。

この上清に結晶α−アミラーゼ２５０■を添加し、６５
℃で２４時間作用せしめた後、１００℃に加温した。

冷却後、エタノール濃度３０優になるようにエタノール
を加え生じた沈でんを遠心分離によって採取した。

この沈でんに水３１を加えて溶解した後、遠心分離を行
なって上清を得た。

この上清を１４となるまで減圧濃縮し、さらに遠心分離
して上清を得、これを凍結乾燥して淡黄褐色粉末４１１
ｇを得た。

製造例５製造例４で得た粉末２０ｇを５００ｍＡ’の水に溶解し
、遠心分離を行なって得た上清４８０ｍ１を陽イオン交
換ゲルであるＣＭセファロース（ファルマシア製）およ
び陰イオン交換ゲルであるＤＥＡＥセファロース（ファ
ルマシア製）で順次イオン交換処理し、非吸着部を凍結
乾燥して白色粉末１４ｇを得た。

製造例６製造例４で得た粉末２０ｇを５００ｍＡの水に溶解した
後、活性炭５ｇを加え、３０分後に遠心分離を行なって
上清を得た。

この上清を凍結乾燥し、白色粉末１８ｇを得た。

上注により得た多糖体ＲＢＳ物質の分析値は第１表に示
す。

製造例７製造例４で得た粉末３０ｇを１１の水に溶解し遠心分離
して得た上清をセファロース６Ｂ（ファルマシア製）で
ゲル濾過し、そのボイドボリューム画分を凍結乾燥して
白色粉末１８ｇを得た。

製造例８製造例１でエタノール沈でん後凍結乾燥して得た黄白色
粉末１００ｇを０．２Ｎギ酸溶液として１００°Ｃ２
０分間加熱して軽く加水分解した後、セロハン膜で２４
時間流水透析し、濃縮後、凍結乾燥して８２ｇの水易溶
性の白色粉末を得た。

製造例９製造例３で得た淡黄褐色粉末４０ｇを水１１に溶解し、
グルカナーゼ（クミアイ化学製、キクラーゼ粉末）５０
η加えて３時間、５０°Ｃに保持した後、１分間煮沸し
てから珪藻土濾過した濾液をセファロース６Ｂ（ファル
マシア製）でゲル濾過し、そのボイドボリューム画分を
凍結乾燥して白色粉末２．２ｇを得た。

製造例１０製造例４においてエタノールの代りに３５係（Ｗ／Ｗ）
濃度の硫酸アンモニウムを用いて塩析し、生じた沈で
んを集め、流水に対して２４時間透析して脱塩した後、
製造例４と同様に処理して灰白色の粉末３９０ｇを得た
。

【図面の簡単な説明】

第１図は免疫賦活作用を有する多糖体ＲＢＳ物質の紫外
線吸収スペクトルの特性吸収図であり、第２図は同じく
赤外線吸収スペツクルの特性吸収図であり、第３図は１
３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１透析膜を通過せず、アルコール、アセトン、ヘキサ
ン、ベンゼン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、リ
グロイン、四塩化炭素、クロロホルムおよびエーテルに
不溶であり、水には可溶であり、１ｏｉ）水溶液は中性
を示し、モーリッシュ反応、アンスロン硫酸反応、トリ
プトファン硫酸反応、システィン硫酸反応、クロモトロ
ープ硫酸反応、フェノール硫酸反応、カルバゾール硫酸
反応、ビューレット反応、ニンヒドリン反応、ローリ−
フォリン反応が陽性であり、エルソン・モルガン反応、
ヨード反応が陰性であり、第１図に示す紫外部吸収スペ
クトルを示し、第２図に示す光外部吸収スペクトルを示
し、第３図に示す’３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す、グ
ルコースを唯一の糖構成成分とし、α−１，６グルコシ
ド結合を主骨格としα−１，４グルコシド結合を有する
多糖体ＲＢＳ物質または該物質と製薬上許容される賦形
剤より実質的になるものを有効成分とする免疫賦活剤。