KR870001931B1

KR870001931B1 - 다당체 rin 물질의 제조방법

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Publication number: KR870001931B1
Application number: KR1019850006015A
Authority: KR
Inventors: 스기루 다께오; 히사오 야마모또; 히사오 가또; 노부히로 와다나베; 미노루 가미우라; 기이찌 우찌다; 야시따다 모리
Original assignee: 샷뽀로 비루 가부시기사이샤; 다까구와 요시다까; 다이셀 가가꾸 고오교 가부시기가이샤; 이또우 에쓰오; 구보다 요시후미
Priority date: 1984-08-22
Filing date: 1985-08-21
Publication date: 1987-10-22
Also published as: KR860001827A; JPS6153221A; EP0173228A2; EP0173228A3

Abstract

내용 없음.

Description

다당체 RIN 물질의 제조방법

제1도는 다당체 RIN 물질의 자외부흡수 스펙트럼이다.

제2도는 다당체 RIN 물질의 적외부 흡수 스펙트럼이다.

제3도는 다당체 RIN 물질의¹³C-NMR 스펙트럼이다.

본 발명은 신규다당체 RIN 물질의 제조방법 및 그것을 유효성분으로 하는 항종양제, 면역조절제, 감염증예방치료제 및 종양회저인자(tumor necrosis factor)의 유발체에 관계한다.

종래 기술에 있어서 알려진 바와같이 다당체는 여러가지 원천으로 부터 입수되는데 예컨데 담자균류(Basidiomycetes)(일본특허공보 94012/1978호) 모울드(mould)(일본특허공보 59097/1978호) 조류(algae)(일본특허공보 28923호/1977호) 및 곡립(grains)(일본특허공보 139713/1978호)이 있다.

또한 이들 다당체가 항종양활성을 가지고 있는 것도 알려져 있다. 그러나 여러가지 문제점, 예컨데 저수득량 복잡한 제조과정 및 독성을 지니고 있는 여러가지 문제점을 그러한 다당체 사용시에 부딪히게 된다.

본 발명에 의하면 신규의 다당체 RIN 물질은 쌀겨에서 얻을 수 있고, 또한 상술한 다당체 RIN 물질은 항종양제, 면역조절제, 감염증 예방 치료제 및 종양회저인자의 유발체로서 효과적이라는 점이 알려져 있다.

본 발명은 하기사항에 관계한다.

(1) 신규의 다당체 RIN 물질

(2) 쌀겨를 열수처리하여 추출액을 얻고 상술한 다당체 RIN 물질을 함유하는 침전물을 형성하기 위하여 상술한 추출액에 극성 유기용매 또는 염석제를 첨가하는 다당체 RIN 물질의 제조법.

(3) 유효성분으로서 다당체 RIN 물질을 함유하는 항종양제.

(4) 유효성분으로서 다당체 RIN 물질을 함유하는 면역조절제.

(5) 유효성분으로서 다당체 RIN 물질을 함유하는 감염증 예방치료제.

(6) 유효성분으로서 다당체 RIN을 함유하는 종양회저인자의 유발체.

본발명의 다당체 RIN 물질은 추출과정제에 의하여 쌀겨로 얻어진다.

이 쌀겨는 현미로부터 정백미를 생산할때 얻어지는 부산물이고, 이것은 현미의 품종 산지 및 정백율에 관계가 없다.

쌀겨로부터 다당체 RIN 물질을 추출하고 정제하기 전에 당해 원료중에 혼재하는 쇄미 및 기타 불순물을 제거하기 위하여 세정함이 바람직하다. 또한 쌀겨 기름을 추출한 후의 찌꺼기처럼 다른 목적에 사용된 후의 쌀겨라도 본 발명에 사용할 수 있다.

다당체 RIN 물질은 합성분을 준비하기 위한 쌀겨의 열수처리로 얻어지는 추출물에 유기용매 또는 염석제를 첨가함으로서 제조된다. 그리고 필요하면 그 합성분을 정화하기 위하여 물에서 용해한다.

쌀겨는 불순물을 제거하기 위하여 분액기(separator), 예컨데 스크리인(screen)을 통과하게 되는데 필요하다면 분쇄후에 물로 세정한다. 지질가용획분은 에틸아세테이트, 4염화탄소클로로훠름, 에테르, 엔-헥산, 벤젠, 석유에테르, 아세톤 등과 같은 유기용매를 사용하여 제거함이 바람직하다.

쌀겨의 추출액은 쌀겨를 열수처리함으로서 얻을 수 있다.

열수처리는 쌀겨에 2 내지 100배량, 바람직하기는 5 내지 10배량의 물을 첨가하고 0 내지 70kg/㎠ 바람직하기는 0 내지 5.0kg/㎠의 압력, 50 내지 300℃, 바람직하기는 100 내지 150℃의 온도에서 10분간 내지 24시간, 바람직하기는 0.5 내지 5시간 추출을 실시한다.

실용적으로는 0 내지 3.0kg/㎠의 압력 100 내지 140℃의 온도에서 1 내지 5시간의 열처리가 적당하다.

열수처리로 얻어진 추출액은 여과 혹은 원심분리등의 조작에 의하여 고형분과 분리하고 필요에 따라서 적당한 수단, 예컨데 감압농축 한외여과 등의 수단을 단독 혹은 조합해서 실시하여 적당량까지 농축한다.

이 추출액에 대하여 물에 가용인 극성 유기용매 혹은 염석제를 가하여 생긴 침전물을 채집함으로서 조제다당체 RIN 물질을 얻을 수 있다. 여기서 사용하는 극성유기용매로는 예컨데 메타노올 에타노올, 프로파노올 및 아세톤 등이 있다.

극성유기용매의 사용량은 추출액속에 있어서의 목적물질의 함유량등을 고려하여 결정하지만 에타노올을 사용하는 경우를 예로든다면 에타노올의 농도가 30내지 50%(V/V)가 되도록 첨가하면 된다. 또한 생성된 침전은 전술한 에타노올과 같은 유기용매로 세정함이 바람직하다.

한편 염석제로서는 염화나트륨, 유산암모늄, 염화카륨 등이 있고 통상적으로는 열수수출에 대하여 염석제가 포화도 0.5 내지 1이 될때까지 첨가하여 침전을 생성시킨다.

본 발명에서는 극성유기용매 혹은 염석제를 열수수출액에 첨가하기전 혹은 상술한 바와같이 이들 물질을 첨가하여 침전물을 생성시키고, 이어서 물에 용해한 후에 필요에 따라서 제단백처리와 정제처리를 할수 있다.

제단백처리와 정제처리로서는 여러가지의 조작을 적용할 수가 있다. 예컨데 다당체 RIN 물질을 함유하는 용액에 전분분해효소 및 혹은 단백분해효소를 작용시켜서 혼재하고 있는 전분 또는 단백질등의 불순물을 저분자화시킨다.

저분자화된 것은 그후의 정제공정에서 제거된다.

그러한 효소로서는 α-아밀라제와 같은 아미롤리릭(amylolylic)효소, 프로나아제와 같은 단백질 가수분해효소, 또한 필요하면 다른 효소가 사용될 수 있다.

이 효소처리에 있어서는 기초 1/1000 내지 1/5000의 비율로 효소가 첨가되고 또한 그 처리는 0.5 내지 24시간 바람직하기는 1 내지 15시간 실시함이 바람직하다.

다른 제단백처리 및 정제처리로서 전술한 다당체 RIN 물질함유수용액에 염산, 탄닌산, 트리클로르 초산등의 무기산 혹은 유기산을 0.1 내지 10% 바람직하기는 3 내지 5% 정도 첨가하고 침전이 생성됐으면 여과 또는 원심분리등의 조작에 의하여 제거하고 이어서 잔존하는 산, 무기이온 및 저분자 획분을 유수 또는 증류수 중에서 1 내지 3일간 투석하는 방법, 세바아크법, 이온교환 처리방법 분획분자량 10,000 내지 100,000의 막을 사용하는 한외여과방법 겔여과, 원심분리, 활성탄 처리, 농축등을 단독 혹은 조합하여 적용해서 정제한다.

제단백처리에는 세바아그법이 응용될 수도 있다.

나아가서 산이나 효소 등에 의한 저분자 처리를 적용할 수가 있다. 상술한 정제처리는 그 조작순서 조합방법 등에 제한이 없고 필요에 따라서 단독 또는 두가지 이상을 조합하여 적용하면 된다.

다량의 단백질이 상술한 방법에 의하여 다당체 RIN 물질로부터 제거되었다.

전술한 조작에 의하여 정제된 고분자의 다당체 RIN 물질을 포함하는 수용액이 앰버라이트(Amberlite) IR-4B, 다이에이이 세화로오즈(DEAE-Sepharose) 또는 디이이에이이-셀로오즈(DEAE-Cellulose)와 같은 음이온 교화체원주(anion exchanger column)에 응용됐을 때에 그 획분은 수집됐다.

이 획분으로부터 동결건조, 분물건조, 극성유기용매에 의한 침전 등을 실시하여 다당체 RIN 물질을 백색의 분말상으로 만들 수가 있다.

이와같이하여 얻어진 다당체 RIN 물질은 다음과 같은 이화학적 성질을 가지고 있다.

(단, G, α-D-글루코피라노 실기를 나타내고 n와 n'의 합계는 4이다)

반복단위 N의 수자는 N>10이고 투석막을 통과하지 않는다(따라서 분자량은 약 10,000이라고 인정할 수가 있다).

유기용매 예컨데 메타놀, 에타놀, 프로파놀, 부타놀과 같은 알코올아세톤, 헥산, 벤젠, 오산에틸, 리구로인, 4염화탄소, 클로로 훠름 및 에텔등에는 불용이지만 물, 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide) 및 포름아미드에는 가용이다.

또한 본 물질의 1% 수용액의 pH는 중성이다.

본발명 물질은 일정한 융점을 표시하지 않고 220℃에서 갈변하고 280℃에서 흑변하여 탄화가 생긴다.

후술하는 바 제조예(1)에 의한 본 물질의 원소분석의 결과는 탄소 41.39% 내지 수소 6.09%, 회분 3.20%, 질소 0.13%이다. 1% 수용액의 정색반응은 안드론 유산반응(anthrone-sulfuric acid) 훼노올유산반응 및 크로모트로우프유산반응(chromotrope-sulfuric acid reaction)이 양성이고, 뷰렛(buiset)반응, 로우리-훠린(Lowry-Folin)반응, 엘슨-모르간(Elson-Morgan)반응 및 전분-요오드 반응이 각각 음성이었다.

또한 본 물질의 비선광도(srecific rotation)는

= +142 °+ 145°(H₂O)이고 회성분에 관하여는 주로 Si, P, K, Na, Ca, Mg, Cl 등이 포함되어 있음을 확인하였다.

이들 원소는 RIN 물질을 세화로우즈(Sepharose) CL-6(Pharmacia Chemicals AB제조)로 겔여과했을때에 당성분과 거동을 같이하여 보이드볼륨에 나타나는 점으로 봐서 오염균으로서 단독으로 RIN 물질에 존재하고 있는 것이 아니고 RIN 물질의 골격성분에 화학적으로 결합하여 존재하고 있는 것으로 추정된다.

나아가서 본 물질의 1% 수용액에 1N 유산이 되도록 유산을 첨가하고 100℃에서 3시간 가수분해를 실시하고, 이어서 탄산바륨을 첨가하여 중화한 후의 상청액은 모오릿슈 반응안드론 유산반응, 트리프토환유산반응, 시스틴 유산반응, 크로모트로우프유산반응등은 모두 다 양성뷰레트반응, 닌히드린반응, 로우리-포린 반응 등은 음성 또한 RIN 물질의 유산 및 개미산에 의한 완전가수분해물의 박층크로마토그래프를 하기의 4종류의 전개용매로 전개했던바 어느 것이나 글루코오스이외의 당스폿을 검출하지 않기 때문에 본물질은 글루코오스만을 구성당으로 하는 다당임이 판명되었다.

(1) 초산에틸 : 메타노올 : 초산 : 물

65 15 10 10

(2) 초산에틸 : 이소프로파노올 : 물

65 23 12

(3) 이소프로파노올 : 피리딘 : 물 : 초산

8 8 4 1

(4) 부타노올 : 피리딘 : 물

6 4 3

나아가서 본 물질은 제1도에 표시하는 자외부 흡수스펙트럼 및 제8도에 표시하는 적외부 스펙트럼 및 제3도에 표시하는 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이들 스펙프럼의 해석과 비선광도의 결과로부터 α결합의 존재가 추정된다. 또한 RIN 물질은 과옥소산 산화실혐에 의한 글수코오스 잔기한개당 약 1.78몰의 과옥소산을 소비하고, 약 0.81몰의 개미산을 생성하는 점, 스미드분해를 실시한 용액을 페이퍼크로마토그래프로 분석하면 다량의 글리세린을 검출하는 점, 메틸화당 분석은 2, 3, 4, 6-테트라메틸-글루코오스(I)2,3,4-트리메틸-글루코오스(II),2,3-디메틸-글루코오스(III)가 검출된 점등인데 상술한 메틸화당분석의 상관비는 아래와 같다.

I : Ⅱ : Ⅲ=1 : 4 : 1

상술한 시험결과로부터 본 RIN 물질은 G는 α-D-글루코피라노실기이고, n와n'의 합계가 4인 구조적 반복단위를 가지는 다당체라고 추정되다.

본 발명에 의하여 얻어지는 다당체 RIN 물질은 항종양활성, 면역조절활성 및 감염방어활성등 및 종양회저인자의 유발활성등 여러가지 생리활성을 지니고 있음이 판명됐다. 이하 각각의 생리활성에 관하여 그 검정법 및 후술하는 제조예(1)에서 얻어진 다당체 RIN 물질을 투여한 실험에서의 검정결과에 관하여 상술한다.

(1) 항종양활성에 관하여

(가) 동계종양메스-A(Meth-A)에 대한 복강투여의 효과 6주짜리 평균체중 20g의 BALB/C-CRJ 생쥐에게 일주일동안 같은 계통의 생쥐의 복강내에서 계대한 암세포 Meth-A를 생쥐 한마리당 1×10⁵개를 복강내에 이식하고 대조무리 20마리(한무리) 시험무리 각 10마리(세무리)인 합계 4무리로 나누었다.

암세포를 이식한 다음날부터 연속 5일간 시험무리에는 생리식염수에 용해한 RIN 물질을 생쥐 한마리의 체중 1kg당 각 10, 30, 100mg을 0.1ml식 복강내에 투여하고, 대조군에는 마찬가지로 생리식염수만을 투여했다.

이후 생존일수를 관찰하고 연명효과를 다음식으로 산출했다.

(나) 동계종양메스-A에 대한 RIN 물질의 경구투여의 효과 6주짜리 암놈, 평균 체중 20g의 BALB/C-CRJ 새앙쥐에 일주일동안 같은 계통의 새앙쥐의 복강내에서 계대한 암세포 메스-A를 새앙쥐 한 마리당 1×10⁴개를 오른쪽 겨드랑이 하피에 이식하고 대조군 20마리(한무리) 시험군 각 10마리(세무리)인 계 4무리를 나누었다. 암세포를 이식한 다음날부터 연속 10일간 시험군에는 생리시험수에 용해한 RIN 물질을 새앙쥐 한마리의 체중 1kg당 1회 각 10, 30, 100mg를 경구로 위안으로 투여하고, 대조군에는 마찬가지로 하여 생리식염수만을 투여했다.

세포암을 이식하고 나서 35일후에 각 생쥐를 도살하고 증식한 종양을 잘라내서 중량을 측정하였다. 또한 저지율은 다음식에 의하여 산출하였다.

상술한 (가) (나)의 방법에 의하여 검정한 RIN 물질의 항종양 효과는 하표와 같았다.

[제 1표]

상기표(1)에서 명백한 바와같이 복강투여, 경구투여 공히 새앙쥐의 체중 1kg 당 30mg 부근을 가장 적합한 투여량으로 하여 RIN 물질은 강한 항종양활성을 지니고 있음이 판명됐다.

그밖에 RIN 물질은 동계종양루이스(Lewis)폐암, 멜라노오마(Melanoma) B-16, 자루코오마(Sarcoma)-18, 에에르릿히종양(Ehrlich ascites carcinma) 등에 대하여 투여량 10~100mg/kg의 범위에서 복강투여 또는 경구투여에 의하여 종양저지율 30 내지 70%의 효과가 확인되어 있으며, 후술하는 바와같이 독성을 전혀 볼수 없는 점과 합쳐서 극히 유효한 항종양제로 될수 있다고 생각된다.

(2) 면역 조절활성에 관하여

(가) 카아본클리어란스테스트(CCT)

본 방법은 면역조절작용중에서 마크로화아지(macrophage)의 식세포활성의 증강효과를 조사하는 것이다. 4주짜리 암놈, 평균체중 20g이 ICR-CRJ 새앙쥐 한무리 6마리에 생리식염수에 용해한 RIN 물질을 2일간 복강투여하고(다조군은 생리식염수만을 투여) 3일만에 카아본액(페리칸사제 흑잉크, 상품명 파운드 인디아를 생리식염수로 5배로 희석한 액)을 새앙쥐 꼬리정맥으로부터 0.25ml 주입하고, 주입직후 및 10분후에 안와정맥총으로부터 0.025ml 채혈하고, 3.5ml의 0.01몰 탄산나트륨용액에 현탁용해시키고, 650nm흡광도(0D650)를 측정하고 혈중카아본 농도의 감소율을 조사했다. 그 효과는 다음식에 표시하는 탐식계수로 표시하였다.

^*T1시에 있어서의 흡광도(0D650)를 C1, T2시에 있어서의 0D650을 C2로 한다.

또한 담암 새앙쥐에 관하여는 RIN 물질의 투여개시보다 7일전에 자루코오마세포를 1×10⁷개를 대퇴부근육에 이익하고, 이하 마찬가지로 시험했다.

결과는 제2표와 같고, 정상새앙쥐, 담앙새앙쥐 공히 RIN 물질의 10 내지 100mg/kg 특히 30mg/kg의 투여에 의하여 새앙쥐의 세망내피계의 기능이 앙진하고, 마크로화아지의 탐식능이 크게 증진되어 있는것이 판명됐다.

[제 2표]

(나) 플라이크 풔어밍 셀법(PEC) (plaque-forming cell test)

본법은 면역조절작용중에서 숙주의 B세포의 활성화에 의한 항체산생능의 증강효과를 조사하는 것이다.

4주짜리 암놈, 평균체중 20g의 ICR-CRJ 새앙쥐 한 무리 6마리에 생리식염수에 용해한 RIN 물질을 3일간 연속하여 복강내에 투여하고(대조군은 생리식염수만을 투여) 4일째와 11일째에 각각 양적혈구 4×10⁸개를 꼬리정맥으로부터 주입하고, 그 4일 후에 카닝감(Cuningham)의 방법으로 새앙쥐의 넙적다리 살세포의 플라아크형성능을 측정했다.

결과는 제3표와 같고, RIN 물질은 10 내지 100mg/kg의 투여에 의하여 항체산생능을 현저히 증강하고 있음이 표시됐다.

[제 3표]

(다) 지연형 피부 반응법(DHR)

본법은 면역조절작용중에서 숙주의 T세판의 활성화에 의한 세포성 면역의 작용의 증강효과를 조사하는 것이다.

8주짜리 암놈, 평균체중 27g의 ICR-CRJ 새앙쥐 한무리 6마리에 생리식염수에 용해한 RIN 물질을 8일간 연속하여 경구투여하고(대조군은 생리식용수만을 투여함), 투약개시후 4일째에 생쥐의 털을 깎은 복부에 5% 염회피크릴에타노올용액을 발라서 감작시키고, 11일째에 1% 피크릴올리이브유 용액을 새앙쥐의 두귀의 안팎에 발라서 2차로 감작하고, 그 24시간후에 귀두께의 증가를 게이지로 측정하고, 도포전의 귀두께와 차로부터 귀두께의 증가량을 관찰하였다. 한편 담암새앙쥐에 관하여는 자루코오마 180복수형 종양세포를 1×10⁵개를 투약개시 전일에 새앙쥐 복강내에 이식하고, 이하 마찬가지로 시험하였다.

결과는 제4표와 같고, RIN 물질은 시험한 30 내지 500mg/kg의 경구투약에 의하여 정상 새앙쥐, 담암쥐 공히 세포성면역능을 현저히 증강하고 있음을 나타냈다.

[제 4표]

이상 (가) (나) (다)의 각 면역실험에 의하여 RIN 물질은 메카니즘이 상이한 면역작용을 각각 현저히 앙진시키고 있는 것을 알았다.

면역조절제는 일반적으로는 생체의 면역기능이 저하하기도 하고 이종항원인식기능이 약한 경우등에 사용될 수 있는 점으로 인하여 특히 미생물감염증과 악성종양의 치료제, 치료보강제 또는 병용제, 예방제 혹은 수술후 회복촉진제로서의 약제용도가 기대된다.

이상의 면역활성화 회복기능밖에도 면역조절제는 이상하게 앙진한 생체면역반응을 정상화하고, 예컨데는 류마티(rheumatism)고원변, 알레르기등과 같은 자기면역질환에도 적용할 수 있는 경우를 생각할 수 있다.

(3) 감염방어활성에 관하여

생체의 세균의 의한 감염증에 대한 방어작용으로서는 침입세균에 대한 항체생산에 의한 소위 체액성 면역작용에 의하는 것과 마크로화아지와 T세포가 침입세균과 싸우는 소위 세포성 면역에 의한 것이 있는 것이 알려져 있다.

일반적으로는 생체는 이들 이종 세균의 침입에 대하여는 충분한 방어작용을 가지고 있지만, 담암상태 특히 암의 말기에는 현저히 방어작용이 저하하는 것이 알려져 있고 통상 숙주와 공생하고 있는 비병원균에 의해서 조차도 위독한 결과를 초래하는 것이 알려져 있다.

그래서 RIN물질이 이들 세균의 감염증에 대하여 숙주의 방어활성을 증가하는지 어쩐지 체액성 면역이 관여한다고 알려진 대표적 감염균이 에세리히아. 코일(Escherihia coli) 및 세포성면역이 관여한다고 알려진 리스테리아. 모노사이토게네스(Listria monocytogenes)감염에 대한 RIN 물질의 효과를 조사하였다.

7주짜리 암놈, 평균체중 26g의 ICR-CRJ 새앙쥐를 한무리 20마리씩 사용하여 생리식염수에 용해한 RIN물질을 10내지 100mg/kg(대조군은 생리식염수만 투여) 새앙쥐의 장등피하에 세균감염 1일전 1일후에 각 일회식 투여했다. 에세리히아. 코일의 경우는 2×10⁷개를 장등피하에 리스테리아. 모노사이토게네스의 경우는 2×10⁷개를 복강내에 감염시키고, 각각 1주일간 관찰하여 살아난 새앙쥐 수를 비교하였다.

방어효과는 다음식에 의하여 산출하였다.

결과는 제5표에 표시된 바와같고 RIN 물질의 10내지 100mg/kg의 사전투하에 의하여 에세리히아. 코일 감염에 대하여는 대단히 강한 방어작용이 생기고, 리스테리아. 모노사이토게네스 감염에 대하여도 의미있는 방어작용의 증강효과를 볼 수 있었다. 또한 감염후 투여의 경우에서도 두 감염군에 대하여 의의있는 치료효과를 나타냈다.

후술하는 바와같이 RIN물질은 독성을 전혀 볼 수 없는 점도 곁들여서 극히 유효한 감염증 예방치료제로 될 수 있다고 생각할 수 있다.

[제 5표]

(4) 종양회저인자(tumor necrosis factor)의 유기활성(Inducing activity) 8주짜리 암놈 ICR-CRJ 새앙쥐 점화제(priming agent) 지모산 A(Sigma 사제) 3mg이 정맥으로 주입됐다.

프라이밍(priming) 7일후에 750g의 RIN 물질 또는 25g LPS (Difco 사제 Em Coli에 유래하는 것)가 양성콘트로올(positive cintrol)로서 이들 쥐에게 유출제로서 정맥주입됐다.

유출후 90분후에 새앙쥐의 안와정맥총에서 조입되었고, 활성화된 혈청을 얻기 위하여 여과를 통하여 원심분리 및 살균되었다.

이와같이 활성화된 혈청은 하기 시험에 제공된다.

(가) L-929 세포에 대한 인비트로시토시달활성(in vitro cytocidal activity against L-929 cells)

L-929세포에 대한 활성화된 시토시달 황성은 아래의 절차에 따라 측정된다.

[³H]티마딘(5Ci/ml)으로 사전표시되어 있는 L-929 세포는 Co2 배양기에서 24시간 37℃로 상술한 혈청의 존재하에 배양됐다.

세포에서[³H]를 해제하여 액체 신티레이션 계수관으로 측정됐다. 소의 태아 혈청 10%와 함께 이이글의 엠이엠(MEM)매체가 활성화된 혈청의 배양과 희석에 사용되었고 그 결과는 하기 제6표와 같다.

[제 6표]

^*시토시달활성은 목표세포중 30%가 죽는 혈청의 희석층(dilution fold)에 의하여 표시된다.

상기표는 새앙쥐가 지모산 A로 점화되고 RIN 물질로 유출될 때에 RIN 물질이 적극적 제어로서 사용되는 LPS와 같이 강력한 시토톡식팩터(aytotoxie factor)를 유발함을 나타낸다.

(나) 메스-A고체종양(Meth-A solid toumer)에 대한 괴사활성.

전술한 시토디알 활성이 종양회저인자에 기인함을 확인하기 위하여 인비보시험(in vivo test)이 실시됐다. 5×10⁵개의 메스-A 세포가 8주짜리 암놈 BLLB/C-CRJ 새앙쥐에게 피하접종되었다.

접종 7일후에 자발적인 회저(necrosis)가 없는 종양직경이 7mm에 도달한 새앙쥐 열마리가 선정되었고 또 2개 그루우프로 분류되었다.

각 그루우프에서 종양을 지니는 새앙쥐는 활성화된 혹은 활성화되지 않는 0.5ml의 혈청을 정맥에 주입하였고 종양에 발생하는 변화가 관찰되었다.

비록 5마리의 대조군에서 변화가 관측되지 않았지만 별개의 출혈회저가 활성화된 혈청을 받은 시험군의 새앙쥐 다섯마리전부에서 관찰되었다.

(다) 담종양 새앙쥐에 있어서의 종양회저인자의 내생적 유도(endogenous induction) 8주짜리 암놈 BALB/C-CRJ 새앙쥐 10마리에 5×10⁵개의 메스-A 세포가 피하접종되었다.

접종 2주일후에 3mg의 지모산 A가 시험군 새앙쥐 10마리에 정맥주입되었고 RIN물질 1mg이 지모산 A주입 1주일후에 주입되었다.

비록 변화를 볼 수 없었고 또한 종양이 대조군 5마리에서 착실히 성장하였더라도 RIN 물질 주입후 1주일 동안에 별개의 출혈회저가 관찰되었고 또한 시험군 새앙쥐 5마리 전체에서 종양성장이 억제되었다.

실험 (가)(나)(다)에서 본 결과로부터 RIN 물질은 새앙쥐에 있어서 강력한 종양회저인자의 유발활성을 가지고, 또한 적당한 점화제와 함께 사용될 때에 담종양 새앙쥐에 있어서 내생적인 종양회저인자를 유도하는 활성을 가진다고 결론할 수 있을 것이다. 따라서 그 항종양 활성이 기대된다.

다만 LPS와 같은 종양회저인자의 유독성 유도물도 알려져 있기 때문에 해물질은 약품으로 이용하는 유익한 방법을 개발하는 것이 불가능하였다. 그러나 RIN과 같은 무독성물은 종양회저유도의 활성을 가진다면 그것은 대단히 유용할 것이다.

한편 다음의 RIN의 인비트로(in vitro)생물학적 활성은 상술한 바와같은 인비보(in vivo)생물학적 활성을 지지하는 증거로서 확인됐다. 새앙쥐의 지라에서 인출한 네이추랄 킬러(natural Killer & NK)세포가 RIN 물질의 존재하에 세포(목표세포)와 함께 배양돼었을 때에는 목표세포에 대한 NK 세포의 시토시달활성(cytocidal activity)은 RIN에 의하여 현저히 증강된다. L-929에 대한 존재하는 복막의 대식세포(macro 1/2 hage)의 시토시달(cytocidal)활성은 RIN의 존재에서 현저히 증강된다. 인터로이킨(interleukins)나 혹은 프로스타그란딘(prostagandins)의 분비물도 RIN 물질의 존재에서 증강되었다.

RIN 물질의 극렬한 독성은 이하 상세히 설명될 것이다. 5주일짜리 숫놈 SD-CRJ의 쥐(rat)(체중 120g 내지 150g)가 각각 대조군과 실험군에서 사용됐다.

RIN 물질은 실험군에게 육체적으로 최대투여량 15g/kg이 경구투여되고, 대조군에는 생리식염수만이 투여되었다.

쥐는 죽지 않았다. 실험군에서의 체중증가는 대조군의 그것과 동일하였다. 나아가서 아무런 비정상이 외관과 시체해부에서 발견되지 않았다.

이와같이 본물제 LD50는 15g/kg보다 컷고 또한 해물질은 격렬한 독성을 가지지 않는다고 사료된다.

본 발명에 따르면 우수한 항종양활성, 면역조절활성, 감염방어활성 및 종양회저인자의 유도활성을 나타내는 다당체 RIN 물질이 비교적 용이한 조작의 조합에 의하여 하기 제조예에 표시되는 바와같이 대량으로 얻어지기 때문에 쌀겨로부터 생리활성 다당을 공업적으로 제조하는 기술면에 주는 효과는 대단히 큰것이다.

나아가서 인터훼론유기능을 볼 수 있는 점으로 봐서 루페스(herepes)와 인플엔자같은 바이러스성 질환에 대한 예방치료효과를 기대할 수 있다.

RIN 물질은 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있기 때문에 극히 유용한 항종양제, 면역조절제, 감염증예방치료제 및 종양회저인자의 유도활성제로 기대할 수 있다.

또한 실제의 제제화에 관하여는 본 물질을 단독으로 혹은 부형제(물, 생리식염수, 폴리에틸렌글리코올, 글리세제라틴, 전분, 데키스트린, 유당등)과 조합하여 수제 환제 정제, 산제, 좌제등의 제형으로 제조할 수 있다.

본 물질의 제조를 아래의 제조예를 따라 설명하기로 한다.

[제조예 1]

시판의 쌀겨를 사용하여 체로 쇄미등을 제거한 것 25kg에 수도물 125ℓ를 가하여 120℃에서 1시간, 그후에 다시 100℃에서 5시간 가열하고 교반하면서 추출을 실시했다.

추출액을 여과후에 40l로 감압농축하고, 수산화 나트륨로 PH를 6.7로 만든 후에 500mg의 α-아밀리아제를 첨가하고, 70℃에서 1시간 효소처리를 실시하였다.

반응후에 100℃까지 가열하여 효소를 실활시키고 원심분리에 의하여 불용물을 제거하고, 최종농도가 30%(V/V)가 되도록 에타노올을 첨가하여 생성된 침전을 분리하였다.

분리후에 물에 용해하여 불용물을 제거하고, 동결건조를 실시하였던 바, 508g의 담황색분말을 얻었다.

이 담황색분말 4g을 재차 이온교환수에 용해하고, 불용물을 원심분리로 제거한후에 세화로오즈 CL-6B(활마시아제조)에 의하여 겔여과하고, 그 보이드 볼륨에 용출된 획분을 채집하고, 나아가서 이 획분을 음이온 교환체 DEAE-세화로오즈 CL-6B(활마시아 Pharmacia 제조)의 코럼(column)을 통과시켰을때에 흡착되지 않고 그대로 용출하는 획분을 채집하여 2일간 증류수투석으로 농축하고, 동결건조하여 백색분말 200mg을 얻었다.

[제조예 2]

시판의 쌀겨 25kg을 헥산 100l로 환류탈지한 후에 건조한 쌀겨를 제조예 1과 동일한 방법으로 추출회수처리를 하여 담황색분말 450g을 얻었다.

이 분말 4g을 사용하여 제조예 1과 동일한 방법으로 처리하여 200mg의 백색분말을 얻었다.

[제조예 3]

시판의 탈지 쌀겨 3kg에 물 26l를 가하여 교반하면서 120℃에서 2시간 가압가열하여 추출하였다. 추출액을 감압농축하여 얻은 5l의 농축액에 결정 α-아밀아아제 0.3g을 가하여 60℃에서 5시간 보호유지하였다.

연후에 100℃로 가열한후 원심분리하여 상청액 4.9l를 얻었다.

이 상청액에 에타노올을 첨가하여 에타노올 농도 40%로 하고, 생성된 침전을 채취하였다.

이어서 이것을 동결건조하여 담황 갈색분말 88g을 얻었다.

이 분말 4g을 사용하여 제조예 1과 동일하게 처리하여 190g의 백색분말을 얻었다.

[제조예 4]

시판의 쌀겨 20kg을 30멧슈의 체로 쇄미등의 협작물을 제거한 후에 이온교환수지로 처리한 수도물 100l로 세정하였다. 이어서 세정한 쌀겨에 증류수 50l를 가하여 교반하면서 110℃에서 3시간 가압가열하여 추출한후에 여과하였다.

얻어진 여과액을 감압농축하고, 나아가서 원심분리하여 상청약 10l를 얻었다. 이 상청약에 결정 α-아밀라아제 250mg를 첨가하고 65℃에서 24시간 작용시킨후에 100℃로 가열하였다. 이어서 에타노올농도 30%가 되도록 에타노올을 첨가하고 생성한 침전을 원심분리에 의하여 채취하였다.

이상청액 1l에 음이온교환체 DEAE-세화로오즈 CL-6B 300g을 첨가하고, 실온에서 1시간 천천히 교반한후에 원심분리로 음이온교환체를 제거하여 상청액 900ml를 얻었다.

이상청액을 제조예 4와 동일한 방법으로 이온교환처리 및 동결건조처리를 실시하여 백색분말 135g을 얻었다.

[제조예 5]

제조예 4에 있어서 활성화된 탄소(10)가 투석과 원심분리로 얻어진 상등액 1l에 첨가되었다. 30분후에 그 혼합물은 원심분리되었다.

이렇게 얻어진 상청액은 동일한 이온교환체와 동결건조처리에 의하여 30g의 백색분말을 얻었다.

[제조예 6]

제조예 4에서 투석한 후 원심분리하여 얻어진 상청액 1l 중에서 20ml를 세화로오즈 CL-6B로 겔여과하고, 그 보이드볼륨획분을 채집하여 100ml로 만들었다.

이액을 제조예 1과 동일하게 이온교환처리 및 동결건조처리를 실시하여 백색분말 500mg을 얻었다.

[제조예 7]

제조예 1에서 아밀라아제처리물을 에타도올 침전시켜서 얻어진 침전물을 다시 10l의 물에 용해하고, 분획분자량 80,000의 울트라필터막을 사용하여 저분자획분을 제거함과 동시에 3l가 될때까지 농축하고, 생성한 침전물을 원심분리로 제거하여 2.8l의 상청액을 얻었다. 이 상청약 30ml 를 제조예 1과 동일하게 이온교환처리 및 동결건조처리를 실시하여 110mg의 백색분말을 얻었다.

[제조예 8]

제조예 1에서 α-아밀라아제 처리하여 120℃에서 1시간 가열하여 효소를 실활시킨액에 최종농도 40%(V/V)가 되도록 아세톤을 첨가하여, 생성한 침전물을 10l의 물에 용해하였다.

그후에 제조예 7에 있어서의 울트라필터막을 사용한 처리이후의 공정을 실시하여 150mg의 백색분말을 얻었다.

[제조예 9]

제조예 1에서 α-아밀라아제 처리하고 100℃에서 1시간 동안 가열하여 효소를 실활시킨후에 포화도 70%가 되도록 유산암모늄을 첨가하여 염석을 실시하고, 생성한 침전을 원심분리로 채집하여 3l의 물에 용해하고, 유수에 대하여 2일간 투석을 실시하였다.

이 투석내액에 트리크롤초산을 농도 7%가 되도록 첨가하여 침전물을 생성시키고, 생성한 침전물을 원심분리로 제거하고, 상청액을 다시 유수에 대하여 2일간 투석하고 투석내액을 동결건조하여 담황색분말을 얻었다.

이분말 4g을 이온교환수에 용해하고 그후에는 제조예 1과 동일하게 겔여과, 이온교환 및 동결건조를 실시하여 백색분말 100mg을 얻었다.

[제조예 10]

제조예 1에서 아밀라제 처리를 실시한 액을 그대로 40℃까지 내리고, 단백분해효소(프로나아제 E)600mg을 첨가하여 24시간 반응시켰다. 반응액을 100℃에서 1시간 가열하여 효소를 실활시킨 후에 원심분리하여 불용물을 제거한 상청액에 최종농도 30%(V/V)가 되도록 에타노올을 첨가하고 생성한 침전물을 원심분리로 채집하고 10l의 물에 용해하였다.

그후에 제조예 7에 있어서의 울트라필턱막을 사용한 처리이후의 공정을 실시하여 백색분말 150mg을 얻었다.

[제조예 11]

제조예 8과 같은 공정을 거쳐서 얻어진 울트라필터막 처리한 상청액 3l에 음이온교환 수지안바-아라이트 IR-4B를 500g첨가하고 실온에서 1시간 교반한후에 수지를 여과분취하고, 상청액 2.9l를 얻었다. 이것을 농축한 후에 분무건조(스프레이 드라이)하여 백색분말을 15g을 얻었다.

[제조예 12]

제조예 11에서 이온교환처리를 실시한 상청액에 최종농도가 40%(V/V)가 되도록 원심분리로 채집하고 나아가서 3회 에타노올에서 세정 및 잘수를 한후에 진공건조하여 백색분말 13g을 얻었다.

[제조예 13]

제조예 1에서 제조한 백색분말 2g에 2%의 유산-기산(formic acid)액 100ml를 첨가하고 60℃에로 4시 간 가수분해를 실시했다. 분해후에 탄산바륨을 첨가하여 중화하고, 원심분리로 상청액을 얻고 이절반의 분량을 세화로오즈 CL-2B인 코럼을 거쳐겔여과를 실시하고, 보이드 볼륨에 용출하는 획분(fraction)F1(분자량 2000만 이상)중간 분자량 약 100만인 획분 F2를 얻었다.

또한 나머지 반량을 세화딕스 G-200을 거쳐서 중간분자량 약 10만 약 1만의 획분 F3 및 F4 를 얻었다. 각각의 획분을 동결건조하여 F1 : 380mg, F2 : 250mg, F3 : 300mg, F4 : 250mg 의 백색분말을 얻었다.

각각의 획분의 생물활성을 "발명의 상세한 설명"에서 설명한 방법에따라서 조사한 결과는 다음의 각표와 같고, 어느 획분에도 가수분해전의 샘플에 지지하는 활성이 있음이 판명되었다. 그상세한 설명은 아래와 같다.

(1)항종양활성에 관하여

동계종양메스-A에 대한 투여량 30mg/kg 경구투약에서의 효과는 다음 제7표와 같다.

[제 7표]

(2) 면역 조절활성에 관하여

(가) 카본 클리아란스테스트(CCT)

담암새앙쥐를 사용하여 투여량 30mg/kg 복강투여한 효과는 다음 제8표와 같다.

[제 8표]

(나)플라이크 훠어밍 셀(PFC)

정상적 새앙쥐를 사용하여 투여량 30mg/kg 복강투여로 4일만에 양적혈구로 감작한 경우의 결과는 다음의 제9표와 같다.

[제 9표]

(다) 지연형 피부반응(DHR)

(Delayed type hypessensitivity reaction (DHR)

담암새앙쥐를 사용하고, 투여량 30mg/kg 복강투여에서의 결과는 다음 표와 같다.

[제 10표]

(3)지연형 피부반응(DHR)

담암새앙쥐를 사용하여 투여량 30mg/kg 복강투여에서의 결과는 아래 제11표와 같다.

[제 11표]

또한 감염 1일후에 30mg/kg를 피하투여했을 경우의 방어활성은 제12표에 표시하는 바와 같다.

[제 12표]

(4) 종양회저인자의 유도활성

(가) L-929세포에 대한 인비트로시토디알 활성에 관하여,

750kg의 RIN이 유도체로서 정맥투입되었을 때의 L-929에 대한 시토디알 세균활성은 하기 제13표에 표시되어있다.

[제 13표]

(나) 메스-A 고형종양에 대한 회사활성

출혈회저(hemorrhagic necrosis)는 (가)항에서 마련된 활성화된 혈청이 주입된 모든 담종양새앙쥐에서 관찰되었다.

(다) 담종양새앙쥐에 있어서의 종양회저인자의 내성적 유도.

메스-A를 지니는 새앙쥐에세 지모산 A 3g이 주입된 1주일후에 RIN 물질을 각 획분의 1mg이 주입되었을 때, 별개의 출혈회저가 관찰되었고 종양의 트기는 각 획분의 주입후 1주일이내에 모든 실험군 새앙쥐에서 종양의 성장이 억제되었다.

Claims

글루코오스를 유일한 구성성분으로하고 α결합만으로 형성되고 하기특징을 가지는 신규 다당체 RIN 물질의 제조방법.

(1) 반복단위

(단 G는 α-D-글루코피라노실기를 표시하고 n+n'=4이다)

(2) 투석막을 통과하지 않는다.

(3) 알코올, 아세톤, 헥산, 벤젠, 초산에틸, 4염화탄소, 클로로훠름 및 에테르에 불용하고, 물, 훠름아미드 및 디메틸슬훠시드에 가용이다.

(4) 1%수용액은 중성이다.

(5) 소량의 무기질(Si, P, K, Na, Ca, Mg, Cl등)을 결합상태에서 함유한다.

(6) 비선광도
=+142°-145°(H₂O)

(7) 융점 : 명확한 융점을 표시하지 않고 220℃에서 갈변하고, 280℃에 흑변하여 탄화된다.

(8) 제1도에 표시하는 것은 자외부 흡수스펙트럼을 표시한다.

(9) 제2도에 표시하는 것은 적외부 흡수 스펙트럼을 표시한다.

(10) 제3도에 표시하는 것은¹³C-NMR 스펙트럼을 표시하는데 하기의 것을 포함한다. 쌀겨를 상술한 다당체 RIN 물질을 추출하기 위하여 열수처리 하고 α-아밀라아제의/또는 프로티나아제와 함께 전분과/혹은 단백질을 제거하기 위하여 RIN 물질을 함유하는 추출물이 처리되고, 극성유기용매 또는 염석제를 침전물로서의 RIN 물질을 다시 찾기 위하여 RIN 물질을 함유하는 추출물에 첨가하고, 침전물을 물에서 용해하고 이와같이 얻은 RIN 물질을 포함하는 용액을 울트라 여과 또는 겔여과 또는 유수에 대한 투석에 의하여 처리하고, 상술한 RIN 물질을 함유하는 용액은 상술한 음이온 교환체에 흡착되어 있지 않는 획분(fraction)을 얻기 위하여 음이온 교환체로 처리되고, 상술한 음이온 교한체로 처리된 RIN 물질을 함유하는 용액으로부터 RIN 물질을 백색분말을 다시 찾는 과정을 포함한다.
청구범위 제1항에 있어서, 극성유기용매, 메타노올, 에타노올, 프로파노올 및 아세톤으로 형성되는 그룹에서 선정되는 다당체 RIN의 제조방법.
청구범위 제1항에 있어서, 염석은 염화나트륨, 유산암모늄 및 염화카륨을 포함하는 그룹에서 선택되는 화합물인 신규다당체 RIN 물질의 제조방법.
청구범위 제1항에 있어서, 흡착되어 있지않는 상술한 RIN 물질용액을 염화나트륨(NaCl)이 0.05N내지 0.4N이 되도록 전해질 수용액으로 당해 음이온 교환체로 담겨진 컬럼으로부터 용리(dtuting)에 의하여 실시되는 음이온 교환체에 의한 처리를 포함하는 신규 RIN 물질의 제조방법.
청구범위 제1항에 있어서, 상술한 RIN 물질 함유 용액에 음이온 교환체를 첨가하고 그 결과로 얻어진 혼합물을 1~2시간 동안 교반하고, 상술한 음이온 교한체에 흡착되어 있지 않는 용액을 제거한 후에 염화나트륨이 0.05N내지 0.4N인 것과 같은 전해질 수용액으로 RIN 물질 함유 용액을 용리에 의하여 실시되는 음이온 교환체에 의한 처리가 포함되는 신규 RIN 물질이 제조방법.
청구범위 제1항에 있어서, RIN 물질을 침전시키기 위하여 RIN 물질을 함유하는 용액을 동결건조 또는 분무건조하거나 혹은 극성유기용매에 의하여 실시되는 RIN 물질의 재회수과정을 포함하는 신규다당체의 제조방법.