JPS59170017A - 新規多糖体ｒｄｐ物質，その製造法およびそれを有効成分とする抗腫瘍剤、免疫調節剤および感染症予防治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規多糖体ＲＤＰ物質、その製造法およびそれ
を有効成分とする抗層ｉ剤、免疫調節剤および感染症予
防治療剤に関し、詳しくは優れたわ゛し肺瘍活性、免疫
調節活性および感染防御活性をイ１する新規多糖体ＲＤ
Ｐ物質と、米糠を原料として当該物質を抽出、精製する
当該物ノαの製活法に関する。

かつて、穀粒、豆粒等あるいにこれらの表層部を原料と
１−て生理活性を有する物質を製造する方法が提案され
ているが、これらの方法は収得爪か非常に少ない、毒性
がみられる等の問題点がある。

本発明はこれらの問題点を解消すべく鋭意研究を続けた
結果なされたものである。

本発明の多糖体ＲＤｐ物質は米糠を熱水処理し、て得ら
れる抽出液に極性有機溶媒を加えるが、あるいｄ、塩析
、剤を加え、生じだ沈でんを分取したのち水に溶解し、
除蛋白操作、必要に応じて精製処理。

粉末化処理を行なうことＫよって製造することができる
。

本発明に用いられる原料米糠は通常の精米において発生
する米糠であり、当該米糠の発生源である玄米の品種、
産地および精白歩留等を問わないが、この原料米糠から
の多糖体ＲＤＰ物質の抽出。

精製に先立って当該原料中′に混在する砕米等は−ｒｉ
Ｊ及的に除去し、洗浄することが望ましい。また、米糠
油を抽出した後の残液である脱脂糠等のように、他の目
的に使用された後の米糠であっても本発明に使用するこ
とができる。

米糠の抽出液は、米糠を熱水処理することにより得られ
る。熱水処理は細かく粉砕した米糠に対し約５〜１０倍
量（重量）の蒸留水または精製水をカロえ、ステンレス
タンク、ホーロー引きタンク。

ガラス裂タンク、流通式の管状抽出装置等の容器あるい
はこれらの耐圧性容器を用いて攪拌し、または攪拌しな
いで０〜１５に９／ｃｎｔ、好ましくけＤ〜５．０　ｋ
ｇ　／　ｃｒｌ　ｔ７）圧力、７０〜２００’Ｃ，好ま
しくは１００〜１５０’Ｃの温度で１ｏＯＪ５至２４時
間、好ましくは０．５〜５時間攪拌しながら抽出を行な
う。実用上はｏ　Ｑ　３．　Ｏｋｇ　／　ｄ　ノ圧カ、
１００〜１４０℃の温度で１〜５時ｆｆ１Ｊの熱水処理
が適当である。

なお、該処理に先立って、米糠は水洗後、酢１νｘ　チ
ル＋　四ｊ４化炭ＩＳ？　＋クロロボルム、エーテル。

ｎ−へキサン、べ〉セン２石油エーテル、アセトン等の
有機溶媒によって脂溶性区分の除゛去を行なうことが望
ましい。

前記熱水処理にょリイ柘られた抽出液は濾過あるいは遠
心分離等の操作によって固ル分と分離し、必要に応じて
適当な手段、たとえば減圧濃縮、限外濾過等の手段を単
独もしくは組合せて？′］′ない適当量まで濃縮する。

この抽出液に対して水に可溶な極性有機溶媒もしくは塩
析剤を加え、生じた沈でんを分取することによって多糖
体ＲＤＰ物質を含む両分を得ることができる。ここで用
いる極性有機溶媒としては、ｆｖニー　トエＬＪメタノ
ール、エタノール、プロパツール。

アセトン等がある。極性有機溶媒の使用量は抽出液中に
おける目的物質の含有量等を考慮して決定するが、エタ
ノールを用いる場合を例処すると、エタノール濃度が５
０〜５０％（Ｖ／Ｖ）になるように添加すればよい。な
お、生じた沈でんは前記エタノール等の有機溶媒で洗浄
することが好ましい。一方、塩析剤としては塩化ナトリ
ウム、硫酸アソモニウム、４７′＃−一　　−塩化カリ
ウム等があり、通常は熱水抽出液に対し塩析剤が飽和度
０．５〜１になるまで加えて沈でんを生成せしめる。

本発明では、極性有機溶媒もしくは塩析剤を熱水抽出液
に加える前あるいは上記の如くこれら物質を添加して沈
でんを生成せしめ、次いで水に溶１１ＩＩ（シた後に、
除蛋白処理、必要に応じて精製処理および粉末化処理を
単独であるいは適宜糾合せて行なうことができる。除蛋
白処理や精製処理としては種々の操作を適用することが
できる。たとえば多糖体ＲＤＰ物質を含有する溶液に澱
粉分解酵素および／または蛋白分解酵素を作用させて混
在している澱粉、蛋白質などの不純物を低分子化する。

低分子化されたものは後の精製工程で除去される。

酵素は任意のものを使用することができ、たとえばα−
アミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼなどの種々
のアミラーゼ、パパイン、ペプシン。

トリプシン、プロナーゼなどの種々のプロテアーゼや必
要ならば他の酵素も任意に使用できる。酵素処理は、好
ましくは酵素を基質の１／１０００〜１１５００［］の
割合で添加し、０．５〜２４時間、好ましくは１〜１５
時間行なう。

他の除蛋白処理および精製処理として、前記多糖体ＲＤ
Ｐ物質含有水洛液に氷酢酸、硫酸、塩酸。

タンニン酸、トリクロル酢酸などの無機酸あるいは有機
酸をＱ、１〜１０％、好ましくは３〜５％程度加え、沈
でんが生成したならば濾過、遠心分離等の操作によシ除
き、続いて残存する酸、力１上櫛イオンおよび低分子区
分を流水または蒸留水中でセロフアシ膜、コロジオン膜
等の透析膜にて１〜６日透析する方法、ダウエックス、
アンバーライト。

デュオライト、ダイヤイオン等のカチオ〉、アニオン交
換樹脂を用いるイオン交換処理方法、分画分子量ｉｏ、
ｏｏｏ〜１００，０００の膜を使用する限外濾過方法、
ゲル濾過、遠心分離、活性炭処理、濃縮等を単独である
いは組み合わせて適用して分画除去する。

上記したプロテアーゼまだは酸処理により多糖体ＲＤＰ
物質に夾雑した蛋白質の大部分は除去されるが、一部多
糖体ＲＤＰ物質に化学的に結合した蛋白質は完全には除
去されない場合がある。その場合はさらにセバーグ法等
の除蛋白法を使用することにより完全除蛋白を行なうこ
とができる。

上記した有機溶媒による洗浄、酵素処理、除蛋白、イオ
ン交換処理、限外濾過、ゲル濾過、遠心分離、活性炭処
理および濃縮等の精製処理は、その操作順序２組み合わ
せ方などに制限はなく必要に応じて単独もしくは２種以
上を組み合わせて適用すればよい。

前記の操作により精製された高分子の多糖体ＲＤＰ物質
を含む水溶液を凍結乾燥、噴輪乾燥、極性有機溶媒によ
る沈でんなどを行なって白色の粉末状とすることができ
る。

このようにして得られた多糖体ＲＤＰ物質は次のような
理化学的性質を有している。透Ｍｒ膜を通過せず、有機
酸または有機溶媒、たとえばアルコール（メタノール、
エタノール、プロパツール、ブタ／−ル等）、ア七トン
、ヘキサン、べ〉ゼン。

酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、リグロイン。

四塩化炭素、クロロホルム、エーテル等に不溶であるが
、水には可溶である。また、本物質の１％水溶液の１）
Ｈは中性である。本物質は一定の融点を示さず、２２０
°Ｃで褐変し、２８０　”Ｃで黒変して炭化が起る。後
記製造例１で代表される本物質の元素分析の結果は、炭
素３８．１０％、水素６，２７％、酸素５０．７５％、
無機質４，９０％であった。

また、本発明の方法により得た物質の１％水溶液の呈色
反応はモーリッシュ反応、アンスロン硫ｍ反応、トリプ
トファン硫酸反応、システィン硫酸反応、クロモトロー
プ硫酸反応、フェノール硫酸反応、カルバゾール硫酸反
応がいずれも陽性であす、ビューレット反応、ニンヒド
リン反応、ローリーフオーリ〉反応、エルソ〉モルガン
反応、ヨード反応は陰性である。

また、後記製造列１で代表される本物質の比旋光度は〔
α）”＝＋１４２°〜＋１４５°（Ｈ２Ｏ）であった。

次に、無機質については主としてＳｉ、Ｐ。

Ｋ、Ｎａ、Ｏａ、Ｍｇなどが含まれていることを確認し
た。これら元素はＲＤＰ物質をセファローズｃＬ−６Ｂ
　（ファルマシア製）にてゲル濾過したとき、糖成分と
挙動を共にし、ボイドボリュームに現われることから考
えて、無機質として単独でＲＤＰ物質に夾雑しているの
ではなく、ＲＤＰ物質の骨格成分に化学的に結合して存
在しているものと推定される。

さらに、本物質の１％水溶液に１Ｎ硫酸になるように硫
酸を加え、１００°Ｃで６時間加水分解を行ない、次い
で炭酸バリウムを加えて中和した後の上清ｉｉｄモーリ
ッシュ反応、アンスロン硫酸反応、トリプトファン硫酸
反応、システィン硫酸反応。

クロモトロープ硫酸反応等はいずれも陽性であった。ビ
ューレット反応、ニンヒＦす〉反応、ローリ−７オ一リ
ン反応等は陰性であった。一方、当該分解液の薄層クロ
マトグラフィーを行なうと、必ずグルコースのみを検出
した。

また、ＲＤＰ物質の硫酸およびギ酸による完全加水分解
物の薄層クロマトグラフィーを下記の４種類の展開溶媒
で展開したところ、いずれもグルコース以外の糖スポッ
トを検出しないので、本物質はグルコースのみを構盛糖
とする多糖であることが判明した。

（１１酢酸エチル：メタノール：酢酸：水６５　　　：
　　　１５　　　：　　１ｏ：ｉ。

（２）酢酸エチル：イソプロノシール：水６５　　　　
：　　　　２５　　　　：１２（３）インカバノール：
　ピリジン　：　水　：酢酸８　　　　　：　　　　８
　　　　　：４：１（４１ｎ−ブタノール：　ピリジン
　：　水６　　　　：　　　　４　　　　：５ さらに１本物質は第１図に示す紫外部吸収スペクトル、
第２図に示す赤外部吸収スペクトルおよび第３図に示す
１３０−　ＮＭＲスペクトルを示す。これらのスペクト
ルの解析と比旋光度の結果から、α結合の存在が推定さ
れる。また、本物質が透析膜全通過せず、セファローズ
０Ｌ−６Ｂ（７アルマシア製）のゲル濾過でボイドボリ
ュームに現われる点から、本物質はグルコースを唯一の
糖構成成分とする多糖体であると認められる。

また、ＲＤＰ物質は過ヨウ素酸酸化実験によりグルコー
ス残基１個当シ約１．７モルの過ヨウ素酸を消費し、約
０．８５モルのギ酸を生ずること、スミス分解を行なっ
た溶液をペーパークロマトグラフィーで分析すると多量
のグリセリンを検出すること、メチル化糖のペーパーク
ロマトグラムがら少量のテトラメチルグルコース、ジメ
チルグルコースの他に多量の２．３．４−）ジメチルグ
ルコースを検出すること等の実験結果から考えてα−１
゜６グルコシド結合を主体とする多糖であることが推定
される。さらに、ＲＤＰ物質を１３０−　ＮＭＲで解析
しだスペクトルから本物質はα−１，６グルコシド結合
が主体であるが、少量のα−１，４結合をも含有し、そ
の存在比は約１０対１であることが判明した。

以上の解析結果を総合すると、ＲＤＰ物質の構造は、α
−１，６グルコシド結合を主骨格とし、約１０個のα−
１，６結合で結ばれたグルコース残基に１個の割合でα
−１，４結合の枝分かれを持った多糖で、さらにリン酸
基を介して各種の無機元素を結合させた新規な構造を有
していると考えられる。

本発明によシ得られる多糖体ＲＤＰ物質は、抗腫瘍活性
、免疫調節活性、感染防御活性等の種々の生理活性を有
していることが判明した。以下にそれぞれの生理活性に
ついてその検定法および後述する製造例１で得られた多
糖体ＲＤＰ物質を投与した実験での検定結果について詳
述する。

（１）抗腫瘍活性について （イ）同系腫瘍メス−ＡＫ対するＲＤＰ物質の腹腔投与
の効果 ６週令メス、平均体重２０９−のＢＡＬＥ／Ｃ−ＣＲＪ
マウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細
胞メス−Ａをマウス１匹当りｌＸ１０５個を腹腔内に移
植し、対照群２０匹（１群）。

試験許容１０匹（３群）の計４群に分けた。癌細胞を移
植した翌日から連続５日間、試験群には生理食塩水に溶
解したＲＤＰ物質をマウス１匹の体重１ゆ当シ各１０，
５０，１００ηをｏ、　ｉｍｌずつ腹腔内に投与し、対
照群には同様にして生理食塩水のみを投与した。以後、
生存日数をｉｍｌ察し、延命効果を次式によシ算出した
。

（ロ）同慕腫瘍メス−Ａに対するＲＤＰ物質の経口投与
の効果 ６週令メス、平均体重２０１のＢｈｘ、Ｂ／ｃ−ｃＲｘ
マウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細
胞メス−Ａをマウス１匹当シｌＸ１０４個を右腋下皮下
に移植し、対照群２０匹（１群）。

試験許容１０匹（３群）の計４群に分けた。癌細胞を移
植した翌日から連続１０日間、試験８′Ｉ・には生理食
塩水に溶解したＲＤＰ物賀をマウス１匹の体重１ｋｇ当
シ各１０．３０，１００嘘をａ２−ずつ経ロゾ〉デを用
いて胃内に投与し、対照群には同様にして生理食塩水の
みを投与した。癌細胞を移植してから６５日後に各マウ
スを層殺し、増殖した腫瘍を切り出し重Ｍを測定した。

なお、阻止率は次式によ！ｌｌ算出した。

上記（イ）、（ロ）の方法によシ検定したＲＤＰ物質の
抗腫瘍効果は下表の通シであった。

「 − 」１表より明らかなように、腹腔投与、経口投与ともに
マウス体重１　ｋｇ当り３０１９付近を至適投与量とし
てＲＤＰ物質は強い抗腫瘍活性を有していることが判明
した。

その他にＲＤＰ物質は同系腫瘍ルイス肺癌、メラノーマ
Ｂ−１６．同種腫瘍ザルコーマ１８０゜エールリッヒ腫
瘍等に対し、投与量１０〜１００１１１　／　ｋｇの範
囲で腹腔投与まだは経口投与により腫瘍阻止率′５０〜
７０％の効果が確認されでおり後述するように毒性が全
く見られない９点とも合わせて極めて有効な抗腫瘍剤と
なりうると考えられる。

（２）免疫調節活性について （イ）カーボンクリアランステスト　（ＯＣＴ　）本法
は免疫調節作用のうちマクロファージの食細胞活性の増
強効果について調べるものである。

４週令メス、平均体重２０１の工ＯＲ−ＣＲＪマウス１
群６匹に、生理食塩水に溶解したＲＤＰ物質を２日間腹
腔投与しく対照群は生理食塩水のみを投与）、３日目に
カーボン液（ペリカン製黒インク（商品名：ファウント
　インディア）を生理食塩水で５倍に希釈した液）をマ
ウス尾静脈より０．２５　ｄ注入し、注入直後および１
０分後に眼窩静脈叢より０．０２５　ｍ採血し、５，５
ｄの００１モル炭酸ナトリウム溶液に懸濁溶解させ、６
５０　ｎｍ　の吸光度（ＯＤ６ａｏ）ｋ測定し、血中カ
ーボン濃度の減少率を調べた。効果は次式に示す３゛食
係数で表わしだ。

なお、担癌マウスについて（はＲＤＰ物質の投与開始よ
り７日前にザルコーマ１８０細胞を１×１０７個大腿部
筋肉に移植し、以下同様に試験した。結果は下表の通り
であり、正常マウス。

担癌マウスともにＲＤＰ物質の１０〜３０　ｍ９　／　
ｋｇ、特に６ｏｉｙ／ｋｇの投与によシマウスの細網内
皮系の機能が冗進し、マクロファージの貴食能が大幅に
増強されていることが判明した。

（ロ）プラーク７オーミングセル法　（ＰｌｉＩＣ）本
法は免疫調節作用のうち、宿主のＢ細胞の賦活による抗
体産生能の増強効果を調べるものである。

４週令メス、平均体重２０７７’の工ＯＲ−ＣＲＪマウ
ス１ｎ６匹に、生理食塩水に溶解したＦＤＰ物質を６日
間連続して腹腔内に投与しく対照群は生理食塩水のみを
投与）、４日目と１１１日目それぞれ羊赤血球４Ｘ１０
８個を尾静脈よシ注入感作せしめ、その４日後にカニン
ガムの方法でマウス杵細胞のプラーク形成能を測定した
。

結果は下表の通シであり、ＦＤＰ物質は１０〜１００ｍ
ｇ／ｋｇの投与により抗体産生能を著しく増強している
ことが示された。

（ハ）遅延型皮膚反応法（ＤＩＲ） 本法は免疫調節作用のうち宿主のＴ　２４１１胞の賦活
による細胞性免疫の作用の増強効果を調べるものである
。

８週令メス、平均体重２７７−のＴ、ＣｊＲ−ＯＲＪマ
ウス１群６匹に、生理食塩水に溶解しだＲＤＰ物質を８
日間連続して経口投与しく対照群は生理食塩水のみを投
与）、投薬開始後４日目にマウスのカｊ毛腹部に５％塩
化ピクリルエタノール溶液を塗布して一次感作し、１１
日０に１％ビクリルオリーブ油溶液をマウス両耳の表裏
に塗布１−で二次感作し、その２４時間後に耳厚の増加
をゲージで測定し、塗布前の耳厚との差から耳厚の増加
Ｉ＆＃、（ｒ−みｒ＝。一方、担癌マウスについてはザ
ルコーマ１８０腹水型腫瘍細胞をｌＸ１０５個を投薬開
始前日にマウス腹腔内に移植【２、以下同様に試験した
。

結果は下表の通りであり、ＲＤＰ物質は試験した６０〜
５００ｔｎｇ／ｋｇの経口投与にょシ、正常マウス、担
癌マウスともに細胞性免疫能を著しく増強していること
が示された。

以上、（イ）、（ロ）、（ハ）の各免疫実験によりＲＤ
Ｐ物質はメカニズムの異なる免疫作用をそれぞれ顕著に
亢進させていることがわかった。免疫調節剤は一般には
生体の免疫機能が低下したり、異種抗原認識機能が弱い
場合などに使用され得ることから、特に微生物感染症や
悪性腫瘍の治療剤、治療補強剤または併用剤、予防剤あ
るいは術後回復促進剤としての薬剤用途が期待される。

以上の免疫賦活回復機能の他にも、免疫調節剤は異常に
元通した生体免疫反応を正常化し、だとえばリウマチ、
膠原病、アレルギー等の自己免疫疾患にも適用できる場
合が考えられる。

（３）感染防御活性について 生体の細菌による感染症に対する防御作用としては、侵
入細菌に対する抗体産生による、いわゆる体液性免疫作
用によるものと、マクロファージやＴ細胞が侵入細菌と
斗う、いわゆる細胞性免疫によるものがあることが知ら
れている。一般には生体はこれら異種細菌の侵入に対し
、ては充分な防御作用を持っているが、担癌状態、特に
癌の末期には著しく防御作用が低下することが知られて
おシ、通常宿主と共生している非病源菌によってさえ重
篤な結果を招来することが知られている。

そこでＲＤＰ物質がこれらの細菌の感染症に対して宿主
の防御活性を増強するかどうか、体液性免疫が関与する
といわれる代表的感染菌であるエシェリヒア・コリ　（
Ｅｓｃｈｅｒｉ、ｃｈｉａ　　ｃａｄｉ　）および細胞
性免疫が関与するといわれるリステリア・モノサイトゲ
ネス（Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｓ　）感染に対するＲＤＰ物質の効果を調べた。

７週令メス、平均体重２６？の工ＯＲ−ＯＲＪマウスを
１群２０匹ずつ用い、生理食塩水に溶解したＲＤＰ物質
を１０〜１００　ｚｇ／ｋｇ　（対照群は生理食塩水の
み）マウスの背中皮下に細菌感染６日前。

１日前に各１回投与した後、エシェリヒア・コリの場合
は２Ｘ１０’個を背中皮下に、リステリア・モノサイト
ゲネスの場合は２Ｘ１０７個を腹腔内に感染させ、それ
ぞれ１週間観察して、生残マウス数を比較した。防御効
果は次式によシ算出した。

結果は下表に示す通りであり、ＲＤＰ物質の１０〜１０
０■／ｋ１７の事前投与により、エシェリヒア・コリ感
染に対しては非常に強い防御作用が生じ、リステリア・
モノサイトゲネス感染に対しても有意な防御作用の増強
効果がみられた。

後述するように、ＦＩＤＰ物質は毒性か全く見られない
点とも合わせて、極めて有効な感染症予防治療剤となり
うると考えられる。

次に、ＲＤＰ物質の急性毒性について言及する。

５週令、ｔＸ（７）ＳＤ−ＯＲＪ　ラッ）　、体重１２
０〜１５゜７．１Ｍ８１０匹を用いてＲＤＰ物質の物理
的投与限界である１５Ｐ／ｋｇを投与し観察を続けたと
ころ、金的死亡しリがなく体重増加も対照と変わらず、
しかも外観上や剖検上も全く異常が認められなかった。

したがって、ＬＤ５０　＞　１５　ｇ−７ｋｇと考えら
れ、急性形性はないものと判断される。

このように優れた抗腫瘍活性、免疫調節活性。

感染防御活性を示す多糖体ＲＤＰ物質が比較的容易な操
作の組み合わせにより下記製造例に示されるように大量
に得られるので、米糠から生理活性多糖を工業的に製造
する技術上に与える効果は非常に犬なるものである。

さらにインターフェロン誘起能がみら汎ることカラヘル
ペス、イ〉フルエンザ等のウィルス性疾患に対する予防
治療効果が期待できる。

ＲＤＰ物質は経口的まだは非経口的に投与できるので、
極めて有用な抗腫瘍剤、免疫調節剤あるいは感染症予防
治療剤として期待される。

なお、実際の製剤化については、本物質を単独で、ある
いは賦形剤（水、生理食塩水、ポリエチレングリコール
、グリセロゼラチン、澱粉、デキス）　ＩＪン、乳糖な
ど）と組み合わせて水剤、丸剤。

錠剤、散剤、学則などの剤型にて製造することができる
。

次に、本物質の製造を以下の製造例によって説明する。

製造例１ 市販の米糠を用い篩で砕米等を除いだもの２５ｋｇに水
道水１２５ｔを加え、１２０°Ｃで１時間、その後さら
に１００°Ｃで５時間加熱し旦ＨＨ，拌しながら抽出を
行なった。

抽出液を洗過後、４０１に減圧濃縮し、水酸化ナトリウ
ムでｐＨを６．７とした後、５ｏｏｔｙのα−アミラー
ゼ（長瀬産業製）を加え、７０°Ｃで１時間酵素処理を
行４ｉつだ。反応後、１００°Ｃまで加熱し酵素を失活
させ、遠心分離により不溶物を除去し、最終濃度が６０
％（Ｖ／ｖ）となるようにエタノールを加えて、生じだ
沈でんを分離した。分離後、水に溶解せしめて不溶物を
除き、凍結乾燥を行なったところ、５０Ｂ？・の淡黄色
粉末を得た。

この淡黄色粉末４１を再度イオン交換水に溶かし、不溶
物を遠心分離で除去した後、セファローズＯＬ　６Ｂ　
（７アルマシア製）によりゲル濾過し、そのボイドボリ
ュームに溶出された画分を集めて凍結乾燥を行ない、１
ｆ／−の白色粉末を得た。これをさらに１００Ｈのイオ
ン交換水に溶解させ、クロロホルム２０ｍ１．］］１１
−ブタノール４ｍｌとともに分液濾斗を用いて６０分間
振とうし、低速で遠心すると水層とクロロホルム層との
間に変性蛋白γｆの白い層ができだ。水層部分を取り出
し、再び同比率のクロロホルムおよびｎ−ブタノールを
加えて振とうした。この操作を変性蛋白質の白い層が出
なくなるまで約３０回繰り返した後、水層部分を凍結乾
燥させてｓ　ｏ　ｏ　ｍｇの白色の除蛋白された粉末を
得た。

製造列２ 市販の米糠２５ｋｇをヘキサン１００ｔで還流脱脂した
のち乾燥した米糠を製造列１と同様の方法で抽出回収処
理をして淡黄色粉末４５０ｇ−を得た。

この粉末４ｇ−を用いて製造例１と同様の方法で処理し
て７５０■の白色粉末を得だ。

製造例３ 市販の脱脂糠３１ｑ）に水２０１を加え攪拌しなから１
２０°Ｃで２時間加圧加熱下で抽出した。抽出液を減圧
濃縮して得だ５ｔの濃縮液に結晶α−アミラーゼ（長瀬
産業製）０３１を加えて６０°Ｃで５時間保持した。し
かる後、１００℃に加温した後、遠心分離して上清４．
９ｔを得た。この上清にエタノールを加えてエタノール
濃度４０％トシ、生じた沈でんを分取した。次いでこれ
を凍結乾燥して淡黄褐色粉末８８ｙ−を得だ。

この粉末４１を用いて製造列１と同様に処理して７２０
　Ｎ９の白色粉末を得た。

製造例４ 市販の米糠２０ｋｇを３０メツシユの篩でふるって砕米
等の夾雑物を除去した後、イオン交換樹脂で処理した水
道水１００ｔで洗浄した。次いで、洗浄した米糠に蒸留
水５ａｔを加え攪拌しながら１１０℃で６時間加圧加熱
下で抽出した後、濾過した。得られた濾液を減圧濃縮し
、さらに遠心分離して上清１０ｔを得だ。この□上清に
結晶α−アミラーゼ２５０１９を添加し、６５°Ｃで２
４時間作用せしめた後、１００℃に加温した。次いでエ
フノール濃度３０％になるようにエタノールを加え生じ
た沈でんを遠心分離によって採取した。・この沈でんに
水３ｔを加えて溶解した後、遠心分離を行なって上清を
得た。この上清を１ｔとなるまで減圧濃縮し、さらに遠
心分離して上清を得、これを流水に対して２日間透析し
、遠心分離を行なって上清１ｔを得た。この上清１ｔに
クロロホルム２００＋＋＋Ｊ、ｎ−ブタノール４（ｌａ
／をｊＸＩ（え、以下製造例１と同様の方法で除蛋白処
理および凍結乾燥処理を行なって白色粉末４０２ｙ−を
得た。

製造例５ 製造例４で透析後遠心分離して得られた上清１ｔを陽イ
オ〉交換ゲルである０Ｍセファローズ（ファルマシア製
）および陰イオン交換ゲルであるＤｌＣＡＥ　セファロ
ーズ（ファルマシア製）で順次イオン交換処理し、非吸
着部を集め１ｔに濃縮した後、製造列４と同様の方法で
除蛋白処理および凍結乾燥処理を行なって白色粉末６５
８１を得た。

製造例６ 製造例４で透析後遠心分離して得られた上清１ｔに活性
炭１０１を加え、５０分後に遠心分離を行ない上清を得
た。この上清を製造例４と同様の方法で除蛋白処理およ
び凍結乾燥処理を行なって白色粉末６６５１を得だ。

製造例７ 製造例４で透析後遠心分離して得られた上清１ｔのうち
２０＋＋ｌｔをセファローズ０Ｌ−６Ｂ（ファルマシア
製）でゲル濾過し、そのボイドボリューム画分を集めて
１００ｔｎｌとした。この液を製造例１と同様に除蛋白
処理および凍結乾燥処理を行なって白色粉末７０１を得
た。

製造例８ 製造例１でα−アミラーゼ処理物をエタノール沈でんさ
せて得られた沈でん物を再び１ｏｔの水に溶解し、分画
分子量８万のウルトラフィルター膜を用いて低分子画分
を除去すると同時に６ｔになるまで濃縮し、生じた沈で
んを遠心分離しで除去し２．８ｔの上清を得た。この上
清を製造例１と同様に除蛋白処理および凍結乾燥処理を
行なって４００ｙ−の白色粉末を得た。

製造ｅ２す９ 製造例１でα−アミラーゼ処理し１００°Ｃで１時間加
熱して酵素を失活させた液に、最終濃度４０％（Ｖ／ｌ
となるようにアセト〉を加え、生じた沈でんを’ｒｏｔ
の水に溶解した。以後、製造例８におけるウルトラフィ
ルター膜を用いた処理以後の工程を行ない４１２ｚの白
色粉末を得）ｔ。

製造例１０ 製造例１でα−アミラーゼ処坤し１００℃で１時間加熱
して酵素を失活させた液に、飽和度７０％になるように
硫酸アンモニウムを加えて塩析を行ない、生じた沈でん
を遠心分熱で集め５ｔの水に溶解し、流水に対して２日
間透析４曇を行なった。この透析内液にトリクロル酢酸
を濃度７％になるように添加して沈でんを生ぜしめ、生
じた沈でんを遠心分離で除去し、上清を再び流水に対し
て２日間透析し、透析内液を凍結乾燥して淡黄色粉末５
０３１を得た。この粉末４１をイオン交換水に溶解し、
セファローズ０Ｌ−６Ｂ　（ファルマシア製）のカラム
でゲル濾過を行ない、そのボイドボリューム画分を集め
て凍結乾燥し白色粉±１．５　ｆ！−を得た。

製造的１１ 製造列１でα−アミラーゼ処理を行なった液をそのまま
４０℃まで下げ、蛋白分解酵素（プロナーゼＥ、科研化
学製）６［］Ｏｙ＋ｇを加えて２４時間反応させた。反
応液を１００℃で１時間加熱して酵素を失活させた後、
遠心分離して不溶物を除去した上清に、最終濃度３０％
（Ｖ／Ｖ）となるようにエタノールを加え、生じた沈で
んを遠心分離で集め、１０ｔの水に溶解した。以後、製
造し１１８におけるウルトラフィルター膜を用いた処理
以後の工程を行ない白色粉末４１５ｇ−を得た。

製造例１２ 製造例８と同様の工程を経て得られたウルトラフィルタ
ー膜処理上清３ｔに製造例１と同様の比率でクロロホル
ム、ｎ−ブタノールを加えて除蛋白操作を行ない、水溶
部を＠霧乾燥して４２ｏｚの白色粉末を得た。

製造例１６ 製造例１２で除蛋白操作を行なって得られた水溶部に最
終濃ｒ！Ｌ４０％（Ｖ／Ｖ）となるようにエタノールを
加え、生じた沈でんを遠心分離で集め、さらに６回エタ
ノールで洗浄脱水した後、真空乾燥して白色粉末４０５
１を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は生理活性多糖体Ｉ’ｌＤＰ物質の紫外部吸ｊ１
ｙスペクトルの特性吸収図であり、第２図は同じく赤外
部吸収スペクトルの特性吸収図であり、第６図は同じ（
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの特性吸収図である。 特許出願人　サッポロビール株式会社 同　　　ダイセル化学工業株式会社 同　　　　　伊　　藤　　悦　　男 浦添市字沢祇１４０３−１ −Ｔ′続補正１１：（自発） 昭和５９年２月１５１１ 特許庁長官　若杉和人　殿 １、Ｔｉ件の表示 特願昭５８−４／１３１６ ２、発明の名称 新規多槻体ＲＤ　Ｐ物質、その製造法およびそれを有効
成分とする抗腫瘍剤、免疫調節剤および感染症ｒ防治療
剤 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 （２１９）リーノボ１フヒール株式会社（２！１０）ダ
イセル化″ン−Ｔ業株式会社伊藤悦男 ４、代理人 ■】０４ 東京都中央区京橋１丁−目１番１０号 西勘ビル５階 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明のｌＩ’ＪＩ６、補正の内容 （１）　　明１１１１　Ｆ＋第１１１８１ｊｌ−Ｉ　Ｑ
）ｌ除去する。」の後に１さらに、酸や酵素等による低
分子化処理を適用することもできる。１を加入する。 （２）　　同第１６頁５〜１１行目の「以上の解析結果
を・・・・・考えられ、る。」を削除する。 （３）　　同第２１頁の表の１一段の「相癌マウス」を
Ｉ’　ｌｊｊ　ｌ、９＋マウス」に、ｉ１市する。 （以−に）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　透析膜を通過せず、アルコール、アセトン。 ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシ
   ド、リグロイン、四塩化炭素、クロロホルムおよびエー
   テルに不溶であり、水には可溶であり、１％水溶液は中
   性を示し、５％以下の無機質を含有し、モーリッシュ反
   応、了〉スロン硫酸反応、トリプトファン硫酸反応、シ
   スティン硫酸反応、クロモトロープ硫酸反応、フェノー
   ル硫酸反応、カルバゾール硫酸反応が陽性であシ、ビュ
   ーレット反応、ニンヒドリン反応、′ローリー７オーリ
   ン反応、エルソンモルガン反応、ヨード反応が陰性であ
   り、第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示し、第２図
   に示す成分とし、α−１，６グルコシド結合を主骨格と
   し、α−１，４グルコシド結合を有する新規多糖体ＲＤ
   Ｐ物質。 λ　米糠を熱水処理して得られる抽出液に極性有機溶媒
   または塩析剤を力ｌえ、生じた沈でんを分取し１、除蛋
   白操作を行ない、必要に応じて精製処理を行なうことを
   特徴とする新規多糖体ＲＤＰ物質の製造法。 五　極性有機溶媒がメタノール、エタノール。 プロパツールおよびアセトンのいずれかである特許請求
   の範囲第２項記載の新規多糖体ＲＤＰ物質の製造法。 ４、　　塩析剤が塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムお
   よび塩化カリウムのいずれかである特許請求の範囲第２
   項記載の新規多糖体ＲＤＰ物質の製造法。 ′５．　　除蛋白操作が酵素処理法、酸処理法および七
   バーグ法のいずれかである特許請求の範囲第２項記載の
   新規多糖体ＲＤＰ物質の製造法０６　精製処理が透析膜
   による透析、カチオンおよびアニオン交換樹脂を用いる
   イオン交換処理。 限外濾過膜による限外濾過およびゲル濾過を単独でもし
   くは２以上を組み合わせて行なうものである特許請求の
   範囲第２項記１１＆の新規多糖体ＲＤＩＰ　＊質の製造
   法。 ７、透析膜を通過せず、アルコール、アセトン。 ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシ
   ド、リグロイン、四塩化炭素、クロロホルムおよびエー
   テルに不溶であり、水には可溶であり、１％水溶液は中
   性を示し、５％以下の無機質を含有し、モーリッシュ反
   応、アンスロン硫酸反応、トリプトファン硫酸反応、シ
   スティン硫酸反応、クロモトロープ硫酸反応、フェノ　
   ／’硫Ｍ反応、カルバゾール硫酸反応が陽性であり、ビ
   ューレット反応、ニンヒドリン反応、ローリ−フォーリ
   ン反応、エルソンモルガン反応、ヨード反応が陰性であ
   り、第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示し、第２図
   に示す成分とし、α−１，６グルコシト°結合を主骨格
   とし、α−１，４グルコシド結合をイ１する新規多糖体
   ＲＤＰ物質まだは該物質と射」斉１上許芥される賦形剤
   より実質的になるものをイｊ効成分とする抗腫瘍剤。 ａ　透析膜を通過せず、アルコール、アセトン。 ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシ
   ド、リグロイン、四塩化炭素、クロロホルムおよびエー
   テルに不溶であり、水にＩ′ｉ可溶であシ、１％水溶液
   は中性を示し、５％以下の無機質を含有し、モーリッシ
   ュ反応、アンスロン硫酸反応、トリプトファン硫酸反応
   、システィン硫酸反応、クロモトロープ硫酸反応、フェ
   ノール硫酸反応、カルバゾール硫酸反応が陽顎であり、
   ビューレット反応、ニンヒドリン反応、ローリ−７オ一
   リン反ｆ６．エルソンモルカン反応、ヨード反応が陰性
   であシ、第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示し、第
   ２図に示す成分とし、α−１，６グルコシド結合を主骨
   格としα−１，４グルコシド結合を有する新規多糖体Ｆ
   ＤＰ物質また目、該物質と製剤上許容される賦形剤より
   実質的如なるものを有効成分とする免疫調節剤。 ９、透析膜を通過せず、アルコール、アセトン。 ヘキサン、ベンゼ＞、酢酸エチル、ジメチルスルホキシ
   ド、リダロイ〉、四塩化炭素、クロロホルムおよびエー
   テルに不溶であり、水には”１溶であり、１％水溶液は
   中性を示し、５％以下の無機質を含有し、モーリッシュ
   反応、アンスロン硫酸反応、トリプトファン硫酸反応ｒ
   システィ〉硫酸反応、クロモトロープ硫酸反応、フェノ
   ール硫酸反応、カルバゾール硫酸反応が陽性であり、ビ
   ューレット反応、ニンヒドリン反応、ローリ−フォーリ
   ン反応、エルソンモルガン反ｌ芯、ヨード反応が陰性で
   あシ、第１図に示す紫外部吸収スペクトルを示し７、第
   ２図に示す成分とし、α−１，６グルコシド結合を主骨
   格としα−１，４グルコシド結合を有する新規多糖体Ｂ
   ＤＰ物質または該物質と製剤上許容される賦形剤より実
   質的になるものを不動成分とする感染症予防治療剤。