JP2001520019A - アロエからの免疫修飾性多糖類の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アロエから生物学的に活性な多糖類を分離及び調製するための迅速で効果的な方法を与える。本発明は、本発明の方法により製造された多糖類の活性混合物（ここでは「イミュノ−１０」として呼ぶ）を含む。本発明は、その多糖類を免疫刺激剤、免疫修飾剤、創傷治癒剤として用いることも含む。得られる免疫修飾複合体は、従来のアルコール沈澱方式を用いて分離したバルク炭水化物よりも一層安定で、一層大きな活性度を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、アロエからの多糖類を活性化及び精製するための方法に関する。詳
しくは、本発明は、アロエから免疫修飾活性を有する多糖類を分離する方法に関
する。本発明は、本発明の方法により製造された多糖類の活性混合物（今後「イ
ミュノ(Immuno)−１０」又は「イミュノ−１０多糖類」と呼ぶ）を含む。本発明
は、それら多糖類を免疫刺激剤、免疫修飾剤及び創傷治癒剤として使用すること
も含む。

【０００２】 （背景技術） アロエは多くの生物学的に活性な物質を含む複雑な植物である〔コーエン(Coh
en）等、「創傷治癒／生化学的及び臨床的特徴」(Wound Healing/Biochemical a
nd Clinical Aspects)、第１版、ＷＢサウンダーズ(Saunders)、フィラデルフィ
ア（１９９２）〕。３００種以上のアロエの品種が知られており、それらの殆ど
がアフリカ原産である。研究により、生物学的に活性な物質はアロエの葉の三つ
の別々な部分、即ち葉の中心部、葉の堅い皮又は外皮の中に位置する透明ゲルフ
ィレット(gel fillet)、及び葉の堅い皮と内部ゲルフィレットとの間に位置する
維管束の内鞘細胞中に含まれているラテックスと呼ばれている黄色液体の中に存
在していることが示されている。歴史的には、アロエ生成物は火傷、炎症及び他
の創傷を処置するための外皮用薬として用いられてきた。これらの用途は、臨床
効果、特に抗炎症活性を有するアロエからの化合物を同定する膨大な研究を引き
起こしてきた〔例えば、グリンドレイ(Grindlay)、及びレイノルズ(Reynolds)、
J. of Ethnopharmacology, 16:117-151 (1986); ハート(Hart)等、J. of Ethnop
harmacology, 23:61-71 (1988)参照〕。これらの研究の結果として、抗腫瘍活性
、抗酸活性〔ヒラタ及びスガ、Z. Naturforsch, 32c:731-734 (1977)〕、抗糖尿
病活性、チロシナーゼ抑制活性〔ヤギ等、Planta medica, 515-517 (1987）〕、
及び酸化防止活性〔国際特許出願Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７ ４０４、１９９６年１２月１９日公開、公開番号ＷＯ ９６／４０１８２〕を含 めた種々の生物学的活性を有するアロエ化合物の膨大な報告が存在する。

【０００３】 アロエ生成物は免疫系を刺激することができることも報告されている。アロエ
が免疫系を刺激することができるのは、ゲル中に存在する多糖類に起因するもの
であるとされている〔例えば、デイ(Day）等、J. Am. Pharm. Assoc., 11:462〜
463 (1922);フラッグ(Flagg）、American Perfumes and Aromatics, 74:27-28,
61 (1959); ウォラー(Waller)等、Proc. Okla. Acad. Sci., 58:69-76 (1978); シュチャーブクヒン(Shcherbukhin)等、Applied Biochemistry & Microbiology,
15:892〜896 (1979); マンダル(Mandal)等、Carbohydrate Research, 86:247〜
257 (1980); マンダル等、Carbohydrate Research, 87:249〜256 (1980); ウィ ンターズ(Winters）等、Eco. Botany, 35:89〜95 (1981); ロブソン(Robson)等 、J. Burn Care Rehab., 3:157〜163 (1982);イワン(Ivan)等、Drug & Cosmetic
Ind., 52〜54, 105〜106 (1983);スモサーズ(Smothers)、Drug & Cosmetic Ind
., 40:77〜80 (1983);マンダル(Mandal)等、Indian J. of Chem., 22B:890〜893
(1983); ビルカス(Vilkas)等、Biochimie, 68:1123〜1127 (1986); ウォラー(W
aller)等、Cosmetic Toiletries Manufacturing Worldwide, 64〜80 (1994);マ クアナリー(McAnalley）等、米国特許第５，３０８，８３８号を参照〕。

【０００４】 アロエ生成物は、紫外線の有害な影響に対し皮膚を保護するため化粧品工業で
も広く用いられている〔グロリエ(Grollier)等、１９８７年４月７日発行、米国
特許第４，６５６，０２９号〕。皮膚を紫外線に慢性的に露出すると、人間及び
実験動物で皮膚癌を起こす。実験動物の皮膚を紫外線Ｂ（ＵＶＢ）放射線（２８
０〜３２０ｎｍ）に露出すると、皮膚免疫系の抑制を起こし、それがＵＶ誘発皮
膚癌、接触感作ハプテン及び種々の感染性微生物に対し、免疫反応を起こす能力
を損なう〔ストリックランド(Strickland)、J. Invest. Dermatol., 102:197-20
4 (1994)及びそこに引用された文献を参照〕。ストリックランド等による研究で
は、アロエ・ベラ(vera)ゲルを局部的に適用すると、ＵＶＢ露出により起こされ
た免疫系の抑制を減ずることが示されている〔ストリックランド、J. Invest. D
ermatol., 102:197〜204 (1994)〕。

【０００５】 自然のままの(未変性の,native)ゲルの免疫系の抑制を減ずる能力は非常に低 く、不規則であり、時間と共に低下する。一つの仮説は、ＵＶ−Ｂ保護因子がア
ロエ植物中に自然に存在する酵素によって加水分解され且つ（又は）細菌による
劣化を受けることである。従って、アロエから多糖類を分離することは、その免
疫修飾活性を保持するのに役立つものと思われる。しかし、アロエから多糖類を
バルク(bulk)分離するための従来法は、免疫修飾活性を効果的に保持させるもの
ではなかった。例えば、米国特許第４，９５７，９０７号、第４，９６６，８９
２号及び第５，３５６，８１１号明細書に記載されているこれらの方法は、長時
間（４〜２４時間）のアルコール沈澱及び遠心分離工程を用いている。従来法で
はアロエゲルの免疫修飾活性を効果的に保持することができないことを考慮する
と、免疫修飾活性を維持し、安定化することができるアロエからの多糖類分離法
を得ることは有用であろう。本発明は、そのような方法を与えるものである。

【０００６】 （発明の開示） 本願は、アロエから多糖類の混合物を活性化し、分離する方法に関する。本発
明には、生成した多糖類の活性混合物及びその混合物を免疫刺激、免疫修飾、及
び創傷治癒剤として使用することが含まれる。本発明の方法により分離された多
糖類の活性度は、自然のままのアロエゲル抽出物のものよりも遥かに高く、遥か
に安定であり、再現性がある。

【０００７】 本発明の方法は、(a)アロエからアロエゲルジュースを抽出し、(b)前記アロエ
ゲルジュース中の全多糖類の制御限定された(controlled limited)酵素加水分解
を、限定された炭水化物加水分解に適した温度及び時間行い、(c)前記加水分解 を終結させ、そして(d)場合により、前記加水分解された生成物を脱色及び濾過 することからなる。好ましい態様として、限定加水分解は、２５℃±１℃で２〜
２．５時間、ゲル抽出物２１６リットルに対しセルラーゼを０．５ｇ〜２．５ｇ
の比率で添加して行う。本方法の概略図を図１に示す。

【０００８】 本発明は、本発明の方法により製造され、分離された多糖類の混合物（ここで
は「イミュノ−１０」又は「イミュノ−１０多糖類」と呼ぶ）が含まれる。前記
組成物は下に詳細に記述する特性を有する

【０００９】 本発明は、イミュノ−１０を、免疫刺激剤、免疫修飾剤及び創傷治癒剤として
使用することも含む。イミュノ−１０は、ＵＶＢ放射線に曝したマウスの接触過
敏症（ＣＨ）の抑制を防ぎ、ヒト類表皮癌細胞系のＵＶＢ照射誘発腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ−α）放出も阻止する。本発明の方法により分離されたイミュノ−１０
は、ヒト免疫系の回復又は刺激のための経口又は局所用処方剤として、免疫不全
症又は免疫抑制症を患っている患者、又はＨＩＶ等の病気の治療処置のために用
いることができる。本発明の方法により分離されたイミュノ−１０は、創傷治療
のためにも有用である。本発明の方法により分離された多糖類は、自然のままの
アロエゲルよりも一層活性で、一層安定である。

【００１０】 ここに記載した方法は、アロエ多糖類の限定及び制御された加水分解を含み、
それはアロエ多糖類の安定性及び免疫修飾活性を増大する働きをする。本方法は
、従来法よりも速く、簡単で、規模の増大を一層し易く、有機溶媒の使用を含ま
ない。更に、ここに記載する方法は、アロエ多糖類の溶解度を増大し、免疫修飾
活性の損失を起こすことなく、その溶液の粘度を低下する。本発明の方法を用い
て分離されたイミュノ−１０は、同じアロエゲル抽出物から精製された活性化バ
ルク多糖類と定性的に同じＵＶＢ保護活性を示すが、バルク多糖類よりも大きな
比活性度を有する。更に、精製されたイミュノ−１０は、自然のままのアロエゲ
ルのものよりも少なくとも２倍の高さのＵＶＢ ＣＨ回復活性度を示す。

【００１１】 前記一般的説明及び次の詳細な説明の両方共、例及び説明のためだけのもので
あり、特許請求した発明を限定するものではないことを理解すべきである。

【００１２】 （本発明の詳細な説明） 本願は、アロエからの規定した生物学的に活性な多糖類混合物を活性化及び分
離する方法について記述する。用語「アロエ」とは、Aloe barbadensis植物を一
品種とするユリ科の世界的に分布している植物属を指す。本発明の方法は、(a) アロエからアロエゲルジュースを抽出し、(b)前記アロエゲルジュース中の全多 糖類の制御限定された加水分解を、限定された炭水化物の加水分解に適した温度
及び時間行い、(c)前記加水分解を終結させ、そして(d)場合により、前記加水分
解された生成物を脱色及び濾過することからなる。

【００１３】 本発明の方法の概略図を図１に与える。図１に関し、アロエゲルジュース（Ａ
ＧＪ）は、粉砕に限定されないが、それを含めた当分野で既知のいずれかの方法
により、「トンプソン・アロエ・ジュース・抽出器」(Thompson Aloe Juice Ext
ractor）〔テキサス州ハーリンゲンのトンプソン・マニュファクチュアリング社
(Thompson Manufacturing Co.)〕を用いるか、又は加圧ローラを用いることによ
り、新鮮なゲルフィレットから得られる。次にＡＧＪを加水分解剤と混合する。
加水分解剤の例には、セルラーゼ、ペクチナーゼ、又はマンナーゼ等の酵素、及
び塩酸及びトリフルオロ酢酸等の非酵素系加水分解剤が含まれるが、それらに限
定されない。最も好ましい加水分解剤は、セルラーゼ４０００〔バレイ・リサー
チ社(Valley Research Inc.)〕等のセルラーゼである。得られた混合物を、限定
された炭水化物加水分解に適した温度及び時間インキュベートする（例１参照）
。例えば、加水分解剤がセルラーゼである場合、これは、２５℃±１℃で２〜２
．５時間、ゲル抽出物２１６リットルに対しセルラーゼを０．５ｇ〜２．５ｇの
割合で用いて行うのが好ましい（例４を参照）。

【００１４】 次に適当な時間の後、炭水化物の加水分解を停止する。もしセルラーゼを用い
たならば、これは、消化混合物を高温に加熱することにより達成するのが好まし
い。得られたイミュノ−１０はこの段階では赤い色をもち、この色は場合により
そのイミュノ−１０を木炭(チャコール,charcoal)粒子と混合してスラリーを形 成する（例１参照）か、又はカラムクロマトグラフィーにより除去することがで
きる。適当なクロマトグラフィー樹脂の例には逆相樹脂が含まれるが、それらに
限定されない。逆相樹脂の例には、ＸＡＤシリーズの樹脂、ＣＧ−１６１等の芳
香族系樹脂、及びＣ−４、Ｃ−８、Ｃ−１８等の非芳香族系樹脂が含まれるが、
それらに限定されない。好ましい態様として、そのようなイミュノ−１０スラリ
ーを濾過し、木炭粒子を除去する。これは、当分野で既知の方法のいずれかによ
り達成することができる。本発明の好ましい態様では、多段階濾過方式を用い、
この場合、スラリーを次第に気孔孔径が小さくなる一連のフィルタに通す（例１
及び表１及び２参照）。例えば、或る態様では、スラリーを３０μｍの濾紙に通
し、次に１．０μｍの濾紙、最後に０．７μｍの濾紙で濾過する。或る態様では
、シーライト、ＦＷ１２、ＦＷ１４等の濾過助剤を、濾過すべき混合物中に含有
させる。この方法を用いた濾過に続き、濾液を脱色し、木炭微粒子を除去する。

【００１５】 任意的脱色及び濾過に続き、イミュノ−１０を凍結乾燥又は噴霧乾燥により乾
燥して貯蔵してもよい。本発明の方法を用いた典型的な収率は、ＡＧＪ１リット
ル当たり冷凍乾燥固体約６ｇである。セファロース(Sepharose）ＣＬ−４Ｂカラ
ムによるイミュノ−１０のクロマトグラフィーでは、４９０ｎｍでの二つの炭水
化物ピークの存在により証明されるように、多糖類及び単糖類の両方のフラクシ
ョン(fractions)をそれが含んでいることを示している（図２）。免疫調節活性 は多糖類ピーク内に含まれているが、単糖類はこの活性度に影響は与えない（デ
ータは示さず）。単糖類は、限定された酵素による硝化の前に、ＡＧＪのダイア
フィルトレーション(diafiltration)／透析により除去することができる。

【００１６】 例２及び３では、一層大きな生物学的活性及び安定性を有するイミュノ−１０
の純粋な形のものである医薬級イミュノ−１０の製法を記述する。

【００１７】 本発明には、本発明の方法により製造された活性化多糖類（ここでは「イミュ
ノ−１０」又は「イミュノ−１０多糖類」と呼ぶ）が含まれる。

【００１８】 イミュノ−１０の活性化多糖類の組成及び化学的構造を、次のように、９５％
より大きな純度を有する医薬級イミュノ−１０を用いて決定した。

【００１９】 サイズ排除クロマトグラフィー分析は、イミュノ−１０中の多糖類の平均分子
量は７０〜８０ｋＤａで、分子量の範囲は５０〜２００ｋＤａであることを示す
。分子量は、セファデックス(Sephadex)Ｇ−１００カラムによるサイズ排除クロ
マトグラフィー及びセファロース１２カラムによるＨＰＬＣゲル浸透クロマトグ
ラフィー〔Ｈ１０／３０ファーマシア(Pharmacia）〕を用いて決定した。

【００２０】 単糖類組成の分析では、イミュノ−１０の多糖類は、Ｄ−ガラクトース（約５
％以下）、Ｄ−グルコース（約５％以下）及びＤ−マンノース（約９０％）を含
有することが示されている。イミュノ−１０中の多糖類は微量のキシロース及び
アラビノースも含んでいる。

【００２１】 一層高度に精製された医薬級イミュノ−１０（例２及び３参照）は、主にＤ−
ガラクトース及びＤ−マンノースを１対９．６±２．２の比率で含んでいる。

【００２２】 プロトン及び¹³Ｃ ＮＭＲ分光分析では、単糖類結合は主にβ−１，４結合で あることが示されている。プロトン¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルをバリアン(Varian)
ＸＬ−３００分光計で分析した。イミュノ−１０多糖類の主な構造はβ−１，４
グルコマンナンである。更に、多糖類は高度にアセチル化されている（平均一つ
の砂糖残基当り約一つのアセチル基）。単糖類単位の２、３及び６位置は、独立
に−ＯＨ又は−ＯＡｃで置換されていてもよい。

【００２３】 イミュノ−１０のクロマトグラフィーは、それが多糖類及び単糖類の両方のフ
ラクションを含んでいることを示す（図２参照）。活性化多糖類の単糖類組成は
、ジオネックス(Dionex)Ｂｉｏ−Ｌｃ装置を用いてパルス電流検出器を有するジ
オネックス・カルボパック(CardoPac)ＰＡ１カラムによる高性能陰イオン交換ク
ロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により決定した。免疫調節活性は多糖
類ピーク内に含まれているが、単糖類はこの活性度に影響を与えない（データは
示さず）。イミュノ−１０は、その活性度に影響を与えない種々の塩を含んでい
てもよい。

【００２４】 イミュノ−１０は、その生物学的活性を失うことなく熱及び蛋白分解酵素処理
に対し安定であり、そのことは、更にイミュノ−１０の生物学的活性が活性多糖
類に起因するものであることを示している。

【００２５】 本発明の方法により分離されたイミュノ−１０は、従来知られていた方法を用
いて分離されたアロエ多糖類よりも大きな安定性を有する。例５及び６（図５〜
８）は、多糖類を処理する方法とその安定性との間の関係を例示する。

【００２６】 本発明は、免疫刺激、免疫修飾及び創傷治癒剤としてイミュノ−１０を使用す
ることも含む。

【００２７】 免疫修飾活性 イミュノ−１０は、ＵＶＢ抑制免疫反応（接触過敏症）を回復し、ケラチノサ
イト（ヒト類表皮癌細胞、ＫＢ細胞）からのＵＶＢ誘発腫瘍ネクロシス因子α（
ＴＮＦ−α）放出を阻止する。

【００２８】 局部的抑制モデルを用いて、例７で概略的に述べるように、イミュノ−１０の
回復活性としてここで言及するＵＶＢ抑制皮膚免疫機能を逆転させるイミュノ−
１０の能力を決定した〔ストリックランド、J. Invest. Dermatol., 102:197〜2
04 (1994)〕及びビンセク(Vincek)等、Cancer Research, 53:728 (1994) を参照
（これらは言及することによって本明細書に組み入れる）〕。局部的抑制モデル
では、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを低い線量のＵＶＢ放射線に露出し、それが照射側
に適用されたハプテンに対する接触過敏症（ＣＨ）反応の誘発を阻止する。簡単
に述べると、マウスの腹部の毛を剃り、２０００Ｊ／ｍ²のＵＶＢ放射線で照射 し、然る後、既知のビヒクルであるアクアフォール(Aquaphor)中に入れたイミュ
ノ−１０（０．２５ｍｇ／ｍｌ）をその照射した部位に塗った。３日後、マウス
の照射した部位に２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＦＢ）（０．３％、５０μｌ
）を適用することにより感作した。６日後、マウスの耳の厚さを測定し、次にマ
ウスの耳の両側にＤＮＦＢ（０．２％、５μｌ）を適用することによりマウスを
試験した。２４時間後、マウスの耳の厚さを再び測定した。結果を図８に示す。

【００２９】 行った実験の殆どで、ＵＶＢ露出は８０〜１００％ＣＨ反応を阻止した。図８
に関して、このグループは陰性（抑制）対照（ＣＨ反応０％）として用いた。マ
ウスの陽性対照群はＵＶＢ照射を受けておらず、イミュノ−１０で処置されてい
ない（ビヒクルのみ）が、感作され、試験された（ＣＨ反応１００％）。マウス
のビヒクル（ブランク）対照群はＵＶＢ照射を受けておらず、イミュノ−１０で
処置されておらず（ビヒクルのみ）、感作されていないが試験した。この群は化
学的刺激試験によって起こされた真の耳腫脹の差を求めるのに用いた。イミュノ
−１０で処置したマウス群を抑制対照と同じやり方で処置した。但しそれらのマ
ウスはビヒクルのみではなく、ビヒクル中にイミュノ−１０を入れたもので処置
した。イミュノ−１０による回復率は、次の式を用いて計算した。

【００３０】 回復率％＝（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００ (式中、Ａ＝イミュノ−１０処置群の真の耳腫脹−ブランク群の真の耳腫脹； Ｂ＝抑制群の真の耳腫脹−ブランク群の真の耳腫脹；及び Ｃ＝陽性群の真の耳腫脹−ブランク群の真の耳腫脹）。

【００３１】 回復率％が大きい程、イミュノ−１０の活性は大きい。図８から分かるように
、イミュノ−１０の活性度は３０〜８０％であり、平均約６０％である。イミュ
ノ−１０を溶液として４℃で３カ月貯蔵するか、又は固体状態で室温で１年間貯
蔵した場合、免疫修飾活性は安定していた。

【００３２】 ＵＶＢ誘発ＴＮＦ−α放出は、表皮内局部的免疫抑制の仲介に含まれているこ
とが報告されている。イミュノ−１０によるＵＶＢ誘発ＴＮＦ−α放出の抑制を
決定するため、生体内モデルが開発された。この方法は例８に記載されている。
ヒト類表皮癌細胞系（ＫＢ細胞）を用いた（正常な細胞はＥＬＩＳＡにより測定
できる程充分なＴＮＦ−αを生じない）。結果を図９に示す。図９中のＸ軸は、
イミュノ−１０の投与量（細胞媒体中の最終的濃度ｍｇ／ｍｌ）を表す。Ｙ軸は
、イミュノ−１０による阻止率％を示す。イミュノ−１０による阻止％は、次の
式を用いて計算した： 阻止率％＝１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００ (Ａ＝ＵＶＢ照射及びイミュノ−１０処置細胞からの媒体中のＴＮＦ−α量； Ｂ＝ＵＶＢ照射をしない細胞からの媒体中のＴＮＦ−α量；及び Ｃ＝ＵＶＢ照射し、イミュノ−１０処置なしの細胞からの媒体中のＴＮＦ−α 量)。

【００３３】 図９から分かるように、イミュノ−１０は、ＫＢ細胞からのＵＶＢ誘発ＴＮＦ
−α放出阻止の投与量依存性を示している。１ｍｇ／ｍｌの濃度では、イミュノ
−１０は殆ど１００％その放出を阻止した。

【００３４】 免疫刺激活性 イミュノ−１０は、ＴＮＦ−α放出を刺激することによりマクロファージを活
性化する。

【００３５】 悪性腫瘍に対する宿主防衛は、幾つかの異なった機構からなり、免疫学的防衛
の障害又は低下は、悪性疾病の発生又は進行をもたらすことがある。マクロファ
ージは抗原処理細胞であり、細胞毒性及び食細胞性の両方をもつことが示されて
いる。これらの機能のいずれも、マクロファージが活性化されると著しく向上す
る。この細胞集団の選択的刺激が、治療的用途の開発に寄与させるのに重要であ
ろう。活性化されたマクロファージは、人体の創傷治癒能力に決定的に重要なも
のになっている。マクロファージにより放出されるシトキンの一つである腫瘍壊
死因子α（ＴＮＦ−α）は、防衛系統のシグナル導入を仲介するのに重要な役割
を果たす。例９には、イミュノ−１０刺激マクロファージ活性化を決定するのに
用いた方法が記載されている。結果を図１０に示す。図１０に示す通り、イミュ
ノ−１０によりマウス腹膜のマクロファージから放出されたＴＮＦ−αの投与量
依存性刺激が検出された。０．５μｇ／ｍｌのイミュノ−１０濃度では、イミュ
ノ−１０刺激マクロファージは、無刺激細胞よりも５００倍も多くのＴＮＦ−α
を放出した。図１０から分かるように、同じ実験条件下で、自然のままのアロエ
ゲルは、マクロファージからのＴＮＦ−α放出を誘発しなかった。この結果は、
イミュノ−１０を免疫系の非特異性刺激物及び創傷治癒のための両方として用い
ることができることを示している。

【００３６】 傷治癒活性 イミュノ−１０は線維芽細胞の増殖を刺激する（子供ハムスター腎臓細胞、Ｂ
ＨＫ−２１細胞）。

【００３７】 例１０には、イミュノ−１０細胞増殖を決定するために用いた方法が記載され
ている。刺激された細胞増殖を決定するためにＭＴＴ法を用いた。結果を図１１
に示す。図１１から分かるように、イミュノ−１０は、投与量に依存した仕方で
ＢＨＫ−２１細胞の増殖を刺激する。

【００３８】 次の例は例示のためにのみ与えられており、本発明の範囲を限定するものでは
ない。

【００３９】 （諸例） 例１． イミュノ−１０の分離及び精製 図１に概略示すように、イミュノ−１０を分離し精製した。簡単に述べると、
新しいAloe barbadensisゲル抽出物を、限定された炭水化物加水分解に適した温
度及び時間、限定された酵素による消化にかけた。これは、酵素としてセルラー
ゼを用い、２５℃で２時間であるのが典型的である。活性化アロエゲルを活性炭
及び濾過（Ｉ−１０）を用いて或る程度精製した。次にその活性化多糖類を、更
に透析、エタノール沈澱及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。

【００４０】 限定酵素硝化 新しいゲルフィレット〔テキサス州ハーリンゲンのアロエコープ(Aloecorp)に
より与えられたもの〕から生成したアロエゲルジュース（ＡＧＪ）（１０リット
ル）を、マリーン・プロペラ・ブレード(marine propeller blade)（Ａ１００）
を具えた機械的撹拌器で穏やかに撹拌しつつ、６０℃の温水が循環する１/４イ ンチ３１６ステンレス鋼コイルからなる熱交換器により２５℃に加熱した。セル
ラーゼ４０００（バレイ・リサーチ社）１１６ｍｇを５０ｍＭクエン酸水溶液１
０ｍｌ中に入れたｐＨ＝６の溶液を添加し、混合物を２時間穏やかに撹拌した。

【００４１】 酵素不活性化 ２時間後、反応混合物を最低３０分間の間約９０℃に加熱した。次に反応混合
物を氷水浴中に浸漬し、その材料を室温へ冷却した。

【００４２】 脱色及び濾過 酵素不活性化中に発生した赤い色を除くため木炭を用いた。材料を二つの５．
０リットルのバッチに分けた。５．０リットルバッチの各々に１００．０ｇの粗
い木炭〔ノリット(Norit）から購入したダルコ(Darco）２０×４０〕を添加し、
混合物を室温で１時間穏やかに撹拌した。次に５０．０ｇのシーライト５４５（
アルドリッヒ・ケミカル社）を添加し、そのスラリーを更に１０分間撹拌した。

【００４３】 次にスラリーを、３０μｍの濾紙〔ワットマン(Whatman）級１１３〕を具えた
加圧フィルタへポンプで送り、固体を除去した。濾液は少量の、フィルタを通過
した木炭微粒子を含んでいた。その材料を、１００ｇのシーライト５４５で被覆
した０．７μｍ濾紙（ワットマンＧＦ／Ｆ）の上に１．０μｍ気孔孔径の濾紙（
ワットマン＃１）を重ねたものからなる２枚重ねのフィルタに通して濾過すると
、透明になった。濾液は脱色されており、木炭微粒子を含んでいなかった。活性
化多糖類を、更に透析、エタノール沈澱及びサイズ排除クロマトグラフィーによ
り精製した。濾過データを表１及び２に要約する。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【表２】

【００４６】 凍結乾燥 濾過後、二つのバッチを一緒にし、その材料を凍結乾燥皿に移し、２０リット
ルのビールティス(VirTis)凍結乾燥器中で凍結し、乾燥し、５７．１４ｇのイミ
ュノ−１０を生成させ、それはＡＧＪ１リットル当り５．７１ｇのイミュノ−１
０に相当していた。

【００４７】 例２． 中空繊維カートリッジを用いた医薬級イミュノ−１０の製造 １０ｇの凍結乾燥したアロエゲルを、２リットルビーカー内で１．８リットル
の蒸留水中に溶解した。スラリーを一晩４℃で撹拌し、均一な混合物を生成させ
た。その混合物を濾紙（ワットマン＃３）に通して濾過し、全ての粒子を除去し
、濾液の体積を２リットルに調節した。混合物を室温へ持って行き、４．６３ｍ
ｇのセルラーゼ４０００（バレイ・リサーチ社）を５０ｍＭのクエン酸水溶液５
ｍｌ中へ入れたｐＨ６の溶液を添加した。次に濾液を１０〜１５ｐｓｉの導入圧
力で中空繊維カートリッジ〔Ａ／Ｇテクノロジー社 (Technology Corporation) 、ＵＦＰ−５−Ｅ−６、分子量カットオフ：５０００Ｄａ〕へポンプで送った。
５，０００Ｄａより小さな分子量を有する透過物を別の２リットルビーカーに収
集した。５，０００Ｄａ以上の大きな分子量を有する濃縮物を出発濾液と同じビ
ーカー中に収集した。この混合物を連続的に撹拌し、出発濾液の体積が１リット
ルに減少した時、蒸留水（１リットル）を添加して体積を２リットルに戻した。
この手順を５回繰り返した。合計三つの２リットル透過液部分を収集した。最終
濃縮物を保持された部分のまま収集した。各２リットルの透過液部分を収集する
のに平均約２．５時間かかった。それら部分を凍結乾燥皿に移し、２０リットル
のビールティス凍結乾燥器中で凍結し、乾燥した。透過液部分Ｉ、II及びIII 、
及び保持部分の収率は、夫々４．８８ｇ、１．７７ｇ、０．５６ｇ、及び０．３
７ｇであった。保持部分は、ＵＶＢ抑制接触過敏症を回復するのに最も高い活性
度を持っていた。透過物の部分III は、ＵＶＢ抑制接触過敏症を回復するのに中
程度の活性度を持っていた。透過物の部分Ｉ及びIIは不活性であった。

【００４８】 例３． 医薬級イミュノ−１０の製法 例１に記載した方法により製造されたイミュノ−１０（５０ｇ）を蒸留水（ｄ
ｉＨ₂Ｏ）中に溶解し、最終体積を２００ｍｌにした。次にエタノール（６６． ７ｍｌ、最終濃度２５％）をこの溶液に添加した。エタノールの添加は撹拌しな
がらゆっくり行なった。次に溶液を更に３０分間撹拌し、その間に沈澱が形成さ
れた。混合物を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ〔ジョアン(Jouan）Ｃ
Ｒ４１２〕、沈澱物を２５％エタノールで１回洗浄し、遠心分離にかけ、再びｄ
ｉＨ₂Ｏ中に溶解した。得られた溶液を乾固するまで冷凍乾燥した（ｐｐｔ／２ ５％）。更に１３３．３ｍｌのエタノール（２５％〜５０％）を、上に記載した
ように上澄み液に添加し、その溶液を再び３０分間撹拌し、沈澱物を収集し、５
０％エタノールで洗浄し、冷凍乾燥した（ｐｐｔ／２５％〜５０％）。この方法
を更に２回、５０〜７５％エタノール（ｐｐｔ／５０％〜７５％）及び７５〜８
０％エタノール（ｐｐｔ／７５％〜８０％）で繰り返した。ｐｐｔ／２５％、ｐ
ｐｔ／２５〜５０％、ｐｐｔ／５０〜７５％、及びｐｐｔ／７５〜８０％の場合
の沈澱物の固体回収率は、夫々０．３％、２０．５％、１０．３％及び１．５％
であった。ｐｐｔ／５０〜７５％の生成物をセファデックスＧ−１００カラム（
２．５×６８ｃｍ）で分別した。多糖類ピーク（図３の左のピーク）のフラクシ
ョンを一緒にし、冷凍乾燥して医薬級イミュノ−１０を生成させた。ｐｐｔ／５
０〜７５％からの医薬級イミュノ−１０の回収率は１５．８％であった。

【００４９】 例４． アロエ・ベラ・ゲル（ＡＪＧ）多糖類の時間依存性分解 新しいアロエ・ベラ・ゲル抽出物をセルラーゼ（ゲル抽出物１リットル当り１
１．５７ｍｇのセルラーゼ）により室温で３分間、１０分間、３０分間、６０分
間、１２０分間、２４時間、及び４８時間処理した。処理が終わった時、ゲル抽
出物を水浴中で９５℃に３０分間加熱し、次に２５００ｒｐｍで１０分間遠心分
離にかけた。上澄み液を乾固するまで冷凍乾燥した。処理したゲル抽出物中の多
糖類の分子量分布を、セファデックスＧ−７５カラム（２．５×６８ｃｍ、カラ
ムへの試料導入量１７７〜１７９ｍｇ）によるサイズ排除クロマトグラフィーに
より分析した。７５，０００Ｄａ以上の分子量を有する多糖類は空洞体積に溶離
され、一方単糖類及び或るオリゴ糖類はカラム体積に溶離された（図４参照）。
得られた生成物の生物学的活性に基づく好ましい加水分解反応時間は、１２０分
であると決定された。図４から分かるように、１２０分間のセルラーゼによる処
理は、肩の無い鋭い多糖類ピークを与える結果になった（▲）。２４時間（●）
又は４８時間（■）のセルラーゼによる処理は、単糖類及びオリゴ糖類ピークの
吸収率が増大しながら、多糖類ピークの吸収率の著しい低下をもたらした。３分
間（◇）、１０分間（○）及び３０分間（△）の処理により得られた生成物は、
肩を有する多糖類ピークを与える結果になった。

【００５０】 例５． 異なったアロエ製剤中のアロエ多糖類の安定性 新しいアロエゲル抽出物（標準的精製法、即ち、透析及びエタノール沈澱を用
いて精製したもの）、冷凍乾燥アロエゲル、及び冷凍乾燥アロエ全葉中の多糖類
の安定性を、セファローズＣＬ−４Ｂカラムによるサイズ排除クロマトグラフィ
ーにより研究した（図５参照）。図５から分かるように、新しいアロエゲル抽出
物から分離されたアロエ多糖類は、〜２００万Ｄａの分子量を持っていた。冷凍
乾燥したアロエ全葉中の多糖類は、新しいアロエゲル抽出物から分離した多糖類
の分子量よりも小さい分子量を持っており、冷凍乾燥したアロエゲル中の多糖類
は〜５００，０００Ｄａの分子量を持っていた。この結果は、多糖類の処理方法
と、アロエ多糖類の安定性との間の関係を例示している。

【００５１】 例６． イミュノ−１０多糖類の安定性 イミュノ−１０は、多糖類の外に或る塩及び他の小さな分子を含んでいる。蒸
留水（ｄｉＨ₂Ｏ）中のイミュノ−１０のｐＨは約４．３である。イミュノ−１ ０多糖類の安定性を研究するために、精製した自然のままのアロエ多糖類と、ｐ
Ｈ４．３又はｐＨ７．８のイミュノ−１０溶液との両方を室温で３カ月間放置し
た。微生物の増殖を阻止するためイミュノ−１０又は多糖類の溶液に最終濃度０
．０２％のアジ化ナトリウムを添加した。これらの試料中の多糖類の分解をセフ
ァデックスＧ−１００カラムにより分析した。図６は、クロマトグラムが４９０
ｎｍでのイミュノ−１０の多糖類吸収率が吸光度がｐＨ４．３及びｐＨ７．８の
両方で非常に似ていることを示していることを描いた図である。ｐＨ４．３では
多糖類ピークは僅かに右側に移行しているが、それは、出発材料と比較して両方
のｐＨ条件下で依然として非常に安定である。同じ条件下で、自然のままの精製
多糖類はｐＨ７．８で部分的に分解した（図７）。多糖類ピークの僅かな移行は
、セファデックスＧ−１００カラムの再充填によるものであろう。

【００５２】 例７． イミュノ−１０によるＵＶＢ抑制接触過敏症回復の決定 ＳＰＦ雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを、ハーラン・スプラグ・ダウリー(Harlan Sp
rague Dawley）から入手し、ナショナル・リサーチ・カウンシル・オブ・ラボラ
トリー・アニマル・ケアー(National Research Council of Laboratory Animal
Care）ガイドラインに従って病原体を持たない施設に保管した。９〜１０週間の
年齢適合マウスを用いて各実験を行った。

【００５３】 マウスの腹部の毛を電気バリカンで除去した。次にアルミ箔で耳を覆ったマウ
スを一列の四つの無フィルタＦＳ４０太陽灯〔ナショナル・バイオロジカル社（
National Biological Corp.)〕に２０００Ｊ／ｍ²の線量で露出した。これらの ランプから発したエネルギーの約６５％がＵＶＢ範囲（２８０〜３２０）内に入
っており、最大放射光は３１３ｎｍであった。ＵＶＢ照射後、直ちにアクアフォ
ール(Aquaphor)（ビヒクル）単独又はアクアフォール中に１：１の比率で入れた
試験化合物をマウスの腹部皮膚上に適用した。次にマウスを、それらの刈った腹
部皮膚の上に５０μｌの０．３％ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を、Ｕ
ＶＢ照射後３日間適用することにより感作した。感作後６日で各耳の背面及び腹
面の両方の上に５μｌの０．２％ＤＮＦＢを塗布することによりマウスを試験し
た。試験直前及び２４時間後に工学用マイクロメータを用いて耳の厚さを測定し
た。耳の比腫脹を、感作せずに試験したマウス（ブランク群）から得られた値を
差し引くことにより決定した。各処置群は５匹のマウスからなっていた。各実験
には更に二つの対照群が含まれていた、即ち陽性対照群及び抑制群である。陽性
対照群はＵＶＢ照射も処置も受けていないが、感作して試験した（１００％反応
）。抑制マウス群は、ＵＶＢ照射を受けていたが、処置はされておらず、感作し
て試験した（０％反応）。結果を図８に示す。

【００５４】 例８． イミュノ−１０によるＵＶＢ誘発ＴＮＦ−α放出抑制の決定 ヒト類表皮癌細胞（ＫＢ）を１００ｍｍ皿で２×１０⁶個の細胞を培養した。 細胞が集密化した(reached confluence)後（約２日）、それらをＰＢＳで３回洗
浄し、ＵＶＢ放射線に３００Ｊ／ｍ²で露出した。次にそれら細胞をＰＢＳで１ 回洗浄し、イミュノ−１０を入れた又は入れない５ｍｌのＤＭＥＭ／０．２％Ｆ
ＢＳ中で１時間培養した。細胞をＰＢＳでもう１度洗浄し、更に増殖媒体中で一
晩培養した。次の日に媒体を収集し、２５００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離
にかけた。上澄み液中に遊離されたＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより決定した。結
果を図９に示す。

【００５５】 例９． イミュノ−１０によるマクロファージ活性化刺激の決定 ＩＣＲマウスからレジデントマウス腹膜マクロファージを分離し、９６孔井戸
型プレートに１孔当り２００，０００の細胞を植えた。２時間培養した後、付着
していない細胞を除去するため細胞を３回洗浄した。次にイミュノ−１０を用い
、或は用いずにマクロファージを一晩培養した。媒体中に遊離したＴＮＦ−αを
ＥＬＩＳＡにより決定した。陽性対照としてリポ多糖類（ＬＰＳ）を用いた。結
果を図１０に示す。

【００５６】 例１０． イミュノ−１０による細胞増殖（ＭＴＴ）刺激の決定 子供ハムスターの腎臓細胞系（ＢＨＫ細胞）を、９６孔井戸型プレートに１孔
当り５０００個の細胞を植えた。組織培養器中で３日間イミュノ−１０を用い又
は用いずに細胞を培養した。次に細胞を１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ〔臭化３−（４，
５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，３−ジフェニルテトラゾリウム、チ
アゾリルブルー〕を用いて４．５時間培養した。０．０１ＮのＨＣｌ中に入れた
１０％ＳＤ溶液１００μｌを用いて細胞を抽出した後、５７０〜６３０ｎｍでの
吸光度を決定した。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を陽性対照として含ませた。
結果を図１１に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 アロエからのイミュノ−１０を製造するための本発明の一般的方法を概略的に
示す図である。

【図２】 限定された酵素加水分解、脱色及び濾過に続くイミュノ−１０のクロマトグラ
ム（例１）の図である。クロマトグラフィーはセファローズＣＬ−４Ｂカラムに
より行い、フェノール硫酸法を用いて４９０ｎｍでの吸光度を検査した。

【図３】 例３の方法により製造した或る程度精製したイミュノ−１０のクロマトグラム
の図である。クロマトグラフィーはセファデックスＧ−１００カラムにより行い
、４９０ｎｍでの吸光度を調べた。

【図４】 セルラーゼによりアロエ多糖類を３分間（◇）、１０分間（○）、３０分間（
△）、６０分間（◆）、１２０分間（▲）、２４時間（●）、及び４８時間（■
）分解した場合を例示する図である。

【図５】 三つの異なった方法により分離したアロエ多糖類：既知の方法を用いた新しい
抽出物から精製した多糖類（▲）、冷凍乾燥したアロエゲルから誘導した多糖類
（■）、及びアロエ全葉から誘導された多糖類（●）；のクロマトグラムの図で
ある。クロマトグラフィーはセファローズＣＬ−４Ｂカラムにより行い、４９０
ｎｍでの吸光度を調べた。

【図６】 室温でｐＨ４．３（○）及びｐＨ７．８（●）のＨ２ Ｏ中に３カ月間放置し た後のセファデックスＧ−１００カラムによるイミュノ−１０のクロマトグラム
の図である。

【図７】 室温でｐＨ４．３（○）及びｐＨ７．８（●）のＨ₂Ｏ中に３カ月間放置した 後のセファデックスＧ−１００カラムによる精製した自然のままのアロエ多糖類
のクロマトグラムの図である。

【図８】 皮膚免疫機能（接触過敏症ＵＶＢ検定）を回復させるイミュノ−１０の能力を
示すグラフである。

【図９】 イミュノ−１０によるＵＶＢ照射誘発腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）放出阻
止を示すグラフである。

【図１０】 イミュノ−１０によるマウス腹膜マクロファージからのＴＮＦ−α放出の刺激
を示すグラフである。

【図１１】 イミュノ−１０による細胞増殖の刺激を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｑ Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＫＲ，Ｕ Ｓ Ｆターム(参考） 4B064 AF12 CA21 CB07 CC03 CC05 CC06 CD22 DA01 4C086 AA02 AA03 AA04 EA21 ZA89 ZB01 ZB09 4C090 AA01 AA04 AA09 BB10 BB13 BB14 BB33 BB36 CA31 DA23

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アロエ種から免疫修飾性炭水化物を分離する方法において、 (a) アロエ種からアロエゲルジュースを抽出し、 (b) 前記アロエゲルジュース中の全多糖類の制御限定された加水分解を行い、 (c) 前記制御限定された加水分解を終結させ、次いで (d) 場合により、前記アロエゲルジュースを脱色し濾過する、 諸工程を含む、上記方法。
2. 【請求項２】 工程(b)を、アロエゲルジュースを、酵素又は化学的加水分 解剤で処理することにより行う、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 酵素を、セルラーゼ、ペクチナーゼ又はマンナーゼからなる
   群から選択する、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 酵素加水分解剤がセルラーゼであり、アロエゲルジュース２
   １６リットルに対しセルラーゼ０．５ｇ〜２．５ｇの割合で添加する、請求項２
   記載の方法。
5. 【請求項５】 工程(b)を、２５℃±１℃で２〜２．５時間行う、請求項４ 記載の方法。
6. 【請求項６】 工程(b)を、生物学的活性度を最大にする温度及び時間で行 う、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 加水分解を加熱又は中和により終結させる、請求項１記載の
   方法。
8. 【請求項８】 加水分解を、８５〜９０℃に３０〜５０分間加熱することに
   より終結させる、請求項５記載の方法。
9. 【請求項９】 工程(d)を、アロエゲルジュースに木炭を添加し、次に前記 アロエゲルジュースを、次第に気孔孔径が小さくなる一連のフィルタに通すこと
   により達成する、請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 一連のフィルタが、３０μｍフィルタ、１μｍフィルタ、
    及び０．７μｍフィルタを含む、請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 シーライト、ＦＷ１２又はＦＷ１４からなる群から選択さ
    れた珪藻土物質を濾過助剤として工程(c)でアロエゲルジュースに添加すること を更に含む、請求項９記載の方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法により製造された組成物。
13. 【請求項１３】 主にアロエから誘導された多糖類を含む組成物において、 (a) 前記組成物中の前記多糖類が、５０〜２００ｋＤａの範囲内で、７０〜８０
    ｋＤａの平均分子量を有し、 (b) 前記組成物中の前記多糖類が、Ｄ−ガラクトース（約５％以下）、Ｄ−グル
    コース（約５％以下）、及びＤ−マンノース（約９０％）を含み、 (c) 前記組成物中の前記多糖類が、主にβ−１，４結合を有する単糖類を含み、
    しかも (d) 前記組成物中の多糖類が、高度にアセチル化されて単糖類１分子当り約一つ
    のアセチル基を有し、該アセチル基が単糖類単位の２、３又は６位置にある、 諸特性を有する、上記組成物。
14. 【請求項１４】 多糖類が微量のキシロース及びアラビノースも含む、請求
    項１３記載の組成物。
15. 【請求項１５】 多糖類が、主に、１対９．６±２．２の比率でＤ−ガラク
    トース及びＤ−マンノースを含む、請求項１３記載の組成物。
16. 【請求項１６】 免疫刺激剤、免疫修飾剤又は創傷治癒剤として、請求項１
    記載の組成物を使用する方法。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載の方法により製造された組成物を、それを
    必要とするヒトに投与することによる、免疫不全症又は免疫抑制症の治療法。
18. 【請求項１８】 免疫刺激剤、免疫修飾剤又は創傷治癒剤として、請求項１
    ３記載の組成物を使用する方法。
19. 【請求項１９】 請求項１３に記載の組成物を、それを必要とするヒトに投
    与することによる、免疫不全症又は免疫抑制症の処置法。