JP2016104779A

JP2016104779A - アロエ多糖体の組成物及び方法

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Publication number: JP2016104779A
Application number: JP2015255849A
Authority: JP
Inventors: アイヴァンイー．ダンホフ; E Danhof Ivan
Original assignee: North Texas Medical Associates
Current assignee: North Texas Medical Associates
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2016-06-09
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Also published as: JP6129947B2

Abstract

【課題】フリーズドライしたアロエ粉末からポリマンナン抽出物を調製する方法の提供。【解決手段】所定量のフリーズドライされたアロエ粉末を脱イオン水に溶解するステップと、有機溶媒を添加して第１の混合物を形成するステップと、静置後上清を第１の混合物から抜き取り、第２の混合物を形成するステップと、第２の混合物を遠心分離するステップと、第２の混合物中において沈殿物が観察された場合に、追加量の有機溶媒を第１の混合物に添加するステップと、吸い上げることによって第１の混合物の上清をデカンテーションするステップと、吸引漏斗を使用して第１の混合物から前記沈殿物を濾過するステップと、削り取ることによって前記ポリマンナン抽出物の粉末を回収するステップと、冷凍庫内に少なくとも８時間置くステップと、凍結乾燥させるステップと、粉砕機内で粉砕するステップとを含む、ポリマンナン抽出物の微粉末の調製方法。【選択図】なし

Description

本発明は、一般に、アロエ多糖体の分野、より詳細には、アロエ多糖体の組成物、並びに免疫調節薬として及び様々な種類のがんの治療のためのそのような組成物の使用に関する。

本発明の範囲を限定するものではないが、その背景を、アロエ・ベラ（Aloe Vera）多糖体の組成物、調製方法及び治療的使用と関連付けて記述する。

Pascoらが取得した米国特許第７，１９６，０７２号（２００７）は、アロエ・ベラから単離した強力な免疫刺激活性を有する複合水溶性多糖体画分について記述している。多糖体画分は、グルコース、ガラクトース、マンノース及びアラビノースをその主成分として有し、２００万ダルトンを上回る見かけの分子量を有する。本発明は、本多糖体画分を、許容される医薬担体及び／又は添加剤（excipents）と場合により組み合わせて含有する、医薬組成物についてさらに記述する。これらの医薬組成物を使用して、そのような治療を必要とする個体に有効量の組成物を投与することにより、そのような個体に免疫刺激を提供することができる。

Avalos及びDanhofが取得した米国特許第６，０８３，５０８号（２０００）は、アロエの葉を切り開いて内部の葉肉を除去した後に取得された葉残留物のみからアロエ生成物を形成するためのプロセスについて記述している。米国特許第６，０８３，５０８号によれば、残留物を粉砕することによってスラリーにし、そのスラリーからアロエ生成物を生成する。加えて、アロエ生成物を調製するステップは、アロエの葉を切り開く前に洗浄すること、形成されたスラリーを液体及び固体に分離すること、さらに、アロエ生成物を形成する前に分離された液体を処理して緩下剤を除去することを含む。また、上記ステップのすべてを包含するプロセスは、液体を形成するためにも実施され得る。

米国特許出願第２００６／００８４６２９号明細書（Needleman及びNeedleman、２００６）は、体の自然免疫応答を活性化する長鎖の高分子量多糖体を含む免疫系活性を刺激して、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、サイトカイン及び抗体の生成の増大をトリガーするための、アロエ・ベラ及びマイタケＴＤから単離された２つの特殊な長鎖の高分子量画分の組合せを開示している。これらの長鎖の多糖体は、他の活性成分と一緒になって、適正な免疫系支持を提供することができ、それにより、がん、心疾患及び老化等の消耗性疾患を予防する。

米国特許第７，１９６，０７２号明細書米国特許第６，０８３，５０８号明細書米国特許出願第２００６／００８４６２９号明細書

本発明は、アロエ多糖体組成物、並びに、免疫調節剤としての、並びに白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん、及び結腸がん、免疫疾患、特に免疫に関係する腫瘍から選択される様々な種類のがんの治療のための該組成物の使用について記述する。

本発明は、（ｉ）所定量のフリーズドライされたアロエ粉末を秤量するステップであって、前記量が水分含有量に対して補正されるステップと、（ii）フリーズドライされたアロエ粉末を脱イオン水に溶解して、溶液を形成するステップと、（iii）有機溶媒を該溶液に添加して第１の混合物を形成ステップであって、有機溶媒と脱イオン水との比が少なくとも２．５：１であるステップと、（iv）第１の混合物を少なくとも８時間静置させるステップと、（ｖ）所定体積の上清を第１の混合物から抜き取り、過剰体積の上清溶液を添加して、第２の混合物を形成するステップと、（vi）第２の混合物を遠心分離するステップと、（vii）第２の混合物中における沈殿物の存在を観察するステップと、（vii）第２の混合物中において任意の沈殿物が観察された場合に、追加量の有機溶媒を第１の混合物に添加するステップと、（viii）吸い上げることによって第１の混合物の上清をデカンテーションする（decanting）ステップであって、該デカンテーションが、第２の混合物中において沈殿物が観察されない場合にのみ実施されるステップと、（ix）減圧下、濾紙及び吸引漏斗を使用して第１の混合物から沈殿物を濾過するステップと、（ｘ）削り取る（scraping）ことによって吸引漏斗からポリマンナン抽出物の粉末を回収するステップと、（xi）キャップをした凍結乾燥フラスコ中のポリマンナン抽出物の粉末を、冷凍庫内に少なくとも８時間置くステップと、（xii）ポリマンナン抽出物の冷凍粉末を、凍結乾燥機内で凍結乾燥（lyophilizing）させるステップと、（xiii）ポリマンナン抽出物の凍結乾燥粉末を、粉砕機内で細粒質に粉砕するステップとを含む、ポリマンナン抽出物の微粉末を調製するための方法を提供する。

一態様において、前記方法は、ポリマンナン抽出物の微粉末を、秤量し、ラベル付けし、容器内に保存するステップをさらに含む。本発明の実施形態において記述されたフリーズドライされたアロエ粉末は、アロエ・ベラ、キダチアロエ（Aloe arborescens）、アヤニシキ（Aloe aristata）、タカロカイ（Aloe dichotoma）、アロエ・ニエリエンシス（Aloe nyeriensis）、チヨダニシキ（Aloe variegate）、ホンロカイ（Aloe barbadensis）及びアロエ・ウィルディ（Aloe wildii）からなる群から選択されるアロエ種に由来する。本発明において使用されるフリーズドライされたアロエ粉末はアロエ多糖体を含み、該アロエ多糖体は、１又は２以上の短鎖（small chain）、中鎖（medium chain）、長鎖（large chain）、極長鎖多糖体（very-large chain polysaccharides）、又はそれらの任意の組合せを含む。具体的な態様において、有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びプロパノールからなる（consiting）群から選択される。別の態様において、アロエ多糖体は、グルコース、マンノース、アラビノース及びガラクトースからなる群から選択される単糖をさらに含み、１１，５００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン超の範囲の分子量を有する。

別の態様において、フリーズドライされたアロエ粉末は、少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する。また別の態様において、フリーズドライされたアロエ粉末は、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のアロエ多糖体を有する。本発明の方法において記述されているフリーズドライされたアロエ粉末は、６６，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも１４％、４８０，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも９％、１，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも３．５％、２，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも２．４％含む。

フリーズドライされたアロエ粉末中のアロエ多糖体組成物に関係する方法の具体的な態様において、アロエ多糖体の約１．３２％〜６．３６％は２，０００，０００ダルトンの分子量を有し、２．５５％〜３．８９％は１，０００，０００の分子量を有し、アロエ多糖体の６３．８５％〜７３．３６％は４８０，０００ダルトンの分子量を有する。一態様において、フリーズドライされたアロエ粉末は、グルコース、有機酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択される１又は２以上の残留低分子量種を含有し得る。別の態様において、１又は２以上の残留低分子量種は、１４％〜２４％の範囲の量で存在する。また別の態様において、ポリマンナン抽出物の微粉末は、白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん並びに結腸がんからなる群から選択される１又は２以上の悪性腫瘍（malignacies）の治療において、並びに１又は２以上の免疫障害の治療のために使用すべき、医薬組成物の調製において使用される。

別の実施形態において、本発明は、脱イオン水に溶解された所定量の微細なポリマンナン抽出物と、１又は２以上の医薬品保存剤とを含む、ポリマンナン抽出物の無菌注射用製剤を開示する。以上で記述した製剤において使用され得る１又は２以上の医薬品保存剤は、パラベン、安息香酸及びそれらの塩、水銀剤、第４級アンモニウム塩、ベンジルアルコール及び他の関連アルコール、並びにフェノールからなる群から選択される。具体的な態様において、保存剤はベンジルアルコールである。一態様において、ポリマンナン抽出物はアロエ多糖体を含み、該アロエ多糖体は、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む。別の態様において、アロエ多糖体は、グルコース、マンノース、アラビノース及びガラクトースからなる群から選択される単糖をさらに含む。

他の具体的な態様において、アロエ多糖体は、１１，５００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン超の範囲の分子量を有し、ポリマンナン抽出物は少なくとも２５％のアロエ多糖体を有し、該ポリマンナン抽出物は、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のアロエ多糖体を有する。関係する態様において、ポリマンナン抽出物は、６６，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも１４％含み、少なくとも９％は４８０，０００ダルトンの分子量を有し、少なくとも３．５％は１，０００，０００ダルトンの分子量を有し、２，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも２．４％含む。本発明の組成物は、白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん並びに結腸がんからなる群から選択される１若しくは２以上のがんの治療において、免疫調節、免疫刺激のために、又は免疫系の不全若しくは免疫疾患を持つ個体の治療のために使用される。本発明の組成物は、１又は２以上のナチュラルキラー（ＮＫ，natural killer）細胞の７５〜８０％の増加を引き起こす。

また別の実施形態において、本発明は、１又は２以上のがんに対する治療を必要とする個体を特定するステップと、無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤を、週に２〜３回、１又は２以上のがんを治療するために十分な投薬量で注射するステップであって、該無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤が、脱イオン水に溶解された所定量の微細なポリマンナン抽出物及び１又は２以上の医薬品保存剤を含むステップとを含む、白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん並びに結腸がんからなる群から選択される１又は２以上のがんの治療について記述する。該方法は、血液試料を個体から１又は２以上の所定の間隔で抜き取るステップと、血液中のカスパーゼ３タンパク質のレベルを測定し、取得されたレベルを注射の前のレベルと比較するステップであって、カスパーゼ３のレベル増加が、１又は２以上のがん細胞のアポトーシスのレベル増加と直接関係しているステップとをさらに含む。

一態様において、無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤の投薬量は、個体の体重、年齢、民族性及び性別によって決まる。別の態様において、ポリマンナン抽出物はアロエ多糖体を含み、該アロエ多糖体は、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む。また別の態様において、アロエ多糖体は、１１，５００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン超の範囲の分子量を有する。本発明の方法において記述されたポリマンナン抽出物は、少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する。本発明の方法のポリマンナン抽出物は、１又は２以上のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の７５〜８０％の増加を引き起こす。

一実施形態において、本発明は、（ｉ）免疫系の不全又は免疫疾患を有し、免疫調節又は免疫刺激を必要とする個体を特定するステップと、（ii）所定投薬量の無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤を静脈内に投与するステップであって、該無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤が、脱イオン水に溶解された所定量の微細なポリマンナン抽出物及び１又は２以上の医薬品保存剤を含み、無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤の投薬量が、個体の体重、年齢、民族性及び性別によって決まるステップと、（iii）血液試料を個体から１又は２以上の所定の間隔で抜き取り、血液中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα，tumor necrosis factor-alpha）のレベルを測定し、取得されたレベルを注射の前のレベルと比較するステップであって、該ＴＮＦαのレベル増加が免疫調節又は免疫刺激を示すステップとを含む、免疫系の不全又は免疫疾患を持つ個体における免疫調節又は免疫刺激の方法を開示する。具体的な態様において、免疫疾患は免疫に関係する腫瘍である。一態様において、ポリマンナン抽出物はアロエ多糖体を含み、該アロエ多糖体は、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む。別の態様において、ポリマンナン抽出物は、１又は２以上のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の７５〜８０％の増加を引き起こす。また別の態様において、ポリマンナン抽出物は少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する。

本発明の特色及び利点のより完全な理解のために、ここで、本発明の詳細な説明を添付の図とともに参照する。
様々なグルコース及びマンノースサブユニットの保持時間を示すアロエ多糖体のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。様々なグルコース及びマンノースサブユニットに対応するピークを示すアロエ多糖体のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。本発明のポリマンナン抽出物のプロトン核磁気共鳴プロファイルの図である。メタノール沈殿アロエ多糖体濃縮物中の各多糖体分子群における多糖体の量を示すＨＰＬＣクロマトグラムの図である。メタノール沈殿アロエ多糖体濃縮物のプロトン核磁気共鳴プロファイルの図である。エタノール沈殿アロエ多糖体濃縮物中の各多糖体分子群における多糖体の量を示すＨＰＬＣクロマトグラムの図である。エタノール沈殿アロエ多糖体濃縮物のプロトン核磁気共鳴プロファイルの図である。イソプロピルアルコール沈殿アロエ多糖体濃縮物中の各多糖体分子群における多糖体の量を示すＨＰＬＣクロマトグラムの図である。イソプロピルアルコール沈殿アロエ多糖体濃縮物のプロトン核磁気共鳴プロファイルの図である。プロパノール沈殿アロエ多糖体濃縮物中の各多糖体分子群における多糖体の量を示すＨＰＬＣクロマトグラムの図である。プロパノール沈殿アロエ多糖体濃縮物のプロトン核磁気共鳴プロファイルの図である。

本発明の種々の実施形態の作製及び使用について以下で詳細に論じるが、本発明は、多種多様な特定の文脈において具現化され得る多くの適用可能な発明概念を提供することを理解すべきである。本明細書において論じられる具体的な実施形態は、本発明を作製及び使用するための具体的な手法の例証にすぎず、本発明の範囲の限界を定めるものではない。

本発明の理解を容易にするために、若干数の用語を以下で定義する。本明細書において定義されている用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」等の用語は、単数の構成要素のみを指すことではなく、具体例が例証のために使用され得る一般的な種類を包含することが意図されている。本明細書における術語は、本発明の具体的な実施形態について記述するために使用されるが、それらの使用法は、請求項において明示されている場合を除き、本発明の限界を定めるものではない。

本発明は、ポリマンナン抽出物を調製するためのプロセス、及び注射の形態の前記抽出物の免疫刺激化合物としての使用について記述する。免疫刺激は、ヒト由来のマクロファージ／単球を使用して評価され、細胞型は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の分泌について評価される。

アロエ多糖体は、概して、１０，０００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトンの分子量の鎖長を有する、グルコース及びマンノースという単純な糖で大部分が構成される分子であるとみなされている。マンノース含有量が高くなり、鎖長が長くなるほど、多糖体によって発現される免疫調節活性は大きくなる。これらのアロエ多糖体を含む様々な長い非分岐状鎖を、表１に収載する。

１００，０００ダルトン以上の分子量を持つアロエ多糖体を、表２に収載する。

ポリマンナン抽出物の前駆体材料については、本発明者らにより「Method of Processing Aloe Leaves」と題された先行特許（米国特許第６，０８３，５０８号、Avalos及びDanhof、２０００）において記述されている。ポリマンナン抽出物前駆体材料の分析の証明書を、表３において提示する。

図１は、種々のサイズのグルコース及びマンノースサブユニットの保持時間を示すアロエ多糖体調製物のサイズ排除クロマトグラムである。図２は、１００〜１０，０００，０００ダルトンの範囲の分子量を同定するアロエ多糖体調製物のサイズ排除クロマトグラムである。図３は、本発明のポリマンナン抽出物のプロトン核磁気共鳴プロファイルである。図３は、（ｉ）標準的な保存剤−安息香酸ナトリウム及びソルビン酸カリウムの非存在、（ii）より小型のモノヘキソースの存在、（iii）生のアロエ材料を加工する際に全葉方法論が用いられたことを示すイソクエン酸のピーク、（iv）リンゴ酸ピーク−アロエ・ベラのプライマリマーカーの存在、（ｖ）大型多糖体種の存在を裏付けるプロファイルの多糖体部分におけるアロエライド／アセマンナンピークの存在、並びに（vi）部分的にアセチル化された多糖体グルコマンナンの存在を裏付けるアセチル基が存在することを示す。

ポリマンナン抽出前のアロエ調製物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ，Size exclusion chromatography）：
機器：ＨＰＬＣシステムは、Hitachi社製L-7100ポンプ、及びWaters社製410示差屈折計と対になった7250オートサンプラーである。ＳＥＣは、カラムヒーター内、７０℃で動作する、Tosoh Biosep社製G6000 PWXL TSK Gel ３０ｃｍ×７．８ｍｍである。分子量標準物質は、Sigma社製−２，０００，０００ダルトン、１，０００，０００ダルトン、４８０，０００ダルトン、６６，０００ダルトン及び１８０ダルトン（グルコース）である。移動相は、流速０．７０ｍＬ／分の脱イオン水である。注射体積は１０ｕＬである。ＳＥＣ法がＰｕｇｈらにより記述されている（Pugh N., Ross S.A., ElSohly M.A., and Pasco, D.S. (2001). Characterization of Aloeride, a new high-molecular weight polysaccharide from Aloe vera with potent immunomodulatory activity. J Agr. Food Chem., 49, 1030-1034）。

アロエ沈殿剤評価研究：ＣＯＡＴＳ濃縮アロエの２５ｍｌの試料を２００ｍｌのビーカーにピペットで取り、１２５ｍｌの種々の多糖体沈殿剤液をビーカーに添加し、徹底的に撹拌した。沈殿した多糖体を、風袋を量った脱水濾紙に通す濾過によって収集し、濾過後、これを乾燥炉内に終夜置いた。翌朝、沈殿した多糖体の乾燥重量を決定した。本発明者らは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びプロパノールを包含する４つのアルコール沈殿剤を研究した。粉末のＨＰＬＣ手順を経て分子種すべての種々の量を決定し、２，０００，０００ダルトン超、１，０００，０００ダルトン超、４８０，０００ダルトン超、６６，０００ダルトン超を包含する、多糖体分子群のそれぞれにおける多糖体、及び非常に低分子量の種、例えば１８０の分子量を有するグルコースを含有する残留画分の量の決定とともに記録した（ＨＰＬＣデータを表６〜９に示す）。４つの沈殿剤メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びプロパノールに対応するＨＰＬＣクロマトグラムを、それぞれ図４Ａ、５Ａ、６Ａ及び７Ａに示す。沈殿物のプロトン核磁気共鳴プロファイルも取得され、図４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ及び７Ｂに示す。収集したデータを、表５に示す。

ポリマンナン抽出物は、沈殿から調製される。上記で記述したフリーズドライされたアロエ粉末を、水分含有量に対して適切に補正した後に秤量した。例えば、水分含有量が３．７％であり、８０ｇを必要とする場合、本発明者らは、８２．９６ｇ（８０ｇ＋（３．７％×８０）ｇ）だけ量り分けた。秤量したアロエ粉末を、ステンレス鋼製の沈殿槽内、１ガロンの脱イオン水（Ｄ．Ｉ，deionized water）に完全に溶解した。２．５ガロンの９５％エタノールを添加し、撹拌して完全混合を確実にした。槽をステンレス鋼製の蓋で覆い、混合物を終夜静置させた。

翌日、２ｍｌの透明上清を採取し、５ｍＬの９５％エタノールを添加し、試料を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。試料を沈殿について検査し、沈殿物が観察されなければ、沈殿が完了したとみなした。何らかの有意な程度の沈殿が観察されれば、追加の９５％エタノールを沈殿槽に添加した後、続行した。沈殿槽内の透明上清流体を、吸い上げることによって、槽の底部にある沈殿物を乱すことなくデカンテーションした。吸引漏斗（Whatman社製No. 42（登録商標）定量的無灰濾紙）を使用して、底部にある白色沈殿物を分離した。沈殿した物質を、６００ｍｌのVirtis社製凍結乾燥フラスコ中に削り取ることにより移し、フラスコの片側に物質を分布することによって大きい露出表面積を持つ薄層を形成した。凍結乾燥フラスコをシェル冷凍庫内に終夜置いた。次の日、冷凍内容物の入った冷却した凍結乾燥フラスコを、−９０℃及び１／３気圧で動作する凍結乾燥機に２４時間置いた。凍結乾燥機（lyophizer）を止め、凍結乾燥粉末を、均一に挽いた微粉末になるまで、小型の粉末粉砕機に入れた。挽いた粉末を秤量し、プラスチックの小型容器に入れ、該容器を冷凍庫内に保存した。

ポリマンナン抽出物の注射用溶液剤の調製：上記で記述した通りに調製したポリマンナン抽出物粉末（ＰＭＥ，polymannan extract powder）を、サイズ排除クロマトグラフィーによる測定で少なくとも２％のアロエライド含有量を有するよう、水分含有量で補正した後に秤量（１．５ｇ）した。１２５ｍｌの加温Ｄ．Ｉ水に、１ｍｌの濃ＨＣｌを添加し、撹拌し、続いてＰＭＥ粉末を常に撹拌しながらゆっくり添加した。すべてのＰＭＥ粉末が溶解して溶液が無色透明になるまで撹拌を続け、追加量の濃ＨＣｌを添加して、１．６〜１．７のｐＨを取得した（ｐＨメーターを使用して連続的に測定した）。追加のＤ．Ｉ水を添加して体積を１５０ｍｌに調整し、続いて１．６〜１．７のｐＨに確実になるようｐＨモニタリングした。次いで、ＰＭＥ溶液を、細孔径０．４５μｍのCorning（登録商標）１５０ｍｌフィルターシステムフラスコに注ぎ入れた。フラスコシステムを冷蔵庫に入れ、濾液を細孔径０．２２μｍのCorning（登録商標）１５０ｍｌフィルターシステムフラスコに移し、冷蔵庫内に終夜置いた。無菌条件下、フィルターシステムのフィルター頂部を除去し、ボトルを無菌キャップで密閉した。次いで（them）、ボトルを配合研究室に移し、無菌フード下、０．９％ベンジルアルコールを保存剤として添加し（最終生成物が複数回投薬使用用であるため）、溶液を無菌１０ｍＬガラスバイアルに入れ、複数回投薬クロージャー（multidosage closure）で密閉した。バイアルには、医師及び患者の名前とともに、バッチ番号、制御番号、製造日付、６か月の使用期限を記入したラベルを付ける。

ＰＭＥ免疫調節活性評価：免疫刺激活性は、メリーランド州のAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手したヒト由来のマクロファージ／単球を使用して評価する。細胞型を、ＴＮＦαの分泌によって評価した。標準的な細胞条件下、少量の最終ＰＭＥ生成物を培養物に導入した。サンプルを６、１２及び２４時間の時点で取り出し、ＴＮＦαレベルについて評価した。異なる細胞バッチにおいて不均一であるため、特定量のＴＮＦαは使用しなかった。臨床状況においては、免疫調節応答は、全白血球数、マクロファージ分画／単球分画数、白血球上の表面マンノース受容体の数、マンノース結合担体タンパク質の量等のような変化する血液学的要因により、変動することが予測される。

白血球プロファイルは、細胞が絶えず血流に出入りするのに伴って変動する。ＰＭＥに対する細胞のマンノース受容体の親和性は、マンノース結合タンパク質のそれをはるかに超えるものである。新たなマクロファージ／単球が血流に入ると、ＰＭＥは循環しているマンノース結合タンパク質から新たな細胞へと移される。マクロファージ／単球マンノース結合タンパク質と結合したＰＭＥは、各種のサイトコミュニケーター（cytocommunicators）の放出をもたらす。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−６を包含するサイトコミュニケーターは、がん患者においてその腫瘍検出機能を失った免疫系の監視機能低下を正常に戻し、患者の免疫系が悪性細胞を特定及び除去することを可能にする。

１，０００，０００、３００，０００、１００，０００、５０，０００及び２５，０００の分子量を有するポリマンナン抽出物中のアロエ多糖体は、いずれもカスパーゼ活性を示した。このカスパーゼ３、カスパーゼ９及びシトクロム−Ｃ活性は、カスパーゼ３が腫瘍細胞アポトーシスのメディエーターであるため、本発明の組成物による悪性腫瘍の治療においてキーポイントとなる。開始剤（アピカル（apical））カスパーゼ３及びエフェクター（エグゼキューショナー（executioner））カスパーゼ３並びにシトクロム−Ｃの免疫調節活性は、現存するものとして実証されており、腫瘍細胞アポトーシスのメディエーター系であるとみなされる。

本発明者らは、様々な種類のがん患者１０４名について本明細書において記述されている組成物を試験した。白血病及びリンパ腫が、本発明のポリマンナン抽出物に対して最も応答性であった（９８％を超える）。前立腺がん、乳がん及び結腸がんも、本発明のポリマンナン抽出物に対して応答性であった。試験では、ポリマンナン（polyamman）抽出物を注射として投与した（adminsiteres）。１０ｍｇのポリマンナン抽出物を、無菌注射用水中で再構成して、約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。これを週に２〜３回注射した。次いで、患者から血清試料を一定の間隔で採取し、カスパーゼ３活性についてモニターした。

本明細書において論じられている任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実装することができ、逆もまた然りであることが企図されている。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。

本明細書において記述されている特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、例証として示されていることが理解されよう。本発明の主要な特色は、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態において用いられ得る。当業者であれば、本明細書において記述されている具体的な手順の多数の等価物を、認識する、又は日常実験以上のものを使用することなく解明することができるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、請求項によって網羅される。

本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技量レベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が、具体的に且つ個々に参照により組み込まれると指示されているのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、請求項及び／又は明細書において用語「を含む」と併せて使用される場合、「１」を意味し得るが、「１又は２以上の」、「少なくとも１の」及び「１又は１を超える」の意味とも一致する。本開示は、用語「又は」が代替物のみ及び「及び／又は」を指すという定義を裏付けてはいるが、請求項における用語「又は」は、代替物のみを指すことが明示的に指示されているか又は代替物が相互排他的であるのでない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。本出願全体を通して、用語「約」は、ある値が、デバイスの誤差の固有の変動、値を決定するために用いられている方法、又は研究対象間に存在する変動を包含することを示すために使用される。

本明細書及び請求項（複数可）において使用される場合、語「を含む（comprising）」（並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「を有する（having）」（並びに「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」等のｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「を包含する（including）」（並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」等のｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）又は「を含有する（containing）」（並びに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」等のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、包括的又はオープンエンド型であり、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。

用語「又はそれらの組合せ」は、本明細書において使用される場合、該用語に先行する収載されている項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを、及び特定の文脈において、順序が重要ならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも包含することが意図されている。この例に続き、明白に包含されるのは、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等、１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せである。当業者であれば、典型的には、文脈から明らかな場合を除き、任意の組合せ中の項目又は用語の数に限定はないことを理解するであろう。

本明細書において開示及び特許請求されている組成物及び／又は方法はすべて、本開示を踏まえて、必要以上の実験をすることなく作製及び実行され得る。本発明の組成物及び方法について、好ましい実施形態の観点から記述してきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法に、並びに本明細書において記述されている方法のステップ又は一連のステップにおいて、変形形態を適用できることが、当業者には明らかとなるであろう。当業者に明らかである、すべてのそのような同様の代用物及び修正形態は、添付の請求項によって定義される、本発明の趣旨、範囲及び概念内であると考えられる。

（参考文献）
United States Patent No. 7,196,072: High Molecular Weight Polysaccharide Fraction From Aloe Vera with Immunostimulatory Activity
United States Patent No. 6,083,508: Method of Processing Aloe Leaves
United States Patent Application No. 2006/0084629: Immune System Activating Formula Composed of Selected Long Chain Polysaccharides From Natural Sources
¹Pugh N., Ross S.A., ElSohly M.A., and Pasco, D.S. (2001). Characterization of Aloeride, a new high-molecular weight polysaccharide from Aloe vera with potent immunomodulatory activity. J Agr. Food Chem., 49, 1030-1034

Claims

ポリマンナン抽出物の微粉末の調製方法であって、
所定量のフリーズドライされたアロエ粉末を秤量するステップであって、前記量が水分含有量に対して補正されるステップと、
前記フリーズドライされたアロエ粉末を脱イオン水に溶解して、溶液を形成するステップと、
有機溶媒を前記溶液に添加して第１の混合物を形成するステップであって、前記有機溶媒と前記脱イオン水との比が少なくとも２．５：１であるステップと、
前記第１の混合物を少なくとも８時間静置させるステップと、
所定体積の上清を前記第１の混合物から抜き取り、過剰体積の前記上清溶液を添加して、第２の混合物を形成するステップと、
前記第２の混合物を遠心分離するステップと、
第２の混合物中における沈殿物の存在を観察するステップと、
第２の混合物中において任意の沈殿物が観察された場合に、追加量の前記有機溶媒を第１の混合物に添加するステップと、
吸い上げることによって第１の混合物の上清をデカンテーションするステップであって、前記デカンテーションが、第２の混合物中において沈殿物が観察されない場合にのみ実施されるステップと、
減圧下、濾紙及び吸引漏斗を使用して第１の混合物から前記沈殿物を濾過するステップと、
削り取ることによって前記吸引漏斗から前記ポリマンナン抽出物の粉末を回収するステップと、
キャップをした凍結乾燥フラスコ中の前記ポリマンナン抽出物の粉末を、冷凍庫内に少なくとも８時間置くステップと、
前記ポリマンナン抽出物の冷凍粉末を、凍結乾燥機内で凍結乾燥させるステップと、
前記ポリマンナン抽出物の凍結乾燥粉末を、粉砕機内で細粒質に粉砕するステップと
を含む、前記方法。
ポリマンナン抽出物の微粉末を、秤量し、ラベル付けし、容器内に保存するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、アロエ・ベラ、キダチアロエ、アヤニシキ、タカロカイ、アロエ・ニエリエンシス、チヨダニシキ（Aloe variegate）、ホンロカイ及びアロエ・ウィルディからなる群から選択されるアロエ種に由来する、請求項１に記載の方法。
有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びプロパノールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末がアロエ多糖体を含み、前記アロエ多糖体が、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項１に記載の方法。
アロエ多糖体が、グルコース、マンノース、アラビノース及びガラクトースからなる群から選択される単糖をさらに含む、請求項５に記載の方法。
アロエ多糖体が、１１，５００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン超の範囲の分子量を有する、請求項５に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のアロエ多糖体を有する、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、６６，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも１４％含む、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、４８０，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも９％含む、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、１，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも３．５％含む、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、２，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも２．４％含む、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末中における２，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体の量が、１．３２％〜６．３６％の範囲である、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末中における１，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体の量が、２．５５％〜３．８９％の範囲である、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末中における４８０，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体の量が、６３．８５％〜７３．３６％の範囲である、請求項１に記載の方法。
フリーズドライされたアロエ粉末が、グルコース、有機酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択される１又は２以上の残留低分子量種を含有し得る、請求項１に記載の組成物。
１又は２以上の残留低分子量種が、１４％〜２４％の範囲の量で存在する、請求項１７に記載の方法。
ポリマンナン抽出物の微粉末が、医薬組成物の調製において使用される、請求項１に記載の方法。
医薬組成物が、白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん並びに結腸がんからなる群から選択される１又は２以上の悪性腫瘍の治療において、並びに１又は２以上の免疫障害の治療のために使用される、請求項１９に記載の方法。
脱イオン水に溶解された所定量の微細なポリマンナン抽出物と、
１又は２以上の医薬品保存剤と
を含む、ポリマンナン抽出物の注射用製剤。
注射用製剤が無菌である、請求項２１に記載の組成物。
１又は２以上の医薬品保存剤が、パラベン、安息香酸及びそれらの塩、水銀剤、第４級アンモニウム塩、ベンジルアルコール及び他の関連アルコール、並びにフェノールからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
保存剤がベンジルアルコールである、請求項２１に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物がアロエ多糖体を含み、前記アロエ多糖体が、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項２１に記載の組成物。
アロエ多糖体が、グルコース、マンノース、アラビノース及びガラクトースからなる群から選択される単糖をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
アロエ多糖体が、１１，５００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン超の範囲の分子量を有する、請求項２５に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物が少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する、請求項２１に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物が、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のアロエ多糖体を有する、請求項２１に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物が、６６，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも１４％含む、請求項２１に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物が、４８０，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも９％含む、請求項２１に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物が、１，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも３．５％含む、請求項２１に記載の組成物。
ポリマンナン抽出物が、２，０００，０００ダルトンの分子量を有するアロエ多糖体を少なくとも２．４％含む、請求項２１に記載の組成物。
組成物が、白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん並びに結腸がんからなる群から選択される１又は２以上のがんの治療において使用される、請求項２１に記載の組成物。
注射用製剤が、免疫調節、免疫刺激のために、又は免疫系の不全若しくは免疫疾患を有する個体の治療のために使用される、請求項２１に記載の組成物。
１又は２以上のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の７５〜８０％の増加を引き起こす、請求項２１に記載の組成物。
白血病及びリンパ腫、前立腺がん、乳がん並びに結腸がんからなる群から選択される１又は２以上のがんの治療のための方法であって、
１又は２以上のがんに対する治療を必要とする個体を特定するステップと、
無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤を、週に２〜３回、前記１又は２以上のがんを治療するために十分な投薬量で注射するステップであって、前記無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤が、脱イオン水に溶解された所定量の微細なポリマンナン抽出物及び１又は２以上の医薬品保存剤を含むステップと
を含む、前記方法。
血液試料を個体から１又は２以上の所定の間隔で抜き取るステップと、
前記血液中のカスパーゼ３タンパク質のレベルを測定し、取得した前記レベルを注射前のレベルと比較するステップであって、カスパーゼ３のレベル増加が、１又は２以上のがん細胞のアポトーシスのレベル増加と直接関係しているステップと
をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤の投薬量が、個体の体重、年齢、民族性及び性別によって決まる、請求項３７に記載の方法。
ポリマンナン抽出物がアロエ多糖体を含み、前記アロエ多糖体が、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項３７に記載の方法。
アロエ多糖体が、１１，５００ダルトン〜１０，０００，０００ダルトン超の範囲の分子量を有する、請求項４０に記載の方法。
ポリマンナン抽出物が少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する、請求項３７に記載の方法。
ポリマンナン抽出物が、１又は２以上のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の７５〜８０％の増加を引き起こす、請求項３７に記載の方法。
免疫系の不全又は免疫疾患を有する個体における免疫調節又は免疫刺激の方法であって、
免疫系の不全又は免疫疾患を有し、免疫調節又は免疫刺激を必要とする個体を特定するステップと、
所定投薬量の無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤を静脈内に投与するステップであって、前記無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤が、脱イオン水に溶解された所定量の微細なポリマンナン抽出物及び１又は２以上の医薬品保存剤を含み、前記無菌注射用ポリマンナン抽出物製剤の投薬量が、前記個体の体重、年齢、民族性及び性別によって決まるステップと、
血液試料を前記個体から１又は２以上の所定の間隔で抜き取るステップと、
前記血液中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）のレベルを測定し、取得された前記レベルを注射前のレベルと比較するステップであって、前記ＴＮＦαのレベル増加が免疫調節又は免疫刺激を示すステップと
を含む、前記方法。
免疫疾患が免疫に関連する腫瘍である、請求項４４に記載の方法。
ポリマンナン抽出物がアロエ多糖体を含み、前記アロエ多糖体が、１又は２以上の短鎖、中鎖、長鎖、極長鎖多糖体、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項４４に記載の方法。
ポリマンナン抽出物が、１又は２以上のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の７５〜８０％の増加を引き起こす、請求項４４に記載の方法。
ポリマンナン抽出物が少なくとも２５％のアロエ多糖体を有する、請求項４４に記載の方法。