KR100678238B1

KR100678238B1 - 알로에로부터 면역조절성 다당류를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100678238B1
Application number: KR1020007003894A
Authority: KR
Inventors: 자이하우 퀴우; 벨라이드 마히오우
Original assignee: 유니젠 파아마슈티컬스,인크.
Priority date: 1997-10-10
Filing date: 1998-10-09
Publication date: 2007-02-01
Also published as: EP1036187A1; JP2001520019A; JP4542262B2; EP1036187A4; US6436679B1; KR100729887B1; US6133440A; KR20010015736A; US6271214B1; WO1999019505A1; KR20060103285A

Abstract

본 발명은 알로에로부터 생물학적으로 활성인 다당류를 분리 및 제조하는, 신속하고 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 생성된, 다당류의 활성화된 혼합물(본원에서는 "면역-10"으로 언급됨)을 포함한다. 본 발명은 또한 면역 촉진제, 면역 조절제, 상처 치유제로서의 상기 다당류의 용도를 포함한다. 생성되는 면역 조절 복합체는, 선행기술의 알콜 침전 체계(scheme)를 사용하여 분리된 벌크(bulk) 탄수화물보다 더 안정하며 더 높은 활성을 갖는다.

알로에, 다당류 혼합물, 면역-10, 면역 촉진제, 면역 조절제,

Description

알로에로부터 면역조절성 다당류를 제조하는 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF IMMUNOMODULATORY POLYSACCHARIDES FROM ALOE}

본 발명은 알로에로부터 다당류(polysaccharide)를 정제 및 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 알로에로부터 면역조절 활성을 지닌 다당류를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 생산된, 다당류의 활성화된 혼합물(본원에서는 "면역-10" 또는 "면역-10 다당류"로 언급함)을 포함한다. 본 발명은 또한 면역 촉진제, 면역 조절제 및 상처 치유제로서의 다당류의 용도를 포함한다.

알로에는 많은 생물학적 활성 물질들을 함유하는 복잡한 식물이다(코헨 외 다수의 문헌, 상처 치유/생화학적 및 임상적인 면, 제1판, WB 사운더스, 필라델피아(1992)). 알로에의 종은 300 개 이상 알려져 있으며, 그 중 대부분은 아프리카의 토착종이다. 그 생물학적 활성 물질들은, 알로에 잎의 3개의 별도 영역 - 잎의 피층(cortex), 잎 껍질(rind) 또는 잎 중앙내에 위치한 투명한(clear) 겔 필릿(fillet) 및 잎 껍질과 내부 겔 필릿 사이에 위치한 관다발의 내초(pericyclic) 세포에 함유된 황색 유체(라텍스로 호칭됨) 내에 존재한다고 연구에 의해 밝혀졌다. 역사적으로, 알로에 제품은 화상, 미란(sore) 및 기타 상처의 치료를 위한 피부과 용도로 사용되었다. 이 용도들로 인해, 임상적 효능을 지닌 화합물들, 특히 항염증 활성을 지닌 화합물들을 알로에로부터 동정(identify)하기 위한 연구들이 많이 행해졌다.(예를들면 그린드레이(Grindlay) 및 레이놀즈(Reynolds)(1986) J. of Ethnopharmacology 16:117-151; 하트(Hart) 외 다수.(1988) J. of Ethnopharmacology 23: 61-71 참조). 이들 연구의 결과로서, 항-종양 활성, 항-산(acid) 활성(히라타(Hirata) 및 슈거(Suga)(1977) Z. Naturforsch 32c:731-734), 항-당뇨 활성, 타이로시나아제(tyrosinase) 억제 활성(야기(Yagi) 외 다수. (1987) Planta Medica 515-517) 및 항산화제 활성(국제 특허 출원 PCT/US95/07404, 1996년 12월 19일 공개, 국제 공개 번호 WO 96/40182)을 비롯하여, 다양한 생물학적 활성을 지니는 알로에 화합물에 대한 보고서가 많이 있다.

알로에 제품이 면역계를 자극할 수 있다는 것이 또한 보고되어 있다. 면역계를 자극하는 알로에의 능력은, 겔 내에 존재하는 다당류에 기인한 것이다.(예를들면 데이(Day) 외 다수.(1922) J. Am. Pharm. Assoc. 11: 462-463; 플라그(Flagg)(1959) American Perfumes and Aromatics 74:27-28, 61; 왈러(Waller) 외 다수.(1978) Proc. Okla.Acad.Sci. 58:69-76; 스처부킨(Shcherbukhin) 외 다수.(1979) Applied Biochemistry ＆ Microbiology 15:892-896; 만달(Mandal) 외 다수.(1980) Carbohydrate Research 86:247-257; 만달 외 다수.(1980) Carbohydrate Research 87:249-256; 윈터스(Winters) 외 다수.(1981) Eco. Botany 35:89-95; 롭손(Robson) 외 다수.(1982) J.Burn Care Rehab. 3:157-163; 이반(Ivan) 외 다수.(1983) Drug ＆ Cosmetic Ind. 52-54,105-106; 스모더스(Smothers) (1983) Drug ＆ Cosmetic Ind. 40:77-80; 만달 외 다수.(1983) Indian J. of Chem. 22B:890-893; 빌카스(Vilkas) 외 다수(1986) Biochimie 68:1123-1127; 왈러 외 다수 (1994) Cosmetic Toiletries Manufacturing Worldwide 64-80; 맥카널리(McAnally) 외 다수의 미국 특허 제5,308,838호)

알로에 제품은 또한 자외선 조사의 유해한 영향에 대해서 피부를 보호하기 위해 향장(cosmetic) 산업에서도 광범위하게 사용된다(그롤리어(Grollier)외 다수. 미국 특허 4,656,029, 1987년 4월 7일 특허됨). 사람 및 실험 동물에 있어서 피부가 만성적으로 자외선 조사에 노출되면, 피부암이 유발된다. 실험 동물의 피부를 자외선 B (UVB) 조사(280-320 nm)에 노출시키면 피부 면역계의 억제가 유발되어, UV(자외선)-유도된 피부 암, 접촉-감작성 합텐(hapten) 및 다양한 전염성 미생물에 대한 면역 반응을 전개하는 피부 면역계의 능력이 손상된다(스트릭랜드(Strickland)(1994) J.Invest.Dermatol. 102:197-204, 및 여기에 삽입된 참고문헌 참조). 스트릭랜드 외 다수의 연구에서, 알로에 베라 겔(Aloe vera gel)을 국소 적용하면, UVB 노출에 의해 야기되는 면역계의 억제가 감소된다는 것이 밝혀졌다(스트릭랜드(1994) J.Invest.Dermatol. 102:197-204).

면역계의 억제를 감소시키는 천연(native) 겔의 능력은, 매우 낮고 불규칙하며 또한 시간이 지나면서 감소된다. 이에 대한 한가지 가설은, 알로에 식물 내에 천연적으로 존재하는 효소 및/또는 박테리아 분해에 의해, UV-B 에 대한 차단(protective) 인자가 가수분해된다는 것이다. 그러므로, 알로에로부터 다당류를 분리하는 것이 이 면역조절 활성을 보존하는 데 도움이 될 것이다. 그러나, 알로에로부터 다당류를 벌크(bulk) 분리하기 위한 선행기술 방법들은, 그 면역조절 활성을 효과적으로 보존하지 않는다. 이들 방법은, 예를들면 미국 특허 출원 제4,957,907호, 제4,966,892호 및 제5,356,811호에 기재되어 있는데, 장시간(4 ~ 24시간)의 알콜 침전 및 원심분리 단계를 사용한다. 선행기술 방법들이 알로에 겔의 면역조절 활성을 효과적으로 보존하지 못하는 것을 고려해 볼 때, 면역조절 활성이 보유 및 안정화될 수 있는, 알로에로부터의 다당류의 분리 방법을 갖는 것이 유용하다. 본 발명은 이러한 방법을 제공한다.

본원은 알로에로부터 다당류의 혼합물을 분리 및 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 상기의 방법에 의해 생산된 다당류의 활성화된 혼합물과, 이 혼합물의 면역 촉진제, 면역 조절제 및 상처 치유제로서의 용도도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 다당류의 활성은, 천연 알로에 겔 추출물의 활성보다 훨씬 높고 훨씬 더 안정하며 재현성도 매우 크다.

본 발명의 방법은 (a) 알로에로부터 알로에 겔 즙(juice)을 추출하는 단계; (b) 한정된 탄수화물 가수분해에 적합한 시간동안 및 온도에서 상기 알로에 겔 즙내에 있는 전체 다당류의 제어되고 한정된 효소적 가수분해를 수행하는 단계; (c) 상기 가수분해를 종결시키는 단계; 및 (d) 상기 가수분해된 생성물을 탈색 및 여과 시키는 임의의(optional) 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서는, 25℃ ±1℃ 에서 2 ~ 2.5 시간동안 셀룰라아제를 첨가하는데 216 L 의 겔 추출물에 대해 0.5 g ~ 2.5 g 의 셀룰라아제의 비율로 첨가하여 한정된 가수분해를 수행한다. 도 1에 본 발명의 방법의 개략도가 제시되어 있다.

본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 분리 및 제조된 다당류의 혼합물(본원에서는 "면역-10" 또는 "면역-10 다당류"로 언급되어 있음)을 포함한다. 상기 조성물(composition of matter)의 특징이 하기에 상세히 기재되었다.

본 발명은 또한, 면역 촉진제, 면역 조절제 및 상처 치유제로서의 면역-10의 용도를 포함한다. 면역-10은, UVB 조사에 노출된 마우스내에서 접촉 과민성(contact hypersensitivity: CH)의 억제를 방지하고 또 사람 표피모양암종(epidermoid carcinoma) 세포주내에서 UVB 조사에 의해 유발된 종양괴사인자(TNF-α) 방출을 억제한다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 면역-10은, 면역 결핍 또는 면역-억제 질병을 지니고 있는 사람들을 위해 또는 HIV와 같은 질병의 치료를 위해, 사람 면역계의 복원(restoration) 또는 촉진을 위한 경구용 또는 국소용 제제로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 면역-10은 또한 상처 치유제로서도 유용하다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 다당류는, 천연 알로에 겔보다 활성이 높고 더 안정하다.

본원에 기재된 방법은 알로에 다당류의 한정되고 제어된 가수분해를 포함하는데, 이 가수분해는 알로에 다당류의 안정성과 면역 조절 활성을 증가시키는 것으로 작용한다. 이 방법은, 선행기술의 방법보다 더 빠르고 더 간단하며 생산규모의 확대가 더 용이하고, 유기용매의 사용을 포함하지 않는다. 더우기, 본원에 기재된 방법은 알로에 다당류의 면역 조절 활성에 손실을 주지 않으면서 알로에 다당류의 용해도를 높이고 그 용액의 점도를 감소시킨다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 면역-10은, 동일한 알로에 겔 추출물로부터 정제된, 활성화된 벌크 다당류와 정성적으로(qualitatively) 유사한 UVB-차단(protective) 활성을 나타내지만, 벌크 다당류보다는 높은 고유 활성도(specific activity)를 가진다. 부가적으로, 정제된 면역-10은 천연 알로에 겔보다 2배 이상 높은 UVB CH(접촉 과민성) 복원 활성을 나타낸다.

상기의 일반적인 설명과 하기의 상세한 설명은 단지 본원 발명을 예시 및 설명하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 청구범위를 제한하는 것은 아니다.

본원은, 정의되고(defined) 생물학적으로 활성인 다당류 혼합물을 알로에로부터 분리 및 활성화시키는 방법에 관한 것이다. "알로에"라는 용어는 릴리아시(Liliaceae)과에서 세계적으로 발견되는 식물의 속명(genus)을 의미하며, Aloe barbadensis 식물은 릴리아시(Liliaceae)과에 속하는 종이다. 본 발명의 방법은, (a) 알로에로부터 알로에 겔 즙(juice)을 추출하는 단계; (b) 한정된(limited) 탄수화물 가수분해에 적합한 시간동안 및 온도에서 상기 알로에 겔 즙내에 있는 전체 다당류의 제어되고 한정된 가수분해를 수행하는 단계; (c) 상기 가수분해를 종결시키는 단계; 및 (d) 상기 가수분해된 생성물을 탈색 및 여과하는 임의의 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 개략도가 도 1에 제시되어 있다. 도 1을 참고로 살펴보면, 알로에 겔 즙(AGJ)은 신선한 겔 필릿(fillet)으로부터 당해분야에서 공지된 방법으로 생산되며, 이 공지 방법은 분쇄(grinding)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는데, 이 공지의 분쇄 방법은 "톰프슨 알로에 즙 추출기"(텍사스주 할링겐에 소재하는 Thompson Manufacturing Co.)를 사용하거나 압력(pressure) 롤러를 사용한다. 그후, 알로에 겔 즙은 가수분해제와 혼합된다. 가수분해제의 예는, 효소, 예를들면 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase) 또는 만나나아제(mannanase)와, 비효소성 가수분해제, 예를들면 염산(hydrochloric acid) 및 트리플루오로아세트 산(trifluoroacetic acid)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 가수분해제는 효소이다. 가장 바람직하게는 가수분해제는 셀룰라아제, 예를 들어 셀룰라아제 4000 (Valley Research Inc.)이다. 생성되는 혼합물은, 한정된 탄수화물 가수분해에 적합한 시간동안 및 온도에서 인큐베이트된다(실시예 1 참조). 예를들어, 가수분해제가 셀룰라아제인 경우는, 이것은 216 L 의 겔 추출물에 대해 0.5 g ~ 2.5 g 의 셀룰라아제의 비율을 사용하여 25℃ ±1℃ 에서 2 ~ 2.5 시간동안이 바람직하다(실시예 4 참조).

그 후 적절한 시간이 지난 후에 탄수화물의 가수분해를 종결시킨다. 셀룰라아제가 사용된 경우에는, 이것은 바람직하게는 상기의 소화(digestion) 혼합물을 고온으로 가열시킴으로써 행해진다. 그 결과 생성된 면역-10은 이 단계에서 적색인데, 이 색은, 면역-10과 샤르콜(charcoal) 입자를 혼합하여 슬러리(slurry)를 형성시킴에 의해(실시예 1 참조) 또는 칼럼 크로마토그래피(column chromatography)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 적합한 크로마토그래피 수지(resin)의 예로는 역상(reverse-phase) 수지를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 역상 수지의 예는, 방향족(aromatic) 수지, 예를들면 XAD 계열의 수지 및 CG-161 과, 비방향족 수지, 예를들면 C-4, C-8 및 C-18 를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 샤르콜 입자를 제거하기 위해 이러한 면역-10의 슬러리(slurry)를 여과시킨다. 이것은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 다단계 여과 체계(scheme)를 사용하는데, 이 다단계 여과 체계에서 슬러리는 기공(pore)의 크기가 점차적으로 작아지는 일련의 필터를 통과한다(실시예 1과 표 1 및 2 참조). 예를들어 일부 구체예에서 슬러리는 30 ㎛의 필터 종이를 통해 여과된 다음, 1.0 ㎛의 필터 종이를 통해 여과되고 최종적으로 0.7 ㎛의 필터 종이를 통해 여과된다. 일부 구체예에서는 셀라이트(celite), FW12 또는 FW14와 같은 여과보조제(filtration aid)가, 여과될 혼합물내에 포함된다. 이 방법을 사용한 여과 후에, 여과액(filtrate)은 탈색되고 미세한 샤르콜 입자가 존재하지 않는다.

임의의(optional) 탈색 및 여과 후에, 면역-10은 저장을 위해서, 동결건조(lyophilization) 또는 스프레이-건조(spray-drying)에 의해 건조될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용한 전형적인 수율(yield)은, 1L의 알로에 겔 즙당 대략 6g의 동결건조된 고체이다. 세파로오스(Sepharose) CL-4B 칼럼상에서의 면역-10의 크로마토그래피는, 490㎚에서의 2개의 탄수화물 피크(peak)의 존재(도 2)에 의해서 증명된 바와 같이, 면역-10이 다당류 및 단당류 분획 둘다를 함유하는 것을 보여준다. 면역 조절 활성이 다당류 피크내에 포함되어 있긴 하지만 상기 단당류들이 이 활성에 영향을 미치지 않는다(데이타는 도시되지 않음). 단당류는 한정된 효소적 소화(digestion) 전에 알로에 겔 즙의 다이아필트레이션(diafiltration)/투석에 의해 제거될 수 있다.

실시예 2 및 3에서는 약제 등급의 면역-10를 제조하는 방법을 설명하고 있는데, 약제 등급의 면역-10은 더 큰 생물학적인 활성과 안정성을 갖는 보다 순수한 형태의 면역-10이다.

본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 생산된, 활성화된 다당류(본원에서는 "면역-10" 또는 "면역-10 다당류"로 언급됨)를 포함한다.

면역-10 내의 활성화된 다당류의 조성과 화학 구조를, 95% 이상의 순도를 갖는 약제 등급의 면역-10을 사용하여 결정하였다. 이는 하기와 같다.

크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 분석은, 50 ~ 200 kDa 의 범위와 함께 면역-10 내의 다당류의 평균 분자량이 70 ~ 80 kDa 이라는 것을 보여준다. 세파덱스 G-100 칼럼(Sephadex G-100 column)상에서의 크기 배제 크로마토그래피 및 슈퍼로우스(Superose) 12 칼럼(H10/30 Pharmacia)상에서의 HPLC 겔 투과(permeation)를 사용하여, 분자량을 측정했다.

단당류 조성의 분석에 의하면, 면역-10내의 다당류는 D-갈락토오스(D-galactose)(대략 5% 이하), D-글루코오스(D-glucose)(대략 5% 이하) 및 D-만노오스(D-mannose)(대략 90%)를 함유한다. 면역-10내의 다당류는 또한 미량(trace amount)의 자일로오스(xylose) 및 아라비노오스(arabinose)를 함유할 수도 있다.

더 고도로 정제된(실시예 2 및 3 참조) 약제 등급의 면역-10은, 1 대 9.6 ±2.2 의 비율로 D-갈락토오스 및 D-만노오스를 주로 함유하고 있다.

양자(proton) 및 ¹³C NMR-스펙트로스코피(spectroscopy) 분석은, 상기 단당류의 결합(linkage)이 주로 β-1,4 결합이라는 것을 나타낸다. 양자(proton) 및 ¹³C NMR 스펙트럼은, 바리안(Varian) XL-300 분광계 상에서 분석되었다. 면역-10 다당류의 주된 구조는 β-1,4 글루코만난(glucomannan)이다. 더우기 다당류는 고도로 아세틸화(acetylated)되어 있다( 평균적으로 당(sugar) 잔기 1개당 대략 1개의 아세틸기). 단당류 유니트의 2, 3 및 6 위치는 -OH 또는 -OAc로 독립적으로 치환될 수 있다.

면역-10의 크로마토그래피는, 면역-10 이 다당류 및 단당류 분획 둘다를 함유하는 것을 나타낸다(도 2 참조). 활성화된 다당류의 단당류 조성은, 디오넥스(Dionex) 바이오-Lc 시스템을 사용하는 펄스(pulsed) 전류측정분석(amperometric) 검출기(HPAEC-PAD)와 함께 디오넥스 카보팩(CarboPac) PA1 칼럼상에서의 고성능 음이온-교환 크로마토그래피에 의해, 측정되었다. 면역 조절 활성이 다당류 피크(peak)내에 포함되어 있긴 하지만 상기 단당류들이 이 활성에 영향을 미치지 않는다(데이터는 도시되지 않음). 면역-10은 또한, 그 활성에 영향을 미치지 않는 다양한 염을 함유할 수도 있다.

면역-10은 열 및 단백질분해효소(protease)의 처리에도 그 생물학적 활성을 잃지 않고 안정하다. 이것은, 면역-10의 생물학적 활성이 활성화된 다당류에서 유 래하는 것일 수 있다는 것을 추가로 나타낸다.

본 발명의 방법에 의해 분리된 면역-10은, 종래의 공지된 방법에 의해 분리된 알로에 다당류보다 훨씬 더 안정하다. 실시예 5 및 6 (도 5 ~ 8)은 다당류의 가공방법과 그 안정성 사이의 관계를 나타낸다.

본 발명은 또한 면역 촉진제, 면역 조절제 및 상처 치유제로서의 면역-10의 용도를 포함한다.

면역조절 활성.

면역-10은, UVB 에 의해 억제된 면역반응(접촉 과민성:CH)을 복원시켜 주고, 또한 케라티노사이트(keratinocyte)(사람 표피모양암종 세포, KB 세포)로부터의 UVB-유도된 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 방출을 억제한다.

실시예 7 에 개략적으로 기재된 바와 같이, UVB에 의해 억제된 피부 면역 기능을 반전시키는 면역-10의 능력을 측정하기 위해 국소 억제(suppression) 모델을 사용하였으며, 본원에서는 이러한 면역-10의 능력을 면역-10의 복원 활성(restorative activity)으로 언급했다. (본원에 참고로서 삽입된, 스트릭랜드(1994) J.Invest.Dermatol. 102:197-204 및 빈섹(Vincek) 외 다수 (1994) Cancer Research 53:728 참조). 국소 억제 모델에 있어서 C3H/HeN 마우스가 저용량의 UVB 조사에 노출되면, 조사된 위치에 도포된 합텐(hapten)에 대한 접촉 과민성(CH) 반응의 유도가 억제된다. 간단히 말해서, 마우스의 복부의 털을 제거하고 2000 J/m²으로 UVB 조사에 노출시킨 후 공지의 비이클(vehicle)인 아쿠아퍼(Aquaphor)내에 있는 면역-10 (0.25mg/mL)을 조사된 부위에 도포하였다. 3일 후에, 조사된 부위에 2,4-디니트로벤젠(DNFB)(0.3%, 50㎕)을 도포함으로써 마우스를 감작(sensitize)시켰다. 6일 후에, 마우스의 귀의 두께를 측정한 후 DNFB(0.2%, 5㎕)를 마우스 귀의 양면에 도포하여 마우스를 챌린지(challenge)시켰다. 24시간 후에 마우스 귀의 두께를 다시 측정하였다. 그 결과가 도 8에 도시되었다.

수행한 실험의 대부분에서, UVB 노출은, 접촉 과민성(CH) 반응을 80~100% 억제시켰다. 도 8를 참조해 보면, 이 군이 음성(억제) 대조군(0%의 접촉 과민성 반응)으로 사용되었다. 마우스의 양성 대조군은 UVB의 조사를 받지 않았고 면역-10으로 처리되지도 않았으나(비이클만 존재), 감작되었고 챌린지되었다(100%의 접촉 과민성 반응). 마우스의 비이클(블랭크(blank)) 대조군은 UVB의 조사를 받지 않았고 면역-10으로 처리되지도 않았으며(비이클만 존재) 감작되지도 않았으나, 챌린지되었다. 이 군은, 챌린지 화학물질 자극에 의하여 유발된 마우스 귀의 순수(net) 팽윤(swelling)을 빼는 데 사용되었다. 면역-10으로 처리된 마우스 군은, 비이클만 사용하는 대신에 비이클내의 면역-10으로 마우스를 처리했다는 점을 제외하고는, 억제 대조군과 동일한 방법으로 처리되었다. 면역-10에 의한 회복(recovery) 백분율은 하기의 식을 사용하여 계산했다.

회복% (% Recovery) = (A-B)/(C-B) X 100

여기서,

A = 면역-10으로 처리된 군의 귀의 순수(net) 팽윤 - 블랭크군의 귀의 순수 팽윤;

B = 억제군의 귀의 순수 팽윤 - 블랭크군의 귀의 순수 팽윤; 및

C = 양성군의 귀의 순수 팽윤 - 블랭크군의 귀의 순수 팽윤.

회복% 가 높을수록 면역-10의 활성이 높다. 도 8에서 볼 수 있듯이, 면역-10의 활성은 30~80% 사이이며, 평균은 약 60% 이다. 면역조절 활성은, 면역-10이 4℃에서 용액내에 저장될 때는 3개월동안, 또는 실온에서 고체 상태로 저장될 때는 일년동안 안정하다.

UVB-유도된 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 방출이, 표피내의 국소적인 면역 억제의 매개(mediation)와 관련된다는 것이 보고되어 왔다. 면역-10에 의한, UVB -유도된 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 방출의 억제를 측정하기 위하여 시험관내(in vitro) 모델이 개발되었다. 이 방법은 실시예 8에 기재되어 있다. 사람 표피모양암종(epidermoid carcinoma) 세포주(KB 세포)가 사용되었다(정상 세포는 ELISA에 의해 측정될 만큼의 충분한 TNF-α를 생산하지 않는다). 그 결과가 도 9에 제시되었다. 도 9에서 X축은 면역-10의 용량(mg/ml,세포배지에서의 최종 농도)을 나타내고, Y축은 면역-10에 의한 억제 백분율을 나타낸다. 면역-10에 의한 억제%은 하기 식을 사용하여 계산되었다.

억제% (%Inhibition) = 1 - (A-B)/(C-B) X 100

A = UVB로 조사되고 면역-10으로 처리된 세포들로부터의 배지내 TNF-α의 양;

B = UVB로 조사되지 않은 세포들로부터의 배지내 TNF-α의 양; 및

C = UVB로 조사되었지만 면역-10으로 처리되지 않은 세포들로부터의 배지내 TNF-α의 양.

도 9에서 볼 수 있듯이, 면역-10은, KB 세포로부터의 UVB-유도된 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 방출을 용량-의존적(dose-dependent)으로 억제하는 것을 나타냈다. 1 mg/ml의 농도에서 면역-10은 거의 100%에 가깝게 상기 방출을 억제했다.

면역 촉진 활성.

면역-10은 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 방출을 촉진함으로써 마크로파지(macrophage)를 활성화시킨다.

악성 종양에 대한 숙주의 방어(defense)는 몇개의 상이한 메카니즘으로 이루어지는데, 면역 방어의 실패 또는 손상은 악성 질병의 발생 또는 진전을 초래할 수 있다. 마크로파지는 항원-처리 세포이고, 세포독성 작용과 식세포(phagocytic) 작용이 둘다 있음이 밝혀졌다. 마크로파지가 활성화되었을 때 상기 기능들 각각은 유의성있게(significantly) 증가된다. 이 세포 집단의 선별적 촉진은, 치료적 용도의 개발에 기여한다는 점에서 중요할 수 있다. 활성화된 마크로파지는 신체의 상처 치유 능력에 있어서도 매우 중요하다. 마크로파지에 의해서 방출되는 사이토카인(cytokine)중 하나인 종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 방어 시스템에서의 신호전달을 매개(mediate)하는 데에 중요한 역할을 한다. 실시예 9는 면역-10에 의해 촉진된 마크로파지의 활성화를 측정하는 데에 사용되는 방법을 기재하고 있다. 그 결과가 도 10에 제시되어 있다. 도 10에서 보여지듯이, 마우스 복막의 마크로파지로부터의 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 방출이 면역-10에 의해 용량-의존적으로 촉진된다는 것이 검출되었다. 1ml당 0.5㎍의 면역-10의 농도에서, 면역-10에 의해 촉진된 마크로파지는, 촉진되지 않은 세포보다 종양 괴사 인자-α(TNF-α)를 500배 이상 더 방출했다. 도 10 에서 또한 볼 수 있듯이, 동일한 실험조건하에서, 천연 알로에 겔은 마크로파지로부터 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 방출을 유도하지 않았다. 이 결과는, 면역-10이 면역계의 비특이적(non-specific) 촉진제로서 그리고 상처 치유제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

상처치유활성.

면역-10은 섬유아세포(어린 햄스터의 신장 세포, BHK-21 세포)의 증식을 자극한다.

실시예 10은 면역-10에 의한 세포 증식을 측정하기 위해 사용된 방법을 기재하고 있다. 촉진된 세포 증식을 측정하기 위해 MTT 방법이 사용되었다. 그 결과가 도 11에 제시되어 있다. 도 11에서 볼 수 있듯이, 면역-10이 BHK-21 세포의 성장을용량-의존적으로 촉진한다.

도 1은, 알로에로부터 면역-10을 제조하기 위한 본 발명의 일반적인 방법을 개략적으로 예시(illustrate)한 것이다.

도 2는, 한정된 효소 가수분해, 탈색 및 여과 후의 면역-10의 크로마토그램(실시예 1)을 나타낸 것이다. 페놀 황산 방법을 사용하여 490 nm 에서 흡수도(absorbance)를 모니터하면서 크로마토그래피를 세파로오즈 CL-4B 칼럼상에 서 수행하였다.

도 3은, 실시예 3의 방법에 따라 제조된, 부분적으로 정제된 면역-10의 크로마토그램을 나타낸 것이다. 크로마토그래피는, 490 nm 에서 흡수도를 모니터하면서 세파덱스 G-100 칼럼상에서 수행되었다.

도 4는 3분(

), 10분(

), 30분(

), 60분(

), 120분(▲), 24시간(●) 및 48시간(■)에서의, 셀룰라아제에 의한 알로에 다당류의 분해를 예시한 것이다.

도 5는 세개의 다른 방법에 의해 분리된 알로에 다당류의 크로마토그램을 도시한 것이다. 여기서 세개의 다른 방법에 의해 얻은 다당류는 첫째, 공지의 방법을 사용하여 신선한 추출물로부터 정제된 다당류(▲), 둘째, 동결건조된 알로에 겔로부터 유래된 다당류(■), 셋째, 알로에 전체 잎에서 유래된 다당류(●)이다. 크로마토그래피는, 490nm에서 흡수도를 모니터하면서 세파로오스 CL-4B 칼럼상에서 수행되었다.

도 6은 실온에서 pH 4.3(○) 및 pH 7.8(●)의 H₂O내에 3개월간 방치한 후 세파덱스 G-100 칼럼상에서의 면역-10의 크로마토그램을 도시한 것이다.

도 7은 실온에서 pH 4.3(○) 및 pH 7.8(●)의 H₂O내에 3개월간 방치한 후 세파덱스 G-100 칼럼상에서의 정제된 천연 알로에 다당류의 크로마토그램을 도시한 것이다.

도 8은 피부 면역 기능을 복원시키는 면역-10의 능력을 그래프로 예시한 것이다(접촉 과민성 UVB 분석).

도 9는 UVB 조사에 의해 유도된 종양괴사인자-α(TNF-α)의 방출이 면역-10에 의해 억제되는 것을 그래프로 예시한 것이다.

도 10은 마우스 복막(peritoneal)의 마크로파지로부터의 TNF-α방출을 면역-10이 촉진하는 것을 그래프로 예시한 것이다.

도 11은 면역-10에 의한 세포 증식의 촉진을 그래프로 예시한 것이다.

다음의 실시예들은 예시만을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1. 면역-10의 분리 및 정제

면역-10은 도 1에 대략 제시된 바와 같이 분리되고 정제되었다. 간단히 말해서, 신선한 Aloe barbadensis 겔 추출물을, 탄수화물의 한정된 가수분해에 적합한 시간동안 및 온도에서 한정되게 효소 소화(digest)시켰다. 이것은, 효소로서 셀룰라아제(cellulase)를 사용하여, 통상적으로 25℃에서 2시간이다. 활성화된 알로에 겔을, 활성탄 및 여과를 사용하여 부분적으로 정제하였다(I-10). 그 후, 활성화된 다당류는 투석, 에탄올 침전 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해서 더 정제되었다.

한정 효소 소화(digestion)

신선한 겔 필릿(fillets)(텍사스주 할링겐에 소재하는 Aloecorp에 의해 제공됨)으로부터 생산된 알로에 겔 즙(AGJ)(10 L)을 열 교환기로 25℃까지 가열했다. 이 열교환기는 마린 프로펠러 블레이드(marine propeller blade)(A100)가 장착된 기계적 교반기로 부드럽게(gently) 혼합되면서 1/4"316 스테인레스 강 코일을 통해 순환하는 60℃의 물로 이루어졌다. pH 6의 50mM의 구연산염(citrate) 수용액 10mL내에 있는 116mg의 셀룰라아제 4000(밸리 리서치 회사)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 2시간동안 부드럽게 교반했다.

효소 불활성화

2 시간 후에, 최소 30분동안 이 반응 혼합물을 약 90℃ 로 가열했다. 그 다음 이 반응 혼합물을 얼음과 물이 혼합된 배쓰(ice-water bath)에 침지(immerse)시켜 이 물질을 실온으로 냉각시켰다.

탈색 및 여과

효소를 불활성화시키는 동안 생긴 적색을 제거하기 위해 샤르콜(charcoal)을 사용했다. 상기 물질을 두개의 5.0 L 뱃치(batch)로 나누었다. 각각의 5.0 L 뱃치에 거친(coarse) 샤르콜(charcoal)(Norit 으로부터 구입한 Darco 20 X 40) 100.0g을 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 1 시간동안 부드럽게 교반시켰다. 그 후에, 50.0 g의 셀라이트(celite) 545(알드리히 케미컬 회사)를 첨가한 다음 이 슬러리(slurry)를 추가로 10분동안 교반시켰다.

그 후, 상기 슬러리(slurry)를 30㎛ 필터 종이(왓트만(Whatman) 등급 113)가 장착된 압력 필터로 펌프시켜 고체를 제거했다. 이 여과액(filtrate)은 필터를 통과한 소량의 미세한 샤르콜 입자를 함유했다. 상기 물질은 포개놓은(superimposed) 2개의 필터상에서 여과되었을 때 정화되며, 100g의 셀라이트(celite) 545로 코팅된 0.7 ㎛ 필터 종이(왓트만 GF/F)의 위에 1.0 ㎛ 기공 크기의 필터 종이(왓트만 #1)가 포개져 있다. 여과액(filtrate)은 탈색되고 미세한 샤르콜 입자가 없는 상태로 되었다. 그 활성화된 다당류는 투석, 에탄올 침전 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 더 정제되었다. 여과 데이터가 표 1과 표 2에 요약되어 있다.

제1여과

매개변수(parameter)	수치(value)
슬러리(slurry) 부피	5 L
필터 종이	왓트만 #113
기공크기	30 ㎛
여과 보조제	없음
여과 면적	113 cm²
최대 압력	<1 psi
평균 여과 속도	7.0 ml/min/cm²
액체 회수	정량적
물질 외관(material appearance)	미세한 샤르콜 입자 함유함

제2여과

매개변수	수치
슬러리 부피	5 L
필터 종이 (조합)	왓트만 GF/F의 위에 왓트만 #1
기공크기	0.7㎛위에 1.0㎛
여과 보조제	100g의 셀라이트 545
여과 면적	113 cm²
최대 압력	2 psi
평균여과속도	0.74 ml/min/cm²
액체 회수	정량적
물질 외관	투명

동결건조(lyophilization)

여과 후에 두 뱃치(batch)가 혼합되고 상기 물질이 동결건조 트레이(tray)에 이송된 후 20L 비르티스(VirTis) 동결건조기(Freeze Dryer)내에서 동결 및 동결건조(lyophilize)되어 57.14g의 면역-10을 생산하는데, 이것은 알로에 겔 즙(AGJ) 1리터당 5.71g의 면역-10 과 등가(equivalent)이다.

실시예 2. 중공(Hollow)-섬유 카트리지(Cartridge)를 사용한 약제 등급의 면역-10의 제조

동결건조된 알로에 겔 10g을, 2 L의 비이커내에 있는 1.8 L의 증류수에 용해시켰다. 그 슬러리는 4℃에서 하룻밤동안 교반되어 균질한(homogenous) 혼합물을 생산했다. 상기 혼합물을 필터 종이(왓트만 #3)를 통해 여과하여 미립자들(particulates)을 제거한 다음, 그 여과액의 부피를 2L가 되도록 조정했다. 상기 혼합물의 온도를 실온으로 하고, pH 6의 50 mM의 구연산염(citrate) 수용액 5 mL내에 있는 4.63 mg의 셀룰라아제 4000(밸리 리서치 회사)의 용액을 첨가했다. 그 후, 상기 여과액을 유입구 압력이 10 내지 15psi사이인 중공-섬유 카트리지(UFP-5-E-6, 분자량 컷오프(cutoff) : 5000 Da, A/G 테크놀로지 회사)를 통해 펌프시켰다. 5000 Da 미만의 분자량을 가진 투과물(permeate)을 별도의 2 L의 비이커에 모았다. 5000 Da 보다 큰 분자량을 갖는 농축물(concentrate)을, 출발 여과액과 동일한 비이커에 모았다. 이 혼합물을 연속적으로 교반시키고, 출발 여과액의 부피가 1 L로 감소되었을 때 증류수(1 L)를 첨가하여 이 부피가 다시 2 L가 되게 했다. 이 과정을 다섯 번 반복했다. 투과물(permeate)의 세개의 2 L 분획물 전체를 모았다. 최종 농축물(concentrate)은 보유된(retained) 분획으로서 모아졌다. 각각의 2 L 투과물(permeate) 분획을 모으는데 평균적으로 대략 2.5시간이 걸렸다. 이 분획들을 동결건조 트랩(trap)으로 이송시킨 후 20 L 비르티스(VirTis) 동결건조기내에서 동결 및 동결건조(lyophilize)시켰다. 투과물(permeate) 분획 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 및 상기 보유된 분획의 수율(yield)은 각각 4.88g, 1.77g, 0.56g 및 0.37g이었다. 상기 보유된 분획은, UVB에 의해 억제된 접촉 과민성(CH)을 복원시키는 데 가장 높은 활성을 가졌다. 투과물의 분획 Ⅲ는 UVB에 의해 억제된 접촉 과민성(CH)을 복원시키는 데 중간 정도의 활성을 가졌다. 투과물의 분획 Ⅰ및 Ⅱ은 활성이 없었다.

실시예 3. 약제 등급의 면역-10의 제조 방법

실시예 1에 기재된 방법으로 제조된 면역-10 (50g)을, 증류수(diH₂O)에 용해시켜 최종 부피가 200ml가 되게 했다. 그 후, 에탄올(66.7ml,25%의 최종 농도)을 이 용액에 첨가했다. 에탄올의 첨가는 교반되면서 서서히 행해졌다. 그 후 이 용액을 추가로 30분 동안 교반시키는데, 이 동안 침전물이 형성되었다. 이 혼합물을 10분동안 2500rpm(Jouan CR412)으로 원심분리시키고, 이 침전물을 25%의 에탄올로 1회 세정하고 원심분리시킨 후 diH₂O에 다시 용해시켰다. 그 결과 생성된 용액을 건조상태로 동결건조시켰다(ppt/25%). 상기 상청액(supernatant)에 추가의 133.3ml의 에탄올(25%~50%)을 첨가하고, 전술한 바와 같이, 이 용액을 다시 30분동안 교반시킨 다음 침전물을 모으고, 50%의 에탄올로 세정한 후 동결건조시켰다(ppt/25%~50%). 이 과정을, 50~75%의 에탄올(ppt/50%~75%) 및 75~80%의 에탄올(ppt/75%~80%)로 재결정시키면서 2회 더(two more times) 반복했다. ppt/25%, ppt/25%~50%, ppt/50%~75% 및 ppt/75%~80%에 대하여 침전물의 고체 회수율은 각각 0.3%, 20.5%, 10.3% 및 1.5%이었다. ppt/50%~75%의 생성물은 세파덱스(Sephadex) G-100 칼럼(2.5 x 68cm)상에서 더 분별(fractionate)되었다. 다당류 피크(좌측 피크, 도 3)의 분획을 혼합(combine)시키고 동결건조시켜, 약제 등급의 면역-10을 생산했다. ppt/50%~75%로부터 약제 등급의 면역-10의 회수율은 15.8%이었다.

실시예 4. 알로에 베라(Vera) 겔(AJG) 다당류의 시간-의존적 분해

신선한 알로에 베라 겔 추출물을 실온에서 3분, 10분, 30분, 60분, 120분, 24시간 및 48시간동안 셀룰라아제(겔 추출물 1리터당 11.57mg의 셀룰라아제)로 처리했다. 처리의 끝 단계에서, 겔 추출물을 워터 배쓰(water bath)내에서 30분동안 95℃로 가열시킨 후 10분동안 2500rpm으로 원심분리시켰다. 상청액을 건조상태로 동결건조시켰다. 처리된 겔 추출물내의 다당류의 분자량 분포를, 세파덱스(Sephadex) G-75 칼럼(2.5 x 68 cm, 177 ~ 179 mg의 샘플이 이 칼럼에 적용되었음) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석했다. 75,000 Da 이상의 분자량을 가진 다당류는 공극 용적(void volume)에서 용출한 반면 단당류와 일부 올리고당류(oligosaccharide)는 칼럼 용적(column volume)에서 용출했다(도 4 참조). 그 결과의 생성물의 생물학적 활성에 기초하여, 바람직한 가수분해 반응 시간은 120분으로 측정되었다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 120분동안 셀룰라아제로 처리하면, 쇼울더(shoulder)가 없이 날카로운(sharp) 다당류 피크가 만들어졌다(

). 24 시간(

) 또는 48시간(

)동안 셀룰라아제로 처리하면, 다당류 피크의 흡수도(absorbance)는 상당히 감소한 반면 단당류 피크와 올리고당류 피크의 흡수도는 증가하였다. 3분(◇), 10분(○) 및 30분(△)동안 처리하여 수득한 생성물은, 쇼울더가 있는 다당류 피크를 만들었다.

실시예 5. 상이한 알로에 제제들내의 알로에 다당류의 안정성

신선한 알로에 겔 추출물(표준 정제방법, 즉 투석과 에탄올 침전을 사용하여 정제됨), 동결건조된 알로에 겔 및 동결건조된 알로에 전체(whole) 잎 내의 다당류의 안정성을, 세파로오스 CL-4B 칼럼상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 연구했다(도 5참조). 도 5에서 볼 수 있듯이, 신선한 알로에 겔 추출물로부터 분리된 알로에 다당류는 ~2백만 Da의 분자량을 가진다. 동결건조된 알로에 전체 잎내의 다당류의 분자량은 신선한 알로에 겔 추출물로부터 분리된 다당류의 분자량보다 낮고, 동결건조된 알로에 겔내의 다당류는 ~500,000 Da의 분자량을 가진다. 이 결과는 알로에 다당류의 안정성과 다당류의 가공방법 사이의 관계를 나타내준다.

실시예 6. 면역-10 다당류의 안정성

면역-10은 다당류 외에 몇몇의 염들과 기타 작은 분자들을 함유하고 있다. 증류수(diH₂O)내에서 면역-10의 pH는 약 4.3이다. 면역-10 다당류의 안정성을 연구하기 위하여, pH 4.3 또는 pH 7.8의 정제된 천연(native) 알로에 다당류 및 면역-10의 용액을 실온에서 3개월동안 방치해 두었다. 최종 농도가 0.02%인 나트륨 아자이드(sodium azide)를 면역-10 또는 다당류 용액에 첨가하여 미생물의 성장을 억제 시켰다. 이 샘플들에서 다당류의 분해(degradation)를 세파덱스(Sephadex) G-100 칼럼상에서 분석하였다. 도 6은, 490nm에서의 면역-10의 다당류 흡수도(absorbance)가 pH 4.3과 pH 7.8 둘다에서 매우 유사했다는 것을 보여주는 크로마토그램을 도시하고 있다. 다당류 피크가 pH 4.3에서 오른쪽으로 약간 이동(shift)하긴 했지만, 이것은 출발물질과 비교했을 때 양 pH 조건하에서 여전히 매우 안정했다. 동일한 조건하에서, 정제된 천연 다당류는 pH 7.8에서 부분적으로 분해되었다(도 7). 다당류 피크의 약간의 이동은, 세파덱스 G-100 칼럼의 리팩킹(repacking) 때문일 수도 있다.

실시예 7. 면역-10에 의한, UVB-억제된 접촉 과민성의 복원의 측정

특이적 병원균이 없는 암컷 C3H/HeN 마우스를 할란 스프라그 다울리(Harlan Sprague Dawley)로부터 얻고, 이를 실험 동물 관리(care)의 내쇼날 리서치 카운슬(National Research Council)의 지침에 따른 병원균-부재의 시설내에 놓아 두었다. 각각의 실험은, 9~10주 된 연령이 맞추어진 마우스를 가지고 수행되었다.

마우스의 복부의 털을 전기 가위(clipper)로 제거하였다. 그 후 알루미늄 호일로 귀를 덮은 마우스를, 일렬의 4개의 여과되지 않은(unfiltered) FS40 태양등(sunlamp)(National Biological Corp.)에 2000J/m²의 용량으로 노출시켰다. 이들 태양등으로부터 방출(emit)되는 에너지의 약 65%가 UVB의 범위(280-320)내에 있으며 피크 방출(emission)은 313 nm 이었다. UVB에 노출시킨 직후에, 아쿠아퍼(Aquaphor)(비이클) 단독을, 또는 1:1 비율의 아쿠아퍼(Aquaphor)내 테스 트 화합물을 마우스 복부의 피부에 도포하였다. UVB에 노출시키고 3일 후에, 0.3% 디니트로플루오로벤젠(DNFB) 50㎕을 마우스의 털을 깍아낸 복부 피부상에 도포하여 마우스를 감작(sensitize)시켰다. 감작시키고 6일 후에, 0.2% 디니트로플루오로벤젠(DNFB) 5㎕을 마우스의 각각의 귀의 귓등(dorsal)표면과 그 반대쪽의 전면(ventral surface) 둘다의 위에 도포하여 마우스를 챌린지(challenge)시켰다. 챌린지 직전에 및 24시간 후에, 엔지니어의 마이크로미터(engineers^, micrometer)로 귀의 두께를 측정하였다. 챌린지되었지만 감작되지 않은 마우스(블랭크 군)에서 얻은 수치를 빼줌으로써, 귀의 고유(specific) 팽윤을 측정했다. 각각의 처리군은 5개의 마우스를 포함하고 있다. 2개의 추가의 대조군, 즉 양성 대조군과 억제 대조군이 각각의 실험에 포함되었다. 양성 대조군은 UVB의 조사를 받지 않고 어떤 처리도 되지 않았지만, 감작 및 챌린지되었다(100% 반응). 마우스의 억제 대조군은 UVB 조사를 받고 어떤 처리도 되지 않았지만, 감작 및 챌린지되었다(0% 반응). 그 결과가 도 8에 제시되어 있다.

실시예 8. 면역-10에 의한, UVB-유도된 TNF-α방출의 억제의 측정

사람 표피모양암종(epidermoid carcinoma) 세포(KB)가 100mm의 접시당 2 x 10⁶의 세포 비율로 플레이트(plate)되었다. 이 세포들이 합류점(confluence)에 도달한 후(약 2일 후)에, 이 세포들을 PBS로 3회 세정하고, 300 J/m²의 UVB 조사에 노출시켰다. 그후 이 세포들을 한번 더 PBS로 세정한 다음, 5ml의 DMEM/0.2% FBS내에서 면역-10과 함께 또는 면역-10이 없이 한시간동안 인큐베이트(incubate)시켰다. 이 세포들을 다시 한번 PBS로 세정한 후 성장배지내에서 하룻밤동안 인큐베이트시켰다. 다음 날 그 배지를 모으고 4 ℃에서 2500rpm으로 10분간 원심분리시켰다. 상청액으로 방출된 TNF-α를 ELISA에 의해 측정했다. 그 결과가 도 9에 제시되어 있다.

실시예 9. 면역-10에 의한 마크로파지 활성화의 촉진의 측정

마우스 복막에 거주하는 마크로파지를 ICR 마우스로부터 분리시킨 후, 웰(well)당 200,000 세포의 비율로 96-웰(well) 판(plate)에 플레이트시켰다. 2시간 동안 인큐베이트시킨 후에 세포들을 3회 세정하여 부착되지 않은 세포들을 제거하였다. 그 후 마크로파지는 면역-10과 함께 또는 면역-10이 없이 하룻밤동안 인큐베이트되었다. 배지로 방출된 TNF-α는 ELISA에 의해서 측정되었다. 리포다당류(Lipopolysaccharide:LPS)가 양성 대조군으로서 사용되었다. 그 결과가 도 10에 제시되었다.

실시예 10. 면역-10에 의한 세포증식 촉진의 측정(MTT)

어린 햄스터 신장 세포주(BHK 세포)가 웰당 5000세포의 비율로 96-웰 판에 플레이트되었다. 이 세포들은 면역-10이 없이 또는 면역-10과 함께 3일간 조직 배양 인큐베이터(incubator)내에서 인큐베이트되었다. 그 후 이 세포들은 4.5시간동안 1mg/ml의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,3-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue)와 함께 인큐베이트되었다. 0.01N의 HCl내의 10% SD 100㎕로 이 세포들을 추출한 다음, 570~630nm에서의 흡수도를 측정하였다. 섬유아세포 성장 인자(FGF)가 양성 대조군으로서 포함되었다. 그 결과가 도 11에 제시되었다.

Claims

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알로에 종으로부터 면역 조절성 탄수화물(carbohydrate) 조성물을 분리하는 방법으로서,

상기 면역 조절성 탄수화물 조성물은:

(i) 알로에로부터 유래된 다당류를 95%이상 포함하며, 상기 조성물내 상기 다당류는 50 ~ 200 kDa 의 범위와 함께 70 ~ 80 kDa 의 평균 분자량을 가지며;

(ii) 상기 조성물내 상기 다당류는 D-갈락토오스(D-galactose)(5% 이하), D-글루코오스(D-glucose)(5% 이하) 및 D-만노오스(D-mannose)(90% 이하)를 포함하고 있으며;

상기 분리하는 방법은 하기의 (a)~(d)의 단계를 포함하는 방법:

(a) 상기 알로에 종으로부터 알로에 겔 즙(juice)을 추출하는 단계;

(b) 상기 알로에 겔 즙을 효소 또는 비효소성 가수분해제와 혼합하여, 상기 알로에 겔 즙 내에 있는 전체 다당류(polysaccharide)의 제어되고 한정된 가수분해를 수행하는 단계

(c) 상기 제어되고 한정된 가수분해를 종결시키는 단계; 및

(d) 상기 알로에 겔 즙을 탈색 및 여과시키는 임의의 단계.
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제20항에 있어서, 상기 효소가 셀룰라아제(cellulase), 펙티나아제(pectinase) 또는 만나나아제(mannanase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 효소가 셀룰라아제이며, 216 L의 알로에 겔 즙에 대해 0.5g ~ 2.5g 의 셀룰라아제의 비율로 첨가되는 방법.
제23항에 있어서, 상기 (b)단계가, 2 ~ 2.5 시간동안 25℃ ±1℃ 에서 수행되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 가수분해가 가열 또는 중성화(neutralization)에 의해서 종결되는 방법.
제25항에 있어서, 상기 가수분해가, 30 ~ 50분 동안 85 ~ 90 ℃ 로 가열시킴으로써 종결되는 방법.
제20항에 있어서, 상기 (d)단계가, 상기 알로에 겔 즙에 샤르콜(charcoal)을 첨가한 후 상기 알로에 겔 즙을 기공(pore)의 크기가 점차적으로 작아지는 일련의 필터를 통해 통과시킴으로써 수행되는 방법.
제27항에 있어서, 상기 일련의 필터가 30 ㎛의 필터, 1 ㎛의 필터 및 0.7 ㎛의 필터를 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 (d)단계에서 셀라이트(celite)를 여과 보조제(filtration aid)로서 상기 알로에 겔 즙에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.