KR20110009652A

KR20110009652A - 난과 식물로부터 얻어지는 추출물 및 그의 제조방법, 및 난과 식물로부터 얻어지는 추출물을 함유하는 피부 외용제

Info

Publication number: KR20110009652A
Application number: KR1020107007394A
Authority: KR
Inventors: 아키코 사사키; 마사카즈 카와쿠치; 아야카 히모노
Original assignee: 가부시키가이샤 니찌레이 바이오사이언스
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2011-01-28
Also published as: JP5108025B2; EP2275083A1; US8637488B2; JPWO2009139231A1; US20100267659A1; CN101980695A; EP2275083B1; WO2009139231A1; CN101980695B; EP2275083A4

Abstract

본 발명은 난과 오돈토글로섬 속의 식물, 또는 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배 속 유래의 식물로부터 얻어지는 추출물, 상기 추출물의 제조 방법 및 상기 추출물을 함유하는 피부 외용제에 관한 것이다.

Description

난과 식물로부터 얻어지는 추출물 및 그의 제조방법, 및 난과 식물로부터 얻어지는 추출물을 함유하는 피부 외용제{Extract produced from orchid family plant, method for production thereof and prepartion for external application to skin comprising extract produced from orchid family plant}

본 발명은 난과(Orchidaceae) 식물로부터 얻어지는 추출물 및 그 추출물의 제조 방법, 및 난과(Orchidaceae) 식물로부터 얻어지는 추출물을 함유하는 피부 외용제에 관한 것이다.

종래부터, 난과 식물의 추출물은 보습 효과, 피부정돈 효과, 미백효과, 피부 노화방지 효과 등이 있는 것으로서 화장료 등에 사용되고 있다. 예를 들어, 특허문헌, 즉 JP-A-2007-008911호, JP-A-2007-077079호 JP-A-2006-282536호, JP-A-2005-179219호, JP-A-2004-067549호, JP-A-2002-205933호, JP-A-2002-003336호, 일본특허 제3526590호, 일본특허 제3090156호, JP-A-H2-279618호(1990), 및 JP-A-S57-102809호(1982)는 난과 식물의 추출물을 함유하는 화장료, 보습제, 피부 외용제를 개시하고 있다.

추출물을 얻기 위해서 사용되는 난과 식물로서, 상기 특허문헌에는 김나데니아(Gymnadenia)(JP-A-2007-077079호), 카틀레야(Cattleya)(JP-A-2006-282536, JP-A-2004-067549호), 칼란테(Calanthe), 파이우스(Phaius)(JP-A-2005-179219호), 블레틸라 스트리아타(Bletilla striata), 세팔란테라 팔카타(Cephalanthera falcata), 크레마스트라 아펜디쿨라타(Cremastra appendiculata), 심비듐 고에린기(Cymbidium goeringii), 닥틸로히자 아리스타타(Dactylorhiza aristata), 덴드로븀 모닐리포르메(Dendrobium moniliforme), 에피팍티스 툰베르기(Epipactis thunbergii), 갈레올라 셉텐트리오날리스(Galeola septentrionalis), 네오티아 니두사비스(Neottia nidusavis), 오키스(Orchis), 바닐라 프라그란스(Vanilla fragrans)(JP-A-2002-205933호), 심비듐(Cymbidium)(JP-A-2002-003336호), 닥틸로리자(Dactylorhiza), 세팔란테라(Cephalanthera), 네오티아(Neottia), 에피팍티스(Epipactis)(일본특허 제3526590호), 호접란(Phalaenopsis)(일본특허 제3090156호), 덴브로븀(Dendrobium), 카틀레야(Cattleya), 심비듐(Cymbidium), 심비듐 고에린기(Cymbidium goeringii)(JP-A-H2-279618호(1990)), 및 블레틸라 스트리아타(Bletilla striata)(JP-A-S57-102809호(1982)) 등이 기재되어 있다.

난과 식물은 2만종 이상 있는 것으로 말해지며, 피자 식물의 1할 전후를 점하는 최대의 과이다. 분포지역은 열대부터 한대까지, 생육 환경은 극단적인 건조지대를 제외한 모든 환경에 생육하고 있다. 이 때문에, 생태적으로도 형태적으로도 매우 다양화되어 있고, 난과의 계통, 분류에 관해서는 많은 학설이 제안되어 있다("Sekai no Chinran Kiran daizukan," Seibundo Shinkosha, Japan, 2006). 따라서, 상이한 속에 속하는 난과 식물은 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 등의 형태가 크게 상이하다. 또한 그 추출물의 성분도 서로 상이한 것을 용이하게 추측할 수 있다.

한편, 천연 다당의 보습제로서의 이용은, 동물 유래 다당의 히알우론산, 식물 유래의 퀸스(quince), 트레멜라 푸시포르미스(Tremella fuciformis), 및 알로에 다당 등이 알려져 있다(FRAGRANCE　JOURNAL, Japan, March 2005). 또한, 상기 특허문헌에는, 난과 식물인 심비듐(JP-A-202-003336호), 덴드로븀, 카틀레야, 심비듐, 심비듐 고에린기(Cymbidium goeringii) 근경(rhizomes)(JP-A-H2-279618호(1990)), 및 블레틸라 스트리아타 괴경(tubers)(JP-A-S57-102809호(1982))의 추출물에 다당이 포함되며, 이들 다당이 보습작용을 지닌 것이 기재되어 있다. 일반적으로, 다당류는 다수의 단당류가 글리코시드 결합으로 연결된 것으로, 다수 유형의 다당류가 존재하며, 또 천연 다당류는 그 유래에 따라 구성하는 당의 조성, 구조, 분자량 등이 상이한 것이 알려져 있다. 예를 들어, 히알우론산은, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 상호 결합한 직쇄상의 고분자 다당이고, 트리멜라 푸시포르미스(Trimella fuciformis) 다당은 만노오스, 크실로오스, 글루쿠론산을 주요 구성 당으로 하는 산성 헤테로 다당이고, 마루메로 외피의 다당은, 아라비노오스, 크실로오스 또는 우론산이 결합한 산성 헤테로 다당이고(FRAGRANCE　JOURNAL, Japan, March 2005), 알로에 다당은, 만노오스, 갈락토오스, 글루코오스의 조성이 11:0.2:1인 헤테로 다당이고("Modified　Aloe　barbadensis　Polysaccharide　with　Immuno-regulatory　 Activity," Plant　Medica, 　66, 　152-156, 　2000), 블레틸라 스트리아타 괴경의 다당(블레틸라-글루코만난)은, 만노오스, 글루코오스의 조성이 3:1인 헤테로 다당("Plant　Mucilages.VIII.　Isolation　and　Characterization　 of　a　Mucous　Polysaccharide, 　"Bletilla-glucomannan," from Bletilla　 striata　Tubers.,"　Chem.　Pharm.　Bull.　21(12)　2667-2671, 1973)이다. 난과 식물 유래의 다당류에 관해서는 블레틸라 스트리아타의 괴경에 포함되는 블레틸라(Bletilla)-글루코만난 이외의 기재는 없고, 그 상세한 내용은 명확하게 되어 있지 않다.

난과 식물 이외에, 만난 화합물을 다수 포함하는 식물로서, 아이보리 야자, 구아, 세라토니아 실리쿠아(Ceratonia siliqua), 타라 등을 들 수 있다. 이들 식물로부터 만난 화합물 추출물에 포함되는 만난 화합물을 산 가수분해시켜 만노오스를 제조하는 것이 알려져 있다(JP-A-2000-700000).

본 발명은 수분 유지 효과 등이 높은 난과 식물의 추출물을 얻고, 그 추출물을 함유하는 피부 외용제를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 중첩한 결과, 난과의 특정 속에 속하는 식물의 추출물이 높은 보습효과 등을 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 요약하면 이하와 같다.

[1]　난과(Orchidaceae) 오돈토글로섬(Odontoglossum) 속의 식물, 또는 오돈토글로섬 속과 코크리오더(Cochlioda) 속의 교배 속 유래의 식물로부터 얻어지는 추출물이고, 이하의 (1)~(4)의 특징을 갖는, 상기 추출물:

(1)　추출물이 당 성분을 포함하고, 그 중, 다당류가, 약 60~70　wt% 또는 그 이상임;

(2)　다당류의 구성 당의 90% 이상이 만노오스임;

(3)　만노오스가 β-1,4 글리코시드 결합으로 결합되어 있음;

(4)　추출물이 보습효과를 가짐.

[2]　이하의 특징을 또한 갖는, [1]에 기재된 추출물:

(1)　만노오스의 일부가 만노오스 분자의 2, 3 또는 6 위치에 분기를 가짐

[3]　이하의 특징을 또한 갖는, [1] 또는 [2]에 기재된 추출물:

(1)　추출물이 히알우론산 생산 촉진 작용, 세라미드 생산 촉진 작용, 및 IV형 콜라겐 생산 촉진 작용을 가짐.

[4]　이하의 특징을 또한 갖는, [1]~[3]중 어느 하나에 기재된 추출물:

(1)　추출물이 과산화지질 생성 억제 작용을 가짐.

[5]　오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배 속 유래 식물이 오돈티오더 (Odontioda) 속 식물인, [1]~[4]중 어느 하나에 기재된 추출물:

[6]　난과 식물의 품종이 라벤더 레이스 "실반"(Lavender Lace "Sylvan"), 마리 노엘　벨라노(Marie Noel "Velano") 및 오구레 "로얄 새슈"(Augres　"Royal　Sash")로 이루어진 군으로부터 선택되는, [1]~[5]중 어느 하나에 기재된 추출물.

[7]　추출 원료에 꽃을 포함하는, [1]~[6]중 어느 하나에 기재된 추출물.

[8]　난과 오돈토글로섬 속 식물, 또는 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배속 유래 식물의 꽃을 포함한 식물 부분과, 물, 친수성 유기 용매 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 용매를 혼합하는 공정; 상기 식물 부분과 용매의 혼합물을 가열 및 추출하는 공정; 및 그 추출물을 회수하는 공정을 포함하는, [1]~[7]중 어느 하나에 기재된 추출물의 제조방법.

[9]　가열 및 추출 공정은 60~120℃의 온도에서 가열한 다음 0~60℃의 온도로 냉각하여 추출을 실시하는 것을 포함하는, [8]에 기재된 방법.

[10]　용매가 물 및 1,3-부틸렌글리콜의 혼합물인 [8]또는 [9]에 기재된 방법.

[11]　추출물이 [8]~[10]중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 것인, [1]~[7]중 어느 하나에 기재된 추출물.

[12]　[1]~[7] 및 [11]중 어느 하나에 기재된 추출물을 유효성분으로서 함유하는, 피부 외용제.

[13]　의약 또는 화장용인 [12]에 기재된 피부 외용제.

본 발명의 추출물은 높은 점성을 갖고, 보습효과, 예를 들어 수분 유지 효과, 각질 수분량 상승효과, 표피 각화 세포에 있어서 히알우론산 생산 촉진 효과, 세라미드 생산 촉진 효과, 및 IV형 콜라겐 생산 촉진 효과를 갖는다. 또한 상기 추출물은 과산화 지질의 생성 억제 작용도 갖는다. 본 발명의 추출물은, 피부 외용제(보습제, 화장료 등)의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2008-129943호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 실시예 11의 과산화 지질의 생성 억제 시험의 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 12의 수분 유지 시험(1)의 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 13의 수분 유지 시험(2)의 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 14의 보습성 시험의 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 28의 IV형 콜라겐 생산 촉진 시험의 결과를 나타낸다. 패널 A는 대조용의 염색 결과를 나타내고, 패널 B는 실시예 1의 추출물 첨가시의 염색 결과를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

(1) 추출물을 얻기 위해서 사용되는 식물

본 발명의 추출물은 난과 오돈토글로섬 속의 식물, 또는 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배 속 유래 식물로부터 얻을 수 있다. 여기서 "오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배 속 유래 식물"이라는 것은, 오돈토글로섬 속의 식물과 코크리오더 속의 식물을 선조로 가진 식물로서, 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 2속간 교배 속인 오돈티오더 속의 식물 이외에, 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 2속과 또한 다른 속의 오돈토글로섬 속과 속간 교배가능한 속(1개 또는 그 이상의 속)과의 교배 속의 식물을 포함한다. 또한 본 명세서에 있어서 난과 식물의 분류는 Robert　L.　Dressler의 저서 PHYLOGENY　and　CLASSIFICATION of　the　Orchid Family를 따르고 있다.

오돈토글로섬 속은, 에피덴드럼(Epidendrum) 아과 막실라리에아애(Maxillarieae) 족(tribe) 온시듐(Oncidiinae) 아족(subtribe)에 속하고 있고, 중앙남아메리카의 열대, 아열대의 산악지대에 분포하고 있다. 중대형의 착생란으로서 다수의 꽃을 붙이고 있는 특징이 있다(Yamakei Color Meikan , Ran (orchid), Yama-kei Publishers, Japan, 1996). 본 발명에 이용되는 오돈토글로섬 속의 식물은 특히 한정되지 않지만, 예를 들어 품종 오구레　"로얄 새슈"(종묘법에 의한 품종 등록번호 제10588호), 하벵텐스 츄츄(Harvengtence "Tutu"(종묘법에 의한 품종 등록번호 제10942호), 푸치니 리모(Pucini "Rimo")(종묘법에 의한 품종 등록번호 제16093호) 등을 들 수 있고, 특히 오구레　"로얄 새슈"가 바람직하다.

오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배속 유래의 식물은, 예를 들어, 오돈티오더 속의 식물이나 윌슨나라(Wilsonara) 속의 식물 등을 들 수 있고, 특히 한정되지 않지만, 오돈티오더 속의 식물이 바람직하다.

오돈티오더 속은, 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 2속간 교배에 의해 작출된 인공 속이고, 큰 꽃송이를 내며 색채 변화가 풍부한 품종이 많은 것이 특징이다(Yamakei Color Meikan , Ran (orchid), Yama-kei Publishers, Japan, 1996). 오돈티오더 속의 식물에는, 오돈토글로섬 속의 식물과 코크리오더 속의 식물을 교배하여 작출된 식물, 오돈티오더 속의 식물과 오돈토글로섬 속의 식물을 교배하여 작출된 식물, 오돈티오더 속의 식물과 코크리오더 속의 식물을 교배하여 작출된 식물, 오돈티오더 속 식물끼리 교배하여 작출된 식물이 포함된다.

윌슨나라 속은, 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속과 온시듐 속의 3속간 교배에 의해 작출된 인공 속이다. 꽃대가 길고, 다화성이며 내한성이 있는 품종이 많다(Yamakei Color Meikan , Ran (orchid), Yama-kei Publishers., Japan, 1996). 윌슨나라 속의 식물에는, 오돈티오더 속의 식물과 온시듐 속의 식물을 교배하여 작출된 식물, 오돈티오더 속과 오돈토시듐(Odontocidium) 속의 식물을 교배하여 작출된 식물, 오돈티오더 속의 식물과 윌슨나라 속의 식물을 교배하여 작출된 식물, 오돈토글로섬 속의 식물과 윌슨나라 속의 식물을 교배하여 작출된 식물 등이 포함된다.

오돈티오더 속의 식물로서, 예를 들어 품종 라벤더 레이스　"실반"(종묘법에 의한 품종 등록번호 제11539호), 마리 노엘 "벨라노"(종묘법에 의한 품종 등록번호 제3740호), 바이저 "오빈"(Baiser "Aubigne"), 니치레이 스트로베리필드 "오리온 스타"(Nichirei Strawberryfield "Orion Star")(종묘법에 의한 품종 등록번호 제10344호) 등을 들 수 있고, 특히 라벤더 레이스 "실반", 마리 노엘 "벨라노"가 바람직하다.

윌슨나라 속의 식물로서, 예를 들어 품종 니치레이 골드　"스타 게이저"(Nichirei Gold "Star Gazer")(종묘법에 의한 품종 등록번호 제15106호), 류카디아　"오톰 리프"(Leucadia "Autumn Leaf")(종묘법에 의한 품종 등록번호 14753호) 등을 들 수 있다.

오돈토글로섬 속의 식물, 코크리오더 속의 식물, 오돈티오더 속의 식물, 및 윌슨나라 속의 식물은, 상기 특허문헌(즉, JP-A-2007-008911호, JP-A-2007-077079호, JP-A-2006-282536호, JP-A-2005-179219호, JP-A-2004-067549호, JP-A-2002-205933호, JP-A-2002-003336호, 일본 특허 제3526590호, 일본특허 제3090156호, JP-A-H2-279618호(1990), 및 JP-A-S57-102809호(1982))에 기재된 난과 식물과는 속 및 족(tribe)이 상이하며, 또한 식물의 분포나 형태 등도 상이하다.

(2) 추출방법

본 발명의 추출물의 제조방법은, 꽃을 포함하는 식물 부분과, 물, 친수성 유기 용매 또는 그 혼합물로 이루어지는 용매를 혼합하는 공정, 상기 식물 부분과 용매의 혼합물을 가열 및 추출하는 공정, 및 그 추출물을 회수하는 공정을 포함한다. 추출에 사용되는 식물은 날것, 반건조한 것, 건조한 것, 동결건조한 것 등의 어느 것도 좋지만, 동결건조시킨 것이 바람직하다. 또한, 식물은, 적절히 분쇄 또는 재단된 것, 식물 그자체의 형태로서도 좋지만, 분쇄된 것이 바람직하다. 추출 원료에 이용되는 식물의 부분은, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 구근 등, 또는 전체 식물 어느 것도 좋지만, 꽃을 포함하는 식물부분이 바람직하고, 꽃이 더욱 바람직하다. 상기 품종의 식물을 단독으로 사용하여도 좋고, 복수 조합하여 사용하여도 좋다.

용매로서, 물, 친수성 유기 용매, 또는 이들의 혼합물을 사용될 수 있다. 친수성 유기 용매는, 더욱 점도의 높은 추출물을 얻을 수 있어 바람직하다. 용매의 구체예로서는, 순수, 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜 등의 알코올, 아세톤, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 1,4-디옥산, 피리딘, 디메틸설폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 아세트산 등을 들 수 있고, 특히 한정되지 않지만, 메탄올, 부탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜이 바람직하다. 친수성 유기 용매를 추출에 사용하여도 좋지만, 친수성 유기 용매와 물의 혼합물을 이용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 친수성 유기 용매의 농도는, 바람직하게는 10~90　vol%, 더욱 바람직하게는 20~60　vol%, 또한 바람직하게는 25~35　vol%이다. 또한, 친수성 유기 용매를 복수 혼합하여 사용하여도 좋다.예를 들어 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜 및 물을 혼합하여도 좋다. 식물에 대한 용매첨가량은 특히 한정되지 않지만, 식물 100g에 대하여 바람직하게는 100~1000 ml, 더욱 바람직하게는 200~600 ml이다.

용매를 식물에 첨가하고, 30초~1시간, 바람직하게는 10~15분간 가열한다. 가열온도는 60~120℃, 바람직하게는 80~90℃이다. 그 후, 냉각, 바람직하게는 급냉하여 온도를 0~60℃, 바람직하게는 20~30℃로 하고, 추출을 실시한다. 온도를 낮춘 후의 추출시간은 특히 한정되지 않지만, 1시간~7일간, 바람직하게는 8~16시간(하룻밤)이다. 추출의 최초에 가열하며, 냉각하여 추출하는 것에 의해 점도가 높은 추출물이 얻어지며, 그와 같이 하여 얻어진 추출물은 보존시의 경시 점도 안정성이 양호하다. 점성성분을 분해하는 효소류가 식물체에 포함되며, 이것이 가열에 의해 실활(deactivated)하여 있는 것으로 생각된다. 또한, 추출물의 갈색화를 방지하고, 옅은 황색 ~ 적색(꽃을 사용한 경우, 꽃색을 반영할 수 있다)의 색조를 유지할 수 있다.

추출 종료 후, 필요에 따라서 여과, 원심분리 등으로 잔사를 제거하여도 좋고, 농축 공정이나 정제공정을 실시하여도 좋다. 이들 공정은 감압농축, 동결건조, 에탄올 등의 용매에 의한 침전, 크로마토그래피, 예를 들어 DEAE 컬럼을 이용하는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, HPLC 등, 한외여과 등의 각종 공지 방법을 이용하여 실행할 수 있다.

(3) 추출물

상기 (2)의 방법으로 얻어진 추출물은 당, 단백질, 폴리페놀 등을 포함하고, 높은 점도를 갖는다. 추출물 고형분의 주성분은 당이고, 당 성분의 약 60~70　wt% 또는 그 이상이 다당류이다. 추출물의 당의 구성 성분은, 단당으로 환산할 때, 만노오스 40~60　wt%, 글루코오스 15~25　wt%이다. 여기서, 추출물을 더 정제하는 것에 의해 프럭토오스는 완전하게 제거되어도 좋고, 한편 글루코오스는 약 2~5　wt% 함유할 수 있다. 또한 추출물에 포함되는 다당류의 전 구성 당을 100　wt%로 하면, 그 90　wt% 이상, 바람직하게는 95　wt% 이상, 더욱 바람직하게는 97　wt% 이상이 만노오스이다. 상기 다당류의 정제물(실시예 10(iv), 실시예 21(iv), 실시예 22(iv))은 만노오스와 글루코오스가 바람직하게는 90:10~99:1, 더욱 바람직하게는 95:5~98:2 범위의 조성비(질량비)를 가지고, β-1,4 글리코시드 결합한 만노오스를 다수 포함하는 고분자 다당을 포함한다. 만노오스의 일부는, 만노오스 분자의 2, 3 또는 6 위치에 분기를 갖는다.

추출물의 정제물은, 고점성을 가지며, 효소 분해(β-1,4-만나아제)에 의해 점도가 저하된 점에서(실시예 10 참조), 상기 정제물에 포함되는 다당류가 점성에 기여하고 있는 것으로 추정된다. 추출물의 점도는, 음차형(音叉型) 진동식 점도계에 의한 25℃에서의 측정으로, 예를 들어 0.01~0.6　Pa·s(10~600　cP)이다. 추출물은, 보습효과를 가지며, 구체적으로는 수분 유지 효과, 각질 수분량 상승효과, 표피 각화 세포에 있어서 히알우론산생 산 촉진 효과, 세라미드 생산 촉진 효과, 및 IV형 콜라겐 생산 촉진 효과를 가지며, 또한 과산화 지질의 생성 억제 효과도 갖는다. 이들 생물학적 효과(작용)는, 후술한 실시예에 의해 증명되고 있다. 또한, 추출물을 포함하는 화장료는 끈적임이나 땅기는 느낌이 없고, 피부 침투성이 좋다.

(4) 피부 외용제

본 발명의 피부 외용제는, 보습제, 화장료 등의 의약 및 화장용으로서, 피부에 적용하는 제형이라면 특히 한정되지 않는다. 제형으로서는 예를 들어 크림상, 겔상, 액상, 현탁상, 분말상, 폼상, 고형의 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 핸드크림, 로션, 유액, 미용액, 훼이스크림, 클렌징 크림, 세안비누, 팩, 면도용 크림, 썬 크림, 썬 로션, 썬 크림, 썬 로션, 메이컵베이스, 파운데이션, 분, 파우더, 립스틱, 립크림, 아이라이너, 아이 크림, 아이새도우, 마스카라, 샴푸, 린스, 콘디쇼너, 염모료, 바디샴푸, 바디로션 등을 들 수 있다.

본 발명의 추출물의 배합량은, 피부 외용제 중 바람직하게는 0.0001~25　wt%, 더욱 바람직하게는 0.1~15　wt%이다. 또한, 추출물 이외에, 피부 외용제에 사용되는 각종 성분, 예를 들어 보습제, 미백제, 항산화제, 증점제, 유성 성분, 항균제, 유화제, 자외선흡수제 등을 적절히 혼합할 수 있다. 보습제로서, 예를 들어 히알우론산, 콘드로이틴 황산 등의 뮤코다당류 및 그 유도체, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴 등의 단백질 및 그 유도체, 글리신, 세린, 아스파라긴산, 글루타민산, 아르기닌 등의 아미노산 및 그 유도체, 소르비톨, 트레할로오스, 글루코오스, 수크로오스 등의 당류, 요소, 인지질, 세라미드, 알로에 추출물 또는 퀸스(quince) 추출물과 같은 식물 추출물, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 다가 알코올류 등을 들 수 있다. 미백제로서, 예를 들어 비타민 C 및 그 유도체, 비타민 E 및 그 유도체, 비타민 A 및 그 유도체, 글리시르포스페이트 및 그 유도체, 글리시르리진 및 그 유도체, 나이아신아미드, 아르부틴, 코직산, 엘라직산(ellagic acid), 리놀산, 트라넥사믹산(tranexamic acid), 태반 추출액, 카모밀 추출물, 황금(scutellaria) 추출물, 포도 추출물, 아세로라 추출물, 카무 카무(Camu Camu) 추출물 , 카무 카무 종자 추출물 등의 식물 추출물 등을 들 수 있다. 항산화제로서, 예를 들어 슈퍼옥사이드 디뮤스타아제, 만니톨, 케르세틴(quercetin), 카테킨, 아스탁산틴(astaxanthin), 비타민 A류, 비타민 B류, 비타민 E류, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 코엔자임 Q10, α-리포산, 아세로라 종자 추출물 등의 식물 추출물 등을 들 수 있다. 증점제로서, 예를 들어 카라키난, 펙틴, 한천, 아라비아 검, 구아 검, 로커스트빈 검, 크산탄 검, 퀸스 종자(Quince seed), 젤라틴, 전분 등의 천연물계 고분자, 메틸셀룰로오스 히드록실셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 고분자, 카복시비닐 폴리머 등의 아크릴산계 고분자, 아르긴산 나트륨 등의 아르긴산계 고분자, 세토스테아릴 알코올, 베헤닐 알코올 등의 알코올류 등을 들 수 있다. 유성 성분으로서, 예를 들어 스쿠알렌, 호호바 오일, 피마자유, 홍화유, 올리브유 등을 들 수 있다. 항균제로서, 예를 들어 파라히드록시벤조에이트, 에틸파라히드록시벤조에이트, 프로필 파라히드록시벤조에이트, 부틸 파라히드록시벤조에이트, 소르브산, 데히드로부티르산, 페녹시에탄올 등을 들 수 있다. 유화제로서, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트, 수산화칼륨, 스테아르산 등을 들 수 있다. 자외선흡수제로서, 예를 들어 파라아미노벤조산계 자외선흡수제, 살리실산계 자외선흡수제, 신남산계 자외선흡수제, 안트라닐산계 자외선흡수제, 벤조페논계 자외선흡수제 등을 들 수 있다.

또한 계면활성제, 킬레이트제, 색소, pH조절제, 향료, 청량제, 혈류촉진제, 각질용해제, 수렴제, 창상치료제, 증포제, 항알레르기제, 세포부활제 등을 포함하여도 좋다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1: 추출물의 제조법(1)

오돈티오더 속 라벤더 레이스 "실반"(Lavender　Lace　"Sylvan")의 꽃(100g)을 -40℃의 냉동기(MEDICAL　FREEZER, 　SANYO)에서 1주간 이상 동결하고, 동결건조기(FREEZE-DRYER,　TRIO　SCIENCE　CO.　LTD)에서 4일간 동결건조시킨 후, Labo　Milser(이와타니 코포레이션)를 이용하여 분쇄하였다. 여기에 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액(500 ml)을 부가하고 80~90℃에서 10분간 교반 추출을 실시하고, 이어 냉각한 후 25℃에서 하룻밤 교반 추출하였다. 이 추출물을 여과하고, 추출물(400 ml)(고형분 농도 1.4　wt%)을 얻었다.

실시예 2: 추출물의 제조법(2)

오돈티오더 속 라벤더 레이스 "실반"의 전체 식물(꽃, 줄기, 잎, 뿌리, 구근)(111g)을 사용하고, 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액 555 ml을 부가한 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여 추출물(400 ml)(고형분 농도 0.55　wt%)을 얻었다.

실시예 3: 추출물의 제조법(3)

오돈토글로섬 속 오구레 "로얄 새슈"(Augres　"Royal Sash")의 꽃(100g)을 사용한 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여 추출물(400 ml)(고형분 농도 1.1　wt%)을 얻었다.

실시예 4: 추출물의 제조법(4)

오돈토글로섬 속 오구레 "로얄 새슈"의 전체 식물(꽃, 줄기, 잎, 뿌리, 구근)(93.5g)을 사용하고, 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액 467 ml을 부가한 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여 추출물 (400ml)(고형분 농도 0.60　wt%)을 얻었다.

실시예 5: 추출물의 제조법(5)

오돈티오더 속 마리 노엘 "벨라노"(Marie 　 Noel 　"Velano")의 꽃(100g)을 사용한 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여 추출물(400 ml)(고형분 농도 1.1　wt%)을 얻었다.

실시예 6: 추출물의 제조법(6)

오돈티오더 속 마리 노엘 "벨라노"의 전체 식물(꽃, 줄기, 잎, 뿌리, 구근)(101g)을 사용하고, 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액 505 ml을 부가한 이외는, 실시예 1과 동일하게 하여 추출물(400 ml)(고형분 농도 0.73　wt%)을 얻었다.

실시예 7: 점도측정

실시예 1, 실시예 3, 실시예 5의 방법으로 제조한 추출물의 25℃에서의 점도를 음차형 진동식 점도계 SV-10(주식회사 에이·앤드·디)에 의해 측정하였다. 대조군은 추출물의 용매인 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 하였다. 비교로서, 점성 다당의 글루코만난을 포함하는 것으로 알려진 블레틸라 스트리아타(Bletilla striata) 괴경의 열수 추출물을 특허 문헌 11(JP-A-57-102809호(1982))에 기재되어 있는 실시예의 방법으로 제조하였다.또한 시험 시에 고형분 농도, 용매의 종류 및 용매의 농도를 실시예의 조건과 동일하게 하기 위하여 이 추출물을 고형분 농도가 1　wt%, 용매가 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 되도록 희석하였다. 결과는 표 1에 나타내었다. 실시예 1, 3, 5의 추출물의 점도는, 블레틸라 스트리아타 괴경 추출물에 비하여 5배 이상 높은 것이 확인되었다. 또한 실시예 1, 3, 5의 추출물은 피부 침투성이 좋고, 끈적임이나 땅기는 느낌은 확인되지 않았다.

	점도 Pa·s (cP)
라벤더 레이스 "실반" 꽃 추출물(실시예 1)	0.0986 (98.6)
오구레 "로얄 새슈" 꽃 추출물(실시예 3)	0.0446 (44.6)
마리 노엘 "벨라노" 꽃 추출물(실시예 5)	0.0499 (49.9)
블레틸라 스트리아타 괴경 추출물	0.00909 (9.09)
대조군 (30% 1,3-부틸렌글리콜)	0.00391 (3.91)

실시예 8: 실시예 1에서 얻어진 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 성분 분석

실시예 1의 방법으로 제조한 추출물의 성분을 명확하게 하기 위하여, 당 함량, 폴리페놀 함량, 단백질 함량을 측정하였다. 이하에 각각의 시험법과 결과를 나타낸다.

(i) 당 함량 측정(페놀 황산법)

[시험법 및 결과]

증류수를 사용하여 500배로 희석한 추출물의 용액 500 ㎕에 4　vol%　페놀수용액 500 ㎕를 가하고, 진한 황산 2.5ml를 강하게 적하하고 교반하였다. 수욕(water bath)에서 5 분간 냉각한 후 30℃에서 10분간 가온하여 485 nm의 흡광도를 측정하였다. 글루코오스 표준액을 사용하여 검량선을 작성하고, 추출물 중의 전체 당의 양을 산출하였다. 추출물의 당 함량은 12,323 ㎍/ml이고, 고형분(1.4 wt%)의 약 88 wt%가 당류이었다.

(ii) 폴리페놀 함량 측정(Folin-denis법)

[시험법 및 결과]

증류수를 사용하여 6배 희석한 추출물 1의 용액 80ml를 C18 컬럼(Sep-Pak　Vac　35cc　C18　Cartridge:　Waters)에서 정제하고, 흡착 성분의 건조물 28.9 mg을 얻었다. 이것을 50　vol%　메탄올 수용액에 용해시켜 고형분 농도 1　wt%로 제조한 후, 증류수로 100배 희석하여 측정 시료로 하였다. 측정 시료 200 ㎕에 증류수 3.2 ml, Folin-Ciocalteu's phenol　reagent　(Merck) 200 ㎕를 부가하여 교반한 후, 포화 탄산 나트륨 수용액 400 ㎕를 가하여 교반하고 60분간 정치하고, 700 nm의 흡광도를 측정하였다. 블랭크는 Folin-Ciocalteu's　phenol　reagent 대신에 증류수를 가하였다. 카테킨 표준액을 사용하여 검량선을 작성하여 측정 시료 중의 폴리페놀 양을 산출하고, 추출물 중의 폴리페놀 양을 구하였다. 추출물은 폴리페놀 0.1 mg/ml을 함유하고 있고, 고형분(1.4　wt%)의 약 1　wt%가 폴리페놀인 것이 명백하게 되었다.

(iii) 단백질 함량 측정(Lowry법)

DC　Protein　assay　kit　(Bio　Rad　Laboratories)를 사용하여 측정하였다. 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 7배 희석한 추출물의 용액 200 ㎕에 Reagent A 100㎕를 부가하여 교반한 후 Reagent B 800 ㎕를 부가하여 교반하며, 15분간 정치하여 750 nm의 흡광도를 측정하였다. BSA 표준액을 사용하여 검량선을 작성하여 추출물의 단백질 함량을 산출하였다. 추출물은 단백질을 1,529.0 ㎍/ml 함유하고 있고, 고형분(1.4　wt%)의 약 10　wt%가 단백질인 것이 명백하게 되었다.

이들 분석 결과로부터, 추출물의 주성분이 당류이고, 그 외의 성분으로서 단백질과 폴리페놀을 함유하는 것이 명백하게 되었다.

실시예 9: 실시예 1에서 얻어진 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 당 조성 분석

추출물의 주성분인 당류에 관하여 분명하게 하기 위하여, 실시예 1의 방법으로 제조한 추출물의 당 조성 분석을 실시하였다. 분석처리에 의해 다당 성분을 분해하여 측정하는 방법과 분해를 실시하지 않고 유리 당만을 측정하는 2개의 방법으로 분석을 실시하였다. 이하에 시험법과 결과를 나타낸다.

(i) 분해처리에 의한 분석

[시료의 제조]

추출물 40 ㎕를 감압 건조한 후, 2 mol/L 트리플루오로아세트산 수용액을 200㎕ 첨가하고, 감압밀봉관하 100℃에서 6시간 가수분해를 실시하고 다시 감압 건조하였다. 건조물을 증류수 200 ㎕에 용해하여 0.22 ㎛의 필터로 여과하였다.

[중성당의 측정방법]

제조한 시료를 HPLC 시스템(LC-9A 시스템: 시마즈 코포레이션, 일본)을 사용하여 측정하였다. 측정 조건을 이하에 나타낸다.

컬럼: TSK-gel　Sugar　AXG　15cm x 4.6mm　I.D.　(토우소 코포레이션, 일본)

컬럼 온도: 70℃

이동상: 0.5M　붕산 칼륨 완충액 pH 8.7

이동상 유속: 0.4　ml/분

반응시약: 1% 아르기닌/3% 붕산　

반응시약 유속: 0.5　ml/분

반응온도:150℃

검출기: 분광형광광도계 RF-10A_XL (시마즈 코포레이션, 일본)

검출파장: Ex.=320nm　　Em.=430nm

람노오스, 리보오스, 만노오스, 프럭토오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 수크로오스 표준액을 사용하여 검량선을 작성하여 추출물의 당 함량(㎍/ml)을 산출하였다. 표 2에 결과를 나타낸다.

[산성 당의 측정방법]

제조한 시료를 HPLC 시스템(LC-9A 시스템: 시마즈 코포레이션, 일본)을 이용하여 측정하였다. 측정 조건은 이하에 나타낸다.

컬럼: Shimpack　ISA-07　25cm x 4.6mm　I.D.　(시마즈 코포레이션, 일본)

컬럼온도:70℃

이동상: 1M　붕산 칼륨 완충액　pH8.7

이동상 유속: 0.8　ml/분

반응시약: 1% 아르기닌/3% 붕산　

반응시약 유속: 0.8　ml/분

반응온도: 150℃

검출기: 분광형광광도계 RF-10A_XL (시마즈 코포레이션, 일본)

검출파장: Ex.=320nm　　Em.=430nm

갈락쿠론산, 글루쿠론산(이즈론산), 글루쿠론산 표준액을 사용하여 검량선을 작성하여 추출물의 당 함량(㎍/ml)을 산출하였다. 표 2에 결과를 나타낸다.

	(㎍/ml)
Man	5198.92
Glu	1426.29
GalA	117.04
Xyl	114.14
Gal	59.86
Ara	44.57
Rha	37.96
Rib	5.03
총합	7003.81

Man: 만노오스, Glu: 글루코오스, GalA: 갈락쿠론산

Xyl: 크실로오스, Gal: 갈락토오스, Ara: 아라비노오스

Rha: 람노오스, Rib: 리보오스

(ii) 유리 당의 분석

[시료의 제조]

증류수를 사용하여 10배 희석한 추출물의 용액 200㎕를 0.22㎛의 필터로 여과하였다.

[중성당의 측정방법]

제조한 시료를 HPLC 시스템(LC-9A 시스템: 시마즈 코포레이션, 일본)을 이용하여 측정하였다. 측정 조건을 이하에 나타낸다.

컬럼: TSK-gel　Sugar　AXG　15cm x 4.6mm　I.D.　(토우소 코포레이션, 일본)

컬럼온도: 70℃

이동상: 0.5M　붕산 칼륨 완충액　pH8.7

이동상 유속: 0.4　ml/분

반응시약: 1% 아르기닌/3% 붕산　

반응시약 유속: 0.5　ml/분

반응온도: 150℃

검출기: 분광형광광도계 RF-10A_XL (시마즈 코포레이션, 일본)

검출파장: Ex.=320nm　　Em.=430nm

람노오스, 리보오스, 만노오스, 프럭토오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 수크로오스 표준액을 사용하여 검량선을 작성하여 추출물의 당 함량(㎍/ml)을 산출하였다. 표 3에 결과를 나타낸다.

	(㎍/ml)
Fru	1754.83
Glu	1275.63
Suc	330.48
Xyl	23.66
Man	22.19
Gal	19.97
총합	3426.76

Fru: 프럭토오스, Glu: 글루코오스, Suc: 수크로오스,

Xyl: 크실로오스, Man: 만노오스, Gal: 갈락토오스

표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 제조법으로 추출한 추출물은프럭토오스, 글루코오스 등의 단당류, 및 만노오스를 다수 포함하는 다당류를 함유하며, 다당류의 비율이 절반 이상을 점하고 있는 것이 명확하게 되었다. 만노오스는 유리 당으로서의 함유량이 적기 때문에 다당류의 구성 당인 것으로 생각되었다. 실 시예 10: 실시예 1에서 얻어진 라벤더 레이스 " 실반 " 꽃의 추출물의 정제 물에 포함되는 다당류의 분석

추출물의 주성분인 다당류의 조성 및 구조를 명확하게 하기 위하여, 실시예 1의 방법으로 제조한 추출물로부터 다당류를 분리정제하며, 당 조성 분석 및 효소 분해를 실시하였다. 이하에 시험법과 결과를 나타낸다.

(i) 조 분획(에탄올 침전법)

실시예 1의 방법으로 제조한 추출물(300g)에 에탄올(1200g)을 부가하여, 80　wt% 에탄올 수용액을 제조하였다. 이것을 7℃에서 하룻밤 정치한 후, 원심분리 에 의해 침전과 상층액을 분리하고, 침전은 동결건조기에 의해 건조시켰다. 한편, 상층액은 회전 증발기로 농축하고, 다시 에탄올을 가하여 동일한 조작을 실시하였다. 이 2회의 작업에 의해 에탄올 침전물(3.7g)을 얻었다.

(ii) 조 분획(C18 컬럼 처리)

(i)에서 제조한 에탄올 침전물(3.7g)을 물에 용해시켜 1　wt% 수용액으로 한 후, 역상계의 충전제(YMC-GEL, 　ODS-A120-S150:　YMC)를 넣은 컬럼(3cm x 100cm)에 통과시켜, 흡착되는 불순물을 제거하였다. 컬럼을 통과한 분획은 회전 증발기로 농축한 후 (i)과 동일하게 에탄올 침전을 실시하여 에탄올 침전물(1.8g)을 회수하였다.

(iii) 분리정제(DEAE 컬럼 처리)

(ii)에서 제조한 에탄올 침전물을 증류수에 용해시켜 2wt% 수용액으로 한 후, 이온 교환 수지(DEAE　sepharose　CL-6B:　Amersham　Pharmacia　Biotech　AB)를 충전시킨 컬럼(3cm x 100cm)에 5ml를 통과시켜 증류수 및 0.5M　NaCl로 용출시키고, 당이 포함된 프랙션을 분획하였다. 분획분자량 5000의 한외여과막(Amicom　Ultra, Ultracel-10K:　MILLIPORE)을 이용하여 10배로 농축시켜, 매우 점성이 높은 무색용액을 얻었다. 이것을 동결건조하는 것에 의해 백색의 정제물(52.7mg)을 얻었다.

(iv) 당 조성 분석

(iii)에서 얻어진 정제물을 증류수에 용해시켜 1　wt% 수용액을 제조하고, 당 조성 분석을 실시하였다.

[시료의 제조]

1　wt% 수용액 100㎕에 5　mol/L 트리플루오로아세트산 수용액을 200㎕ 첨가하고, 120℃에서 3시간 가수분해를 실시하여 감압건조시켰다. 건조물을 증류수 500㎕에 용해시킨 샘플 및 증류수로 10배 희석한 샘플을 0.22㎛의 필터로 여과하였다.

[중성당의 측정방법]

컬럼: TSK-gel　Sugar　AXG　15cm x 4.6mm　I.D.　(토우소 코포레이션, 일본)

컬럼온도:70℃

이동상: 0.5M　붕산 칼륨 완충액　pH8.7

이동상 유속: 0.5　ml/분

반응시약:1% 아르기닌/3% 붕산　

반응시약 유속: 0.5　ml/분

반응온도: 150℃

검출기: 분광형광광도계 RF-10A_XL (시마즈 코포레이션, 일본)

검출파장: Ex.=320nm　　Em.=430nm

람노오스, 리보오스, 만노오스, 프럭토오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 크실로오스, 글루코오스, 수크로오스 표준액을 사용하여 검량선을 작성하여 정제물의 당 함량을 산출하였다.

다당류의 분석결과를 표 4에 나타낸다. 정제물은 만노오스와 글루코오스를 포함하고 있었다. 또한, 만노오스와 글루코오스의 조성비(질량비, %)를 표 4에 나타낸다. 만노오스와 글루코오스의 조성비는 약 98: 2이었다.

	(㎍/ml)	비율(%)
Man	945.54	98.1
Glu	18.74	1.9
총합	964.28	100

Man: 만노오스, Glu: 글루코오스

(v) 효소 분해

(iv)에서 제조한 정제물의 1　wt% 수용액, 및 실시예 1의 방법으로 제조한 추출물에 β-1,4-만나아제(야쿠르트 약품공업주식회사)와 0.2M　인산 완충액(pH6.8)을 가하여 50℃에서 하룻밤 정치하여 효소 분해 반응을 실시하였다. 반응 후, 90℃에서 10분간 가열하여 효소를 실활시키고, 실시예 9-(ii)와 동일한 조건에서 당 조성 분석을 실시하였다.

분석 결과, 효소 분해에 의해 유리된 만노오스가 검출된 점에서, 고분자 다당은 만노오스가 β-1,4 글리코시드 결합으로 결합한 다당을 포함하는 것이 명확하게 되었다. 또한, 용액 및 추출물의 점성이 대폭 감소한 점에서 다당이 점성에 기여하고 있는 것이 명확하게 되었다.

실시예 11: 과산화 지질의 생성 억제 시험

과산화 지질 생성에 대한 추출물의 억제 효과를 리놀산 자동산화 억제 시험에 의해 평가하였다. 과산화 지질은 티오시안산철법에 의해 평가하였다. 이하에 시험법과 결과를 나타낸다.

[시료의 제조]

2.5　wt%　리놀산 에탄올 용액 2ml에 0.5M　인산 완충액(pH7.0) 4ml, 에탄올 2ml, 고형분 농도 0.02　wt%, 용매가 3　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 되도록 희석한 실시예 1의 방법으로 제조한 추출물 2ml를 첨가하여 혼합하고, 갈색병에 넣어 40℃에서 보존하였다. 4℃에 보존한 것을 블랭크로 하였다. 또 3 vol%　1,3-부틸렌글리콜을 첨가한 시료를 대조군으로 하였다.

[측정법 및 결과]

시료 0.1ml에 에탄올 9.7ml, 30　wt% 로단 철 암모늄 수용액 0.1ml, 20mM　염화제1철 수용액 0.1ml를 첨가하고, 3분 후에 500nm의 흡광도를 측정하였다. 블랭크의 흡광도를 뺀 Δ흡광도를 산출하여 과산화 지질 양을 평가하였다. 비교로서 일반적으로 산화제로서 사용되는 비타민 E(0.02　wt%)을 사용하였다. 도 1에 결과를 나타낸다. 비타민 E와 동등 이상의 과산화 지질의 생성 억제 효과가 있고, 효과의 지속성이 확인되었다.

실시예 12: 수분 유지 시험(1)

추출물의 수분 유지력을 평가하였다. 이하에 시험법과 결과를 나타낸다.

[시험법 및 결과]

실시예 1, 실시예 3, 실시예 5의 방법으로 제조한 추출물을 고형분 농도1　wt%로 되도록 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 희석하여 시험 검체로 하였다. 시험 검체 10 ㎍을 1cm x 1cm 여과지(FILTER　PAPER　5B　(ADVANTEC　TOYO))에 도포하고, 22℃, 30% RH 환경하에서의 질량변화를 경시적으로 측정하였다. 또한 대조군은 추출물의 용매인 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 하였다. 비교로서 난과 식물의 추출물 중에서 수분유지(보수) 효과가 알려져 있는, 블레틸라 스트리아타 괴경의 열수 추출물(JP-A- S57-102809 (1982))), 심비듐 전체 식물의 50% 에탄올 추출물(JP-A-2002-3336)), 호접란(Phalaenopsis) 꽃의 열수 추출물(JP-A-H5-70338(1993))을 각각 공개 특허공보의 실시예에 기재된 추출방법으로 제조하였다. 또한 시험시는 고형분 농도, 용매의 종류 및 용매의 농도를 실시예의 조건과 동일하게 하기 위하여 이들 추출물을 고형분 농도가 1 wt%, 용매가 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 되도록 희석 또는 농축하였다. 단, 실시예의 추출용매와 상기 비교로 한 추출 용매가 상이한 경우는 후자의 추출 용매를 회전증발기(Rotary　Evaporator, EYELA)로 제거하여 제조하였다.

결과는 도 2에 도시하였다. 수치는 수분 유지율을 나타내고 있고, 측정 개시 시의 질량을 100%로서 산출하였다. 도 2에는, 측정 개시 후 15분 후의 수분 유지율을 나타내었다.

실시예 1, 실시예 3, 실시예 5의 방법으로 제조한 추출물의 수분 유지 효과는 상기 비교로한 추출물과 비교하여 우수한 것이 확인되었다(도 2).

실시예 13: 수분 유지 시험(2)

다당류의 수분 유지력을 평가하였다. 이하에 시험법과 결과를 나타낸다.

[시험법 및 결과]

실시예 10-(iii)에서 얻어진 정제물을 고형분 농도 1　wt%로 되도록 증류수로 제조하고, 시험검체로 하였다. 시험 검체 10 ㎍을 1cm x 1cm 여과지(FILTER　PAPER　5B(ADVANTEC　TOYO))에 도포하고, 22℃, 30% RH 환경하에서의 질량변화를 경시적으로 측정하였다. 증류수를 대조군으로 하였다. 비교로서 보수(수분 보유) 효과가 높은 화장품 원료로서 범용되고 있는 히알우론산(기분 푸드 케미파 컴패니 리미티드)를 고형분 농도 1　wt%로 증류수로 제조하였다.

결과는 도 3에 나타내었다. 수치는 수분 유지율을 나타내고 있고, 측정 개시 후의 질량을 100%로서 환산하였다. 도 3에는 측정 개시후 15분 후의 수분 유지율을 나타내었다.

실시예 10-(iii)에서 얻어진 정제물은 대조군과 비교하여 수분 유지력이 유의하게 높고, 보수력이 높은 것으로 알려져 있는 히알우론산과 동등 정도의 보수성이 확인되었다.

실시예 14: 보습성 시험

추출물의 보습성을 평가하기 위하여 각질층 수분량을 경시적으로 측정하였다. 또한 각질층 수분량은 피부의 콘덕턴스 값으로 평가하였다. 이하에 시험법과 결과를 나타낸다.

[시험법 및 결과]

측정기기: SKICON-200EX　(I.B.S. 리미티드, 일본)

시험환경: 20~22℃, 30~40% RH

각 패널(건강 성인 N=3)에는 시험실에 입실 후, 시험 부위를 보습성분을 함유하지 않는 비누로 세정하여 두고, 20분간 안정하여 두고 나서 측정을 실시하였다. 앞쪽 팔 내측부의 초기 값을 측정한 후, 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 5의 방법으로 제조한 추출물을 10 ㎕/4cm² 도포하고, 각질층 수분량을 경시적으로 측정하였다. 또한 대조군은 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 하였다. 비교로서 난과 식물의 추출물 중에서 보습효과가 알려져 있는 블레틸라 스트리아타 괴경의 열수 추출물(JP-A-S57-102809 (1982)), 심비듐 전체 식물의 50% 에탄올 추출물(JP-A-2002-3336), 호접란 꽃의 열수 추출물(JP-A-H5-70338 (1993))을 각각 공개 특허공보의 실시예에 기재된 추출방법으로 제조하였다. 또한 시험 시는 고형분 농도, 용매의 종류 및 용매의 농도를 실시예의 조건과 동일하게 하기 위하여 이들 추출물 을 고형분 농도가 1　wt%, 용매가 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액으로 되도록 희석 또는 농축하였다. 단, 실시예의 추출용매와 상기 비교로 한 추출물의 추출용매가 상이한 경우는 후자의 추출 용매를 증발기(Rotary　Evaporator, 　EYELA)로 제거한 다음 제조하였다. 또한, 보습효과가 높은 화장품 원료로서 범용되고 있는 히알우론산(기분 푸드 케미파 컴패니 리미티드)을 고형분 농도 1　wt%로 되도록 30　vol%　1,3-부틸렌글리콜 수용액에 용해시켜 비교로서 사용하였다.

결과는 도 4에 나타내었다. 수치는 수분량을 나타내고 있고, 초기치는 100%로 한 상대치로 표시하였다. 도 4에는 측정개시후 60분 후의 수분량을 나타내었다.

실시예 1, 실시예 3, 실시예 5의 방법으로 제조한 추출물의 도포에 의해 수분량이 상승하고, 그 효과는 장시간 지속하였다. 이 효과는 상기 비교로 한 다른 추출물(블레틸라 스트리아타 추출물, 심비듐 추출물, 호접란 추출물)이나 보습제(히알우론산)를 도포한 경우보다도 우수한 점에서 실시예 1, 실시예 3, 실시예 5의 방법으로 제조한 추출물은 보습효과가 높고, 보습제로서 유효한 것이 확인되었다.

실시예 15: 화장료로의 배합

이하에 나타내는 처방예에 따라서, 실시예 1의 제조법으로 추출한 추출물을 배합한 로션, 유액, 크림을 통상의 방법에 의해 제조하였다. 또 추출 성분만을 제외한 플라시보(placebo)도 동일하게 제조하였다. 단위는 wt%로 나타내었다.

[로션]

정제수 81.9

추출물(실시예 1) 10.0

1,3-부틸렌글리콜 3.0

진한 글리세린 2.0

무수 에탄올 2.0

폴리에틸렌 글리콜 1540 0.5

페녹시에탄올 0.35

메틸 파라히드록시벤조에이트 0.15

크산탄 검 0.1

[유액]

정제수 77.04

추출물(실시예 1) 10.0

스쿠알렌 3.0

1,3-부틸렌글리콜 3.0

세토스테아릴알코올 3.0

진한 글리세린 2.0

글리세릴 모노스테아레이트 1.2

카복시비닐폴리머 0.3

크산탄검 0.15

메틸 파라히드록시벤조에이트 0.15

수산화 칼륨 0.12

프로필 파라히드록시벤조에이트 0.03

천연 비타민 E 0.01

[크림]

정제수 60.13

스쿠알렌 15.0

추출물(실시예 1) 10.0

스테아르산 4.0

1,3-부틸렌글리콜 3.0

세토스테아릴알코올 3.0

베헤닐알코올 2.0

글리세릴 모노스테아레이트 2.0

메틸폴리실옥산 0.5

메틸파라히드록시벤조에이트 0.17

L-아르기닌 0.1

프로필 파라히드록시벤조에이트 0.05

천연 비타민 E 0.05

[플라시보 로션]

정제수 88.9

1,3-부틸렌글리콜 6.0

진한 글리세린 2.0

무수 에탄올 2.0

폴리에틸렌글리콜 1540 0.5

페녹시에탄올 0.35

메틸 파라히드록시벤조에이트 0.15

크산탄 검 0.1

[플라시보 유액]

정제수 84.04

1,3-부틸렌글리콜 6.0

스쿠알렌 3.0

세토스테아릴알코올 3.0

진한 글리세린 2.0

글리세릴 모노스테아레이트 1.2

카복시비닐폴리머 0.3

크산탄검 0.15

메틸 파라히드록시벤조에이트 0.15

수산화칼륨 0.12

프로필 파라히드록시벤조에이트 0.03

천연 비타민 E 0.01

[플라시보 크림]

정제수 67.13

스쿠알렌 15.0

1,3-부틸렌글리콜 6.0

스테아르산 4.0

세토스테아릴알코올 3.0

베헤닐알코올 2.0

글리세릴 모노스테아레이트 2.0

메틸폴리실옥산 0.5

메틸 파라히드록시벤조에이트 0.17

L-아르기닌 0.1

프로필 파라히드록시벤조에이트 0.05

천연 비타민 E 0.05

실시예 16: 사용시험

실시예 15에서 제조한 로션, 유액, 크림을 각 패널(건강 성인 N=5)에 사용하여 앙케이트에 의해 평가를 실시하였다. 비교로서 추출물 성분만을 제외한 플라시보를 사용하여, 우수한 쪽을 선택하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.

어떤 화장료도 플라시보와 비교하여 피부 침투성이 양호하고, 보습감이 있으며, 땅기는 느낌이나 끈적거림이 없는 것이 확인되었다.

앙케이트 항목	로션		유액		크림
앙케이트 항목	라벤더 레이스 "실반"	플라시보	라벤더 레이스 "실반"	플라시보	라벤더 레이스 "실반"	플라시보
촉촉함 (보습감)	5	0	5	0	5	0
보송보송함	5	0	5	0	5	0
퍼짐성	5	0	5	0	5	0
침투성	5	0	5	0	5	0
끈적거림	0	5	0	5	0	5

* 수치는 선택한 인원수를 나타냄.

실시예 17: 실시예 3에서 얻어진 오구레 "로얄 새슈" 꽃의 추출물의 성분 분석

당 함량을 페놀황산법으로 측정하였다.

[시험법 및 결과]

시험은 증류수로 추출물을 200배로 희석한 이외는, 실시예 8-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

추출물의 당 함량은 10,063 ㎍/ml이고, 고형분(1.1wt%)의 약 91　wt%가 당류이었다.

실시예 18: 실시예 5에서 얻어진 마리 노엘 "벨라노" 꽃의 추출물의 성분 분석

실시예 5의 방법으로 제조한 추출물의 성분을 명확하게 하기 위하여, 당 함량을 페놀황산법으로 측정하였다.

[시험법 및 결과]

시험은 증류수로 추출물을 200배로 희석한 이외는, 실시예 8-(i)과 동일하게 실시하였다.

추출물의 당 함량은 9,238 ㎍/ml이고, 고형분(1.1wt%)의 약 84　wt%가 당류이었다.

실시예 19: 실시예 3에서 얻어진 오구레 "로얄 새슈" 꽃 추출물의 당 조성 분석

실시예 3의 방법으로 제조한 추출물의 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 분해처리에 의한 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

분해처리에 의한 당 조성 분석 결과를 표 6에 나타낸다.

	오구레 "로얄 새슈" (㎍/ml)	마리 노엘 "벨라노" (㎍/ml)	심비듐 (㎍/ml)	호접란 (㎍/ml)
Man	2721.10	2099.25	155.41	48.21
Glu	975.13	1102.52	2368.70	667.82
Xyl	58.88	42.71	13.72	3.37
Gal	53.60	49.10	105.55	13.93
Ara	57.18	1.31	34.93	10.34
총합	3865.89	3294.89	2678.31	743.67

Man: 만노오스, Glu: 글루코오스, Xyl: 크실로오스,

Gal: 갈락토오스, Ara: 아라비노오스

(ii) 유리 당의 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

유리 당의 분석결과를 표 7에 나타낸다.

	오구레 "로얄 새슈" (㎍/ml)	마리 노엘 "벨라노" (㎍/ml)	심비듐 (㎍/ml)	호접란 (㎍/ml)
Fru	1288.56	1730.05	2170.82	454.23
Glu	1033.90	1327.00	2137.41	428.81
Xyl	11.81	8.21	5.07	0.00
Man	14.09	18.56	0.00	0.83
Gal	21.30	18.56	28.31	1.29
총합	2369.66	3102.38	4341.61	885.16

Fru: 프럭토오스, Glu: 글루코오스, Xyl: 크실로오스,

Man: 만노오스, Gal: 갈락토오스

표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 3의 제조법으로 추출한 추출물은, 만노오스, 프럭토오스, 글루코오스를 다수 포함하는 것이 명백하게 되었다. 만노오스는 유리 당으로서의 함유량이 적은 점에서, 다당류의 구성 당인 것으로 생각되었다.

실시예 20: 실시예 5에서 얻어진 마리 노엘 "벨라노" 꽃의 추출물의 당 조성 분석

실시예 5의 방법으로 제조한 추출물의 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 분해처리에 의한 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

분해처리에 의한 당 조성 분석 결과를 상기 표 6에 나타낸다.

(ii) 유리 당의 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

유리 당의 분석결과를 상기 표 7에 나타낸다.

표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 5의 제조법으로 추출한 추출물은, 만노오스, 프럭토오스, 글루코오스를 다수 포함하는 것이 명확하게 되었다. 만노오스는 유리 당으로서의 함유량이 적은 점에서, 다당류의 구성 당인 것으로 생각되었다.

비교예 1: 심비듐 전체 식물의 추출물의 당 조성 분석

실시예 12에서 제조한 심비듐 전체 식물의 50% 에탄올 추출물의 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 분해처리에 의한 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

(ii) 유리 당의 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(ii)과 동일한 방법으로 실시하였다.

유리 당의 분석결과를 상기 표 7에 나타낸다.

표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 추출물의 당의 구성 성분은, 주로 글루코오스와 프럭토오스이었다. 만노오스의 비율은 낮고, 5　wt% 이하이었다. 라벤더 레이스 "실반", 오구레 "로얄 새슈", 마리 노엘 "벨라노"와 조성이 상이한 것이 밝혀졌다.

비교예 2: 호접란 꽃의 열추출물의 당 조성 분석

실시예 12에서 제조한 호접란 꽃의 열 추출물의 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 분해처리에 의한 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다.

(ii) 유리 당의 분석

[시료의 제조]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

[중성당의 측정방법]

실시예 9-(ii)와 동일한 방법으로 실시하였다.

유리 당의 분석 결과를 상기 표 7에 나타낸다.

실시예 21: 실시예 3에서 얻어진 오구레 "로얄 새슈" 꽃의 추출물의 정제물에 포함되는 다당류의 분석

실시예 3의 방법으로 제조한 추출물로부터 다당류를 분리정제하고, 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 조 분획(에탄올 침전법)

실시예 10-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다. 에탄올 침전물 3.0g을 얻었다.

(ii) 조 분획(C18 컬럼 처리)

실시예 10-(ii)과 동일한 방법으로 실시하였다. 에탄올 침전물 1.2g을 회수하였다.

(iii) 분리정제(DEAE 컬럼 처리)

실시예 10-(iii)과 동일한 방법으로 실시하였다. 백색의 정제물 44.9mg을 얻었다.

(iv) 당 조성 분석

실시예 10-(iv)과 동일한 방법으로 실시하였다.

다당류의 분석결과를 표 8에 나타낸다. 정제물은 만노오스와 글루코오스를 포함하고 있었다. 다당류의 만노오스와 글루코오스의 조성비(질량비, %)를 표 9에 나타낸다. 만노오스와 글루코오스의 조성비는 약 98:2이고, 만노오스를 다수 포함하고 있었다.

	오구레 "로얄 새슈" (DEAE 컬럼에 의한 정제물) (㎍/ml)	마리 노엘 "벨라노" (DEAE 컬럼에 의한 정제물) (㎍/ml)	호접란 (에탄올 침전법에 의한 분획물) (㎍/ml)
Man	639.95	675,75	797.90
Gal	16.15	18.40	274.10
총합	656.11	694.15	1071.99

Man: 만노오스, Glu: 글루코오스

	오구레 "로얄 새슈" (DEAE 컬럼에 의한 정제물) (%)	마리 노엘 "벨라노" (DEAE 컬럼에 의한 정제물) (%)	호접란 (에탄올 침전법에 의한 분획물) (%)
Man	97.5	97.3	74.4
Gal	2.5	2.7	25.6
총합	100	100	100

Man: 만노오스, Glu: 글루코오스

실시예 22: 실시예 5에서 얻어진 마리 노엘 "벨라노" 꽃의 추출물의 정제물에 포함되는 다당류의 분석

실시예 5의 방법으로 제조한 추출물로부터 다당류를 분리정제하고, 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 조 분획(에탄올 침전법)

실시예 10-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다. 에탄올 침전물 2.3g을 얻었다.

(ii) 조 분획(C18 컬럼 처리)

실시예 10-(ii)과 동일한 방법으로 실시하였다. 에탄올 침전물 0.4g을 회수하였다.

(iii) 분리정제(DEAE 컬럼 처리)

실시예 10-(iii)과 동일한 방법으로 실시하였다. 백색의 정제물 54.0mg을 얻었다.

(iv) 당 조성 분석

실시예 10-(iv)과 동일한 방법으로 실시하였다.

다당류의 분석결과를 상기 표 8에 나타낸다. 정제물은 만노오스와 글루코오스를 포함하고 있었다. 만노오스와 글루코오스의 조성비(질량비, %)를 상기 표 9에 나타낸다. 만노오스와 글루코오스의 조성비는 약 97:3이고, 만노오스를 다수 포함하고 있었다.

비교예 3: 블레틸라 스트리아타의 괴경 추출물에 포함되는 다당류의 분석

실시예 5의 방법으로 제조한 추출물로부터 다당류를 분획하고, 당 조성 분석을 실시하였다.

(i) 분획 (에탄올 침전법)

실시예 10-(i)과 동일한 방법으로 실시하였다. 에탄올 침전물 4.8g을 얻었다.

(ii) 당 조성 분석

(i)에서 얻어진 분획물을 사용한 이외는, 실시예 10-(iv)와 동일한 방법으로 실시하였다.

다당류의 분석결과를 상기 표 8에 나타낸다. 분획물은 만노오스와 글루코오스를 포함하고 있었다. 만노오스와 글루코오스의 조성비(질량비, %)를 상기 표 9에 나타낸다. 만노오스와 글루코오스의 조성비는 약 3:1이고, 라벤더 레이스 "실반", 오구레 "로얄 새슈", 마리 노엘 "벨라노"의 정제물과 비교하여 만노오스의 조성비가 낮았다.

실시예 23: 실시예 1에서 얻어진 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 정제 다당의 메틸화 분석

실시예 1의 제조법으로 추출한 추출물로부터, 실시예 10-(iii)의 방법으로 얻어진 분리 정제물 1.85mg에, 오산화인 존재하에서 디메틸설폭시드 0.4ml를 부가하여 교반한 후, 수산화 나트륨 40mg, 요오드화 메틸 0.3ml을 첨가하고, 4시간 교반시켰다. 반응액을 클로로포름으로 추출하여, 메틸화 당을 얻었다. 메틸화 당에 90% 포름산을 0.5ml 첨가하고, 100℃에서 2시간 가수분해한 후, 증발건조시키고, 또한 2N 트리플루오로아세트산으로 가수분해한 후 증발건조시켰다. 1% 수산화 붕소 나트륨 0.5 ml를 첨가하여 환원시킨 후, 무수 아세트산-피리딘을 0.4 ml 부가하여 아세틸화하고, 부분 메틸화 알디톨(aldithol) 아세테이트를 얻었다. 이 부분 메틸화 알디톨 아세테이트를 GC 및 GC/MS로 측정하였다.

[GC 측정조건]

장치: GC-2000AF(시마즈 코포레이션, 일본)

컬럼: SPB-5 융합 실리카 캐필러리(fused　silica　capillary)　30m　X　0.25　mm　ID　(스펠코 재팬)

캐리어 가스: He

컬럼 온도: 80℃　1분　→　280℃

주입온도: 280℃

검출 모드: FID

검출기 온도: 280℃

주입량: 1 ㎕

주입모드: 스플리트리스(splitless)

[GC/MS 측정조건]

장치: 질량분석계　JMS-700V(JEOL Ltd., 일본)

가스 크로마토그래피 HP-6890　(아질렌트 테크놀로지 주식회사)

(GC부)

컬럼: SPB-5 fused　silica　capillary　30m　X　0.25　mm　ID　(스펠코 재팬)

캐리어 가스: He

컬럼 온도: 80℃　1분　→　280℃

주입온도: 280℃

주입량: 1　㎕

주입모드: 스플리트리스(splitless)

(MS부)

이온화법: 전자충격(EI)법

MS 측정부: 이중수속형 (역배치), 가속전압 10kV

이온화 전압: 70　eV

이온화 전류: 300μA

이온화실 온도: 250℃

주사속도: 1 sec/scan (m/z 35-500)

주사간격: 1 sec

[결과]

GC의 유지 시간 및 매스 스펙트럼을 표준 매스 스펙트럼과 비교하는 것으로 각 피이크를 확인하고, GC의 피크 면적으로부터 몰 비를 산출하였다. 결과를 표 10에 나타내었다.

메틸화 당	조성비
2,3,4,6-테트라-O-메틸만노오스	1.00
2,3,6-트리-O-메틸만노오스	265.33
2,6-디-O-메틸만노오스	4.95
3,6-디-O-메틸만노오스	14.03
2,3-디-O-메틸만노오스	1.82

이상의 결과는, 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물로부터 분리된 다당을 구성하는 만노오스 분자 중, 가장 많은 결합 양식은 1→ 4 결합의 만노오스이지만, 그 일부에 분기를 만든 것으로 생각되는 만노오스 분자도 있는 것을 나타내고 있었다. 그 분기 부분의 결합 양식은 1→3, 1→4 결합, 1→2, 1→4 결합, 1→6, 1→4 결합이었다.

실시예 24: 히알우론산 생산 촉진 시험

정상 인간 표피 각화 세포 NHEK(F)(KURABO)를 48웰 플레이트에 25,000 세포/cm²로 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배양 5일째에 시험검체를 포함하는 배지 HuMedia-KG2(KURABO)로 교환하고, 또한 2일간 배양한 후, 배양 상층액 중의 히알우론산을 히알우론산 측정 키트(세이카가쿠 코포레이션, 일본)로 측정하였다. 또한, 동시에 DC　Protein　Assay　Kit(Bio-Rad　Laboratories 제조)로 단백질량을 측정하고, 단백질 질량당 히알우론산 양을 산출하였다.

시험검체는 실시예 1의 방법으로 제조한 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물로 하고, 최종 농도가 각각 126 ㎍/ml, 63 ㎍/ml, 31.5 ㎍/ml, 용매의 최종 농도가 0.3　vol%　1,3-부틸렌글리콜로 되도록 배지에 첨가하였다. 또한, 대조군은 용매인 0.3　vol%　1,3-부틸렌글리콜로 하였다. 결과를 표 11에 나타내었다. 대조군의 히알우론산 생산량을 100%으로 하고, 히알우론산 생산량을 산출하였다. 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물은, 표피 각화 세포에 있어서, 대조군과 비교하여 유의하게 히알우론산 생산을 촉진시키는 것이 확인되었다.

	농도(㎍/ml)	히알우론산 생산량(%)
대조군	-	100
라벤더 레이스 "실반"	31.5	104
	63	114
	126	125

실시예 25: 세라미드 생산 촉진 시험(1)

정상 인간 표피 각화 세포 NHEK(F)(KURABO)를 60mm 접시에 1.5 x 10⁵세포/접시로 되도록 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배양 4일째에 시험검체를 포함하는 배지 HuMedia-KG2(KURABO)로 교환하고, 또한 3일간 배양한 후, 세포를 회수하였다. 회수한 세포에 클로로포름-메탄올(2:1) 용액을 3ml 부가하여 초음파 파쇄하고, 용매를 제거하여 지질을 추출하였다. 추출한 지질에 3N 염산을 150㎕ 부가하여 100℃에서 2시간 가열하며, 용매 제거 후에 아세트산에틸 2 ml, 0.1M 아세트산 완충액(pH3.7) 1.25 ml, 플루오레스카민액(플루오레스카민 7 mg/아세톤25ml) 250 ㎕를 부가하여 혼합하고, 원심분리한 상층액의 형광강도(Ex:415　nm, Em:492　nm)를 측정하고, 세라미드 양을 정량하였다.

시험검체는 실시예 1의 방법으로 제조한 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물로 하고, 최종 농도가 각각 126 ㎍/ml, 63 ㎍/ml, 용매의 최종 농도가 0.3　vol　%　1,3-부틸렌글리콜로 되도록 배지에 첨가하였다. 또한, 대조군은 용매인 0.3　vol　%　1,3-부틸렌글리콜로 하였다. 결과를 표 12에 나타내었다. 대조군의 세라미드 생산량을 100%로 하고, 세라미드 생산량을 산출하였다. 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물은, 표피 각화 세포에 있어서, 대조군과 비교하여 유의하게 세라미드 생산을 촉진시키는 것이 확인되었다.

	농도 (㎍/ml)	세라미드 생산량(%)
대조군	-	100
라벤더 레이스 "실반" (추출물)	63	113
라벤더 레이스 "실반" (추출물)	126	131

실시예 26: 세라미드 생산 촉진 시험(2)

시험검체를, 실시예 10-(ii)에서 얻어진 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 에탄올 침전물로 하고, 최종 농도가 100 ㎍/ml로 되도록 물에 용해시키고, 배지에 첨가한 이외는, 실시예 25와 동일하게 시험을 실시하였다. 또한, 대조군은 피험물질 무첨가로 하였다. 결과를 표 13에 나타내었다. 대조군의 세라미드 생산량을 100%로 하고, 세라미드 생산량을 산출하였다. 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 에탄올 침전물은, 표피 각화 세포에 있어서, 대조군과 비교하여 유의하게 세라미드 생산을 촉진시키는 것이 확인되었다.

	농도 (㎍/ml)	세라미드 생산량(%)
대조군	-	100
라벤더 레이스 "실반" (에탄올 침전물)	100	121

실시예 27: 세라미드 생산 촉진 시험(3)

시험검체를, 실시예 10-(iii)에서 얻어진 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 정제물로 하고, 최종 농도가 각각 100 ㎍/ml, 200 ㎍/ml로 되도록 물에 용해시키고 배지에 첨가한 이외는, 실시예 25와 동일하게 시험을 실시하였다. 또한, 대조군은 피험물질 무첨가로 하였다. 결과를 표 14에 나타내었다. 대조군의 세라미드 생산량을 100%로 하고, 세라미드 생산량을 산출하였다. 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물의 정제물은, 표피 각화 세포에 있어서, 대조군과 비교하여 유의하게 세라미드 생산을 촉진시키는 것이 확인되었다.

	농도 (㎍/ml)	세라미드 생산량(%)
대조군	-	100
라벤더 레이스 "실반" (정제물)	100	107
라벤더 레이스 "실반" (정제물)	200	122

실시예 28: IV 형 콜라겐 생산 촉진 시험

인간 삼차원 배양 피부 모델 TESTSKIN^TM　LSE-high 1주간 배양+A/L 배양 세트 (TOYOBO)의 배지 중에 시험물질을 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 7일간 배양하며, 포르말린 고정하여 파라핀 절편을 제작하였다. 탈 파라핀 후, 1차 항체로서 항 인간 IV형 콜라겐 항체(Clone　PHM-12+CIV　22)(Thermo　Fisher　Scientific)를 이용하고, 그 후, 히스토파인심플스테인 MAX-PO(M)(니치레이 바이오사이언스 인코포레이티드, 일본)로 반응시키고, DAB 기질 키트(니치레이 바이오사이언스 인코포레이티드, 일본)로 염색하였다. 또한, 헤마토크실린 염색으로 핵염색을 실시하였다. 조직을 관찰하고, 대조군과 염색 강도를 비교하는 것에 의해 IV형 콜라겐 생산량을 판정하였다.

시험물질은 실시예 1의 방법으로 제조한 라벤더 레이스 "실반" 꽃의 추출물로 하고, 최종 농도가 126 ㎍/ml로 되도록 배지에 첨가하였다. 대조군은 피험물질 무첨가로 하였다. 도 5의 패널 A에 대조용의 염색 결과, 도 5의 패널 B에 실시예 1의 추출물 첨가시의 염색 결과를 나타내었다. 도 중의 화살표는 IV형 콜라겐을 나타낸다. 추출물의 첨가에 의해 IV형 콜라겐 생산량이 증가하는 것이 확인되었다.

본 명세서에서 이용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 참고로서 본 명세서에 포함되는 것이다.

Claims

난과(Orchidaceae) 오돈토글로섬(Odontoglossum) 속의 식물, 또는 오돈토글로섬 속과 코크리오더(Cochlioda)속의 교배 속 유래의 식물로부터 얻어지는 추출물이고, 이하의 (1)~(4)의 특징을 갖는, 상기 추출물:
(1)　추출물이 당 성분을 포함하고, 그 중, 다당류가, 약 60~70　wt% 또는 그 이상임;
(2)　다당류의 구성 당의 90% 이상이 만노오스임;
(3)　만노오스가 β-1,4 글리코시드 결합으로 결합되어 있음;
(4)　추출물이 보습효과를 가짐.
제 1항에 있어서, 이하의 특징을 또한 갖는 추출물:
(1)　만노오스의 일부가 만노오스 분자의 2, 3 또는 6 위치에 분기를 가짐.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 이하의 특징을 또한 갖는 추출물:
(1)　추출물이 히알우론산 생산 촉진 작용, 세라미드 생산 촉진 작용, 및 IV형 콜라겐 생산 촉진 작용을 가짐.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,　이하의 특징을 또한 갖는 추출물:
(1)　추출물이 과산화지질 생성 억제 작용을 가짐.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배 속 유래 식물이 오돈티오더 (Odontioda) 속 식물인 추출물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 난과 식물의 품종이, 라벤더 레이스 "실반", 마리 노엘 "벨라노" 및 오구레 "로얄 새슈"으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 추출 원료에 꽃을 포함하는 추출물.
난과 오돈토글로섬 속 식물, 또는 오돈토글로섬 속과 코크리오더 속의 교배속 유래 식물의 꽃을 포함한 식물 부분과, 물, 친수성 유기 용매 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 용매를 혼합하는 공정,
상기 식물 부분 및 용매의 혼합물을 가열 및 추출하는 공정, 및
상기 추출물을 회수하는 공정을 포함하는,
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 추출물의 제조방법.
제 8항에 있어서, 가열 추출공정이 60~120℃의 온도에서 가열하며, 그 후, 0~60℃의 온도로 냉각하여 추출을 실시하는 것을 포함하는 방법.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 용매가 물과 1,3-부틸렌글리콜의 혼합물인 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 추출물이 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 것인 추출물.
제 1항 내지 제 7항 및 제 11항 중 어느 한 항에 기재된 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제.
제 12항에 있어서, 의약 또는 화장용인 피부 외용제.