CN101980695A

CN101980695A - 由兰科植物得到的提取物、生产所述提取物的方法和包含所述提取物的皮肤外用剂

Info

Publication number: CN101980695A
Application number: CN2009801115404A
Authority: CN
Inventors: 佐佐木晶子; 川口将和; 桧物绫香
Original assignee: Nichirei Biosciences Inc
Current assignee: Nichirei Biosciences Inc
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2029-03-27
Also published as: EP2275083A4; JPWO2009139231A1; KR20110009652A; US20100267659A1; EP2275083A1; CN101980695B; EP2275083B1; JP5108025B2; US8637488B2; WO2009139231A1

Abstract

本发明涉及由兰科齿瓣兰属的植物或由源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物得到的提取物，制备提取物的方法，和包括提取物的皮肤外用剂。

Description

由兰科植物得到的提取物、生产所述提取物的方法和包含所述提取物的皮肤外用剂

技术领域

本发明涉及由兰科植物得到的提取物、生产该提取物的方法和包含该提取物的皮肤外用剂。

背景技术

由兰科植物得到的提取物迄今已用在化妆品等中，因为这类提取物对皮肤具有增湿效果、皮肤调理效果、皮肤增白效果、抗老化效果等。例如，以下专利文献即JP-A-2007-008911、JP-A-2007-077079、JP-A-2006-282536、JP-A-2005-179219、JP-A-2004-067549、JP-A-2002-205933、JP-A-2002-003336、日本专利No.3526590、日本专利No.3090156、JP-A-H2-279618(1990)和JP-A-S57-102809(1982)公开了包含由兰科植物得到的提取物的化妆品、皮肤增湿剂和皮肤外用剂。

作为用于得到提取物的兰科植物，上述专利文献公开了例如手参属(Gymnadenia)(JP-A-2007-077079)、卡特兰属(Cattleya)(JP-A-2006-282536，JP-A-2004-067549)、虾脊兰属(Calanthe)、鹤顶兰属(Phaius)(JP-A-2005-179219)、白芨(Bletilla striata)、金兰(Cephalanthera falcata)、杜鹃兰(Cremastra appendiculata)、春兰(Cymbidium goeringii)、Dactylorhiza aristata、Dendrobium moniliforme、Epipactis thunbergii、Galeola septentrionalis、天麻(Gastrodia elata)、鸟巢兰(Neottia nidusavis)、红门兰属(Orchis)、Vanilla fragrans(JP-A-2002-205933)、兰属(Cymbidium)(JP-A-2002-003336)、Dactylorhiza、头蕊兰属(Cephalanthera)、鸟巢兰属(Neottia)、火烧兰属(Epipactis)(日本专利No.3526590)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)(日本专利No.3090156)、石斛属(Dendrobium)、卡特兰属(Cattleya)、兰属(Cymbidium)、春兰(Cymbidium goeringii)(JP-A-H2-279618(1990))和白芨(Bletilla striata)(JP-A-S57-102809(1982))。

据说存在20000种或更多的兰科植物物种，并且兰科是被子植物的最大的科，占其大约10％。分布区域从热带区域到寒冷区域，而且兰科植物在每种环境中都能生长，除了极干燥区域外。因此，这类植物在生态和形态性质方面非常多样化，并存在许多关于兰科植物谱系和分类的理论(“Sekai no Chinran Kiran daizukan”，Seibundo Shinkosha，日本，2006)。因此，属于不同属的兰科植物在形态如花、叶、茎和根方面彼此不同。而且，可容易地推定来自其的提取物的组分彼此不同。

已知用作增湿剂的天然多糖的例子包括源自动物的多糖如透明质酸和源于植物的多糖如温桲属、Tremella fuciformis和芦荟属(FRAGRANCE JOURNAL，日本，2005年3月)。而且，上面提到的专利文献指出，在由兰科(Orchidaceae)植物即兰属(Cymbidium)(JP-A-2002-003336)、石斛属(Dendrobium)、卡特兰属(Cattleya)、兰属(Cymbidium)、春兰(Cymbidium goeringii)根茎(JP-A-H2-279618(1990))和白芨(Bletilla striata)块茎(JP-A-S57-102809(1982))得到的提取物中包含多糖，它们还指出，这种多糖具有润湿效果。通常已知多糖由经糖苷键连接的多种单糖组成，存在多种多糖，并且天然多糖在糖组成、结构、分子量等方面彼此不同，取决于它们的来源。例如，透明质酸为由交替连接的N-乙酰基葡糖胺和葡糖醛酸组成的线性多糖聚合物，银耳(Tremella fuciformis)多糖为主要由甘露糖、木糖和葡糖醛酸组成的酸性杂多糖，由温桲属表皮提取的多糖为其中阿拉伯糖、木糖或糖醛酸被连接的酸性杂多糖(FRAGRANCE JOURNAL，日本，2005年3月)，芦荟属多糖为包括11∶0.2∶1的甘露糖、半乳糖和葡萄糖的杂多糖(“Modified Aloe barbadensis Polysaccharide with Immunoregulatory Activity”，Plant Medica，66，152-156，2000)，由白芨块茎提取的多糖(即白芨属(Bletilla)葡甘露聚糖)为包括3∶1的甘露糖和葡萄糖的杂多糖(“Plant Mucilages.VIII.Isolation and Characterization of a Mucous Polysaccharide，“Bletilla-glucomannan，”from Bletilla striata Tubers.”，Chem.Pharm.Bull.21(12)2667-2671，1973)。关于源自兰科植物的多糖，除了白芨块茎中包含的白芨属葡甘露聚糖外没有描述，其细节仍未阐明。

除了兰科植物外，象牙棕榈树、瓜尔豆、长角豆(Ceratonia siliqua)、tara等被列为包含大量甘露聚糖化合物的植物。已知对由来自上面植物的甘露聚糖化合物提取物中包含的甘露聚糖化合物进行酸性水解产生甘露糖(JP-A-2000-70000)。

发明公开内容

发明要解决的问题

本发明的目的是由属于兰科的植物得到具有较高保湿效果水平等的提取物，和提供包括这类提取物的皮肤外用剂。

解决问题的手段

为了达到上述目的，本发明人进行了广泛研究。结果，本发明人现在发现，由属于兰科特定属的植物得到的提取物具有较高的保湿效果水平等，这种发现导致了本发明的完成。

本发明概述如下。

[1]由兰科(Orchidaceae)齿瓣兰属(Odontoglossum)的植物或源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属(Cochlioda)的杂交植物的植物得到的提取物，具有下面的特征(1)至(4)：

(1)提取物包含多糖占大约60重量％至70重量％的糖组分；

(2)多糖的90％或更多的构成糖为甘露糖；

(3)甘露糖通过β-1，4糖苷键连接；和

(4)提取物具有增湿效果。

[2]根据[1]的提取物，其还具有下面的特征：

(1)一部分甘露糖分子在位置2、3或6处有分枝。

[3]根据[1]或[2]的提取物，其还具有下面的特征：

(1)提取物具有增加透明质酸产生的作用、增加神经酰胺产生的作用和增加IV型胶原产生的作用。

[4]根据[1]至[3]中任何一项的提取物，其还具有下面的特征：

(1)提取物抑制脂质过氧化物的产生。

[5]根据[1]至[4]中任何一项的提取物，其中源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物为齿唇兰属(Odontioda)植物。

[6]根据[1]至[5]中任何一项的提取物，其中兰科植物为选自Lavender Lace“Sylvan”、Marie Noel“Velano”和Augres“Royal Sash”组成的组中的品种。

[7]根据[1]至[6]中任何一项的提取物，其中用于提取的植物材料包含花。

[8]一种制备根据[1]至[7]中任何一项的提取物的方法，包括以下步骤：

使包含兰科齿瓣兰属的植物或源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物的花的植物部分与包含水、亲水有机溶剂或其混合物的溶剂混合；

加热并提取植物部分和溶剂的混合物；和

得到提取物。

[9]根据[8]的方法，其中加热和提取步骤包括在60℃-120℃的温度下加热然后冷却到0℃-60℃的温度下用于提取。

[10]根据[8]或[9]的方法，其中溶剂为水和1，3-丁二醇的混合物。

[11]根据[1]至[7]中任何一项的提取物，其中提取物通过根据[8]至[10]中任何一项的方法得到。

[12]一种皮肤外用剂，包括根据[1]至[7]和[11]中任何一项的提取物作为活性成分。

[13]根据[12]的皮肤外用剂，其中其被用于药物或化妆品。

发明优点

本发明的提取物具有较高的粘性水平和较高的增湿效果水平，如保湿效果、增加皮肤表面水分含量效果、增加透明质酸产生效果、增加神经酰胺产生效果和在表皮角化细胞中增加IV型胶原产生效果。提取物还抑制脂质过氧化物产生。本发明的提取物可用作皮肤用皮肤外用剂的活性成分(例如增湿剂或化妆品)。

本说明书包括如本申请优先权文件日本专利申请No.2008-129943的说明书和/或附图中公开的全部或部分内容。

附图简述

图1显示了实施例11中抑制脂质过氧化物产生的效果。

图2显示了实施例12中利用试验(1)的保湿效果。

图3显示了实施例13中利用试验(2)的保湿效果。

图4显示了实施例14中增加皮肤表面水分含量的效果。

图5显示了实施例28中增加IV型胶原产生的效果。A图显示了对照的染色结果。B图显示了加入实施例1的提取物的情况的染色结果。

实施发明的最佳方式

(1)用于得到提取物的植物

本发明的提取物可从兰科齿瓣兰属植物或齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物得到。术语“齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物”是指祖先为齿瓣兰属植物和蜗瘤兰属植物的植物。除了齿唇兰属植物，其为二种属即齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交物外，这种杂交植物包括通过使二种属即齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物与一种或更多种能与齿瓣兰属杂交的属杂交产生的植物，可使用。在本说明书中，兰科植物按照Phylogeny and Classification of the Orchid Family(Robert L.Dressler撰写)来分类。

齿瓣兰属植物属于柱瓣兰(Epidendrum)亚科中Maxillarieae族Oncidiinae亚族，它们在从中美洲到南美洲的热带和亚热带区域中的山区中生长。这类植物为中等至大尺寸寄生兰并产生多种花(Yamakei Color Meikan，Ran(orchid)，Yama-kei Publishers，日本，1996)。本发明中使用的兰科植物包括但不特别限于例如品种Augres“Royal Sash”(品种登记号10588，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)、Harvengtence“Tutu”(品种登记号10942，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)和Puccini“Rimo”(品种登记号16093，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)，品种Augres“Royal Sash”是尤其优选的。

齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物包括但不特别限于齿唇兰属植物和Wilsonara属植物，齿唇兰属植物是优选的。

齿唇兰属为使两个属(即齿瓣兰属和蜗瘤兰属)杂交得到的人工属，它的许多品种产生大尺寸和各种颜色的花(Yamakei Color Meikan，Ran(orchid)，Yama-kei Publishers.，日本，1996)。齿唇兰属植物包括齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物、齿唇兰属和齿瓣兰属的杂交植物、齿唇兰属和蜗瘤兰属的杂交植物以及齿唇兰属和齿唇兰属的杂交植物。

Wilsonara属为使三个属：齿瓣兰属、蜗瘤兰属和金蝶兰属(Oncidium)杂交得到的人工属。它的许多品种具有长的花茎、多花并且耐寒(Yamakei Color Meikan，Ran(orchid)，Yama-kei Publishers，日本，1996)。Wilsonara属植物的例子包括齿瓣兰属和金蝶兰属的杂交植物、齿唇兰属和Odontocidium的杂交植物、齿唇兰属和Wilsonara的杂交植物以及齿瓣兰属和Wilsonara的杂交植物。

齿唇兰属植物的例子包括品种Lavender Lace“Sylvan”(品种登记号11539，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)、Marie Noel“Velano”(品种登记号3740，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)、Baiser“Aubigne”和Nichirei Strawberryfield“Orion Star”(品种登记号10344，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)。品种Lavender Lace“Sylvan”和Marie Noel“Velano”是尤其优选的。

Wilsonara属植物的例子包括品种Nichirei Gold“Star Gazer”(品种登记号15106，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)和Leucadia“Autumn Leaf”(品种登记号14753，按照Japanese Plant Variety Protection and Seed Act)。

齿瓣兰属植物、蜗瘤兰属植物、齿唇兰属植物和Wilsonara属植物在它们的属和族以及另外植物分布、形态等方面不同于上述专利文献(即JP-A-2007-008911、JP-A-2007-077079、JP-A-2006-282536、JP-A-2005-179219、JP-A-2004-067549、JP-A-2002-205933、JP-A-2002-003336、日本专利No.3526590、日本专利No.3090156、JP-A-H2-279618(1990)和JP-A-S57-102809(1982))中描述的兰科植物。

(2)提取方法

本发明的制备提取物的方法包括使含花的植物部分与由水、亲水有机溶剂或其混合物组成的溶剂混合并加热和提取植物部分与溶剂的混合物的步骤和得到提取物的步骤。用于提取的植物可为新鲜的、半干的、干的或冻干的，优选冻干的。此外，植物可被充分磨碎或切断或不发生变化，磨碎的植物是优选的。用作提取材料的植物部分可为种、根、茎、叶、花、球茎或整个植物，优选包含花的植物部分，更优选单独花。上述品种的植物可单独使用或联合二种或更多种使用。

作为溶剂，可使用水、亲水有机溶剂或它们的混合物。亲水有机溶剂的使用是优选的，因为可得到具有较高粘度的提取物。溶剂的具体例子包括但不特别限于纯水、净化水、醇如甲醇、乙醇、丁醇、丙二醇、甘油和1，3-丁二醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、1，4-二

烷、吡啶、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺和乙酸。优选的溶剂为甲醇、丁醇、丙二醇、甘油和1，3-丁二醇。亲水有机溶剂可单独用于提取，但使用亲水有机溶剂和水的混合物是优选的。在这种情况下，亲水有机溶剂的浓度优选为10vol％至90vol％，更优选20vol％至60vol％，还更优选25vol％至35vol％。或者，二种或更多种亲水有机溶剂可被混合并用于提取。例如，乙醇、1，3-丁二醇和水可被混合。加入到植物的溶剂的数量优选为100ml至1000ml、更优选200ml至600ml每100g植物，但没有特殊限制。

将溶剂加入到植物中，然后加热30秒到1小时并优选10-15分钟。加热温度为60℃至120℃并优选80℃至90℃。然后，冷却混合物，优选急冷，到0℃至60℃并优选20℃至30℃，用于提取。冷却后的提取时间为1小时到7天并优选8小时到16小时(或过夜)，但没有特殊限制。通过在提取的开始阶段加热和冷却植物，可得到具有较高粘度的提取物。这样得到的提取物在储存期间表现出随时间变化的良好粘度稳定性。认为降解粘性组分的酶等包含在植物中并通过加热被灭活。此外，可防止提取物褐变，并能保持浅黄色到红色的色调。(如果使用花，则花的颜色反映所述色调)。

提取后，可在需要时通过过滤、离心或其它手段除去残渣。另外，可进行浓缩或纯化步骤。这类步骤可通过各种已知的技术来进行，如真空浓缩、冻干、用乙醇溶剂沉淀，各种色谱技术如在DEAE柱上的离子交换色谱、凝胶过滤色谱和HPLC，以及超滤。

(3)提取物

通过上面方法(2)得到的提取物包括糖、蛋白质、多元酚等，并且它具有高的粘度。提取物中固体的主要组分为糖，并且糖组分的大约60wt％-70wt％或更多由多糖组成。当转化成单糖时，提取物的糖成分包括40wt％-60wt％的甘露糖和15wt％-25wt％的葡萄糖。可通过进一步纯化从提取物中完全除去果糖，并且提取物可包含大约2wt％至5wt％葡萄糖。在提取物中包含的多糖的全部构成糖为100wt％时，则其90wt％或更多、优选95wt％或更多和更优选97wt％或更多由甘露糖组成。多糖的纯化产物(下面描述的实施例10(iv)、实施例21(iv)和实施例22(iv)中)包括甘露糖和葡萄糖，并且它们的组成(重量比计)优选为90∶10至99∶1，更优选95∶5至98∶2。并且纯化产物包含含有大量经β-1，4糖苷键连接的甘露糖分子的多糖聚合物。部分甘露糖分子在位2、3或6处分枝。

提取物的纯化产物具有较高的粘度，但当酶降解(通过β-1，4-甘露聚糖酶)时粘度降低(见实施例10)。因此，纯化产物中包含的多糖被认为有助于粘度。提取物的粘度为例如0.01-0.6Pa·s(10-600cP)，当使用正弦波振荡粘度仪在25℃下测量时。提取物具有增湿作用。具体地，提取物具有保湿作用、增加皮肤表面水分含量作用、增加透明质酸产生作用、促进神经酰胺产生作用和促进表皮角化细胞中IV型胶原产生作用。此外，提取物抑制脂质过氧化物产生。这种生物效果(或作用)在下面的实施例中被证实。而且，包括这类提取物的化妆品没有粘着性或紧缩性并能充分渗透皮肤。

(4)皮肤外用剂

本发明的皮肤外用剂在其应用方面不受特殊限制，只要它为能被施加到皮肤用在药物或化妆品如增湿剂和化妆品剂中的剂型即可。剂型的例子包括膏剂、凝胶、液体、混悬液、粉剂、泡沫和固体。具体例子包括护手霜、洗液、乳液、精华素(beauty essense)、面霜、清洁霜、面皂、面膜、剃须泡沫、晒黑霜、晒黑露、防晒霜、防晒露、妆底(makeup base)、粉底(foundation)、扑面粉、粉剂、口红、唇膏、眼线膏、眼霜、眼影膏、睫毛膏、洗发液、冲洗液、护发素(conditioner)、染发剂、沐浴露和润肤乳。

皮肤外用剂中本发明的提取物的含量优选为0.0001wt％至25wt％，更优选0.1wt％至15wt％。除了提取物外，可任选地添加皮肤外用剂中可用的各种组分如增湿剂、皮肤增白剂、抗氧化剂、增稠剂、油组分、抗菌剂、乳化剂和紫外线吸收剂到皮肤外用剂中。增湿剂的例子包括：粘多糖如透明质酸或硫酸软骨素或它们的衍生物；蛋白质如胶原、弹性蛋白或角蛋白或它们的衍生物；氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或精氨酸或它们的衍生物；糖如山梨糖醇、海藻糖、葡萄糖或蔗糖；脲；磷脂；神经酰胺；植物提取物如芦荟属提取物或温桲属提取物；和多元醇如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇。皮肤增白剂的例子包括维生素C和其衍生物、维生素E和其衍生物、维生素A和其衍生物、glycyrphosphate和其衍生物、甘草甜素和其衍生物、烟酰胺、熊果苷、曲酸、鞣花酸、亚油酸、凝血酸、胎盘提取物和植物提取物如甘菊提取物、黄苓提取物、葡萄提取物、印度樱桃(acelora)提取物、卡姆果(Camu Camu)提取物和卡姆果种提取物。抗氧化剂的例子包括超氧化物歧化酶、甘露醇、栎精、儿茶素、虾青素、维生素A、维生素B、维生素E、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、辅酶Q10、α-硫辛酸和植物提取物如印度樱桃种提取物。增稠剂的例子包括天然存在的聚合物如卡拉胶、果胶、琼脂、阿拉伯胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、黄原胶、温桲属籽、明胶和淀粉，纤维素聚合物如甲基纤维素和羟基纤维素，丙烯酸聚合物如羧基乙烯基聚合物，褐藻酸聚合物如褐藻酸钠，和醇如十六十八醇和山嵛醇。油组分的例子包括角鲨烷、荷荷芭油(jojoba oil)、蓖麻油、红花油和橄榄油。抗菌剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、山梨酸、脱氢丁酸和苯氧基乙醇。乳化剂的例子包括单硬脂酸甘油酯、氢氧化钾和硬脂酸。紫外线吸收剂的例子包括对-氨基苯甲酸紫外线吸收剂、水杨酸紫外线吸收剂、肉桂酸紫外线吸收剂、邻氨基苯甲酸紫外线吸收剂和二苯甲酮紫外线吸收剂。

此外，可添加表面活性剂、螯合剂、染料、pH调节剂、香料、清凉剂、血流加速剂、角质层分离剂、收敛剂、伤口愈合剂、发泡剂、抗过敏药或细胞活化剂。

下文中，参考实施例描述本发明，但本发明不限于此。

实施例

实施例1：制备提取物的方法(1)

在冷冻机(Medical Freezer，SANYO)中在-40℃下冷冻齿唇兰属Lavender Lace “Sylvan”的花(100g)1周或更长，在冻干机(Freeze-Dryer，TRIO SCIENCE CO.，LTD.)冻干4天，并使用Labo Milser(Iwatani Corporation)研磨。在加入30vol％1，3-丁二醇水溶液(500ml)后，在80℃-90℃下对混合物进行搅拌和提取10分钟，然后立即冷却，然后在25℃下搅拌和提取过夜。过滤后，得到数量为400ml的提取物(固体浓度：1.4wt％)。

实施例2：制备提取物的方法(2)

按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度：0.55wt％)，除了使用齿唇兰属Lavender Lace“Sylvan”整个植物(花、茎、叶、根和球茎)(111g)并加入555ml 30vol％1，3-丁二醇的水溶液以外。

实施例3：制备提取物的方法(3)

按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度：1.1wt％)，除了使用100g齿瓣兰属Augres“Royal Sash”的花以外。

实施例4：制备提取物的方法(4)

按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度：0.60wt％)，除了使用齿瓣兰属Augres“Royal Sash”整个植物(花、茎、叶、根和球茎)(93.5g)并加入467ml 30vol％1，3-丁二醇的水溶液以外。

实施例5：制备提取物的方法(5)

按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度：1.1wt％)，除了使用100g齿唇兰属Marie Noel“Velano”的花以外。

实施例6：制备提取物的方法(6)

按与实施例1相同的方式得到提取物(400ml)(固体浓度：0.73wt％)，除了使用齿唇兰属Marie Noel“Velano”整个植物(花、茎、叶、根和球茎)(101g)并加入505ml 30vol％1，3-丁二醇的水溶液以外。

实施例7：粘度测量

使用正弦波振动粘度计SV-10(A&D)测量按实施例1、实施例3和实施例5中描述的方式制备的提取物在25℃下的粘度。使用提取物的溶剂(30vol％1，3-丁二醇的水溶液)作为对照。为了比较，通过专利文献11(JP-A-57-102809(1982))的实施例中描述的方法制备已知包含粘液(葡甘露聚糖)的白芨块茎的热水提取物。将这种提取物在30vol％1，3-丁二醇中稀释至1wt％，以便得到与实施例在固体浓度、溶剂类型和溶剂浓度方面相同的条件。结果显示在表1中。发现实施例1、3和5的提取物的粘度为白芨块茎提取物粘度的5倍或更高。此外，发现实施例1、3和5提取物充分渗透皮肤并发现没有粘着性或紧缩性。

表1

实施例8：实施例1中得到的Lavender Lace“Sylvan”花提取物的组分分析

为了弄清通过实施例1的方法得到的提取物的组分，测量糖含量、多酚含量和蛋白质含量。试验方法和结果显示在下面。

(i)糖含量测量(通过苯酚-硫酸方法)

[试验方法和结果]

向500μl用蒸馏水稀释500倍的提取物的溶液中加入500μl4vol％苯酚的水溶液。然后快速滴加2.5ml浓硫酸，并搅拌混合物。在水浴中冷却产物5分钟，然后在30℃下加热10分钟。在485nm下测量吸光度。使用葡萄糖标准溶液制备校准曲线确定提取物中糖的总数量。提取物中的糖含量为12323μg/ml，并且固体组分(1.4wt％)的大约88wt％为糖。

(ii)多酚含量的测量(通过Folin-denis方法)

[试验方法和结果]

使用C18柱(Sep-Pak Vac 35cc C18 Cartridge：Waters)纯化用蒸馏水(80ml)稀释6倍的提取物1的溶液得到28.9mg吸附组分的干物质。将干物质溶解在50vol％甲醇的水溶液中调整固体含量至1wt％，并用蒸馏水将得到的溶液稀释100倍制备测量用样品。向200μl样品中加入3.2ml蒸馏水和200μl Folin-Ciocalteu’s酚试剂(Merck)，搅拌混合物，向其中加入400μl饱和碳酸钠水溶液，搅拌混合物，使所得物静置60分钟，并在700nm下测量吸光度。通过加入蒸馏水而不是Folin-Ciocalteu’s酚试剂进行空白试验。使用儿茶素标准溶液制备校准曲线确定样品中的多酚含量，然后确定提取物中的多酚含量。发现提取物包含0.1mg/ml的多酚，并发现固体组分(1.4wt％)的大约1wt％为多酚。

(iii)蛋白质含量测量(通过Lowry方法)

使用DC蛋白质分析试剂盒(Bio Rad Laboratories)测量蛋白质含量。向200μl用30vol％1，3-丁二醇水溶液稀释7倍的提取物的溶液中加入100μl试剂A，并搅拌混合物，向其中加入800μl试剂B，搅拌混合物，并使所得物静置15分钟，在750nm下测定吸光度。使用BSA标准溶液制备校准曲线测定提取物中的蛋白质含量。发现提取物包含1529.0μg/ml的蛋白质，并发现固体含量(1.4wt％)的大约10wt％为蛋白质。

上述分析结果表明，提取物的主要组分为糖，并且提取物包含蛋白质和多酚作为其它组分。

实施例9：实施例1中得到的Lavender Lace“Sylvan”花提取物的糖组成分析

为了弄清作为提取物主要组分的糖的种类，分析通过实施例1的方法制备的提取物中糖的组成。通过二种方法进行分析：即利用降解测量糖组分的方法和没有降解情况下测量仅仅自由糖的方法。试验方法和结果显示在下面。

(i)经过降解处理的分析

[样品制备]

在减压下干燥提取物(40μl)，向其中加入200μl 2mol/l三氟乙酸的水溶液，并在真空密封管中在100℃下水解提取物6小时，然后在减压下再次干燥。将干物质溶解在200μl蒸馏水中并通过0.22-μm过滤器过滤。

[测量中性糖的方法]

使用HPLC系统(LC-9A系统：Shimadzu Corporation，日本)测量制备的样品。测量条件显示在下面。

柱：TSK-凝胶Sugar AXG 15cm×4.6mm(I.D.)(Tosoh Corporation，日本)

柱温度：70℃

流动相：0.5M硼酸钾缓冲液，pH 8.7

流动相流速：0.4ml/min

反应试剂：1％精氨酸/3％硼酸

反应试剂流速：0.5ml/min

反应温度：150℃

检测器：荧光分光光度计RF-10A_XL(Shimadzu Corporation，日本)

检测波长：Ex.＝320nm，Em.＝430nm

使用鼠李糖、核糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖和蔗糖的标准溶液制备校准曲线。结果显示在表2中。

[测量酸性糖的方法]

柱：Shimpack ISA-07 25cm×4.6mm(I.D.)(Shimadzu Corporation，日本)

柱温度：70℃

流动相：1M硼酸钾缓冲液，pH 8.7

流动相流速：0.8ml/min

反应试剂：1％精氨酸/3％硼酸

反应试剂流速：0.8ml/min

反应温度：150℃

检测器：荧光分光光度计RF-10A_XL(Shimadzu Corporation，日本)

检测波长：Ex.＝320nm，Em.＝430nm

使用半乳糖醛酸、艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸的标准溶液制备校准曲线。结果显示在表2中。

表2

Man：甘露糖，Glu：葡萄糖

GalA：半乳糖醛酸，

Xyl：木糖，Gal：半乳糖，

Ara：阿拉伯糖，Rha：鼠李糖，

Rib：核糖

(ii)自由糖分析

[样品制备]

通过0.22-μm过滤器过滤用蒸馏水(200μl)稀释10倍的提取物的溶液。

[测量中性糖的方法]

柱：TSK-凝胶Sugar AXG 15cm×4.6mm(I.D.)(Tosoh Corporation，日本)

柱温度：70℃

流动相：0.5M硼酸钾缓冲液，pH 8.7

流动相流速：0.4ml/min

反应试剂：1％精氨酸/3％硼酸

反应试剂流速：0.5ml/min

反应温度：150℃

检测器：荧光分光光度计RF-10A_XL(Shimadzu Corporation，日本)

检测波长：Ex.＝320nm，Em.＝430nm

使用鼠李糖、核糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖和蔗糖的标准溶液制备校准曲线。结果显示在表3中。

表3

Fru：果糖，Glu：葡萄糖，

Suc：蔗糖，

Xyl：木糖，Man：甘露糖

Gal：半乳糖

如表2和表3中所示，发现通过实施例1的方法得到的提取物包含单糖如果糖和葡萄糖，以及富含甘露糖的多糖，并且发现这类多糖占提取物的一半或以上。由于作为自由糖的甘露糖的含量低，因此认为甘露糖为多糖的构成糖。

实施例10：实施例1得到的Lavender Lace“Sylvan”花提取物的纯化产物中所含多糖的分析

为了研究作为提取物主要组分的多糖的组成和结构，从通过实施例1的方法制备的提取物分离和纯化多糖，并进行糖组成分析和酶降解。试验方法和结果显示在下面。

(i)粗分馏(通过乙醇沉淀)

向通过实施例1的方法制备的提取物(300g)中加入乙醇(1200g)制备80wt％乙醇的水溶液。使这样得到的溶液在7℃下静置过夜，通过离心分离沉淀物和上清液，并使用冻干机干燥沉淀物。使用旋转蒸发器浓缩上清液，再次加入乙醇，进行类似的过程。这样，通过这些过程得到3.7g乙醇沉淀物。

(ii)粗分馏(通过C18柱处理)

将上面(i)中制备的乙醇沉淀物(3.7g)溶解在水中制备1wt％的水溶液，使得到的溶液通过装有反相树脂(YMC-GEL，ODS-A120-S150：YMC)的柱(3cm×100cm)除去已吸附到柱上的杂质。使用旋转蒸发器浓缩通过柱的馏分，并按与上面(i)相同的方式进行乙醇沉淀来回收乙醇沉淀物(1.8g)。

(iii)分离和纯化(通过DEAE柱处理)

将上面(ii)中制备的乙醇沉淀物溶解在蒸馏水中制备2wt％的水溶液，使其5ml通过装填有离子交换树脂(DEAE sepharose CL-6B：Amersham Pharmacia Biotech AB)的柱(3cm×100cm)，并用蒸馏水和0.5M NaCl洗脱含糖馏分用于分馏。使用截止分子量为5000的超滤膜(Amicom Ultra，Ultracel-10K：MILLIPORE)浓缩得到的馏分10倍，得到具有非常高粘度的无色溶液。冻干这种溶液得到52.7mg白色纯化产物。

(iv)糖组成分析

将上面(iii)中得到的纯化产物溶解在蒸馏水中制备1wt％的水溶液，并进行糖组成分析。

[样品制备]

将5mol/l三氟乙酸(200μl)水溶液加入到100μl 1wt％水溶液中，在120℃下对溶液进行水解3小时，然后在减压下干燥。通过0.22-μm过滤器过滤通过在500μl蒸馏水中溶解干产物得到的样品和用蒸馏水稀释10倍的样品。

[测量中性糖的方法]

使用HPLC系统(LC-9A系统：Shimadzu Corporation，日本)测量制备的样品。分析条件显示在下面。

柱：TSK-凝胶Sugar AXG 15cm×4.6mm(I.D.)(Tosoh Corporation，日本)

柱温度：70℃

流动相：0.5M硼酸钾缓冲液，pH 8.7

流动相流速：0.5ml/min

反应试剂：1％精氨酸/3％硼酸

反应试剂流速：0.5ml/min

反应温度：150℃

检测器：荧光分光光度计RF-10A_XL(Shimadzu Corporation，日本)

检测波长：Ex.＝320nm，Em.＝430nm

使用鼠李糖、核糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖和蔗糖的标准溶液制备校准曲线，并测定纯化产物的糖含量。

多糖分析的结果显示在表4中。纯化产物包含甘露糖和葡萄糖。表4显示了甘露糖对葡萄糖的比例(以重量比例，％计)。甘露糖对葡萄糖的重量比为约98∶2。

表4

Man：甘露糖，Glu：葡萄糖

(v)酶降解

向上面(iv)中制备的1wt％纯化产物和通过实施例1的方法制备的提取物的水溶液中加入β-1，4-甘露聚糖酶(Yakult Pharmaceutical Industry Co.，Ltd.，日本)和0.2M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，使所得物在50℃下静置过夜，然后进行酶降解反应。反应后，通过在90℃下加热10分钟灭活酶，在与实施例9-(ii)相同的条件下进行糖组成分析。

作为分析结果，检测经酶降解释放的甘露糖。因此，发现多糖包含由经β-1，4糖苷键连接的甘露糖分子组成的多糖。因为溶液和提取物的粘度明显被降低，因此发现多糖有助于粘度。

实施例11：抑制脂质过氧化物产生分析

通过亚油酸自动氧化抑制试验评价提取物对脂质过氧化物产生抑制的影响。通过硫氰酸铁方法评价脂质过氧化物。分析方法和结果显示在下面。

[样品制备]

向2ml 2.5wt％亚油酸在乙醇的溶液中，加入4ml 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、2ml乙醇和2ml在3vol％1，3-丁二醇(作为溶剂)中稀释至0.02wt％的通过实施例1的方法制备的提取物并混合，并在棕色瓶中在40℃下贮存得到的混合物。使用在4℃下贮存的样品作为空白样品。另外，使用通过加入3vol％1，3-丁二醇制备的样品作为对照样品。

[分析方法和结果]

向0.1ml样品中加入9.7ml乙醇、0.1ml 30wt％硫氰酸铵溶液的水溶液和0.1ml 20mM氯化亚铁的水溶液，3分钟后测量500nm处的吸光度。通过减去空白的吸光度确定Δ吸光度，并评价脂质过氧化物的数量。为了比较，使用常用作抗氧化剂的维生素E(0.02wt％)。结果显示在图1中。样品抑制脂质过氧化物的产生等于或强于维生素E，并观察到效果的持续性。

实施例12：保湿试验(1)

评价提取物的保湿能力。试验方法和结果显示在下面。

[试验方法和结果]

用30vol％1，3-丁二醇的水溶液稀释通过实施例1、实施例3和实施例5的方法制备的提取物至1wt％，并使用得到的溶液作为试验样品。施加试验样品(10μg)到1cmx1cm滤纸(FILTER PAPER 5B(ADVANTEC TOYO))上并在22℃和30％RH下随时间变化测量重量。使用提取物的溶剂(即30vol％1，3-丁二醇的水溶液)作为对照。为了比较，通过相关专利出版物的实施例中描述的提取方法制备在兰科植物提取物中已知具有保湿效果的白芨块茎的热水提取物(JP-A-S57-102809(1982))、整个兰属植物的50％乙醇提取物(JP-A-2002-3336)和蝴蝶兰属(Phalaenopsis)花的热水提取物(JP-A-H5-70338(1993))。将这些提取物在30vol％1，3-丁二醇(作为溶剂)中稀释至1wt％，以便实施例之间在固体浓度、溶剂类型和溶剂浓度方面具有相同条件。当实施例中使用的提取溶剂不同于用于比较的那些时，使用蒸发器(旋转蒸发器，EYELA)除去后者的提取溶剂制备样品。

结果显示在图2中。数值代表保湿百分率，其通过将试验开始时的重量视为100％来确定。图2显示了试验开始后15分钟时的保湿百分率。

与用于比较的提取物相比，发现通过实施例1、实施例3和实施例5的方法制备的提取物具有较高的保湿效果(图2)。

实施例13：保湿试验(2)

评价多糖保湿能力。试验方法和结果显示在下面。

[试验方法和结果]

用蒸馏水稀释实施例10-(iii)中得到的纯化产物至1wt％并使用所得物作为试验样品。施加试验样品(10μg)到1cmx1cm滤纸(FILTER PAPER 5B(ADVANTEC TOYO))上并在22℃和30％RH下随时间变化测量重量。使用蒸馏水作为对照。为了比较，用蒸馏水稀释已广泛用作增湿化妆品用化妆品成分的透明质酸(Kibun.Food Chemifa Co.，Ltd.)至1wt％。

结果显示在图3中。数值代表保湿百分率，其通过将试验开始时的重量视为100％来确定。图3显示了试验开始后15分钟时的保湿百分率。

与对照相比，发现实施例10-(iii)中得到的纯化产物具有明显高的保湿效果。观察到等于或高于已知具有高保湿性质的透明质酸的保湿性质。

实施例14：保湿性试验

为了评价提取物的保湿性，随时间变化测量皮肤表面的水分含量。针对皮肤电传导评价皮肤表面的水分含量。试验方法和结果显示在下面。

[试验方法和结果]

分析仪器：SKICON-200EX(I.B.S.Ltd，日本)

试验环境：20-22℃，30-40％RH

在试验小组(健康成人；N＝3)进入实验室后，要求他们用不包含增湿组分的肥皂洗涤试验区域，要求他们休息20分钟，然后进行测量。在测量前臂内侧处的初始值后，向其施加10μl/4cm²的通过实施例1、实施例3和实施例5的方法制备的提取物，随时间变化测量皮肤表面的水分含量。使用30vol％1，3-丁二醇的水溶液作为对照。为了比较，通过相关专利出版物的实施例中描述的提取方法制备在兰科植物提取物中已知具有保湿效果的白芨块茎的热水提取物(JP-A-S57-102809(1982))、整个兰属植物的50％乙醇提取物(JP-A-2002-3336)和蝴蝶兰属花的热水提取物(JP-A-H5-70338(1993))。将这些提取物在30vol％1，3-丁二醇(作为溶剂)中稀释至1wt％，以便实施例之间在固体浓度、溶剂类型和溶剂浓度方面具有相同条件。当实施例中使用的提取溶剂不同于用于比较的那些时，使用蒸发器(旋转蒸发器，EYELA)除去后者的提取溶剂制备样品。而且，将已广泛用作化妆品富水分的化妆品成分的透明质酸(Kibun.Food Chemifa Co.，Ltd.)用30vol％1，3-丁二醇稀释至1wt％，并用于比较。

结果显示在图4中。数值代表相对于初始值100％的水分含量。图4显示了试验开始后60分钟时的水分含量。

通过施加通过实施例1、实施例3和实施例5的方法制备的提取物，增加了水分含量，保湿效果长时间持续。由于这些效果优于施加其它对比提取物(例如白芨提取物、兰属提取物和蝴蝶兰属提取物)或增湿剂(透明质酸)时得到的那些效果，因此发现通过实施例1、实施例3和实施例5的方法制备的提取物具有更高的增湿效果和作为增湿剂是有效的。

实施例15：化妆品配方

根据下面显示的配方例子，按照常规技术制备包含通过实施例1的方法得到的提取物的洗剂、乳剂和膏剂。另外，按相同的方式制备安慰剂，除了其中不包括提取物以外。单位表示wt％。

[洗剂]

净化水 81.9

提取物(实施例1) 10.0

1，3-丁二醇 3.0

浓甘油 2.0

无水乙醇 2.0

聚乙二醇1540 0.5

苯氧基乙醇 0.35

对羟基苯甲酸甲酯 0.15

黄原胶 0.1

[乳剂]

净化水 77.04

提取物(实施例1) 10.0

角鲨烷 3.0

1，3-丁二醇 3.0

十六十八醇 3.0

浓甘油 2.0

单硬脂酸甘油酯 1.2

羧基乙烯基聚合物 0.3

黄原胶 0.15

对羟基苯甲酸甲酯 0.15

氢氧化钾 0.12

对羟基苯甲酸丙酯 0.03

天然维生素E 0.01

[膏剂]

净化水 60.13

角鲨烷 15.0

提取物(实施例1) 10.0

硬脂酸 4.0

1，3-丁二醇 3.0

十六十八醇 3.0

山嵛醇 2.0

单硬脂酸甘油酯 2.0

聚甲基硅氧烷 0.5

对羟基苯甲酸甲酯 0.17

L-精氨酸 0.1

对羟基苯甲酸丙酯 0.05

天然维生素E 0.05

[安慰剂洗剂]

净化水 88.9

1，3-丁二醇 6.0

浓甘油 2.0

无水乙醇 2.0

聚乙二醇1540 0.5

苯氧基乙醇 0.35

对羟基苯甲酸甲酯 0.15

黄原胶 0.1

[安慰剂乳剂]

净化水 84.04

1，3-丁二醇 6.0

角鲨烷 3.0

十六十八醇 3.0

浓甘油 2.0

单硬脂酸甘油酯 1.2

羧基乙烯基聚合物 0.3

黄原胶 0.15

对羟基苯甲酸甲酯 0.15

氢氧化钾 0.12

对羟基苯甲酸丙酯 0.03

天然维生素E 0.01

[安慰剂膏剂]

净化水 67.13

角鲨烷 15.0

1，3-丁二醇 6.0

硬脂酸 4.0

十六十八醇 3.0

山嵛醇 2.0

单硬脂酸甘油酯 2.0

聚甲基硅氧烷 0.5

对羟基苯甲酸甲酯 0.17

L-精氨酸 0.1

对羟基苯甲酸丙酯 0.05

天然维生素E 0.05

实施例16：使用试验

要求试验小组(健康成人；N＝5)使用实施例15中制备的洗剂、乳剂和膏剂，并用调查表评价洗剂、乳剂和膏剂。为了比较，使用不包括提取物组分的安慰剂，并请求试验小组选择较好的产品。结果显示在表5中。

与安慰剂相比，发现所有化妆品都表现出较好的皮肤渗透、保湿效果并且没有紧缩性和粘着性。

表5

*数字表示选择样品的人数。

实施例17：实施例3中得到的Augres“Royal Sash”花提取物的组分分析

通过苯酚-硫酸方法测量糖含量。

[试验方法和结果]

按与实施例8-(i)相同的方式进行试验，除了用蒸馏水将提取物稀释200倍。

提取物的糖含量为10063μg/ml，并且固体含量(1.1wt％)的大约91wt％为糖。

实施例18：实施例5中得到的Marie Noel“Velano”花提取物的组分分析

为了弄清实施例5中制备的提取物中的组分，通过苯酚-硫酸方法测量糖含量。

[试验方法和结果]

提取物的糖含量为9238μg/ml，并且固体含量(1.1wt％)的大约84wt％为糖。

实施例19：实施例3中得到的Augres“Royal Sash”花提取物的糖组成分析

进行通过实施例3的方法制备的提取物的糖组成分析。

(i)经由降解的分析

[样品制备]

按与实施例9-(i)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(i)相同的方式进行测量。

经由降解的糖组成分析的结果显示在表6中。

表6

Man：甘露糖，Glu：葡萄糖，Xyl：木糖，

Gal：半乳糖，Ara：阿拉伯糖

(ii)自由糖分析

[样品制备]

按与实施例9-(ii)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(ii)相同的方式进行测量。

自由糖分析结果显示在表7中。

表7

Fru：果糖，Glu：葡萄糖，Xyl：木糖，

Man：甘露糖，Gal：半乳糖

如表6和表7中所示，发现通过实施例3的方法得到的提取物富含甘露糖、果糖和葡萄糖。由于作为自由糖的甘露糖的含量低，因此甘露糖被认为是多糖的构成糖。

实施例20：实施例5中得到的Marie Noel“Velano”花提取物的糖组成分析

进行通过实施例5的方法制备的提取物的糖组成分析。

(i)经由降解的分析

[样品制备]

按与实施例9-(i)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(i)相同的方式进行测量。

经由降解的糖组成分析的结果显示在表6中。

(ii)自由糖分析

[样品制备]

按与实施例9-(ii)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(ii)相同的方式进行测量。

自由糖分析结果显示在表7中。

如表6和表7中所示，发现通过实施例5的方法得到的提取物富含甘露糖、果糖和葡萄糖。由于作为自由糖的甘露糖的含量低，因此甘露糖被认为是多糖的构成糖。

对比例1：整个兰属植物的提取物的糖组成分析

进行实施例12中制备的整个兰属植物的50％乙醇提取物的糖组成分析。

(i)经由降解的分析

[样品制备]

按与实施例9-(i)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(i)相同的方式进行测量。

经由降解的组成分析的结果显示在表6中。

(ii)自由糖分析

[样品制备]

按与实施例9-(ii)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(ii)相同的方式进行测量。

自由糖分析结果显示在表7中。

如表6和表7中所示，提取物的构成糖主要是葡萄糖和果糖。甘露糖含量低至5wt％或更低。发现样品的组成不同于Lavender Lace“Sylvan”、Augres“Royal Sash”或Marie Noel“Velano”的。

对比例2：蝴蝶兰属花的热提取物糖组成分析

进行实施例12中制备的蝴蝶兰属花的热提取物糖组成分析。

(i)经由降解的分析

[样品制备]

按与实施例9-(i)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(i)相同的方式进行测量。

经由降解的糖组成分析的结果显示在表6中。

(ii)自由糖分析

[样品制备]

按与实施例9-(ii)相同的方式制备样品。

[测量中性糖的方法]

按与实施例9-(ii)相同的方式进行测量。

自由糖分析结果显示在表7中。

实施例21：实施例3中得到的Augres“Royal Sash”花提取物纯化产物中包含的多糖分析

由通过实施例3的方法制备的提取物分离和纯化多糖，并进行糖组成分析。

(i)粗分馏(乙醇沉淀)

按与实施例10-(i)相同的方式进行分馏。得到乙醇沉淀物(3.0g)。

(ii)粗分馏(C18柱处理)

按与实施例10-(ii)相同的方式进行分馏。得到乙醇沉淀物(1.2g)。

(iii)分离和纯化(DEAE柱处理)

按与实施例10-(iii)相同的方式进行纯化。得到白色纯化产物(44.9mg)。

(iv)糖组成分析

按与实施例10-(iv)相同的方式进行分析。

多糖分析结果显示在表8中。纯化产物包含甘露糖和葡萄糖。表9显示了多糖中甘露糖与葡萄糖的比(以重量比计，％)。甘露糖与葡萄糖的重量比为约98∶2，并且产物富含甘露糖。

表8

Man：甘露糖，Glu：葡萄糖

表9

Man：甘露糖，Glu：葡萄糖

实施例22：实施例5中得到的Marie Noel“Velano”花提取物纯化产物中包含的多糖分析

由通过实施例5的方法制备的提取物分离和纯化多糖，并进行糖组成分析。

(i)粗分馏(乙醇沉淀)

按与实施例10-(i)相同的方式进行分馏。得到乙醇沉淀物(2.3g)。

(ii)粗分馏(C18柱处理)

按与实施例10-(ii)相同的方式进行分馏。得到乙醇沉淀物(0.4g)。

(iii)分离和纯化(DEAE柱处理)

按与实施例10-(iii)相同的方式进行纯化。得到白色纯化产物(54.0mg)。

(iv)糖组成分析

按与实施例10-(iv)相同的方式进行分析。

多糖分析结果显示在表8中。纯化产物包含甘露糖和葡萄糖。表9显示了甘露糖与葡萄糖的比(以重量比计，％)。甘露糖与葡萄糖的重量比为约97∶3，并且产物富含甘露糖。

对比例3：白芨块茎提取物中包含的多糖分析

由通过实施例5的方法制备的提取物分馏出多糖，并进行糖组成分析。

(i)分馏(乙醇沉淀)

按与实施例10-(i)相同的方式进行分馏。得到乙醇沉淀物(4.8g)。

(ii)糖组成分析

按与实施例10-(iv)相同的方式进行分析，除了使用(i)中得到的馏分。

多糖分析结果显示在表8中。馏分包含甘露糖和葡萄糖。表9显示了甘露糖与葡萄糖的比例(以重量比计，％)。甘露糖与葡萄糖的重量比为约3∶1，并且甘露糖含量低于Lavender Lace“Sylvan”、Augres“Royal Sash”或Marie Noel“Velano”纯化产物中的含量。

实施例23：实施例1中得到的Lavender Lace“Sylvan”花提取物的纯化多糖的甲基化分析

在五氧化二磷存在下向1.85mg由通过实施例1的方法得到的提取物经实施例10-(iii)的方法分离得到的纯化产物中加入0.4ml二甲亚砜，搅拌混合物，向其中加入40mg氢氧化钠和0.3ml甲基碘，搅拌混合物4小时用于反应。对反应混合物进行氯仿提取得到甲基化糖。向甲基化糖中加入90％甲酸(0.5ml)以便在100℃下进行水解2小时，并蒸发反应混合物至干，进一步用2N三氟乙酸进行水解，然后蒸发至干。在用0.5ml 1％硼氢化钠还原产物后，然后利用0.4ml乙酸酐-吡啶的加入进行乙酰化得到部分甲基化的糖醇乙酸酯，随后通过GC和GC/MS进行分析。

[GC条件]

装置：GC-2000AF(Shimadzu Corporation，Japan)

柱：SPB-5熔融石英毛细管30mX0.25mm(I.D.)(Spelco Japan)

载气：He

柱温度：80℃1分钟，然后升高到280℃

注射温度：280℃

检测模式：FID

检测器温度：280℃

注射量：1μl

注射模式：无分流

[GC/MS条件]

装置：质谱仪JMS-700V(JEOL Ltd.，日本)

气相色谱仪HP-6890(Agilent Technologies)

(GC条件)

柱：SPB-5熔融石英毛细管30mX0.25mm(I.D.)(Spelco Japan)

载气：He

柱温度：80℃1分钟，然后升高到280℃

注射温度：280℃

注射量：1μl

注射模式：无分流

(MS条件)

电离方法：电子冲击(EI)法

扇形电场(electric sector)：双聚焦(反向)；加速电压：10kV

电离势：70eV

电离电流：300μA

电离室温度：250℃

扫描速度：1秒/扫描(m/z 35-500)

扫描间隔：1秒

[结果]

比较GC保留时间和质谱与标准质谱确定峰，并根据GC峰面积确定摩尔比。结果显示在表10中。

表10

甲基化糖	摩尔比
		2，3，4，6-四-O-甲基甘露糖	1.00
2，3，6-三-O-甲基甘露糖	265.33
		2，6-二-O-甲基甘露糖	4.95
3，6-二-O-甲基甘露糖	14.03
		2，3-二-O-甲基甘露糖	1.82

上面的结果表明，在构成从Lavender Lace“Sylvan”花提取物中分离的多糖的甘露糖分子中，最经常观察到的连接模式是1→4连接的甘露糖，并且一部分甘露糖分子可能是分枝的。在分枝部分观察到的连接模式是1→3、1→4连接、1→2、1→4连接和1→6、1→4连接。

实施例24：透明质酸产生增加分析

在48孔培养板上以25000个细胞/cm²接种正常人表皮角化细胞(NHEK(F))(KURABO，日本)，并在5％CO₂的气氛中在37℃下培养细胞。在培养开始后，用包含每种试验样品的HuMedia-KG2(KURABO，日本)交换培养基5天，再进行培养2天，使用透明质酸分析试剂盒(Seikagaku Corporation，日本)测量培养物上清液中的透明质酸。同时，使用DC蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories)测量蛋白质含量以确定每蛋白质中透明质酸的数量。

使用通过实施例1的方法制备的Lavender Lace“Sylvan”花提取物作为试验样品，并分别以126μg/ml、63μg/ml和31.5μg/ml的最终浓度将提取物加入到培养基中，加入溶剂的最终浓度为0.3vol％1，3-丁二醇。溶剂0.3vol％1，3-丁二醇还用作对照。结果显示在表11中。在由对照产生的透明质酸数量被视为100％时，确定透明质酸产生数量。在角化细胞中，发现Lavender Lace“Sylvan”花提取物与对照相比，显著增加了透明质酸产生。

表11

实施例25：神经酰胺产生增加分析(1)

在60-mm盘上以1.5×10⁵个细胞/盘接种正常人表皮角化细胞(NHEK(F))(KURABO，日本)，并在5％CO₂的气氛中在37℃下培养细胞。在培养开始后，用包含每种试验样品的HuMedia-KG2(KURABO)交换培养基4天，再进行培养3天，然后收获细胞。将氯仿-甲醇(2∶1)溶液(3ml)加入到收获的细胞中，然后对其进行超声处理，除去溶剂，并提取脂质。向提取的脂质中加入150μl 3N盐酸，并在100℃下加热混合物2小时。在除去溶剂后，加入2ml乙酸乙酯、1.25ml0.1M的醋酸盐缓冲液(pH 3.7)和250μl荧光胺溶液(7mg荧光胺/25ml丙酮)并混合，测量通过离心分离的上面相的荧光强度(Ex：415nm；Em：492nm)，并量化神经酰胺的数量。

使用通过实施例1的方法制备的Lavender Lace“Sylvan”花提取物作为样品，并分别以126μg/ml和63μg/ml的最终浓度将提取物加入到培养基中，加入的溶剂的最终浓度为0.3vol％1，3-丁二醇。还使用溶剂0.3vol％1，3-丁二醇作为对照。结果显示在表12中。在由对照产生的神经酰胺数量被视为100％时，确定神经酰胺产生数量。在角化细胞中，发现Lavender Lace“Sylvan”花提取物与对照相比，显著增加了神经酰胺产生。

表12

实施例26：神经酰胺产生增加分析(2)

按与实施例25相同的方式进行分析，除了使用在实施例10-(ii)中得到的Lavender Lace“Sylvan”花提取物的乙醇沉淀物作为样品。将样品溶解在水中，以100μg/ml的最终浓度将混合物加入到培养基中。对照不包含要被分析的物质。结果显示在表13中。在由对照产生的神经酰胺数量被视为100％时，确定神经酰胺产生数量。在角化细胞中，发现Lavender Lace“Sylvan”花提取物的乙醇沉淀物与对照相比，显著增加了神经酰胺产生。

表13

实施例27：神经酰胺产生增加分析(3)

按与实施例25相同的方式进行分析，除了使用在实施例10-(iii)中得到的Lavender Lace“Sylvan”花提取物的纯化产物作为样品。将样品溶解在水中，以100μg/ml和200μg/ml的最终浓度将每种混合物加入到培养基中。对照不包含任何要被分析的物质。结果显示在表14中。在由对照产生的神经酰胺数量被视为100％时，确定神经酰胺产生数量。在角化细胞中，发现Lavender Lace“Sylvan”花提取物的纯化产物与对照相比，显著增加了神经酰胺产生。

表14

实施例28：IV型胶原产生增加检查

将样品加入到人皮肤三维模型(TESTSKIN^TM，TOYOBO，日本)的LSE高的1周培养物/A/L培养物组的培养基中，在5％CO₂的气氛中在37℃下进行培养7天，用福尔马林固定培养细胞制备石蜡(parfin)切片。在去石蜡化后，使用抗人IV型胶原抗体(Clone PHM-12+CIV22)(Thermo Fisher Scientific)作为一抗，用Histofine Simple Stain MAX-PO(M)(Nichirei Biosciences Inc.，日本)进行反应，然后使用DAB底物试剂盒(Nichirei Biosciences Inc.，日本)染色。另外，通过苏木精染色进行核染色。观察组织，与对照比较染色强度以确定IV型胶原产生数量。

使用通过实施例1的方法制备的Lavender Lace “Sylvan”花提取物作为样品，并以126μg/ml的最终浓度将提取物加入到培养基中。对照不包含要被检查的任何物质。在图5中，A图显示了对照的染色结果，B图显示了当加入实施例1的提取物时的染色结果。图中的箭头指示IV型胶原。发现IV型胶原产生数量因提取物的加入而增加。

本文中提到的所有出版物、专利和专利申请都在此全文通过援引并入。

Claims

1.由兰科齿瓣兰属的植物或源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物得到的提取物，具有下面的特征(1)至(4)：

(1)提取物包含多糖占大约60重量％至70重量％的糖组分；

(2)多糖的90％或更多的构成糖为甘露糖；

(3)甘露糖通过β-1，4糖苷键连接；和

(4)提取物具有增湿效果。

2.根据权利要求1的提取物，其还具有下面的特征：

(1)一部分甘露糖分子在位置2、3或6处有分枝。

3.根据权利要求1或2的提取物，其还具有下面的特征：

4.根据权利要求1至3中任何一项的提取物，其还具有下面的特征：

(1)提取物抑制脂质过氧化物的产生。

5.根据权利要求1至4中任何一项的提取物，其中源于齿瓣兰属和蜗瘤兰属的杂交植物的植物为齿唇兰属植物。

6.根据权利要求1至5中任何一项的提取物，其中兰科植物为选自Lavender Lace“Sylvan”、Marie Noel“Velano”和Augres“Royal Sash”组成的组中的品种。

7.根据权利要求1至6中任何一项的提取物，其中用于提取的植物材料包含花。

8.一种制备根据权利要求1至7中任何一项的提取物的方法，包括以下步骤：

加热并提取植物部分和溶剂的混合物；和

得到提取物。

9.根据权利要求8的方法，其中加热和提取步骤包括在60℃-120℃的温度下加热然后冷却到0℃-60℃的温度下用于提取。

10.根据权利要求8或权利要求9的方法，其中溶剂为水和1，3-丁二醇的混合物。

11.根据权利要求1至7中任何一项的提取物，其中提取物通过根据权利要求8至10中任何一项的方法得到。

12.一种皮肤外用剂，包括根据权利要求1至7和11中任何一项的提取物作为活性成分。

13.根据权利要求12的皮肤外用剂，其中其被用于药物或化妆品。