KR19990076537A

KR19990076537A - "치마버섯 유래의 베타-1, 6-분지-베타-1, 3-글루칸의 제조방법및 이 방법에 의해 제조된 베타-1, 6-분지-베타-1, 3-글루칸을함유하는 외용제 조성물

Info

Publication number: KR19990076537A
Application number: KR1019980049026A
Authority: KR
Inventors: 박경목; 박병화; 소성; 김무성; 김중수; 김영택; 이성구; 이동철
Original assignee: 서경배; 주식회사 태평양
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1998-11-16
Publication date: 1999-10-15
Also published as: KR100295623B1

Abstract

본 발명은 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸(β-1,6-branched-β-1,3-glucan)의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하는 외용제 조성물에 관한 것으로, 치마버섯의 균사체를 액체배양하여 피부세포 및 콜라겐 섬유 증식효과, 일광화상 치유 등 피부기능의 활성 촉진효과 및 피부 멜라닌생성 억제 효과가 있으며 균일한 조성을 갖는 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 고수율로 획득할 수 있으며, 이 방법에 의해 생산된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 외용제 조성물에 함유시킴으로써, 피부노화 방지효과, 미백효과 및 피부손상 완화 효과를 갖는 외용제 조성물을 제공할 수 있다.

Description

치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하는 외용제 조성물

본 발명은 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.) 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸(β-1,6-branched-β-1,3-glucan)의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하는 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 피부세포 및 콜라겐 섬유 증식효과, 일광화상 치유 등 피부 기능의 활성 촉진효과 및 피부 멜라닌생성 억제 효과가 있으며, 균일한 조성을 갖는 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸(β-1,6-branched-β-1,3-glucan)을 치마버섯으로부터 단기간에 다량 얻는 방법, 및 이러한 방법에 의해 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸를 함유하는 피부노화 방지, 미백 효과 및 피부손상 완화 효과를 갖는 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 제기관을 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주는 기능을 가지고 있다. 그러나, 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 피부의 노화현상을 촉진시키며 피부를 손상시키게 되는데, 이러한 현상을 방지하여 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위하여, 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리활성물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시켜 피부노화를 효과적으로 억제하기 위한 노력이 있어 왔었다.

이러한 연구의 일환으로, 피부노화의 주된 지표가 되는 피부세포, 거식세포, 랑게르한스(Langerhans)세포 등의 재생감소와 콜라겐 및 엘라스틴 합성의 저하, 피부색소 침착 등과 같은 기능들을 억제시킬 수 있는 물질에 관한 연구가 많이 이루어져 왔고, 그 결과, 버섯 추출물을 화장품에 함유시킬 경우, 버섯세포벽 구성물질의 보습기능, 또는 세포내 물질의 멜라닌 생성억제 및 자외선 차단 기능에 의해, 미백효과나 항산화효과를 갖는 화장료 조성물을 제조할 수 있음을 알았다. 그 예로, 치마버섯의 배양물로부터 추출, 농축된 혼합물을 이용한 미백효과 및 보습효과를 갖는 화장료 조성물이 일본공개특허 평 05-286843호에 개시되어 있다.

그러나, 치마버섯 추출물 중 어떠한 물질이 화장료에서 미백효과나 보습효과를 나타내는지는 아직 규명된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 치마버섯의 성분 중 화장료에서의 활성을 나타내는 성분을 규명하고자 하였고, 그 결과, 치마버섯의 액체배양에 의해 생산된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸이 피부세포 및 콜라겐 섬유의 증식 작용, 일광화상치유 등의 피부기능 활성 촉진 작용 및 멜라닌 생성 억제 기능을 갖는다는 것을 발견하고, 이를 함유하여 피부노화 방지, 미백 효과 및 피부손상 치유에 탁월한 효과가 있는 화장료 또는 일광화상치유용 외용제에 관한 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 본 발명자들은 치마버섯의 균사체를 액체배양하여 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산하는데 있어서, 배양도중에 활성탄을 첨가하거나 포도당을 첨가하는 경우, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산성을 높일 수 있으며, 배양도중 활성탄을 첨가한 후 포도당을 더 첨가하는 경우, 더욱더 생산성을 높일 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 치마버섯(Schizophyllu commune Fr.)으로부터 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 방법에 의해 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하는 피부노화 방지, 피부손상 치유 및 미백효과를 갖는 외용제조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 액체배양에 의한 치마버섯 균사체 및 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 시간별 생성 변화도이다.

도 2는 액체배양법에 의해 얻은 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 적외선 흡광 스펙트럼이다.

도 3은 액체배양법에 의해 얻은 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 핵자기공명 스펙트럼이다.

도 4는 "활성탄 분말 및 탄소원 첨가 2단계 배양법"에 의해 얻은 치마버섯 균사체 및 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 시간별 생성 변화도이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법은 (1)치마버섯의 포자를 발아시켜 균사체를 얻는 단계; (2)상기 균사체를 포도당 1∼10%, 효모추출물 0.1∼1%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, pH 4.0∼8.5로 조정된 액체배지에 1∼10%(v/v)의 양으로 접종한 후, 온도 20∼35℃, 회전수 100∼400rpm, 통기량 0.3∼2vvm의 조건으로 3∼7일간 배양하는 단계; (3)상기 배양액에 활성탄 분말을 0.1∼6%의 양으로 첨가하여 색소 및 단백질 성분을 흡착시킨 후 여과하여 활성탄이 제거된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 얻는 단계; (4)상기 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 여과막을 사용하여 재여과시킨 후, 에틸알코올을 2∼5회 첨가하여 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 침전시켜 회수하는 단계; 및 (5)상기 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 열풍건조 및 동결건조한 후 분쇄하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

또한, 치마버섯의 균사체를 액체배양하는 상기 (2)단계에서, 활성탄을 더 첨가하거나, 탄소원인 포도당을 더 첨가하거나, 활성탄과 포도당을 동시에 더 첨가하여 배양함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 외용제 조성물은, 상기한 방법에 의해 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼10중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

치마버섯(Schizophyllum commune Fr.)은 싱어(Singer, R.)의 분류서(The Agaricales in modern taxonomy, 1975)에 의하면 분류학상으로 담자균류의 주름버섯목 송이과 치마버섯속에 속하는 목질부후균으로, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 다당류를 세포외로 생산하는 균주이다. 치마버섯은 야생에서 채취할 수 있으며, 다음과 같은 형태학적 특성이나 분류학적 지표에 의해 확인할 수 있다.

치마버섯의 자실체는 대가 없으며 갓의 측면이 기질에 부착하고 크기가 보통 1.0∼3.0㎝이며, 모양은 부채형 또는 조개형이며 종으로 주름이 있고 말단은 불규칙하게 갈라지고 미세한 털이 덮혀 있다. 주름살은 백색이지만 성숙하게 되면 담회색 또는 담자갈색을 띄며, 조직은 건조한 경우 수축하게 되지만 수분을 흡수하면 회복된다. 포자문은 백색이고 포자는 4∼6×1.5∼2㎛의 크기의 원추형으로 평활하며 흰색을 띄고 있다. 치마버섯은 활엽수림의 고목 또는 그루터기에 다발로 발생하며, 이에 대한 상세한 섭생 및 모양은 한국버섯도감(김삼순, 김양섭 공저, 유풍출판사, 1990) 및 싱어(Singer, R.)의 분류서(The Agaricales in modern taxonomy, 1975)에 상세히 기재되어 있다.

한편, 베타-글루칸은 베타-1,3-결합, 베타-1,4-결합, 베타-1,6-결합 등 베타형의 포도당결합을 구별없이 사용하고 있으나, 실제 이러한 결합의 유형이 다양할 뿐 아니라 하기 버섯류들에서 알 수 있는 바와 같이, 기원에 따라서도 구성당의 균일성, 분지도, 분자량, 3차 구조 등 많은 차이가 있어 그 물리화학적 특성 및 생체기능도 완전히 다른 경우가 많다. 예를 들어, 영지버섯(Ganoderma licidum)의 베타-글루칸은 주로 세포벽에서 추출되지만, 세포외에도 소량 분비되어 있으며 글루코오스 이외에 마노오스, 갈락토오스 등의 결합형태이다. 구름버섯(Coriolus versicolor)의 베타-글루칸은 세포벽에서 추출되며, 베타-1,3-결합이외에 베타-1,4-결합 유형도 많이 포함한다. 표고버섯(Lentinus edodes)의 베타-글루칸은 세포벽에서 추출되며 베타-1,3 주당쇄의 매 5개의 잔기내에 2개씩 베타-1,5-잔기를 갖는 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸이다. 느타리버섯(Pleurotus ostreatus)의 베타-글루칸은 세포벽에서 추출되며, 여러 유형의 글루칸으로 구성되고, 글루코오스 이외에 마노오스, 갈락토오스 등의 결합형태이다. 상황버섯(Phelllinus linteus)의 베타-글루칸은 세포벽에서 추출되며, 여러 유형의 글루칸으로 구성되고 글루코오스를 70∼90% 함유하며 그외 마노오스, 갈락토오스 등을 포함한다. 또한, 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 베타-글루칸은 세포벽에서 추출되며 분지가 거의 없고 불균일하며 불용성이다.

반면, 본 발명의 치마버섯(Schizopyllum commune)의 베타-글루칸은 균일한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸으로, 베타-1,3 주당쇄의 매 3개의 잔기당 베타-1,6-잔기를 가짐으로써 상기한 버섯류의 베타-글루칸이 불균일한 당조성과 구조를 갖는데 비하여, 분지된 균일하고 특유한 구조를 갖고 세포외로 분비되는 안정한 중성 다당류 특성을 가지며 글루코오스로만 구성된다. 분자량(M.W.)은 200∼500만으로 다른 버섯류가 수십만∼200만인데 비하여 상당히 크다. 따라서, 치마버섯의 베타-글루칸은 다른 베타-글루칸과는 판이한 물성 및 기능성을 갖는다.

이하, 본 발명에서 치마버섯으로부터 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 제조하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

(1) 치마버섯의 포자를 발아시켜 균사체를 얻는 단계;

치마버섯의 균사체는 야생에서 채취한 치마버섯의 자실체로부터 수득한 포자를 증류수로 수회 세척한 후, 효모-맥아추출 한천배지(효모추출물 3g, 맥아추출물 3g, 펩톤 5g, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1ℓ)에 도말하여 24℃ 온도에서 7일간 배양하여 얻는다. 한편, 균사체는 효모-맥아추출 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고, 1개월마다 계대배양하여 사용한다.

(2) 상기 (1)단계의 균사체를 액체배지에 배양하는 단계;

상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화한 후, 이를 액체배지에 1∼10%(v/v), 바람직하게는 3%(v/v)되게 접종한다.

액체배지로는 포도당 1∼10%, 바람직하게는 3%, 효모추출물 0.1∼1%, 바람직하게는 0.3%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 바람직하게는 0.05%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 바람직하게는 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, 바람직하게는 0.05%를 함유하고, pH 4.0∼8.5, 바람직하게는 pH 6.5으로 조정된 영양배지를 사용할 때 균사체 성장의 측면에서 양호하다. 균사체의 액체배양은 발효조내에서 온도 20∼35℃, 바람직하게는 28℃, 회전수 100∼400rpm, 바람직하게는 200rpm, 통기량 0.3∼2vvm, 바람직하게는 1vvm의 조건으로 3∼7일간, 바람직하게는 5일간 배양한다. 한편, 배양시간에 따른 균사체의 성장(◆)과 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산(□) 과정을 도 1에 나타내었다.

도 1로부터 균사체를 5일동안 배양한 경우, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산성이 가장 우수함을 알 수 있다.

(3) 상기 배양액에 활성탄 분말을 0.1∼6%의 양으로 첨가하여 색소 및 단백질 성분을 흡착시킨 후 여과하여 활성탄이 제거된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸용액을 얻는 단계;

배양 종료액에 활성탄 분말을 0.1∼6%, 바람직하게는 1% 되게 첨가하고 교반하여 색소 및 단백질 성분 등의 불필요 성분을 흡착시켜 제거한 후 압축여과장치로 여과하여 균사체 일부와 활성탄이 제거된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 얻는다. 이 때 활성탄 분말의 처리는 압축여과 이후에 행하여도 무방하다.

(4) 상기 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 여과막을 사용하여 재여과시킨 후, 에틸알코올을 2∼5회 첨가하여 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 침전시켜 회수하는 단계; 및

상기 용액을 다시 1㎛ 및 0.45㎛ 크기의 미세공을 가진 여과막에 차례로 통과시켜 균사체와 활성탄을 완전히 제거한 후, 3∼4배량, 바람직하게는 3.5배량의 에틸알코올을 서서히 첨가하여 고분자의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 결집시켜 회수하며, 회수된 베타-글루칸은 다시 초기 용액과 동량의 물에 용해시키고, 점차 에틸알코올의 사용량을 적게는 1배량까지 줄여가면서, 동일한 방법으로 에틸알코올을 1∼4회 더 첨가하여 보다 정제되고 균일한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 회수한다.

(5) 상기 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 열풍건조 및 동결건조한 후 분쇄하는 단계;

재차 회수된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸은 20∼100℃ 온도로 열풍건조하여 알코올성분을 휘발시킨 후, -70℃에서 동결시키고 동결건조기를 이용하여 건조한다. 건조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸은 분쇄기로 분쇄하여 분말 시료를 제조한다.

한편, 상기한 (1) 내지 (5) 단계에 의한 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조과정 중에, 균사체로부터 부산물이 생성될 수 있다.

즉, 이 부산물은 엔도글루카나아제(endo-1,3-beta-glucanase)와, FIS(frui-

ting-inducing substance, 자실체 형성 유도물질)로 알려진 세레브로시드(cerebrosides)의 일종인 (4E, 8E)-N-D-2'-히드록시팔미토일-1-O-베타-D-글루코피라노실-9-메틸-4,8-스핀가디에닌((4E,8E)-N-D-2'-hydroxypalmitoyl-1-O-beta-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine)과 (4E,8E)-N-D-2'-히드록시스테아로일-1-O-베타-D-글루코피라노실-9-메틸-4,8-스핀갈디에닌((4E,8E)-N-D-2'-hydroxystearoyl-1-O-beta-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine)(Mizushina 등. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 249, pp. 17)으로서, 엔도글루카나아제(Prokop 등. 1994. Can. J. Microbiol. Rev. vol. 40, no. 1, pp. 18)는 치마버섯 배양과정 후반부에 생산되어, 이미 생산된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 분해하여 수율을 떨어뜨리는 요인이 되며, FIS는 균사체의 생장을 억제하고 자실체 형성을 유도하는 물질로서, FIS에 의해 균사체 생장이 중단되면 베타-글루칸의 생성도 중단되는 요인이 되므로(Wessels. 1978. Genetics and Morphogenesis in the Basidiomycetes. pp. 81-104. Academic Press; Prokop 등. 1992. Experimental Mycology. vol 16. pp.197-206), 균사체 배양시 이들을 제거하여야 한다.

따라서, 본 발명의 제조방법은 상기 (2)단계의 균사체를 액체배양함에 있어서, 배양 2∼4일 후 멸균된 활성탄 분말을 0.1∼5%의 양으로 첨가한 후 1∼4일간 더 배양할 수 있다(이하, "활성탄 첨가 액체배양법"이라 한다). 이는 배양과정 중에 첨가된 활성탄이 균사체 성장에 필요한 배지 성분에는 큰 영향없이, 주로 엔도글루카나아제와 FIS인 세레브로시드를 흡착하여 균사체의 생장을 촉진하고 생산된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸이 분해되는 현상을 방지하여, 보다 고수율로 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산할 수 있기 때문이다. 그 결과, 단순 액체배양법을 실시하였을 때보다 약 30% 향상된 수율로 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸를 생산할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 수율을 높이기 위하여, 치마버섯 균사체의 액체배양에 대한 최적의 배지 구성 성분을 조사한 결과, 세포 성장에는 질소원의 농도가, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산에는 탄소원의 농도가 주요한 인자로 작용함을 발견하였다. 즉, 배지 성분중의 탄소원 농도와 질소원 농도의 비율(C/N 비율)이 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산성에 주요한 인자로 작용함을 알았다. 이에, 높은 세포 성장 속도와 세포 농도를 얻기 위해서는 비교적 낮은 C/N 비율이 효과적이었으며, 고수율의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산하기 위해서는 높은 C/N 비율이 필수적이었다. 하지만, 생산성을 향상시키기 위해서는 높은 세포 성장 속도와 최종 세포 농도, 고수율의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 생성이 모두 필요한 조건이므로, 본 발명자들은 다음과 같이 두 단계, 즉, 배양 시작 단계에서는 비교적 낮은 C/N 비율의 배지에서 배양을 시작하여 세포 성장을 효율적으로 이루지게 한 후, 세포 성장이 최고조에 이르렀을 때에 배지성분 중의 탄소원을 다시 새로이 배양액에 첨가하여 C/N 비율을 상승시키고, 배양을 좀 더 계속하였다. 그 결과, 1 단계 배양법보다, 약 35% 이상 향상된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산할 수 있었다. 따라서, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 고수율로 생산하기 위하여, 균사체를 포도당 1∼3%, 효모추출물 0.3∼0.5%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, pH 4.0∼8.5로 조정된 배지에서 접종하여, 배양 3∼5일 후에 포도당을 1∼10%의 양으로 첨가한 후 1∼3일간 더 배양할 수 있다(이하, "탄소원 첨가 2단계 배양법"이라 한다). 그 결과, 단순 액체배양법을 실시하였을 때보다 약 35% 이상 향상된 수율로 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산할 수 있었다.

또한, 본 발명은 배양과정 중의 활성탄 첨가 액체배양법과 탄소원 첨가 2단계 배양법을 결합하여, 즉, 1단계 배양에서 세포성장이 최고조에 이르른 때에 활성탄 분말을 첨가하고 또한 새로이 포도당을 첨가하여, 2 단계 배양(이하, "활성탄 분말 및 탄소원 첨가 2단계 배양법"이라 한다)을 함으로써, 이미 세포 성장이 최고조에 이르른 배양 2단계에서는, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 생산에 저해 효과를 가진 물질들인 엔도글루카나아제와 FIS는 활성탄에 흡착되게 하고, 새로이 첨가된 포도당으로 인한 높은 C/N 비율은 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 고수율로 생산하게 한다. 그 결과, 단순 액체배양법을 실시하였을 때보다 총 50% 이상 향상된 수율로 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산할 수 있었다. 따라서, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 고수율로 생산하기 위하여, 균사체를 포도당 1∼3%, 효모추출물 0.3∼0.5%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, pH 4.0∼8.5로 조정된 배지에서 접종하여, 배양 3∼5일 후에 멸균된 활성탄 분말 0.1∼2%와 포도당 1∼10%를 첨가한 후 1∼3일간 더 배양할 수 있다.

상기한 방법에 의해 제조된 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸은 피부노화 방지, 피부손상 치유 및 미백 효과를 갖는 외용제 조성물에 사용되는데, 그 사용량은 그 제형에 따라 적당량으로 선정될 수 있으며, 바람직하게는 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼10중량%의 양으로 함유된다.

본 발명의 피부노화 방지, 피부손상 치유 및 미백효과를 갖는 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩 또는 젤의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 외용제 조성물일 수 있다.

또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 제조예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 제조예에만 한정되는 것은 아니다.

［제조예 1］

1) 효모-맥아추출 한천배지(효모추출물 3g, 맥아추출물 3g, 펩톤 5g, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1ℓ)가 든 시험관에 치마버섯 균사체를 사면배양하여 4℃ 에서 보관하고 1개월마다 계대배양하여 사용하였다.

2) 상기 사면배지에서 자란 균사체를 무균적으로 균질화하여 이를 포도당 3%, 효모추출물 0.3%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 0.05%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂0) 0.05%를 함유하며 pH 6.5로 조정한 액체배지에 3%(v/v)되게 접종한 후, 30ℓ 발효조내에서 온도 28℃, 회전수 200rpm, 통기량 1vvm의 조건에서 5일간 액체배양하였다. 이때, 측정된 균사체의 농도는 약 4.0g/ℓ, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 농도는 9.5g/ℓ이었다.

3) 배양완료 후, 배양액에 활성탄 분말(제일화학) 1.0%를 첨가하고 30분간 교반하여 색소 및 단백질 성분을 흡착시켜 제거한 후, 압축여과장치(press filter)로 여과하여 균사체 일부와 활성탄이 제거된 용액을 얻었다.

4) 상기 용액을 1㎛ 및 0.45㎛의 미세공을 가진 여과막에 차례로 통과시켜 균사체와 활성탄이 완전히 제거된 청정한 무색 또는 연갈색의 배양액을 얻은 후, 3.5배량의 에틸알코올을 서서히 가하고 실온에서 하룻밤동안 방치하여 침전시킨 다음 회수한 후, 다시 초기 액량과 동량의 물에 용해시켰다. 동일한 방법으로 2배량의 에틸알코올을 서서히 가한 후 실온에서 하룻밤동안 방치하여 침전시킨 다음 회수한 후, 다시 초기 액량과 동량의 물에 용해시켰다. 동일한 방법으로 동량의 에틸알코올을 서서히 가한 후 실온에서 하룻밤동안 방치하여 침전시킨 다음 회수하였다.

5) 회수된 침전물은 수거하여, 80℃ 온도로 열풍건조하여 알코올 성분을 휘발시킨 후, -70℃에 동결시키고 동결건조기를 이용하여 건조한 후, 분쇄기로 분쇄하여 분말의 화합물을 얻었다.

상기에서 제조된 분말 화합물의 성분을 확인하기 위하여 적외선 흡광기(Biorad사, FTS-40)로 일차 확인 스펙트럼을 얻었고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 분석결과로부터 상기한 방법으로 제조된 물질이 파장 889.4nm에서 베타 결합을 가진 베타-아노머(beta-anomer), 즉, 목적 화합물인 일차 베타-글루칸임을 확인하였다.

또한, 핵자기공명분석기(Varian Gemini-2000, 300MHa, FT-NMR)를 사용하여 최종 화합물에 대하여 구조분석을 실시하였고, 그 결과, 도 3의¹³C NMR 스펙트럼을 얻었다. 도 3의 분석결과로부터 주성분이 베타-1,3-D-글루코오스 3분자당 1개의 베타-1,6-D-글루코오스를 갖는 구조, 즉, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸임을 확인하였다. 이때의¹³C NMR 스펙트럼은 도 3에서와 같이 약간의 불순물에 의한 피크가 존재하고 있지만 주성분이 베타-1,3-D-glucose 3분자당 1개의 베타-1,6-D-글루코오스를 갖는 구조인 것으로 확인되었다.

¹³C NMR :

C-6(61.15), C-4(68.58), C-6(70.25), C-2(72.74), C-2(73.80), C-3(74.81), C-5(76.40), C-3(86.44), C-1(103.11)ppm

또한, 참게(horseshoe crab)의 변형세포 분해물(amoebocyte lysate)과 베타-글루칸과의 반응에 의한 비지스타 에이 키트(BGSTAR A kit)를 이용한 확인법(일본 화광순약공업주식회사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd))에 의해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 함량을 측정한 결과, 99.2%로 나타났다.

［제조예 2］

1) 사면배지에서 계대배양된 치마버섯의 균사체를 무균적으로 균질화하여, 이를 포도당 3%, 효모추출물 0.3%, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.3%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂0) 0.05%를 함유하며 pH 6.5으로 조정한 액체배지에 3%(v/v)되게 접종한 후, 30ℓ 발효조내에서 온도 28℃, 회전수 200rpm, 통기량 1vvm의 조건에서 3일간 액체배양한 후, 멸균된 활성탄 분말을 0.5%의 양으로 투여한 다음 3일간 더 배양하였다. 이때 측정된 균사체의 농도는 약 3.8g/ℓ, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 농도는 약 12.3g/ℓ이었다.

2) 배양완료 후, 압축여과장치(press filter)로 여과한 다음 활성탄 분말(제일화학) 0.5%를 첨가하고 30분간 교반하여 색소 및 단백성분을 흡착시켜 제거하였다.

3) 제조예 1의 4)∼5)와 동일한 방법에 따라 실시하여 분말의 화합물을 얻었다.

제조예 1에서와 동일한 조건에서 비지스타 에이 키트법에 의해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 함량을 측정한 결과, 99.5%로 나타났다.

［제조예 3］

1) 상기 사면배지에서 계대배양된 치마버섯의 균사체를 무균적으로 균질화하여 이를 포도당 2%, 효모추출물 0.4%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 0.05%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂0) 0.05%를 함유하며 pH 6.5로 조정한 액체배지에 3%(v/v)되게 접종한 후, 30ℓ 발효조내에서 온도 28℃, 회전수 200rpm, 통기량 1vvm의 조건에서 4일간 액체배양한 다음, 포도당을 3%의 양으로 첨가하여 2일간 더 배양하였다. 이때 측정된 균사체의 농도는 약 4.5g/ℓ, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 농도는 약 13.1g/ℓ이었다.

2) 제조예 1의 3)∼5)와 동일한 방법에 따라 실시하여 분말의 화합물을 얻었다.

제조예 1에서와 동일한 조건에서 비지스타 에이 키트법에 의해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 함량을 측정한 결과, 99.4%로 나타났다.

［제조예 4］

1) 상기 사면배지에서 계대배양된 균사체를 무균적으로 균질화하여, 이를 포도당 2%, 효모추출물 0.4%, 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.1%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂0) 0.05%를 함유하며 pH 6.5으로 조정한 액체배지에 3%(v/v)되게 접종한 후, 30ℓ 발효조내에서 온도 28℃, 회전수 200rpm, 통기량 1.0vvm의 조건에서 4일간 액체배양한 다음, 멸균된 활성탄분말 0.5%와 포도당 3%를 투여하여 2일간 더 배양하였다. 이때 측정된 균사체의 농도는 약 4.5g/ℓ, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 농도는 약 15.1g/ℓ이었다.

제조예 1에서와 동일한 조건에서 비지스타 에이 키트법에 의해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 함량을 측정한 결과, 99.6%로 나타났다.

한편, 배양 시간에 따른 균사체의 성장(◆)과 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산(□) 과정을 도 4에 나타내었다. 도 4로부터 균사체를 6일간 배양하는 경우, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산성이 우수함을 알 수 있다.

〈시험예 1〉 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능 측정

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 사람의 섬유아세포를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하였다. 시료로서, 제조예 1 및 4에 의해 얻은 치마버섯의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸과 효모 유래의 베타-1,3-글루칸인 GluCare-S(Cosmoferm사)를 각각 1%의 양으로 사용하여 배양배지에 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가한 후, 37℃ 온도에서 4일간 배양하였다. 치마버섯 추출물은 제조예 1에서와 동일하게 배양한 배양물을 압축여과장치를 사용하여 여과한 후, 여액을 1㎛ 및 0.45㎛의 미세공을 가진 여과막에 차례로 통과시켜 통과된 여액을 그대로 100% 추출물로서 사용하였다. 시료들의 배양을 완료한 후 0.2% MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltertazolium bromide) 용액을 각 well당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 온도에서 4시간동안 배양한 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하여 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 이를 무처리군과 비교하여 섬유아세포의 증식여부를 판정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료농도(%)	제조예 1	제조예 4	GluCare-S	시료농도(%)	치마버섯 추출물
4 × 10^-7	5	5	0	0	0
4 × 10^-6	6	5	0	0	0
4 × 10^-5	5	7	1	0	0
4 × 10^-4	6	7	3	1 × 10^-2	5
8 × 10^-4	15	16	5	1 × 10^-1	10
4 × 10^-3	34	28	7	1 × 10⁰	15
4 × 10^-2	40	35	7	1 × 10¹	17
4 × 10^-1	38	34	5	1 × 10²	14

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 무처리군과 비교하여, 효모 유래의 베타-1,3-글루칸인 GluCare-S를 처리한 섬유아세포는 최고 약 7% 정도의 증식 효능을 보이나, 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 처리한 섬유아세포는 최고 약 40% 정도 향상된 증식 효능을 나타냈다. 한편, 100% 치마버섯 추출물은 최고 약 17% 정도 섬유아세포를 증식시켰다.

〈시험예 2〉 각질형성세포(Keratinocyte)의 증식효능 측정

각질형성세포를 사용하여 시험예 1과 동일한 방법으로 각질형성세포의 증식효능을 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시료농도(%)	제조예 1	제조예 4	GluCare-S	시료농도(%)	치마버섯추출물
4 × 10^-7	5	3	0	0	0
4 × 10^-6	5	3	0	0	0
4 × 10^-5	7	5	1	0	0
4 × 10^-4	11	10	3	1 × 10^-2	5
8 × 10^-4	19	15	10	1 × 10^-1	10
4 × 10^-3	20	19	12	1 × 10^-0	13
4 × 10^-2	19	16	11	1 × 10¹	8
4 × 10^-1	18	15	8	1 × 10²	6

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 무처리군과 비교하여, 효모 유래의 베타-1,3-글루칸인 GluCare-S를 처리한 각질형성세포는 최고 약 12% 정도의 증식 효능을 보이나, 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 처리한 각질형성세포는 최고 약 20% 정도 향상된 증식 효능을 나타냈다. 한편, 100% 치마버섯 추출물은 최고 약 13% 정도 각질형성세포를 증식시켰다.

〈시험예 3〉 섬유아세포의 콜라겐 합성정도의 측정

인체 섬유아세포를 24공 평판배양기에 배양한 후, 시험예 1과 동일한 시료를 사용하여 배양배지에 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가하였다. 배양 3일째 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 각 well당 0.5㎖씩 첨가한 후 L[2, 3, 4, 5-³H]-프롤린 10μCi를 첨가하였다. 24시간 후 각 well에 들어있는 배지와 세포들을 긁어모아 5% 트리클로로아세틱엑씨드(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후 2개의 시험관에 분주하고, 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1unit/㎕를 넣고 37℃ 온도에서 90분간 배양하였으며, 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다. 그후 모든 시험관에 50% TCA를 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 후 각각 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 디피엠(dpm; decay per minute) 값을 얻어 하기 수학식 1에 의거하여 콜라겐 생합성 값(RCB; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시료농도(%)	제조예 1	제조예 4	GluCare-S	시료농도(%)	치마버섯추출물
4 × 10^-6	5	0	0	0	0
4 × 10^-5	5	5	1	1 × 10^-2	0
4 × 10^-4	11	8	3	1 × 10^-1	5
4 × 10^-3	22	21	5	1 × 10⁰	12
4 × 10^-2	32	30	5	1 × 10¹	10
4 × 10^-1	24	23	3	1 × 10²	6

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 무처리군과 비교하여, 효모 유래의 베타-1,3-글루칸인 GluCare-S를 처리한 섬유아세포는 최고 약 5% 정도의 콜라겐 합성증가를 보이나, 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 처리한 섬유아세포는 최고 약 32% 정도 향상된 콜라겐 합성 증가를 나타냈다. 한편, 100% 치마버섯 추출물은 최고 약 12% 정도의 콜라겐 합성 증가를 보였다.

〈시험예 4〉 일광에 의한 피부손상치유 효능시험

피부색소 측정기(Chromameter CM2002)를 이용하여 조사 부위의 피부색 초기값을 측정하였다. 솔라 시뮬레이터(Solar simulator)를 이용하여 피검자의 상박 부위에서 MED를 측정한 후 1.5MED의 자외선을 조사하여 홍반을 유발한 다음, 조사 6시간 후, 8시간 후, 10시간 후, 12시간 후, 16시간 후, 24시간 후에 시험예 1과 동일한 시료를 각각 20㎕씩 처치하였다. 조사 후 16시간, 24시간, 48시간이 경과한 때에 피부 색소 측정기를 이용하여 상기 시료들의 홍반을 측정하고 대조군과 비교하여 화상 치유 효능을 평가하였다. 이때, 홍반 지수는 최초 자외선 조사전의 피부색소 측정값을 100으로 환산한 값이고 홍반 지수는 아노바 테스트(Anova test)를 통해 통계적 유의성을 검증하였고, p<0.05 범위를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시간(hour)	(단위 :홍반지수)
시간(hour)	대조군(D.W.)	제조예 1	GluCare-S	치마버섯추출물
0	100.00	100.00	100.00	100.00
16	197.85	163.60	193.51	180.65
24	193.58	155.01	189.32	178.28
48	174.98	135.87	165.25	160.56

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군과 비교하여 효모 유래의 베타-1,3-글루칸인 GluCare-S를 처리한 피부손상부위는 48시간 경과한 때에 최고 5.56%, 100% 치마버섯 추출물을 처리한 피부손상부위는 최고 약 8.24%의 일광화상 치유효능을 보이나, 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 처리한 피부손상부위는 최고 약 22.35% 향상된 일광화상 치유효능을 나타냈다.

〈시험예 5〉 인체 피부를 대상으로 한 미백효능 시험

시험대상자인 10명의 남자 각각에 대하여 실험부위를 설정하고 실험부위 중 일정 부위(직경 1.5㎝인 6개의 구멍)를 제거한 불투명 테이프로 부착한 후, UVA 램프(TL20W/09U.V., 필립스사)와 UVB 램프(TL20W/12U.V., 필립스사)를 1:1로 혼합하여 200mJ/㎠의 세기로 자외선을 조사하였다. 자외선 조사 후 2주일간 방치하여 색소침착이 안정되면 2개월간 하루 2회씩 제조예 4와 GluCare-S를 각각 0.1% 처리한 시료와, 제조예 1에서와 동일하게 배양한 배양물을 압축여과장치를 사용하여 여과한 후, 여액을 1㎛ 및 0.45㎛의 미세공을 가진 여과막에 차례로 통과시켜 통과한 여액인 100% 치마버섯 추출물을 25%로 희석 처리한 시료를 각각 도포하였다. 시료 처치기간 중 일정한 간격으로 색소측정기(Chromameter CM2002)를 이용하여 피부색을 측정하였으며, 이때 자외선 조사 후 2주가 경과하여 색소침착이 안정된 때의 L값(피부 백색도)을 0으로 놓고, 이후의 변화정도(ΔL)를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시료처리기간(일)	(단위: ΔL)
시료처리기간(일)	무처리	제조예 4(0.1%)	GluCare-S(0.1%)	치마버섯추출물(25%)
0	0	0	0	0
10	0.25	0.95	0.31	0.61
20	0.50	2.15	0.52	1.50
30	1.00	2.65	1.35	2.00
40	1.74	3.52	2.12	2.54
50	2.37	4.2	2.75	2.90
60	2.93	4.71	3.20	3.35

표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 시험대상자 10명의 피부색 변화 평균치를 요약하면, 베타-글루칸 처리일로부터 10일이 경과한 때에 전반적으로 백색도가 증가하였으나, 베타-글루칸 무처리 시료에 비하여 제조예 4는 3.8배 정도의 급격한 백색도 증가를 보였으며, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 처리일로부터 60일이 경과한 때에도 무처리군에 비하여 1.6배정도 향상된 백색도 증가를 보였다.

〈시험예 6〉 인체피부를 대상으로 한 피부주름 개선효과

35∼45세의 안면주름이 있는 시험대상자 10명에 대하여, 하기 표 6과 같은 조성을 갖는 영양크림에 대하여 제조예 1의 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 처리한 실시예 1과 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하지 않는 비교예 1에 대하여 피부주름 개선효과를 비교평가하게 하였다.

성 분	(단위 : 중량%)
성 분	실시예 1	비교예 1
제조예 1의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸	0.1	-
밀납	3.0	3.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
유동파라핀	10.0	10.0
스쿠알란	5.0	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	5.0	5.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

피검자의 안면 좌부에는 실시예 1을, 우부에는 비교예 1을 3개월간 사용하도록 하였다. 크림사용 이전의 안면 양쪽부의 피부상태를 측정해 놓은 후, 크림사용 3개월 후 동일부위를 재측정하여 피부주름의 변화를 측정하였다. 피부측정은 24℃ 온도, 상대습도 40%의 항온항습실에서 하였으며, 눈꼬리부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서 비시오메타 시스템(Visiometer system; C+K사)으로 피부주름을 측정하였다. 피부주름의 변화량은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

(상기 식에서,

Tdi; D₉₀에서의 측정부위 값이며, Tdo; D₀에서의 측정부위 값이다)

상기 식에 따라 계산한 결과, 비교예 1을 사용한 부위의 피부주름은 3.1±2.2%(평균±표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 실시예 1을 사용한 부위의 피부주름은 15±4.1%의 감소치를 보여 우수한 피부주름 개선효과를 나타냈다.

이하, 제형예 1∼9를 들어 상기 제조예 1∼4에서 제조된 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 함유하는 화장료 조성물의 구성을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 조성물이 이들 제형예에 한정되는 것은 아니다.

(제형예 1) 유연화장수(스킨로션)

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	0.1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 2) 영양화장수(밀크로션)

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	0.1
스쿠알란	5.0
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 3) 영양크림

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	0.1
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 4) 마사지크림

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	0.1
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 5) 팩

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	0.1
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
핑지-12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 6) 젤

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	0.1
에틸렌디아민초산나트륨	0.05
글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.3
에탄올	5.0
피이지-60 경화피마자유	0.5
트리에탄올아민	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 7) 연고

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	1.0
밀납	10
폴리솔베이트 60	5.0
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
바셀린	5.0
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
쉐어버터	3.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	10.0
프로필렌글리콜	10.2
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 8) 국소투여용 약제(겔 연고제)

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	3.0
폴리아크릴산(Carbopol 940)	1.5
이소프로판올	5.0
헥실렌글리콜	25.0
트리에탄올아민	1.7
탈이온수	to 100

(제형예 9) 국소 투여용 약제(패취제)

배합성분	중량%
제조예 1 또는 제조예 4	1.2
헥실렌글리콜	20.0
디에틸아민	0.7
폴리아크릴산(Carbopol 934P)	1.0
아황산나트륨	0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9)	1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000)	1.0
점성의 파라핀 오일	2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(Cetiol LC)	2.5
폴리에틸렌글리콜 400	3.0
탈이온수	to 100

이상에서 설명한 바와 같이, 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.)의 균사체를 액체배양함으로써 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 단기간에 고수율로 생산할 수 있으며, 이러한 방법으로 제조된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 외용제 조성물에 함유시킴으로써, 우수한 피부노화 방지효과, 미백 효과 및 피부손상 완화 효과를 갖는 외용제 조성물을 제공할 수 있다.

Claims

(1) 치마버섯의 포자를 발아시켜 균사체를 얻는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 균사체를 포도당 1∼10%, 효모추출물 0.1∼1%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, pH 4.0∼8.5로 조정된 액체배지에 1∼10%(v/v)의 양으로 접종한 후, 온도 20∼35℃, 회전수 100∼400rpm, 통기량 0.3∼2vvm의 조건으로 3∼7일간 배양하는 단계;

(3) 상기 (2)단계의 배양액에 활성탄 분말을 0.1∼6%의 양으로 첨가하여 색소 및 단백질 성분을 흡착시킨 후 여과하여 활성탄이 제거된 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 얻는 단계;

(4) 상기 (3)단계의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 용액을 여과막을 사용하여 재여과시킨 후, 에틸알코올을 2∼5회 첨가하여 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 침전시켜 회수하는 단계; 및

(5) 상기 (4)단계의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 열풍건조 및 동결건조한 후 분쇄하는 단계

로 이루어짐을 특징으로 하는 치마버섯(Schizophyllu commune Fr.) 유래의 베타-1,6-베타-1,3-글루칸의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (2)단계의 균사체의 배양 2∼4일 후에 멸균된 활성탄 분말을 0.1∼5%의 양으로 첨가한 후, 1∼4일간 더 배양함을 특징으로 하는 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (2)단계가 상기 (1)단계의 균사체를 포도당 1∼3%, 효모추출물 0.3∼0.5%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, pH 4.0∼8.5로 조정된 액체배지에 1∼10%(v/v)의 양으로 접종하여, 온도 20∼35℃, 회전수 100∼400rpm, 통기량 0.3∼2vvm의 조건으로 3∼5일간 배양한 후, 포도당을 1∼10%의 양으로 첨가하며, 1∼3일간 더 배양하는 단계임을 특징으로 하는 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (2)단계가 상기 (1)단계의 균사체를 포도당 1∼3%, 효모추출물 0.3∼0.5%, 이인산암모늄((NH₄)₂HPO₄) 또는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 0.05∼0.5%, 일인산칼륨(KH₂PO₄) 0.05∼0.5%, 황산마그네슘(MgSO₄·7H₂O) 0.005∼0.2%, pH 4.0∼8.5로 조정된 액체배지에 1∼10%(v/v)의 양으로 접종하여, 온도 20∼35℃, 회전수 100∼400rpm, 통기량 0.3∼2vvm의 조건으로 3∼5일간 배양한 후, 멸균된 활성탄 분말 0.1∼2%와 포도당 1∼10%를 첨가하여, 1∼3일간 더 배양하는 단계임을 특징으로 하는 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법.
제 1 내지 제 4항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 치마버섯 유래의 베타-1,6-베타-1,3-글루칸을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼10중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 외용제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기한 조성물은 유연화장수(스킨로션), 영양화장수(밀크로션), 영양크림, 마사지크림, 팩 또는 젤의 제형을 갖는 화장료 조성물임을 특징으로 하는 외용제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기한 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 경피투여용 제형을 가짐을 특징으로 하는 외용제 조성물.