WO2014077476A1 - β-글루칸 제조방법 - Google Patents

β-글루칸 제조방법 Download PDF

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WO2014077476A1
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mushroom
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이창호
이남혁
김영호
김영언
조승목
박동준
홍상필
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한국식품연구원
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    • A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -glucan from mushrooms. [Background technology]
  • ⁇ -glucan ( ⁇ -ghican) is a polysaccharide of a polymer in which glucose forms triple helices through beta bonds, and has side chains of ⁇ -1,4 bonds or ⁇ -1,6 bonds, which are found in cereals and mushrooms.
  • ⁇ -glucan represents a water-soluble alcohol by ⁇ -1,4 or ⁇ -1,6 side chain bonding to the main structure of ⁇ -1,3.
  • ⁇ -glucan As the physiological activity of ⁇ -glucan, immunological activity, antioxidant activity, anti-inflammatory activity, anticancer activity and anti-obesity effect have been reported.
  • the anticancer activity of mushroom-derived ⁇ -glucan is attracting attention mainly in Japan and the United States, and the anticancer activity of ⁇ -glucan is a nonspecific immune response rather than directly attacking cancer cells. Inhibits the proliferation of cancer cells by activating their immune function.
  • ⁇ -glucan is a type of blood cholesterol and
  • Mushrooms are generally known as natural products with medical potential and have been widely used in the treatment of various diseases including tumors for hundreds of years in China and other Asian countries. Mushrooms have been reported to have antitumor, antibacterial and antiviral activity depending on their type (Yoon, S. Y. et al., Arch Pharm.
  • zinnia (5 /? Arass / s crispa) is a mushroom belonging to the Democratic Mushroom ⁇ iAphylophoreles, zinnia (5 «ss / s), which grows in nests in Korea, China, Japan, Europe, and North America. .
  • the mushroom mushroom It contains more than 40% of high ⁇ -glucan in dry samples and is recognized as a source of medicinal mushrooms and ⁇ -glucan.
  • the ⁇ -glucan contained in the mushrooms is mostly composed of 1,3- ⁇ -glucan structure with excellent health function. Immuno-enhancing and anticancer effects of 1,3- ⁇ -glucan isolated from zinnia mushroom have been reported. Therefore, there is a need for a process capable of efficiently extracting ⁇ -glucan from the flower mushroom.
  • the present inventors have tried to develop a method for efficiently extracting ⁇ -glucan from mushrooms.
  • ⁇ -glucan was obtained at a higher yield than the conventional alkali or enzymatic extraction process through a series of processes in which a solvent was added to the mushroom pulverized powder obtained by pulverizing the coarsely pulverized mushroom powder again, followed by ultrasonic extraction and heat extraction.
  • the present invention was completed.
  • Another object of the present invention to provide a ⁇ -glucan prepared by the above production method.
  • the present invention provides a method for preparing (or extracting) ⁇ -glucan from a mushroom comprising the following steps:
  • step (b) second milling the coarsely pulverized powder of step (a) to obtain a finely ground powder having an average particle size of 1-20 ⁇ ;
  • step (c) adding a solvent to the finely divided powder of step (b) and sonicating the ultrasonically extracted;
  • step (e) separating ⁇ -glucan from the heat extract obtained in step (d).
  • the present inventors have tried to develop a method for efficiently extracting ⁇ -glucan from mushrooms.
  • ⁇ -glucan was obtained at a higher yield than the conventional alkali or enzymatic extraction process through a series of processes in which a solvent was added to the mushroom pulverized powder obtained by pulverizing the coarsely pulverized mushroom powder again, followed by ultrasonic extraction and heat extraction. It was confirmed that can be extracted and prepared.
  • Method for producing ⁇ -glucanol from the mushroom of the present invention the first step to largely obtain the fine powder of the mushroom, the second step of adding a solvent to the fine powder and ultrasonic extraction and thermal extraction, and the ⁇ in the extract -Third process for separating glucans.
  • the first process of the invention comprises the steps of: (a) first grinding the mushrooms with a grinder to obtain coarse ground powder having an average particle size of 50-100 ⁇ ; And (b) secondary grinding the coarsely pulverized powder of step (a) to obtain pulverized pulverized powder having an average particle size of 1-20 ⁇ .
  • the mushroom in the present invention can be used without limitation as long as the mushroom containing -glucan.
  • the mushroom is one or more mushrooms selected from the group consisting of matsutake mushrooms, edible mushrooms, shigo mushrooms, skirt mushrooms, ganoderma lucidum mushrooms, chaga mushrooms, shiitake mushrooms and leaf mushrooms.
  • the mushroom is a blossom mushroom.
  • the mushroom of step (a) may be dried before grinding to increase the grinding efficiency.
  • the drying may be used without limitation drying methods known in the art, examples of the drying method may be room temperature atmospheric pressure drying, hot air drying, reduced pressure drying, freeze drying, spray drying and rotary evaporation drying.
  • the mushroom is dried to have a water content of 1-8% (v / w).
  • the primary grinding may be performed using a pin mill, ball mill, impact mill, edge runner mill, reller mill, vibrating ball mill, cone mill, hammer mill or colloid mill.
  • the primary grinding is performed using pinmillol.
  • the finely ground powder subjected to the first grinding treatment is subjected to the second grinding treatment to obtain finely divided powder.
  • the finely ground powder can be obtained by classifying the finely divided powder obtained by pulverizing the step (a) and the coarse powder into a grinder with an air classifier.
  • the pulverized powder has an average particle size of 1-20 ⁇ , in another specific example has an average particle size of 1-17 ⁇ , and in another specific example, has an average particle size of 1-16 rn, In another specific example, an average particle size of 1-15 um, in another specific example, an average particle size of 1-14 um, in another specific example, an average ⁇ particle size of 1-13, and in another specific example It has an average particle size of 1-12 ⁇ , and in another specific example, an average particle size of 1-11 ⁇ .
  • the operating condition of the air classifier is an air classifying wheel speed of 7,000-20,000 rpm.
  • the air classification wheel speed is 8,000-20,000 rpm, in another specific example is 9,000-20,000 rpm, in another specific example is 10,000-20,000 rpm, in another specific example is 11,000-20,000 rpm, In another specific example, 12,000-20,000 rpm, in another specific example 13,000-20,000 rpm, and in another specific example 14,000-20,000 rpm.
  • the secondary grinding may be carried out using a jet mill or a disk mill.
  • the second milling is performed using jet millol.
  • the primary grinding is performed using a pin mill, ball mill, impact mill, edge runner mill, reller mill, vibrating ball mill, cone grinder, hammer mill or colloid mill, and the second grinding Can be performed using a jet mill or a disk mill.
  • the primary grinding is performed using a pin mill
  • the secondary grinding is performed using a jet mill.
  • the second step of the present invention is to extract ⁇ -glucan in earnest from the mushroom pulverized powder obtained through the first step, and includes a first extraction step of ultrasonic extraction and a second extraction step of thermal extraction.
  • the extraction solvent is added to the mushroom pulverized powder obtained in the first step, and then extracted with an ultrasonic extractor.
  • Ultrasonic extraction generates very large energy by cavitation caused by ultrasonic vibration, and by inducing local energy and high pressure for reaction by increasing kinetic energy of reactant particles located around by local temperature Cause effect.
  • the tissue is destroyed by high pressure, so that the diffusion is easily performed by the stirring effect, thereby reducing the extraction time, improving the extraction yield and safe eluting of useful components.
  • Ultrasonic extractors can be used without limitation ultrasonic extractors known in the art, the time of ultrasonic extraction may vary depending on the amount of sample to be extracted. Then, heat extraction by applying high temperature heat to the extract obtained by the ultrasonic treatment. The heat extraction temperature can be adjusted in consideration of the amount of the sample, the type of the sample, the conditions and time of the ultrasonic treatment.
  • the heat extraction can be performed at 100-160 ° C.
  • the heat extraction is performed at 100-15CTC, in another specific example at 100-140 ° C., in another specific example at 100-135 ° C., and in another specific example 100 At -130 ° C, in another specific example at 100-125 ° C.
  • the time to extract the heat can be adjusted in consideration of the type of sample, the temperature and time of the heat extraction, the conditions and time of the ultrasonic treatment, and usually 1 to 10 hours is appropriate, in one specific example 1 to 7 Time, in another specific example, heat extraction for 1 to 5 hours.
  • the extractant is added to the pulverized mushroom powder;
  • Organic solvents such as methanol, ethane, butanol, nucleic acid and ethyl acetate;
  • a mixed solvent of the organic solvent and water may be used.
  • the extraction solvent is water.
  • a suitable amount of the extractant is 1-50 times the weight of the mushroom pulverized powder, 1-40 times in one specific example, and 1-35 times in another specific example.
  • the third process of the present invention is the step of separating the ⁇ -glucan from the ⁇ -glucan-containing extract (extract solution) obtained through the second process.
  • Separation of ⁇ -glucan in the present invention is (0 separating the ⁇ -glucan-containing extract from the mushroom pulverized powder contained in the extracting solvent, and ( ⁇ ) by further purification of the isolated ⁇ -glucan-containing extract) Separating the ⁇ -glucan from the extract.
  • the separation of ⁇ -glucan comprises the steps of: separating the supernatant by centrifuging the heat extract obtained in the second process; Adding alcohols to the supernatant to obtain ⁇ -glucan precipitates; And separating the precipitate.
  • the alcohols are ethanol or alcohol.
  • the separated precipitate may be dried, ground and homogenized to prepare a powdery ⁇ -glucan. The drying treatment may be carried out using a room temperature atmospheric pressure drying, hot air drying reduced pressure drying, freeze drying, spray drying or rotary evaporation drying method.
  • the present invention is to produce a fine powder by micronizing the mushroom, and then added to the extraction solvent, ultrasonic extraction and heat extraction through a series of processes than the conventional alkali or enzyme treatment extraction method
  • the extraction yield of ⁇ -glucan was significantly improved (see Table 2).
  • the present invention provides a method of making ⁇ -glucan from mushrooms.
  • the present invention can be prepared by the first coarse milling step and the second milling step to produce the finely divided mushroom powder, and to produce ⁇ -glucan in a high yield through a series of ultrasonic extraction and heat extraction process Therefore, it is economical and can solve the problem of alkali neutralization process and environmental pollution caused by the existing alkali treatment extraction process.
  • the present invention can be usefully used for the preparation of ⁇ -glucan, and the prepared ⁇ -glucan can be usefully used for the manufacture of pharmaceuticals, cosmetics, nutraceuticals and foods.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the various ⁇ -glucan extraction process performed in the embodiment of the present invention.
  • the sample used for the experiment was purchased from Hana Biotech. In order to increase the crushing efficiency of the blossom mushroom was dried for 24 hours at 35T using a hot air dryer. The dried mushrooms were measured for moisture content using a moisture meter MB45 (0haus, Switzerland). After grinding the dried blossom mushrooms with a pin mill (Kyungchang Machinery, Korea), air classifying wheel speed (ACWS) 8000 rpm using a fluidized bed opposed jet mill (Model 100-AFG, Alpine, Germany). Grinded under conditions. The granulated flower pulverized powder was classified using an air classifying system (Model 50 ATP, Alpine, Germany) under conditions of 10,000-14,000 rpm. 2. Extraction of ⁇ -glucan from Flower Mushroom Crushes by Particle Size
  • ⁇ -glucan extraction process is shown in FIG. 20 g of the crushed mushroom mushroom powder by particle size was added to distilled water 600 (30 times of mushroom ground), followed by stirring for 5 minutes (Magnetic Stirrer C-MAG HS7, IKA, Germany). Alkali treatment was stirred by adding 600 ⁇ alkaline solution (1M NaOH) instead of distilled water, and the stirred mushroom solution was extracted by using high-pressure steam sterilizer (Autoclave DS-60, Dosung Science, Korea) at high temperature and high pressure extraction (121 ° C, 2 hours). ) was neutralized with 2M acetic acid (pH 7.0).
  • the untreated group was subjected to high temperature and high pressure extraction (121 ° C, 2 hours) after stirring without alkali, ultrasonic treatment and enzyme treatment.
  • Ultrasound treatment is the stirring solution ultrasonic devices (See- Sonic ⁇ , Ul tech) using an ultrasonic treatment and then repeated with the non-treated at 30-second intervals with 120 watt power ultrasonic treatment for 80 minutes to extract the high-temperature high-pressure (121 ° C, 2 hours).
  • Enzyme treatment was performed after adjusting the pH to 5.0 after high temperature and high pressure extraction, and then using a sallaase (C8546, Sigma, optimum condition: pH 5.0, 37 ° C) 8.3 mg (50 unit, mushroom 5 units per g of the sample) was added and reacted by shaking for 30 minutes at 37 ° C and 120 rpm conditions in a shaker incubator.
  • a sallaase C8546, Sigma, optimum condition: pH 5.0, 37 ° C
  • 8.3 mg 50 unit, mushroom 5 units per g of the sample
  • the supernatant was taken by centrifugation (J2—21M / E Centrifuge, BECKMAN, USA) for 10 minutes at 8000 g of the mushroom solution extracted according to each untreated, alkali treated, enzyme treated and sonicated process. Three times the volume of ethanol was added to the supernatant and precipitated at room temperature (20-40 ° C.) for 12 hours. The precipitated ethanol solution was triturated with an ultrasonic grinder (Ultra-Turrax T25, IKA Labortechnik, Germany) for 3 minutes and then centrifuged at 8000 g for 15 minutes (centrifuge 5810R, Eppendorf, Germany). The supernatant centrifuged was removed and the crude glucan precipitate was taken and dried at 55 ° C. for 48 hours. The crude crude ⁇ -glucan precipitate was weighed, ground and homogenized to obtain crude ⁇ -glucan in powder form.
  • the ⁇ -glucan content (3 ⁇ 4> w / w) was determined by the difference in sugar content other than ⁇ -glucan and glucan. Measured. After adding 37% hydrochloric acid to the crude ⁇ -glucan powder sample for 2 hours at 100 ° C., the pH was adjusted using 2N K0H. The hydrolyzate was distilled off with 200 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) and centrifuged. 100 ⁇ of the supernatant was taken, and the solution was reacted at 40 ° C.
  • the content of total glucan, ⁇ -glucan and ⁇ -glucan was calculated by the following equation.
  • ⁇ -glucan (% w / w) ⁇ x F / W x 9.27
  • ⁇ -glucan total glucan- ⁇ -glucan
  • ⁇ -glucan mercury was varied from 0.43% up to 11.38% for each treatment condition, and the yield was greatly increased when pulverized with a jet mill rather than by simple grinding.
  • Yield was increased, and in case of the ultrasonic treatment, the yield was increased to 8.33%, yielding 74%. Therefore, the ⁇ -glucan extraction by jet mill and ultrasonic treatment can be simplified to replace the existing alkali treatment process, there is an advantage that can greatly enjoy the environmental pollution by eliminating the alkali neutralization process.
  • Pin- ⁇ pin mill unmilled
  • Pin-EN pin mill coarse enzyme treatment
  • Pin-AL pin mill coarse alkali treatment
  • Pin-ALEN pin mill coarse alkali and enzyme treatment
  • Pin-UL pin mill grind ultrasonic treatment tool
  • Jet- ⁇ Jet mill pulverized untreated zone
  • Jet-UL Jet Mill Grinding Ultrasonic Treatment Zone

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Abstract

본 발명은 버섯으로부터 β-글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 1차 조분쇄 공정 및 2차 미분쇄 공정을 통하여 미립자화 된 버섯 분말을 제조하고, 이를 초음파 추출 및 열추출 하는 일련을 공정을 통하여 높은 수율로 β-글루칸을 수득할 수 있어 경제적이며, 기존의 알칼리 처리 추출 공정의 문제점인 알칼리 중화공정 및 이로 인한 환경오염을 해소할 수 있다. 따라서, 본 발명은 β-글루칸의 제조에 유용하게 사용될 수 있고, 제조된 β-글루칸은 의약품, 화장품, 건강기능식품 및 식품의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
β—글루칸 제조방법 【기술 분야】
본 발명은 버섯으로부터 β—글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다. 【배경 기술】
β-글루칸 (β-ghican)은 글루코스가 베타 결합을 통해 삼중의 나선형을 형성하는 고분자의 다당체로서, β-1,4 결합 혹은 β-1,6 결합의 측쇄를 가지며， 곡류나 버섯에서 발견되는 βᅳ글루칸은 β-1,3의 주된 구조에 β -1,4 혹은 β-1,6 측쇄결합에 의해 수용성올 나타낸다.
β-글루칸의 생리활성 효과로 면역활성， 항산화 활성， 항염증 활성， 항암 활성 및 항비만 효능 등이 보고된 바 있다. 특히， 일본 및 미국을 중심으로 버섯 유래 β-글루칸의 항암효능이 주목 받고 있으며, β- 글루칸의 항암활성은 암세포를 직접 공격하기보다 비특이적 면역반웅으로 대식세포， 자연살해세포 및 Τ 세포 등 면역세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식을 억제한다. 또한, β-글루칸은 체내의 혈중 콜레스테롤 및
LDL-콜레스테를 농도를 낮추는 동시에 HDL-콜레스테를 농도를 높이고, 콜레스테를의 간 축적을 억제하며， 지방질의 소화 기능을 저하시키는 효능이 알려지면서 세계적으로 관심이 높아지고 있다.
버섯은 일반적으로 의학적 가능성을 지닌 천연물로 알려져 있고， 중국을 비롯한 동양권 국가에서 수백년간 종양을 비롯한 다양한 질환 치료에 널리 사용되어 왔다. 버섯은 그 종류에 따라 항종양, 항균 및 항바이러스 활성이 있다고 보고된 바 있다 (Yoon, S. Y. et al. , Arch Pharm.
Res. 17, 438-442(1994), Wang, S. Y. et al. , Int. J. Cancer 70, 699-
705(1997)). 몇몇 버섯의 다당류 분획이 항암 효과에 관여한다는 시험관 내 연구와 생체 연구가 확립되어 있다.
이러한 버섯 중에서, 꽃송이버섯 (5/?arass/s crispa)은 민주름버섯 ^iAphylophoreles), 꽃송이버섯 속 (5« ss/s)에 속하는 버섯으로 한국， 중국, 일본, 유럽 및 북아메리카 둥지에 자생한다. 특히, 꽃송이버섯은 건조시료 내에 40% 이상의 높은 β-글루칸을 함유하고 있어 약용버섯 및 β-글루칸 공급원으로 인정받고 있다. 꽃송이버섯에 함유된 β-글루칸은 건강 기능성이 탁왈한 1,3-β-글루칸 구조가 대부분을 차지하고 있으며. 꽃송이버섯으로부터 분리한 1,3-β-글루칸의 면역증강 및 항암효과가 보고된 바 있다. 따라서, 꽃송이버섯으로부터 β-글루칸을 효율적으로 추출할 수 있는 공정이 요구되고 있다.
식물체로부터 β-글루칸을 추출하는 방법으로， 대한민국 공개특허 제 10-2009-0121824호는 버섯분말을 물을 이용하여 70-99 °C , H 10-12에서 15-30시간 동안 추출하는 단계， 및 상기 단계에서 추출된 추출물을 유기용매를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 수용성 β—글루칸의 제조방법을 개시하고 있다. 상기 공개특허의 제조방법은 버섯에 알칼리를 처리하는 것을 요지로 하고 있으나， 이에 의하면 알칼리 중화공정이 필요하여 공정이 복잡하고, 환경오염의 문제가 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다 . 【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 버섯으로부터 β-글루칸을 효율적으로 추출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 조분쇄 된 버섯 분말을 다시 미분쇄하여 수득한 버섯 미분쇄 분말에 용매를 가한 다음 초음파 추출 및 열추출 하는 일련의 공정을 통하여 종래의 알칼리 또는 효소처리 추출공정 보다 높은 수율로 β-글루칸을 추출 및 제조할 수 있음을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 버섯으로부터 β-글루칸올 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 β—글루칸을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 버섯으로부터 β-글루칸을 제조 (또는 추출)하는 방법을 제공한다:
(a) 버섯을 분쇄기로 1 차 분쇄하여 평균 입도 50-100 μπι 의 조분쇄 분말을 얻는 단계 ;
(b) 단계 (a)의 조분쇄 분말을 2차 분쇄하여 평균 입도 1—20 μιη의 미분쇄 분말을 얻는 단계;
(c) 단계 (b)의 미분쇄 분말에 용매를 가하고 초음파 처리하여 초음파 추출하는 단계;
(d) 단계 (c)의 추출물에 100-16(TC의 열을 가하여 열추출 하는 단계; 및
(e) 단계 (d)에서 수득한 열추출물에서 β—글루칸을 분리하는 단계. 본 발명자들은 버섯으로부터 β-글루칸을 효율적으로추출할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 조분쇄 된 버섯 분말을 다시 미분쇄하여 수득한 버섯 미분쇄 분말에 용매를 가한 다음 초음파 추출 및 열추출 하는 일련의 공정을 통하여 종래의 알칼리 또는 효소처리 추출공정 보다 높은 수율로 β-글루칸을 추출 및 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 버섯으로부터 β—글루칸올 제조하는 방법은， 크게 버섯의 미분쇄 분말을 수득하는 제 1 공정， 상기 미분쇄 분말에 용매를 가하고 초음파 추출 및 열추출하는 제 2 공정, 및 상기 추출물에서 β-글루칸을 분리하는 제 3공정을 포함한다 .
이하, 상세히 설명한다. 버섯 미분쇄 분말을 수득하는제 1공정
본 발명의 제 1 공정에서는 버섯을 미분화하여 표면적을 증가시킴으로써 β-글루칸의 추출 효율을 극대화시킨다. 구체적으로, 본 발명의 제 1 공정은 (a) 버섯을 분쇄기로 1 차 분쇄하여 평균 입도 50-100 μη 의 조분쇄 분말을 얻는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조분쇄 분말을 2 차 분쇄하여 평균 입도 1-20 μηι의 미분쇄 분말을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 버섯은 -글루칸을 함유하는 버섯이면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 버섯은 꽃송이버섯， 상황버섯, 차신고버섯， 치마버섯, 영지버섯， 차가버섯, 표고버섯 및 잎새버섯으로 구성된 군으로부터 선택되는 한 종 이상의 버섯이다. 일특정예에 따르면， 상기 버섯은 꽃송이버섯이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 단계 (a)의 버섯은 분쇄 효율을 높이기 위하여 분쇄 전 건조될 수 있다. 상기 건조는 당업계에 알려진 건조 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며， 건조 방법의 예로는 상온상압건조， 열풍건조, 감압건조, 동결건조， 분무건조 및 회전식 증발건조를 들 수 있다. 일특정예에 따르면， 상기 버섯은 수분함량이 1-8% (v/w)가 되도록 건조처리된다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 1 차 분쇄는 핀밀, 볼밀, 임팩트밀， 에지 러너밀, 를러밀， 진동볼밀， 원추분쇄기, 해머밀 또는 콜로이드밀을 사용하여 수행할 수 있다. 일특정예에 따르면， 상기 1 차 분쇄는 핀밀올 사용하여 수행한다.
본 발명에서는 1 차 분쇄 처리된 조분쇄 분말을 2 차 분쇄 처리하여 미분쇄 분말을 얻는다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 미분쇄 분말은 단계 (a)와 조분쇄 분말을 분쇄기로 분쇄하여 얻은 미립자화 된 분말을 공기분급기 (air classifier)로 분급하여 얻을 수 있다. 일특정예에 따르면， 상기 미분쇄 분말은 1-20 μηι 의 평균 입도를 가지고， 다른 특정예에서는 1-17 μιη 의 평균 입도를 가지며， 또 다른 특정예에서는 1-16 rn의 평균 입도를 가지고， 또 다른 특정예에서는 1-15 um 의 평균 입도를 가지며, 또 다른 특정예에서는 1-14 um 의 평균 입도를 가지고, 또 다른 특정예에서는 1- 13 의 평균 μιη 입도를 가지며, 또 다른 특정예에서는 1-12 μιτι 의 평균 입도를 가지고, 또 다른 특정예에서는 1-11 μηι의 평균 입도를 가진다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 공기분급기의 운전조건은 공기분급 휠 속도 (air classifying wheel speed) 7,000-20,000 rpm 이다. 일특정예에 따르면， 상기 공기분급 휠 속도는 8,000-20,000 rpm 이고， 다른 특정예에서는 9,000-20,000 rpm 이며, 또 다른 특정예에서는 10,000-20,000 rpm 이고， 또 다른 특정예에서는 11,000-20,000 rpm 이며, 또 다른 특정예에서는 12,000-20,000 rpm이고, 또 다른 특정예에서는 13,000-20,000 rpm이며, 또 다른 특정예에서는 14,000-20,000 rpm이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 2 차 분쇄는 제트밀 또는 디스크밀을 사용하여 수행할 수 있다. 일특정예에 따르면， 상기 2차 분쇄는 제트밀올 사용하여 수행한다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 1 차 분쇄는 핀밀, 볼밀， 임팩트밀， 에지 러너밀， 를러밀, 진동볼밀， 원추분쇄기， 해머밀 또는 콜로이드밀을사용하여 수행하고， 상기 2차 분쇄는 제트밀 또는 디스크밀을 사용하여 수행할 수 있다. 일특정예에 따르면， 상기 1 차 분쇄는 핀밀을 사용하여 수행하고， 2차 분쇄는 제트밀을 사용하여 수행한다. 초음파추출 및 열추출 하는 제 2공정
본 발명의 제 2 공정은 상기 제 1 공정을 통하여 수득한 버섯 미분쇄 분말로부터 본격적으로 β-글루칸을 추출하는 단계로서, 초음파 추출하는 제 1추출 공정 및 열추출 하는 제 2추출 공정을 포함한다.
본 발명의 초음파 추출( 1^3301 £^：3 011)은 제 1 공정에서 수득된 버섯 미분쇄 분말에 추출용매를 가한 후 초음파 추출기로 추출한다. 초음파 추출은 초음파 진동에 의한 공동현상 (caviation)에 의해 매우 큰 에너지를 발생시키고， 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 함으로써 반웅에 필요한 층분한 에너지와 높은 압력을 유도하여 흔합 효과를 일으킨다. 초음파 추출공정을 이용하면 높은 압력에 의해 조직이 파괴됨으로써 교반효과에 의해 확산이 용이하게 일어나 추출시간 단축， 추출수율 향상 및 유용성분 안전 용출의 효과를 얻을 수 있다.
초음파 추출기는 당업계에 알려진 초음파 추출기는 제한 없이 사용할 수 있으며， 초음파 추출의 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있다. 이후, 상기 초음파 처리하여 얻은 추출물에 고온의 열을 가하여 열추출 한다. 열추출 온도는 시료의 양， 시료의 종류， 초음파 처리의 조건 및 시간 등을 고려하여 조절할수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 열추출은 100-160°C에서 수행할 수 있다. 일특정예에 따르면， 상기 열추출은 100-15CTC에서 수행하고， 다른 특정예에서는 100-140°C에서 수행하며, 또 다른 특정예에서는 100- 135°C에서 수행하고, 또 다른 특정예에서는 100-130°C에서 수행하며, 또 다른 특정예에서는 100-125 °C에서 수행한다. 열추출 하는 시간은 시료의 양 시료의 종류, 열추출 온도 및 시간, 초음파 처리의 조건 및 시간 등을 고려하여 조절할 수 있으며， 통상적으로는 1 내지 10 시간이 적당하며, 일특정예에서는 1 내지 7 시간, 다른 특정예에서는 1 내지 5 시간동안 열추출한다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 버섯 미분쇄 분말에 가해지는 추출용매로 물; 메탄올， 에탄을， 부탄올, 핵산 및 에틸아세테이트 등의 유기용매; 또는 상기 유기용매와 물과의 흔합용매를 사용할 수 있다. 일특정예에 따르면, 상기 추출용매는 물이다. 상기 추출용매의 적합한 양은 버섯 미분쇄 분말 중량의 1-50 배이며， 일특정예에서는 1-40 배이고， 다른 특정예에서는 1-35배이다. β-글루칸을 분리하는 제 3공정
본 발명의 제 3 공정은 상기 제 2 공정을 통하여 수득한 β-글루칸- 함유 추출물 (추출용액)로부터 β-글루칸을 분리하는 단계이다.
본 발명에서 β-글루칸의 분리는 (0 상기 β-글루칸 -함유 추출물을 추출용매에 함유되어 있는 버섯 미분쇄 분말로부터 분리하는 것， 및 (Π) 분리된 β-글루칸 -함유 추출물을 추가 정제하여 추출물로부터 β-글루칸을 분리하는 것을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 β-글루칸의 분리는 제 2 공정에서 수득한 열추출물을 원심분리 하여 상층액을 분리하는 단계; 상기 상층액에 알코을류를 가하여 β-글루칸 침전물을 얻는 단계; 및 상기 침전물을 분리하는 단계를 포함한다. 일특정예에 따르면， 상기 알코을류는 에탄올 또는 주정이다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 분리된 침전물을 건조처리하고, 분쇄 및 균질화하여 분말상의 β-글루칸을 제조할 수 있다. 상기 건조처리는 상온상압건조， 열풍건조 감압건조， 동결건조， 분무건조 또는 회전식 증발건조방법을 사용하여 실시할 수 있다.
하기 실시예에서 증명된 바와 같이， 본 발명은 버섯을 미립자화 하여 미세한 분말로 제조하고， 여기에 추출용매를 가한 후 초음파 추출 및 열추출 하는 일련의 공정을 통하여 종래의 알칼리 또는 효소처리 추출방법 보다 β-글루칸의 추출 수율을 현저히 향상시켰다 (표 2 참조). 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(0 본 발명은 버섯으로부터 β-글루칸을 제조하는 방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 1 차 조분쇄 단계 및 2 차 미분쇄 단계를 통하여 미립자화 된 버섯 분말을 제조하고， 이를 초음파 추출 및 열추출 하는 일련을 공정을 통하여 높은 수율로 β-글루칸을 제조할 수 있어 경제적이며, 기존의 알칼리 처리 추출 공정의 문제점인 알칼리 중화공정 및 이로 인한 환경오염의 문제 또한 해소할 수 있다.
(iii) 본 발명은 β-글루칸의 제조에 유용하게 사용될 수 있고, 제조된 β-글루칸은 의약품, 화장품, 건강기능식품 및 식품의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 본 발명의 실시예에서 수행한 여러 β-글루칸 추출 공정의 모식도이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상와지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
1. 실험재료
실험에 사용된 시료는 (주) 하나바이오텍에서 구입하였다. 꽃송이버섯의 분쇄 효율을 높이기 위하여 열풍건조기를 이용하여 35T에서 24 시간 동안 건조하였다. 건조된 꽃송이버섯은 수분측정기 MB45(0haus, 스위스)를 이용하여 수분함량을 측정하였다. 건조한 꽃송이버섯을 핀밀 (Pin mill, 경창기계， 한국)로 조분쇄한 후 유동화 제트밀 (fluidized bed opposed jet mill, Model 100-AFG, Alpine, 독일)을 이용하여 ACWS(air classifying wheel speed) 8000 rpm 조건에서 분쇄하였다. 미립자화 된 꽃송이 분쇄물은 공기 분급 시스템 (air classifying system, Model 50 ATP, Alpine, 독일)을 이용하여 ACTS 를 10,000-14,000 rpm 의 조건에서 분급하였다. 2. 입도별 꽃송이버섯 분쇄물로부터 βᅳ글루칸추출
β-글루칸 추출 공정은 도 1 에 나타내었다. 입도별 꽃송이버섯 분쇄물을 20g정량하여 증류수 600 (버섯 분쇄물의 30 배)을 가한 후 5분 동안 교반 (Magnetic Stirrer C-MAG HS7, IKA, 독일)하였다. 알칼리 처리구는 증류수 대신 알칼리 용액 (1M NaOH) 600 ^을 가하여 교반하였으며， 교반한 버섯 용액을 고압증기멸균기 (Autoclave DS-60, 도성과학, 한국)를 이용하여 고온고압추출 (121°C, 2 시간)을 시행한 후 2M 아세트산으로 중화 (pH 7.0)하였다.
대조구로서 비처리구는 알칼리， 초음파 및 효소 처리를 하지 않고 오로지 교반후 고온고압추출 (121°C, 2시간)을 시행하였다.
초음파 처리구는 교반한 용액을 초음파기기 (See— Sonic Π， Ul tech)를 이용하여 120 watt 전력으로 30 초 간격으로 초음파 처리와 비처리를 반복하여 80 분 동안 초음파처리한 후 고온고압추출 (121°C, 2 시간)을 시행하였다.
효소 처리구는 고온고압추출 후 pH 를 5.0 으로 조절한 후 샐를라아제 (C8546, Sigma, 최적조건: pH 5.0, 37 °C) 8.3 mg(50 unit, 버섯 시료 g 당 5 unit)을 가하고， 진탕 배양기에서 37°C 및 120 rpm 조건으로 30분 동안 진탕하여 반응시켰다.
각 비처리， 알칼리처리， 효소처리 및 초음파처리 공정에 따라 추출된 버섯 용액을 8000g 속도에서 10 분간 원심분리 (J2— 21M/E Centrifuge, BECKMAN, 미국)하여 상층액을 취하였다. 상층액에 3 배 용량의 에탄올을 가하여 12 시간 동안 상온 (20-40°C)에서 침전시켰다. 침전시킨 에탄올 용액을 초음파분쇄기 (Ultra-Turrax T25, IKA Labortechnik, 득일)로 3 분간 분쇄한 후 8000g 속도에서 15 분간 원심분리 (centrifuge 5810R, Eppendorf, 독일)하였다. 원심분리 한 상층액을 제거하고 조 -글루칸 (crude β- glucan) 침전물을 취하여 55°C에서 48시간 동안 건조하였다. 건조된 조 β- 글루칸 침전물의 중량을 측정하고 분쇄하여 균질화시킨 후 분말 상태의 조 β—글루칸을 얻었다.
3. 2： β-글루칸분말의 β-글루칸 함량 (% w/w) 측정
Mushroom and Yeast β -glucan 키트 (Megazyme, 아일랜드)를 사용하여 전체 글루칸과 글루칸 이외의 당 함량을 구한 후， α-글루칸과 글루칸 이외의 당 함량 차이로 β-글루칸 함량 (¾> w/w)을 측정하였다. 조 β-글루칸 분말 시료에 37% 염산을 첨가하여 100°C에서 2 시간 동안 가수분해 시킨 후 2N K0H 를 이용하여 pH 를 조정하였다. 가수 분해액을 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 (pH 5.0)로 회석한 후 원심분리 하였다. 상층액 100 峰 취하여 액소 1, 3- β-글루카나아제와 β—글루코시다제를 첨가하여 1 시간 동안 40°C에서 반웅시켰다. 그 후 글루코스 확인 시약 (glucose determination reagent)을 첨가하여 20 분 동안 40°C에서 반응시킨 후 510 i 에서 흡광도를 측정 (UV/VIS Spectrophtometer V-530, JASC0, 일본)하여 전체 글루칸과 글루칸 이외의 당 함량을 분석하였다.
α-글루칸과 글루칸 이외의 당 함량은 시료에 2 M K0H 2 ^를 넣고 얼음이 채워진 용기에 고정시켜 교반기 (Magnetic Stirrer C-MAG HS7, IKA Labortechnik, 독일)로 20 분간 교반하였다. 1.2M 아세트산나트륨 버퍼 (pH 3.8) 8 ^를 첨가하고 아밀로글루코시다아제 (amyloglucosidase)와 인베르타아제 (invertase) 200 ^를 넣어 40°C 워터 배스 (Water bath C-WBE, Chang Shin Science Co.)에서 30 분간 반웅시킨 후 원심분리 (1500g, 10 분)하였다. 원심분리 한 상층액 100 ^을 취하여 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 (pH 5.0) 100 ^와 글루코스 확인 시약 3 ^을 넣어 40°C에서 20 분간 반응시킨 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
전체 글루칸， α-글루칸 및 β-글루칸의 함량은 하기의 수학식에 의하여 산출하였다.
[수학식]
전체 글루칸 (% w/w) = ΔΕ X F/ X 90
α-글루칸 (% w/w) = ΔΕ x F/W x 9.27
β-글루칸 = 전체 글루칸 - α-글루칸
상기 수학식에서,
ΔΕ = eact ion absorbance - blank absorbance
F - 100 I G0P0D reagent absorbance for 100 μ g of D-glucose standard
W = weight of sample
4. 통계처리
실험결과는 SPSSCStatistical Package for Social Science Version' 18.0) 통계 프로그램을 이용하여 각 실험군의 평균 士 표준편차로 표시하였고, 일원배치분산분석으로 비교하였으며, 던컨의 다중검정 (Duncan's multiple range test)으로 각 실험군 간에 유의성을 ^<0.05수준에서 검정하였다. 실험결과
1. 미립자화 된 꽃송이버섯 분말의 입도
꽃송이버섯 시료를 분쇄하기 전 수분을 건조하여 분쇄 효율을 높이도록 하였고, 건조 전후의 수분함량은 건조 전 9.15%, 건조 후 7.21%였다. 미립자화 하기 전 핀밀로 조분쇄한 꽃송이버섯 분말의 평균입도는 73.53 卿였고, 조분쇄 분말을 제트밀로 미립자화한 분말의 평균입도는 15.7 / 이었다. 제트밀로 미립자화 된 꽃송이버섯 분말을 다시 회전 속도별 (10,000 rpm, 12,000 rpm 및 14,000 rpm)로 공기 분급한 분말의 입도는 10000 rpm Coarse 분획 (16.91 ) , 12000 rpm Coarse 분획 (16.23 jum), 10000 rpm Fine 분획 (10.75 ^m), 12000 rpm Fine 분획 (1().69 rn) 및 14000 rpm 분획 (9.17 im) 순서로 평균 입도가 작았다 (표 1).
【표 1】
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
2. 조건별 β-글루칸추출효과
표 2 에 나타난 바와 같이， 각 처리 조건 별 β-글루칸 수을은 0.43%부터 최대 11.38%까지 다양하게 나타났으며， 단순 분쇄한 경우보다 제트밀로 미분쇄한 경우 수율이 크게 증대되었다. 각 추출 및 시료 처리 조건별 꽃송이버섯 분쇄물에서 추출된 건조 조 β-글루칸의 수율을 비교한 결과， 제트밀로 미분쇄한 경우 7.9%로 나타나 기존의 알칼리 및 효소 처리한 경우 4.8%보다 65% 정도 수율이 증가하였으며， 초음파 처리를 병행한 경우에는 8.33%까지 증가하여 수율이 74%까지 증가하는 효과를 나타내었다. 따라서， 제트밀과 초음파 처리를 통한 β-글루칸 추출 시 기존의 알칼리 처리 공정을 대체하여 공정을 단순화할 수 있으며, 알칼리 중화공정을 생략하여 환경오염을 크게 즐일 수 있는 장점이 있다.
또한， 제트밀 처리한 경우 입도에 따라 입도가 작을수록 β-글루칸 수을이 높아지는 것을 알 수 있었다. 알칼리 처리의 경우 추출되는 조 β- 글루칸의 평균 중량은 다른 처리구에 비하여 월등히 높으나， 키트로 정량한 순수한 β—글루칸의 양은 작은 것으로 나타났으며, 이를 통하여 증가된 양은 β-글루칸이 아닌 알칼리 중화 시 형성된 염으로 추정되었다. 따라서， 알칼리 처리 추출방법은 추후 순수한 β-글루칸의 제조를 위하여 추가적인 염 제거 공정을 거쳐야하는 문제가 있다.
【표 2】
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
상기 표의 약어를 설명하면 다음과 같다:
Pin-ΝΟ: 핀밀 조분쇄불 비처리구,
Pin-EN: 핀밀 조분쇄물효소 처리구,
Pin-AL: 핀밀 조분쇄물 알칼리 처리구，
Pin-ALEN: 핀밀 조분쇄물 알칼리 및 효소 처리구，
Pin-UL: 핀밀 조분쇄물 초음파 처리구,
Jet-ΝΟ: 제트밀 미분쇄물 비처리구,
Jet-UL: 제트밀 미분쇄물 초음파 처리구,
1000F-UL: 1000 rpm Fine분쇄물 초음파 처리구， 1000C-UL: 1000 rpm Coarse분쇄물 초음파 처리구,
12000F-UL: 12000 rpm Fine분쇄물 초음파 처리구，
12000C-UL: 12000 rpm Coarse분쇄물 초음파 처리구，
14000B-UL: 14000 rpm Back filter-mill 분쇄물 초음파 처리구이며; 모든 데이터는 평균 士 표준편차로 표시되었으며;
다른 위첨자를 갖는 값들은 일원분산분석 (one way AN0VA)과 던컨의 다중검정으로 평가된 것으로 유의성 있게 다름을 의미한다 (/7<0.05). 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 버섯으로부터 β-글루칸을 제조하는 방법:
(a) 버섯을 분쇄기로 1 차 분쇄하여 평균 입도 50-100 μιτι 의 조분쇄 분말올 얻는 단계;
(b) 단계 (a)의 조분쇄 분말을 2 차 분쇄하여 평균 입도 1-20 ym 의 미분쇄 분말을 얻는 단계 ;
(c) 단계 (b)의 미분쇄 분말에 용매를 가하고 초음파 처리하여 초음파 추출하는 단계；
(d) 단계 (c)의 추출물에 100-160°C의 열을 가하여 열추출 하는 단계 ; 및
(e) 단계 (d)에서 수득한 열추출물에서 β-글루칸을 분리하는단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 버섯은 꽃송이버섯， 상황버섯， 차신고버섯， 치마버섯, 영지버섯， 차가버섯， 표고버섯 및 잎새버섯으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 버섯은 건조처리 되어 수분함량이 1-8¾ (v/w)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 단계 (a)의 조분쇄 분말을 분쇄기로 분쇄하여 얻은 미립자화 된 분말을 공기분급기 (air classifier)로 분급하여 평균 입도 1-13 urn 의 미분쇄 분말을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 공기분급기는 공기분급 휠 속도 (air classifying wheel speed) 7,000-20,000 rpm 의 조건으로 운행되는 것을 특징으로 하는 제조방법 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 1 차 분쇄는 핀밀, 볼밀， 임팩트밀， 에지 러너밀, 롤러밀， 진동볼밀， 원추분쇄기， 해머밀 또는 콜로이드밀을 사용하여 수행하고， 상기 2 차 분쇄는 제트밀 또는 디스크밀을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)의 β-글루칸의 분리는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
(e-1) 단계 (d)에서 수득한 열추출물을 원심분리하여 상층액을 분리하는 단계;
(e-2) 상기 상층액에 알코을류를 가하여 β-글루칸 침전물을 얻는 단계; 및
(e-3) 상기 침전물을 분리하는 단계 .
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