KR102316958B1

KR102316958B1 - 담자균류균사의 액상배양공정에 의한 천문동 및 대두배아의 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102316958B1
Application number: KR1020190148422A
Authority: KR
Inventors: 김제경; 김민지; 장용만; 김수동
Original assignee: (주)큐젠바이오텍
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2021-10-26
Also published as: KR20210060885A

Abstract

본 발명은 담자균류균사의 액상배양공정에 의한 천문동 및 대두배아의 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 생물전환산물을 유효 성분으로 포함하는 피부보습, 아토피 증상 개선, 피부장벽 강화, 피부재생 또는 상처치유용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

담자균류균사의 액상배양공정에 의한 천문동 및 대두배아의 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING BIOCONVERSION PRODUCTS OF ASPARAGUS COCHINCHINENSIS AND SOYBEAN EMBRYOAS BY LIQUID CULTIVATION OF BASIDIOMYCETES MYCELIUM}

치마버섯(Schizophyllum commune)은 싱어(Singer, R.)의 분류서(The Agaricales in modern taxonomy,1975)에 의하면 분류학상으로 담자균류의 주름버섯목 송이과 치마버섯속에 속하는 균으로, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 (β-1,6- branched-β-1,3-glucan)을 세포외로 생산하는 균주이다. 치마버섯은 야생에서 채취할 수 있으며, 다음과 같은 형태학적 특성이나 분류학적 지표에 의해 확인할 수 있다. 치마버섯의 자실체는 대가 없으며 갓의 측면이 기질에 부착하고 크기가 보통 1.0 내지 3.0cm이며, 모양은 부채형 또는 조개형이며 종으로 주름이 있고 말단은 불규칙하게 갈라지고 미세한 털이 덮혀 있다. 주름살은 백색이지만 성숙하게 되면 담회색 또는 담자갈색을 띠며, 조직은 건조한 경우 수축하고 수분을 흡수하면 회복된다. 포자문은 백색이고 포자는 4~6 X 1.5~2㎛ 크기의 원추형으로 평활하며 흰색을 띠고 있다. 치마버섯(Schizophyllum commune Fr.)은 고목 등에 자생하는 각질의 버섯으로 더 상세한 섭생 및 모양은 한국버섯도감 및 싱어(Singer)의 분류서에 상세히 기재되어 있다.

치마버섯은 거친 식감으로 인해 중국에서만 일부 식용하는 것으로 알려져 있었으나, 본 버섯에 존재하는 β-1,6-분지-β-1,3-글루칸 구조의 '시조필란(Schizophyllan)'이라는 다당체의 생리활성 즉 보습 효과, 항-종양 활성, 마크로파지 자극, 항생(anti-biotic) 활성 등의 면역학적 효과(Shimizu et al. 1992; Komatsu et al. 1973) 등이 알려지면서 이를 이용하여 약품, 화장품 등의 유효기능성분으로서 다양하게 활용되고 있다. 치마버섯으로부터 유래된 시조필란(schizophyllan)은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸이다. 표고버섯(Lentinus edodes), 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 상황버섯(Phellinus linteus) 등의 다른 버섯류로부터 생산된 β-글루칸의 분자량이 수십만 ~ 200만인데 비해 치마 버섯 유래 시조필란(schizophyllan)의 분자량은 200만 ~ 500만으로 상당히 크며, 다른 버섯류의 β-글루칸이 불균일한 당 조성과 구조를 갖는데 비하여 분지된 균일하고 특유한 구조를 갖고 있으며, 세포외로 분비되는 안정한 중성 다당류의 특성을 갖고 있다 [참조: Kenichi T., Saimei T. Synthesis of the repeating units of Schizophyllan. 1986].

치마버섯에서 유래한 다당류인 베타 글루칸의 기능이 알려지면서 순수 분리정제에 대해 다양한 접근방법이 시도되고 있다. 치마버섯 유래의 베타 글루칸을 얻기 위한 방법으로 버섯 자실체는 배양 기간이 매우 길며 배양방법에 따라 조성이 균일하지 않을 가능성이 있으며, 고형 배지에 의한 균사체 배양 또한 배양기간이 길고, 균일하게 이루어지지 않으며, 베타 글루칸을 추출할 때 배지성분에 의한 추출의 영향을 배제할 수가 없다. 이에 따라 치마버섯의 생리활성 성분인 베타 글루칸을 단기간에 대량으로 얻기 위한 방법으로 자실체로부터 얻은 균사체를 액체 배양하는 것이다. 버섯균사체를 이용해서 순수한 고농도 베타 글루칸을 효율적으로 얻기 위한 방법으로는 액체 배양에 의한 생성량 증대가 많이 연구되어 왔으며, 특히 세포 외로 생성되는 베타 글루칸에 대한 연구가 상황버섯, 영지 등을 대상으로 활발히 진행되어 왔다.

한편, 천문동(Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.)은 한국, 중국, 일본에서 분포하는 백합과(Liliaceae) 식물로서, 예로부터 건근(덩이뿌리)을 식용 및 약용으로 널리 사용되었으며, 항염증, 이뇨작용, 진해제, 항균, 신경안정, 타액 분비 촉진, 해열 등 다양한 약리작용이 알려져 있다.

이에 따라 진정제 및 안정제와 같은 부가적인 효과와 함께 간염, 피부염, 천식, 당뇨, 뇌질환과 관련된 염증 질환의 치료에 이용되어 왔다. 19종의 아미노산과 다당류(polysaccharides) 뿐만 아니라 20종의 다기능성 화합물(β-sitosterol, daucosterol, n-ethatriacontanoic acid, palmitic acid, 9-heptacosylene, smilagenin, diosgenin, sarsasapogenin-3-O-β-D-glucoside feeding grapes imidacloprid, 5-methoxy methylfurfural, yame sapogenin, diosgenin-3-O-β-D imidacloprid feeding glucose glycosides, aspacochioside D, iso-agatharesinoside 및 seven steroidal saponins)을 함유한다. 또한 apoptosis를 저해하고, rat의 피부로 유도된 염증을 억제하는 효과가 확인되었고, 뼈의 대사와 관련하여 조골세포의 분화를 촉진하고 파골세포 생성을 억제효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

[천문동의 영양성분]

대두(Soybean)는 단백질과 지방이 풍부하고, 필수 아미노산인 라이신을 많이 함유하고 있다. 단백질 20~45%, 지방질 18~22%, 탄수화물 22~29%, 회분 4.5~5%이며, 필수 아미노산인 라이신, 시스틴, 트립토판, 글루타민산 등을 함유하며, 그 중에서도 대두배아(Soybean Embryo)에 가장 많은 이소플라본이 함유(2%)되어 있다. 또한 대두에는 사포닌(saponin)이 많이 함유되어 있어 체내에서의 과산화지질 생성을 방지하고 지질대사에 관여하여 노화, 비만방지에 효과적이며, 대두에 포함된 사포닌은 총 5종(Soyasaponin Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, A₁, A₂)으로 구성되어 있다.

본 발명에서는 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 효율적인 생물전환공정(미생물발효전환)을 통하여 수득된 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

미생물 발효전환과 같은 바이오테크놀로지(biotechnology)를 응용하여 만들어진 물질을 주성분으로 함유한 바이오화장품은 화학기술을 이용해 인공적으로 합성하는 기존의 화장품과는 달리 자연 상태에서 기인한 유기물을 활용하여 피부에 보다 안전하다고 여겨진다. 넓은 의미로 천연재료를 함유한 화장품과 혼용하여 사용되는 경우가 있으나, 미생물 발효·세포융합·대량복제 기술 등을 사용하여 유효성분을 대량 생산하고 안전성과 효능을 높인다는 점에서 차별성이 있다.

한편, 아토피 피부염은 최근 20∼30년간 현저히 증가하며, 유전적, 환경적, 면역학적 원인과 각질층 내 세라마이드 함량의 감소, 화농균 감염(S. aureus) 등의 1차적인 원인과 피부 장벽(skin barrier) 붕괴, 피부 건조 및 가려움증, 피부 상처 및 염증발생들의 2차적인 원인으로 발생한다. 기존의 치료제로 많이 사용되었던 화학적 스테로이드 연고제의 부작용이 심각하며, 아토피 피부염에 있어서 손상된 피부 장벽(skin barrier)의 복원 및 강화가 필수적인 바, 항균성, 피부면역, 보습성 및 항염증 효과를 포함한 피부친화적인 소재 및 제품의 개발 필요성이 있다.

대한민국 공개특허 제10-2003-0042526호

본 발명은 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 담자균류균사의 액상배양공정 (생물전환공정(미생물발효전환))을 통하여 수득된 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 피부보습용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 담자균류 균사를 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 아토피 증상 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 담자균류 균사를 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 담자균류 균사를 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치유용 화장료 조성물을 제공한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 담자균류균사를 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효 성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 천문동 및 대두배아는 분말 형태로 사용될 수 있다.

상기 담자균류균사는 액상배지에서 배양된 것일 수 있다.

상기 담자균류균사는 정치용 액상 배지에서 5 ~ 7일간 배양 후, 1~3일간 진탕배양하여 수득된 것일 수 있다.

상기 배양배지는 글루코스, 천문동, 대두배아, 질산나트륨, 인산칼륨 및 황산마그네슘을 포함할 수 있다.

상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함할 수 있다.

상기 배양은 담자균류균사 5 ~ 15 %(v/v)를 접종하여 수행할 수 있다.

상기 배양은 25~ 35 ℃에서 3 ~ 5일간 진탕배양하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 담자균류균사는 치마버섯, 상황버섯, 차가버섯, 표고버섯, 잎새버섯, 목이버섯 및 눈꽃송이버섯으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 생물전환산물은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 포함할 수 있다.

상기 생물전환산물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.

또한 본 발명은, 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 담자균류 균사를 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 아토피 증상 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 천문동과 대두배아를 기질로 한 담자균류균사의 액상배양공정을 이용한 생물전환공정을 통하여 수득한 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 특히 본 발명은 상기 생물전환산물을 포함하는 피부보습 (유지/개선), 아토피 증상 개선, 피부장벽 강화, 피부재생 및 상처치유용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 FFD의 회기분석 결과에서 배지성분들이 베타글루칸 생산성 (EPS 값으로 측정)에 미치는 영향과 교호인자의 효과를 나타낸 교호관계 그래프이다(A:대두배아, B:천문동, C:NaNO₃, D: KH₂PO₄).
도 2는 RSM(Response Surface Method) 트라이얼 수(Trial number)에 따른 DCW, EPS, Final pH, Yp/x 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 RSM 실험을 위한 중심합성계획법에 따른 배지요인들이 생산성에 미치는 효과를 3차원 그래프로 도식화 한 것 배지에 따른 영향과 교호작용을 베타글루칸 생산 관점에서 분석한 그래프이다.
도 4는 OFAT(One Factor At a Time) 방법에 따라 천문동 증가에 따른 배지간의 상호작용과 베타글루칸 생산성을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 OFAT(One Factor At a Time) 방법에 따라, 천문동 증가에 따른 총 플라보노이드의 함량 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 5L 배양기에서 수행되는 천문동/대두배아 생물(발효)전환 공정을 나타내는 것이다.
도 7은 천문동 열수추출물(A) 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물(B), 천문동/대두배아가 첨가되지 않은 발효배양물(C), 대조군(D)의 항균 효과를 분석한 디스크 어세이(Disc assay) 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 한 생물전환공정(미생물발효전환)전후의 아미노산 함량 비교결과를 나타내는 것이다(위에서부터 순서대로 아미노산 대조군, 천문동 열수추출물, 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물).
도 9는 천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 콜라겐 합성량 및 합성능을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 필라그린 (filaggrin) mRNA 발현량을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 11은 천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 아쿠아포린 3 (aquaporin 3 mRNA) 발현량을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 12는 천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 항산화 효과 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 13은 천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 항주름 효과 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 14는 천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 항염 효과 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 15는 천문동/대두배아 생물전환산물의 피부 수분 개선 효과를 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 16은 천문동/대두배아 생물전환산물에 의한 피부 수분 변화율을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 17은 천문동/대두배아 생물전환산물의 라만 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 18은 천문동/대두배아 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물의 피부 수분 개선 효과를 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 19는 천문동/대두배아 생물전환산물을 포함하는 화장료 조성물에 의한 피부 수분 변화율을 분석한 결과를 나타내는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.

본 발명은 천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 담자균류균사를 접종하여 배양한 배양물로부터 수득된 천문동 및 대두 배아의 생물전환산물(또는 발효전환산물)을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에서 생물전환산물과 발효전환산물은 동일한 의미로 사용된다.

상기 조성물은 피부보습 (유지/개선), 아토피 증상 개선, 피부장벽 강화, 피부재생 및 상처치유용 화장료 조성물로 적용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서 상기 생물전환산물의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 생물전환산물이 화장료 조성물 내에 0.0001 중량% 미만인 경우에는 그 용량이 소량이어서 기대하는 효과가 없을 수 있으며, 20 중량%를 초과하는 경우 효과의 변화가 미미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "화장료 조성물"은 상기 화합물을 포함하는 조성물로서 그 제형은 어떠한 형태라도 가능하다. 이러한 제형의 예를 들면 상기 조성물을 이용하여 제조된 화장료는 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징 크림과 같은 크림류, 팩류, 영양로션과 같은 로션류, 에센스류, 유연화장수, 영양 화장수와 같은 화장수류, 파우더류, 파운데이션류 및 메이크업 베이스류 등이고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 이러한 제형 중 어떠한 형태로도 제조되어 상용화될 수 있으며, 상기 예들에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 통상의 화장료 제조 방법으로 제형화할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 화장료는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 각질제거제, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분(생물전환산물)에 더하여 부형제, 담체 등 기타 첨가제를 포함할 수 있으며, 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 경피 침투 강화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, 경피 침투 강화제란 피부의 혈관세포 내로 원하는 성분이 높은 흡수율로 침투할 수 있게 해주는 조성물이다. 바람직하게는 레시틴 화장품에 사용되는 다른 인지질 성분, 리포좀 성분 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.

또한, 유상 성분으로서 주로 사용될 수 있는 오일로는 식물성 오일, 광물성 오일, 실리콘유 및 합성유 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 미네랄오일, 사이크로메치콘, 스쿠알란, 옥틸도데실 미리스테이트, 올리브 오일, 비티스 비니페라 씨드 오일, 마카다미아너트오일, 글리세릴옥타노에이트, 캐스터 오일, 에칠헥실 이소노나노에이트, 디메치콘, 사이크로펜타실록산 및 선플라워 씨드 오일 등을 사용할 수 있다.

또한, 유화 능력을 보강하기 위하여 계면활성제, 고급 알콜 등을 0.1 내지 5 중량% 첨가할 수 있다. 이러한 계면 활성제로는 비이온 계면활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 인지질 등과 같은 통상적인 계면활성제를 사용할 수 있으며, 구체적으로, 소르비탄세스퀴놀리에이트, 폴리솔베이트 60, 글리세릴 스테아레이트, 친유형 글리세릴스테아레이트, 소르비탄 올리에이트, 소르비탄 스테아레이트, 디이에이-세틸포스페이트, 소르비탄스테아레이트/슈크로스코코에이트, 글리세릴스테아레이트/폴리에틸렌글라이콜-100 스테아레이트, 세테아레스-6 올리베이트, 아라키딜알코올/베헤닐알코올/아라키딜 글루코사이드, 폴리프로필렌글라이콜-26-부테스-26/폴리에틸렌글라이콜-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 등을 사용할 수 있다. 고급 알콜로는 탄소수가 12 내지 20인 알코올, 예컨대 세틸알코올, 스테아릴 알코올, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴 알코올 등을 단독으로 또는 1종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.

수상 성분은 수상의 점도 또는 경도를 조절하기 위하여 카보머, 잔탄검, 벤토나이트, 마그네슘알루미늄실리케이트, 셀룰로오스검, 덱스트린 팔미테이트 등과 같은 1종 이상의 점증제를 0.001 내지 5 중량% 더 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 필요에 따라 고급 지방산, 비타민 등의 약효 성분과 자외선 차단제, 산화 방지제(부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산, 토코페릴아세테이드, 부틸레이티드하이드록시톨루엔 등), 방부제(메칠파라벤, 부틸파라벤, 프로필파라벤, 페녹시에탄올, 이미다졸리디닐우레아, 클로르페네신 등), 착색제, pH 조절제(트리에탄올아민, 씨트릭애씨드, 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등), 보습제(글리세린, 솔비톨, 프로필렌 글라이콜, 부틸렌 글라이콜, 헥실렌 글라이콜, 디글리세린, 베타인, 글리세레스-26, 메칠글루세스-20 등), 윤활제 등의 성분을 더 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부에 필수 영양소를 보조적으로 제공할 수 있는 물질을 추가로 포함하는데, 바람직하게는 천연향, 화장품향, 또는 한약재가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명은 다양한 효능을 지닌 천연원료인 천문동과 대두배아를 배양 기질로 효율적인 생물전환공정 (또는 발효전환공정)을 개발하고 천문동과 대두배아의 효능성분과 치마버섯(Schizophyllum commune)이 생산하는 β-글루칸(β-glucan)의 생산성을 극대화한 복합기능성 소재인 생물(발효)전환산물을 제조하여 화장료 조성물에 적용하였다.

본 발명에 따른 생물전환공정 (또는 발효전환공정)은, 천문동과 대두배아의 효능성분과 담자균류균사가 생산하는 β-글루칸(glucan)의 생산성을 극대화할 있다. 더욱 구체적으로 미생물(Schizophyllum commune)의 생리적 기능을 이용해 물질의 화학적인 변화를 이루는 생물전환시스템을 통해 한방 천연물(천문동 및 대두배아)에 함유된 효능 물질의 독성 완화 및 효능을 개선하는 동시에 생물배양공정을 통해 대사산물을 조절함으로써 미생물이 생산하는 유효성분인 베타글루칸을 고생산할 수 있다는 점에서 장점이 있다.

본 발명에서 사용되는 치마버섯(Schizophyllum commune)은 담자균으로 독성이 전혀 없으며 세포외 바이오폴리머(extracellular biopolymer)인 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸(schizophyllan)을 생산한다. 치마버섯 유래 베타글루칸인 시조필란(schizophyllan)은 비이온성 수용성 다당체로서 평균분자량 2~5 X 10⁶ Da이며 항암능력, 항생력, 성장인자 촉진, 보습력, 콜라겐 생성 촉진, 면역강화 기능이 있다. 시조필란(Schizophyllan) 화학구조는 다음과 같다.

치마버섯은 의약품산업(면역조절제, 항암제, 약품전달물질, 피부염/상처 치료제 등), 화장품산업(보습제, 연화제, 경화제 등) 또는 사료산업(면역강화용 동물사료첨가제 등) 등에 적용될 수 있다.

본 발명에서는 천문동과 대두배아의 효능성분과 β-글루칸(glucan)을 고효율로 생산할 수 있는 생물(미생물발효)전환 배지를 통계학적 방법 및 다양한 조합 실험을 통해 개발하였다.

본 발명의 일 실시예에 따라 최종 개발된 생물전환공정의 경우, 천문동과 대두배아가 첨가되어 있지 않은 대조군(control) 조건에 비해 2~3배 높은 약 20g/L의 베타글루칸 생산성을 보였으며, 단위 세포당 생산성을 나타내는 Yp/x 역시 5배 이상 증가하였다.

동일 농도의 천문동 열수추출물에 비해 총 아미노산 함량은 약1.5배, 16종의 아미노산 중 티로신(Tyrosine) 알라닌(Alanine) 트레오닌(Threonine)은 약 1.3~1.7배, 류신(Leucine) 페닐알라닌(Phenylalanine) 글리신(Glycine)은 대략 2.6~3배 증가하였으며, 특히 메티오닌(Methionine)의 경우 10배로 다른 아미노산에 비해 높은 증가율 보였으며, 총 플라보노이드 함량 또한 눈에 띄게 증가한 것을 확인하였다.

필수아미노산을 축으로 한 이러한 아미노산 함량의 증가는 면역력을 비롯한 모발이나 피부 등의 건강상태 개선뿐만 아니라, 비만이나 알츠하이머 같은 특정 질병 치료에 도움이 되는 기능성 소재로써의 가능성을 확인해주는 결과라 할 수 있다.

따라서 본 발명에 따라 제조된 생물(발효)전환 산물은 식품 및 화장품 뿐 아니라 의약외품 및 의약품의 기능성소재로의 적용이 가능하다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는, 글루코스 69.6 g/ℓ, 천문동 건조분말 77 g/ℓ, 대두배아 건조분말 1.5 g/ℓ, 질산나트륨20 g/L, 인산칼륨 15g/ℓ 및 황산마그네슘 2 g/ℓ를 포함하는 생물(발효)전환용 배양배지를 제공할 수 있다.

<실시예> 생물(발효)전화공정을 위한 치마버섯 균사체 액상배양법

(1) 천문동 및 대두배아의 원재료 준비단계

세척 및 절단 작업을 마친 원재료 각각은 대량건조가 가능한 열풍건조기에서 건조 작업을 수행한 후 조분쇄 및 미분쇄 공정을 거쳐 각각의 천연물 원재료의 분말화 작업을 하여 준비한다.

(2) 발효전환을 위한 치마버섯 균사체 종균배양 단계

한천 배지(감자전분 4g 포도당 20g, 한천 15g, 증류수 1ℓ)에서 성장한 균사체(큐젠바이오텍에서 개발한 베타글루칸 고생산균주인 Schizophyllum commune QG143-1의 균사체를 이용)를 무균적으로 수거한 후, 이를 정치용 액상 배지(감자전분 4g, 포도당 20g) 28 ℃에서 6일간 배양하였다. 이렇게 배양한 균체를 다시 무균적으로 수거하여 동일 성분의 성장배지에 10%(v/v)가 되게 접종한 후 150rpm으로 교반하여 28 ℃에서 2일간 진탕배양하여 발효전환공정의 종균으로 사용하였다.

생물(발효)전환공정을 위한 본 배양은 종균 10 %(v/v)를 접종하여 28˚C에서 150rpm 4일간 진탕 배양하였다.

(3) 천문동 및 대두배아의 생물(발효)전환공정 개발 단계

생물(발효)전환을 위한 치마버섯 배양배지를 최적화하고자 천문동 및 대두배아를 첨가하여 통계학적인 방법을 바탕으로 최적화조건을 결정하였다. 이를 위해 OFAT(One Factor At a Time) 방법과 Plackett-Burman design에 의한 배지성분 최적화 그리고 완전요지배치법(Full Factorial design,FFD)과 반응표면분석법(Response surface method,RSM)에 의한 배지농도 최적화를 수행하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 OFAT(One Factor At a Time) 방법과 Plackett-Burman 디자인(design) 등을 통하여 천문동과 대두배아의 생물(발효)전환 공정에 필요한 나머지 배양배지 성분인 탄소원(글루코스)과 질소원(질산나트륨) 그리고 무기염류(인산칼륨, 황산마그네슘)를 경제성과 생산성을 고려하여 선택하였다. 이후, 통계적 배지 최적화 방법인 완전 요인 배치법(full factorial design, FFD)과 반응표면분석법(response surface method, RSM)을 통하여 치마버섯을 이용한 천문동/대두배아 발효전환산물의 유효성을 높이는 동시에 약용버섯의 유효성분인 베타글루칸을 고생산할 수 있는 최적의 배지농도를 다음과 같이 결정하였다: 글루코스 69.6g/ℓ, 천문동 건조분말 77 g/ℓ, 대두배아 건조분말 1.5 g/ℓ, 질산나트륨20g/L, 인산칼륨 15g/ℓ 및 황산마그네슘 2 g/ℓ.

1. 생물(발효)전환공정을 위한 치마버섯 배양배지 성분조사

천문동/대두배아 발효전환산물의 생산배지 최적화를 위하여 탄소원 4종(Glucose, Maltose, Sucrose, Lactose), 질소원 5종(대두배아, Yeast extract, Soytone, 천문동, NaNO3), 무기염류 2종(KH₂PO₄, MgSO₄)을 포함한 총 12가지의 배지성분의 PBD(Plackett-Burman Design) 실험을 통해 EPS(베타글루칸 생산성), Yp/x, 총 플라보노이드(total flavonoid) 값에 긍정적인 영향을 주는 배지성분을 확인하였으며, 또한 OFAT(One Factor At a Time)방법에 의한 조합 실험을 수행하여 대량생산을 위한 산업용 저가배지에 적절한 배지조합을 확인하였다. 이들 결과를 바탕으로 경제성이 있는 저가 원료인 글루코스(glucose)를 탄소원으로 하여 통계학적 실험방법에 하나인 FFD(Full Factorial Design)법을 이용하여 각 배지성분의 효과와 배지 간의 상호작용을 확인하였다.

2. FFD(Full Factorial Design)를 통한 치마버섯-천문동 생산배지 성분조사

FFD(Full Factorial Design)는 통계적 배지 최적화 방법 중 각 요인(factor)간의 상호작용을 확인할 수 있는 대표적인 실험법으로 배지조성의 변화가 베타글루칸의 생산성과 총 플라보노이드(Total flavonoid)값에 미치는 영향을 체계적으로 분석하였다.

FFD는 요인(factor)과 수준(level)의 세부조합반응(response)과 요인factor의 선형모형을 가정한 1차 회귀모형의 해석을 통해 최적조건을 찾아가는 방법으로 n은 수준의 수, k는 요인의 수를 나타내며 실험횟수는 (nk)로 결정된다. 본 발명의 일 실시예에서는 (-1)low level과 (+1)high level 2가지 수준으로 가지고 대두배아, 천문동, NaNO₃, KH₂PO₄ 4가지의 인자(factor)로 (2^k)trials (실험 횟수), 즉 16(2⁴)+2(center point)실험을 수행하였다.

ANOVA 분석을 수행한 결과는 P 값(value)이 <0.0001로 매우 신뢰할 수 있는 수준의 결과로 이는 실험 결과가 99.999이상 정확하다는 것을 의미한다(표1).

[표 1]

FFD 회귀분산 분석결과에서 배지성분들이 베타글루칸 생산성(EPS 값으로 측정) 에 미치는 영향과 교호인자의 효과를 나타낸 교호관계 그래프(interaction graph, 도 1)를 보면 천문동과 대두배아의 첨가농도와 상관없이 NaNO₃의 첨가 농도를 높일수록 생산성이 증가되며, 천문동과 대두배아의 농도가 일정 할 때 NaNO₃와 KH₂PO₄의 첨가량이 높을수록 생산성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

표 2를 통해 NaNO₃와 KH₂PO₄가 모두 낮은 수준으로 첨가된 1~4번 조합과 NaNO₃와 KH₂PO₄가 모두 높은 수준으로 첨가된 13~16번 조합을 살펴보면 1~4번 조합은 pH 4.39~4.52, 베타글루칸 생산성은 10.4~11.75g/L을 13~16번 조합에서는 pH 3.99~4.23, 17.89~20.35g/L의 베타글루칸 생산성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. NaNO₃와 KH₂PO₄ 두 성분 모두 pH 완충기능이 있는 배지 성분으로 천연물유래 원료인 천문동과 대두배아 첨가 시 나타나는 pH 변화의 조절이 베타글루칸 생산성에 매우 밀접하게 영향을 주는 것으로 판단된다. 이는 앞서 제시한 교호관계 그래프 (interaction graph) 결과에서 나타난 경향성과 일맥상통하는 결과라 할 수 있다.

[표 2]

이러한 결과를 통해 배지 성분으로 첨가된 천문동에 의해 감소된 pH를 NaNO₃와 KH₂PO₄가 보정해주는 중요한 인자(factor)임을 확인하였고, 이에 따라 NaNO₃와 KH₂PO₄의 농도조절 및 발효전환 산물의 유효성분을 증가시킬 수 있는 생물(발효)전환용 배지농도 최적화를 위해 RSM(Response Surface Method)을 수행하였다.

이에 따라 RSM은 NaNO₃와 KH₂PO₄가 높은 수준(high level)인 20g/L로 첨가된 13~16번 조합 중 베타글루칸 생산성(EPS 값으로 측정)이 20.35g/L, Yp/x 값이 2.84로 가장 높게 나타난 16번 조합을 센터 포인트(center point)로 설정하여 수행하였다.

3. RSM(Response Surface Method)을 통한 치마버섯-천문동 생산배지 최적화

RSM(반응표면분석법)은 여러 가지 실험 인자들, 즉 독립변수(배지성분)의 상호 작용에 따른 종속변수(EPS 생산성)의 변화에 대하여 최대반응치를 나타내는 최적조건(최적배지농도)을 찾아내기 위해 이용되는 통계적인 분석방법이다. RSM을 통해 신속하게 최적조건을 결정할 수 있으며 여러 조건에서 상호작용 파악이 가능하다. 또한 소규모의 실험으로 실험하지 않은 부분에서의 최적 지점도 예측 가능한 장점을 가지고 있다.

반응표면분석법은 반응에 대한 요인 수준의 최적조건을 찾을 때 비선형모형을 가정한 2차 회귀모형의 최적 조건 해석 즉 독립변수(배지성분)의 상호 작용에 따른 종속변수(EPS 생산성)의 변화에 대하여 최대 반응치를 나타내는 최적조건(최적배지농도)을 찾아내기 위해 이용되는 통계적인 분석방법이다. 이러한 RSM은 소규모의 실험으로 실험하지 않은 부분에서의 최적 지점도 예측을 통해 신속하게 최적조건을 결정할 수 있으며 여러 조건에서 상호작용 파악이 가능하다는 장점을 가지고 있으며, 실험디자인에 따라 박스-벤켄계획법(Box-Behnken Design)과 요인배치법(Factorial Design)의 요인실험점에 중심점과 축점의 실험점을 추가한 중심합성계획법(central composite design)으로 세분화 된다.

본 연구진은 반응표면분석법을 용이하게 하기 위한 실험계획법으로 2^K요인 실험에 중심점 (center points)과 축점 (axial points)을 추가시킨 중심합성계획법 (central composite design)(CCD)을 사용하였다. 중심합성계획법에서는 중심점 (n₀)의 수는 제한이 없으며(본연구에서는 4개의 중점사용), 축점 (α)의 수는 2k로서 본 실험에서는 4가지의 배지 성분 농도를 조사하고자 하였기 때문에 총 8개의 축점 실험을 수행하였다. 총 실험횟수는 2^K+2k+n₀=2⁴+2*4+n₀가 되므로 28개의 선정된 조건에서 실험을 실시하였다.

중심합성계획법에 의거해 얻은 결과는 Design-Expert 6.0 program을 이용해 통계적으로 분석하여 회귀방정식을 얻음으로써 각각의 배지성분들에 대한 상호 영향을 검토하고 베타글루칸 생산성(EPS 값으로 측정)을 위한 최적 배양 조건을 구하였다. 이 때 전체 모델(model)에 대한 유의성은 ANOVA 분석 시 주어지는 P값에 의해 결정되며, 일반적으로 P<0.05일 때 그 유의성이 인정된다. 최적배양 조건, 생물(발효)전환 배지의 최적 농도는 2차 다항식의 f 값이 최대로 되는 지점을 3차원 반응표면도와 컨투어 플롯(contour plot)을 이용하여 분석하였다.

그 결과 P값이 0.0001인 유의한 결과를 얻을 수 있었으며 각 배지 성분의 영향과 교호작용까지 설명해주는 2차 다항식을 얻을 수 있었다(표 3).

[표 3]

[표 4]

실험결과, NaNO₃가 높은 수준(high level)으로 첨가된 13~16번 조합에서 높은 생산성을 확인할 수 있었으며, 그 중 15번 조합의 EPS 함량이 25g/L로 가장 높았으며, 14번 조합에서의 Yp/x값이 3.97로 높았다. 전체적으로 총 플라보노이드(Total flavonoid)는 천문동이 첨가되지 않은 대조군(control) 배지에 비해 천문동을 첨가한 배지에서 높은 것으로 나타났다.

2차 다항식을 통해 확인한 그래프를 통해 배지에 따른 영향과 교호작용을 베타글루칸 생산 (EPS 값으로 측정)관점에서 살펴보면, 대두배아와 천문동은 반비례적으로 상호작용하며 생산성에 영향 주었으며, KH₂PO4와 NaNO₃의 농도가 높은 수준을 유지할 때 대두배아의 첨가량이 낮을수록 생산성이 증가되었다. 또한 앞서 수행한 결과와 마찬가지로 천문동과 NaNO₃는 서로 매우 밀접하게 상호작용하며 직접적으로 생산성에 큰 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.

천문동과 NaNO₃ 컨투어 플롯(contour plot)을 보면 NaNO₃가 중심 포인트 보다 낮은 농도에서는 천문동 농도에 매우 민감하게 영향을 받아 곡선 간격이 매우 좁았지만 20g/L이상의 농도에서는 천문동과의 상호작용이 낮아지고 생산성에도 영향을 적게 주는 것으로 확인 되었다. 이를 통해 질소원이면서 pH 완충작용을 하는 NaNO₃의 최적 농도가 0과 -1 사이의 자리 할 것으로 예측되며 반응표면도의 최대 곡면이 천문동 -2에서 +2까지 넓은 탄원을 나타내는 것으로 보아 천문동의 농도 증가에 따른 생산성을 확인해 볼 필요가 있을 것으로 판단된다.

따라서 최대 농도가 20g/L인 NaNO₃의 3가지 조건과 천문동을 고농도로 첨가한 OFAT(One Factor At a Time) 조합 실험을 통해 천문동 증가에 따른 배지간의 상호작용과 생산성을 확인 해 보았다.

천문동 17, 47, 77, 107, 137g/L와 NaNO₃ 10, 15, 20g/L를 조합으로 계획했으며, 나머지 배지 성분은 Glucose 69.6g/L, KH₂PO₄ 15g/L, MgSO₄ 2g/L로 고정하여 수행하였다. 그 결과 NaNO₃가 20g/L 첨가된 trial에서 높은 베타글루칸 생산성을 보였으며, 천문동의 첨가량이 증가할수록 총플라보노이드 함량도 증가하는 경향을 보였다. 특히, 생물(발효)전환 공정을 수행하기 전 추출물의 총플라노이드 함량에 비해 생물(발효)전환 산물의 총플라보노이드 함량이 매우 증가하였다.

[표 5]

베타글루칸의 생산성이 가장 높았던 6번, 9번 중 총 플라보노이드 함량이 0.75로 비교적 높았던 9번 조합을 결정하여 발효기에서의 생산성과 생물(발효)전환 공정 전후의 아미노산 함량 변화 및 항균효과 등을 비교하여 최적화된 조건에서의 생물(발효)전환산물의 유효성 여부를 확인하였다.

본 연구진은 이러한 과정을 통해 천문동/대두배아 생물(발효)전환을 위한 배양기내 배양특성 연구 및 공정 전후 물질을 비교, 분석을 할 수 있었으며, 생물(발효)전환산물인 개발소재의 우수성을 확인하였다.

5L 배양기에서의 천문동/대두배아 생물(발효)전환 공정을 수행하기 위하여 (주)큐젠바이오텍에서 개발한 베타글루칸 고생산균주인 Schizophyllum commune QG143-1의 균사체를 PDB(Potato Dextrose Broth)배지에서 성장배양시킨 후 본 발명의 일 실시예에서 제공하는 생물(발효)전환용 배양배지(글루코스 69.6 g/ℓ, 천문동 건조분말 77 g/ℓ, 대두배아 건조분말 1.5 g/ℓ, 질산나트륨 20 g/L, 인산칼륨 15 g/ℓ 및 황산마그네슘 2 g/ℓ)가 포함된 생물배양기에 접종하였다. 생물배양기의 70%인 3.5L를 조업부피로 하여 교반속도(agitation speed) 150rpm, 가스 퍼징 속도(gas purging rate) 1vvm을 유지하며 28℃에서 4일간 배양하였다(도 6).

그 결과 대조군(control) 조건에 비해 2~3배 높은 재현성 있는 베타글루칸 생산성을 확인할 수 있었으며, 단위 세포당 생산수율을 나타내는 Yp/x 값은 2.04, 총 플라보노이드 함량은 0.94g/L로 배양 전에 비해 약 36배 증가하였다. 천문동/대두배아의 생물(발효)전환 산물의 이러한 결과는 다양한 유효성 평가 실험에서도 확인할 수 있었다.

또한 기존 추출물(열수 추출물)과 대조군에 비해 탁월한 항균 효과가 있음을 대장균과 포도상구균의 디스크 어세이(Disc assay)실험을 통해 확인할 수 있었다(도 7).

아미노산 분석결과 16종의 1차 아미노산을 기준으로 천문동/대두배아 생물(발효)전환 산물의 총 아미노산 함량이 기존 추출물에 비해 약1.5배 증가하였으며, 티로신(Tyrosine) 알라닌(Alanine) 트레오닌(Threonine)은 약 1.3~1.7배, 류신(Leucine) 페닐알라닌(Phenylalanine) 글리신(Glycine) 대략 2.6~3배 증가하였다. 또한 메티오닌(Methionine)의 경우 그 증가률이 10배 정도로 다른 아미노산에 비해 탁월하였다(표 6, 표 7, 도 8). 필수아미노산을 축으로 한 이러한 아미노산 함량의 증가는 면역력을 비롯한 모발이나 피부 등의 건강상태 개선뿐만 아니라, 비만이나 알츠하이머 같은 특정 질병 치료에 도움이 되는 기능성 소재로써의 가능성을 확인해주는 결과라 할 수 있다. 아미노산은 피부와 모발의 원료가 될 뿐만 아니라 피부와 모발의 수분을 유지하는 중요한 역할을 맡고 있다. 피부건강에 있어 아미노산은 ① 피부의 재생과 소멸을 원활하게 해 표피를 재생하고, ② 피부 세포와 콜라겐원료, 진피재생의 재료가 된다. 또한 ③피부를 보호하는 각질 보습성분으로 작용, 보습력을 높이며, ④항산화 작용으로 표피와 진피의 산화를 방지할 수 있다.

[표 6]

아미노산 분석조건/아미노산 분석을 위한 유도체화 시약 및 방법

[표 7]

아미노산 표준물질 및 실험 시료의 아미노산 함량 분석 결과

4. 콜라겐 합성능 분석

상기에서 확인된 최적 농도의 배지에서 수득된 천문동 및 대두배아의 생물전환산물을 이용하여 콜라겐 합성능을 분석하고 그 결과를 하기 표 8, 표 9 및 도 9에 나타내었다. 실험은 다음과 같이 수행하였다. 계대 배양한 HDF 세포를 6-웰 플레이트에 2 × 10⁵ cells/well로 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 24시간 동안 배양한후 배지를 버리고 PBS (Phosphate Buffered Saline)로 세척한 다음 배양 media를 serum free DMEM로 교체하였다. 이어서 최종 처리 농도가 0.5%, 1%가 되도록 희석한 천문동/대두배아 생물전환산물을 처리한 후 24시간 동안 세포배양 조건에서 배양하였다. 배양 후에 상등액은 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 (Procollagen Type I C-Peptide) PIP EIA kit를 사용하여 마이크로프레이트 리더 (microplate reader)로 450nm에서 흡광도를 측정하였고 콜라겐 합성량을 측정하여 세포로부터 단백질 양을 구하였다.

콜라겐 합성능 시험은 2회 반복 실시하였으며, 콜라겐 표준곡선에 각 흡광도를 대입하여 얻어진 콜라겐 합성량을 식 1로 계산하여 단백질량 대비 콜라겐 합성량을 구하였다. 무처리군 대비 콜라겐 합성능은 식 2로 계산하여 나타내었으며 2회 실험의 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

시험결과, 천문동/대두배아생물전환 산물은 0.05% 농도에서 무처리군 대비 18.36%, 0.1% 농도에서 20.34%의 콜라겐 합성능을 각각 나타내었는 바, 피부 주름 예방 및 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직 수복 및 재생, 피부 노화 방지 및 개선 효과 등을 구현할 수 있다.

[표 8]

천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 콜라겐 합성량

[표 9]

천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 콜라겐 합성능

5. 피부장벽 기능 개선 효과 확인 - 필라그린(Filaggrin) mRNA 발현 평가

상기에서 확인된 최적 농도의 배지에서 수득된 천문동 및 대두배아의 생물전환산물을 이용하여 필라그린(Filaggrin) mRNA 발현량을 분석하였다. 실험은 다음과 같이 수행하였다. 계대 배양한 HaCaT 세포를 60 mm dish에 5 x 10⁵ cells/dish로 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 PBS (Phosphate Buffered Saline)로 세척한 다음 배양 media를 serum free DMEM으로 교체하였다. 이어서 최종 처리농도가 0.5%, 1%가 되도록 희석한 천문동/대두배아 생물전환산물을 세포에 각각 처리한 후 24시간 동안 세포배양 조건에서 배양하였다. 배양 후 세포를 회수하여 RNA를 추출하고 표 10의 조건으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 필라그린(filaggrin) 및 β-액틴(β-actin)(housekeeping gene) 각각의 TaqMan 프로브와 리얼 타임 PCR Master Mix, DEPC-DW를 혼합한 후 CFX96RT PCR (Biorad) 장비를 사용하여 표 11의 조건으로 qPCR을 수행하였다. 각 반복 시험별 결과 값은 표 12 및 도 10에 나타내었다.

[표 10]

cDNA 합성 조건

[표 11]

qPCR 조건

필라그린(filaggrin) mRNA 발현 평가 시험은 2회 반복하여 실시하였으며, 그 결과 값은 상대정량법 (ΔΔCt 방법)에 따라 Bio-Rad CFX 매니저 소프트웨어 (Manager software)를 통해 계산하여 대조군을 "1"로 하였을 때 시료 처리군의 상대정량 값을 산출하여 필라그린 mRNA 발현량으로 나타내었으며 2회 실험의 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 시험결과 천문동/대두배아 생물전환산물은 0.025% 농도에서 무처리군 대비 1.28, 0.05% 농도에서 1.68의 필라그린 mRNA 발현량을 나타내었는 바, 필라그린 증가를 통한 피부 수분과 보습성분 유지, 외부로부터의 세균, 독소 침투의 억제 효과를 구현할 수 있다. 참고로, 필라그란 이상 시에는 NMF의 감소로 인해 각질층 pH 상승, 각질층 내 세린 프로테아제 (serine protease) 활성화로 인해 각질층결합단백질(corneodesmosome)이 조기에 파괴됨으로써 건조성 피부질환이 유발될 수 있다.

[표 12]

천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 필라그린 mRNA 발현량

6. 피부 보습 기능 개선 효과 확인 - 아쿠아포린 3 (Aquaporin 3) mRNA 발현 평가

상기에서 확인된 최적 농도의 배지에서 수득된 천문동 및 대두배아의 생물전환산물을 이용하여 아쿠아포린 3 (Aquaporin 3) mRNA 발현량을 분석하였다. 실험은 다음과 같이 수행하였다. 계대 배양한 HaCaT 세포를 60 mm dish에 5 x 105 cells/dish로 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 PBS (Phosphate Buffered Saline)로 세척한 다음 배양 media를 serum free DMEM으로 교체하였다. 이어서 최종 처리농도가 0.025%, 0.05%가 되도록 희석한 천문동/대두배아 생물전환산물을 세포에 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 회수하여 RNA를 추출하고 표 10의 조건으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 아쿠아포린 3 및 β-액틴 (housekeeping gene) 각각의 TaqMan 프로브와 리얼 타임 PCR Master Mix, DEPC-DW를 혼합한 후 CFX96RT PCR (Biorad) 장비를 사용하여 표 11의 조건으로 qPCR을 수행하였다. 각 반복 시험별 결과 값은 표 13 및 도 11에 나타내었다.

아쿠어포린 3 mRNA 발현 평가 시험은 2회 반복하여 실시하였으며, 그 결과 값은 상대정량법 (ΔΔCt 방법)에 따라 Bio-Rad CFX 매니저 소프트웨어 (Manager software)를 통해 계산하여 대조군을 "1"로 하였을 때 시료 처리군의 상대정량 값을 산출하여 아쿠아포린 3 mRNA 발현량으로 나타내었으며 2회 실험의 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 시험결과 천문동/대두배아 생물전환산물은 0.025% 농도에서 무처리군 대비 1.63, 0.05% 농도에서 1.86의 아쿠아포린 3 mRNA 발현량을 각각 나타내었는 바, 아쿠아포린 3을 통한 물과 글리세롤의 흡수/이동에 의해 세포의 수분 손실을 방지함으로써 피부 탄력을 증가시킬 수 있다.

[표 13]

천문동/대두배아 생물전환산물 처리군의 아쿠아포린 3 mRNA 발현량

7. 항산화/항주름/항염 효과 확인

항산화 효과 평가를 위한 시험은 DPPH 자유라디칼 소거능을 통해 확인하였으며, 천문동/대두배아 생물(발효)전환산물 시료의 IC50값은 0.235%였다. 천문동 및 대두배아를 첨가하지 않은 대조군으로 사용한 치마버섯배양산물의 항산화 효과는 확인되지 않았다 (도 12).

항주름 효과를 확인하기 위한 엘라스타아제 저해 (Elastase inhibition) 실험을 수행하였다. 천문동/대두배아 생물(발효)전환산물 시료의 경우 0.3125~10%에서 농도 의존적으로 엘라스타아제 (Elastase) 저해 활성이 있었다. 천문동 및 대두배아를 첨가하지 않은 대조군으로 사용한 치마버섯배양산물의 경우는 천문동/대두배아 생물(발효)전환산물 시료에 비해 미미한 효과를 나타내었다 (도 13).

항염 효과를 확인하기 위하여 NO 억제 어세이 (NO inhibition assay)를 수행하고 그 결과를 도 14에 나타내었다. 0.2 ~ 1% 범위에서 급격히 증가하였고 2%에서 106.64%로 매우 우수한 효과를 나타내었다.

8. 건조에 의한 가려움증 완화 (아토피 개선 효과) 평가 및 보습 지속력 평가 1

건조에 의한 가려움 증상이 있고, Corneometer 보습 측정기기에 의한 피부 수분량이 50 이하로 평균 이상의 건성 피부를 가진 20세 이상의 성인 여성 20명을 피시험자로 선정하고, 시험물질 (천문동/대두배아 생물(발효)전환산물)의 건조에 의한 가려움증 완화 효과 및 보속 지속력 효과를 분석하였다.

건조에 의한 가려움증 완화 평가

피시험자는 시험기간인 2주 동안 1일 2회 아침, 저녁 세정 후 시험물질 (천문동/대두배아 생물(발효)전환산물) 동일한 양 30 μL을 왼쪽 전완하부에 고르게 펴 발라 흡수시켰다. 이후 Epsilon E100 (Biox Systems Ltd., UK)을 적용하여 건조에 의한 가려움증 완화 평가를 수행하였고 그 결과를 도 15에 나타내었다. Epsilon E100은 센서에 접촉된 피부 표면의 수분을 Epsilon (ε) 값으로 산정하며, 피부 수분량이 높을수록 이미지 결과물의 명도가 증가 하여 파란색 부분이 백색에 가깝게 변화되어 나타난다. 동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 왼쪽 전완하부를 측정하였으며, 이에 대한 분석은 Epsilon E100 전용 분석프로그램인 Epsilon E100 Software V3를 이용하여 피부 수분의 변화를 분석하였다. 시험물질 사용 전과 비교하여 측정값이 증가할수록 보습이 개선되었음을 의미한다. 기기측정은 시험물질 사용 전과 2주 사용 후 의 시점에서 이루어졌다. 시험 결과, 피부 수분이 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 29.60%가 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의한 결과를 나타내었는 바(p<.001) 시험물질이 보습 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다.

피시험자 설문조사를 이용한 건조에 의한 가려움증 완화 평가

또한, 피시험자 설문조사를 이용한 건조에 의한 가려움증 완화 평가를 수행하였다. 본 시험에서는 피시험자의 시험물질 사용 전후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 관한 5문항과 10 ㎝ Visual Analogue Scale (VAS, 0=전혀 없다, 10=매우 심하다)을 이용하여 시험물질 사용 전후의 가려움증으로 인한 심리상태 3문항을 실시하였다. 피시험자의 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 대해 설문조사한 결과, 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.45에서 2주 사용 후 0.50으로, 가려 움 빈도는 시험물질 사용 전 3.55에서 2주 사용 후 0.35로, 수면시 가려움 정도는 시험물질 사용 전 2.85에서 2주 사용 후 0.20으로, 가려움이 가장 심할 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.40에서 2주 사용 후 0.35로, 가려움이 가장 적을 때의 가려움 정도는 시험물질 사 용 전 2.25에서 2주 사용 후 0.25로 각각 감소됨을 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의한 결과를 나타내었는 바(p<.001) 시험물질이 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다 (표 14).

[표 14]

보습 지속력 평가

본 시험에서는 시험물질의 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력 평가를 위하여 Epsilon E100 을 적용하였다. 동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 양쪽 전완상부(4.0×4.0 ㎠)를 시험물질 도포부위와 무도포부위로 나눈 뒤, 각각의 동일한 지점을 측정하였다. Epsilon E100은 센서에 접촉된 피부 표면의 수분을 Epsilon (ε) 값으로 산정하며, 피부 수분량이 높을수록 이미지 결과물의 명도가 증가하여 파란색 부분이 백색에 가깝게 변화되어 나타난다. 동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 양쪽 전완상부를 측정하였으며, 이에 대한 분석은 Epsilon E100 전용 분석프로그램인 Epsilon E100 Software V3를 이용하여 피부 수분의 변화를 분석하였다. 시험물질 무도포부위와 비교하여 도포부위의 측정값 변화가 유의하게(p <.05) 증가할수록 (무도포군 대비) 48시간 보습지속력이 있음을 의미한다. 기기측정은 시험물질 사용 전과 1회 사용 직후, 사용 24시간 후, 사용 48시간 후의 시점에서 이루어졌다.

Epsilon E100을 이용하여 양쪽 전완상부의 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력 개선도를 분석한 결과, 피부 수분이 시험물질 사용 전과 비교하여 도포부위에서 1회 사용 직후 441.18%, 사용 24시간 후 313.07%, 사용 48시간 후 200.48% 유의하게(p〈.001) 증가, 무도포부위에서 1회 사용 직후 1.34%, 사용 24시간 후 39.46%, 사용 48시간 후 32.66% 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 무도포부위의 1회 사용 직후, 사용 24시간 후, 사용 48시간 후 Δ피부 수분과 비교하여 도포부위의 1회 사용 직후, 사용 24시간 후, 사용 48시간 후 Δ피부 수분이 통계적으로 유의한 것으로 확인되었는 바(p〈.001) 시험물질이 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력에 도움을 주는 것으로 판단된다 (도 16 및 표 15).

[표 15]

통계분석 방법

본 시험의 통계처리는 SPSS 17.0 for Windows 프로그램을 이용하여 분석하였다. 피시험자의 건조에 의한 가려움증 완화 설문지 분석을 위하여 Wilcoxon signed-rank test 분석을 실시하였으며, 일반적 설문지 분석은 평균, 표준편차, 빈도, 백분율을 실시하였다. 또한 다양한 바디 피부 개선도에 대한 기기측정 결과의 유의한 변화 여부를 분석하기 위하여 Wilcoxon signed-rank test와 Mann-Whitney U test, Repeated measures ANOVA 분석을 실시하였다.

9. 인체피부 투과 시험 및 수분량 평가

건강한 피부를 가진 만 19~59 세의 여성 시험대상자 10 명을 대상을 시험물질 (천문동/대두배아 생물(발효)전환산물)을 사용하고 20 분간 충분히 흡수시킨 후 라만 스펙트로스코피(Raman Spectroscopy)를 이용하여 평가하였다. 평가는 시험 제품 사용 전, 사용 직후(20 분간 흡수 후), 1 시간 후에 실시하였다.

라만 스펙트럼 측정

분석 결과, 486, 852, 1062, 1466 cm^-1에서 강한 시그널을 나타내었으며 (도 17), 측정된 시험물질 (천문동/대두배아 생물(발효)전환산물)의 라만 스펙트럼을 피부 투과 분석을 위한 레퍼런스로 사용하였다.

피부 투과량 분석

시험물질의 피부 투과 여부는 시험물질 사용 후 측정값이 사용 전 측정값에 비하여 통계적으로 유의하게 증가한 경우 시험물질이 투과되었다고 간주하고 그 깊이를 산출하였다. 시험물질의 피부 투과량은 사용 직후 시점에 피부 깊이 22 μm까지 사용 전 측정값에 비하여 유의하게 증가하였다 (p<0.05). 이에 따라 실험제품이 투과하는 최고 깊이는 시험물질 사용 1 시간 후 시점에 22 μm로 분석되었다.

[표 16]

시험물질의 총 함유량 분석

시험물질이 투과된 최고 피부 깊이인 22 μm까지 함유된 시험물질의 총 함유량과 1 시간 동안의 감소(흡수)율을 분석하였다. 시험물질의 총 함유량은 사용 직후 시점에 17883.92 a.u, 1 시간 후 시점에 15919.27 a.u로 나타났으며, 시험물질 사용 후 1 시간 동안의 감소(흡수)율은 10.04%로 나타났다 (표 17).

[표 17]

상기와 같은 시험 결과, 시험물질은 피부 깊이 최고 22 μm까지 투과하며, 피부수분량 개선 측면에서 시험물질이 각질충의 팽윤현상(swelling)을 유도하는 것으로 판단된다.

10. 건조에 의한 가려움증 완화 (아토피 개선 효과) 평가 및 보습 지속력 평가 2

건조에 의한 가려움 증상이 있고, Corneometer 보습 측정기기에 의한 피부 수분량이 50 이하로 평균 이상의 건성 피부를 가진 20세 이상의 성인 여성 20명을 피시험자로 선정하고, 시험물질(하기 화장료 조성물)의 건조에 의한 가려움증 완화 효과 및 보속 지속력 효과를 분석하였다.

[표 18]

건조에 의한 가려움증 완화 평가

피시험자는 시험기간인 2주 동안 1일 2회 아침, 저녁 세정 후 시험물질인 시험물질 동일한 양 30 μL를 왼쪽 전완하부에 고르게 펴 발라 흡수시켰다. 본 시험에서는 시험물질의 건조에 의한 가려움증 완화 평가 중 보습 개선 평가를 위하여 Epsilon E100 (Biox Systems Ltd., UK)을 적용하였다. Epsilon E100은 센서에 접촉된 피부 표면의 수분을 Epsilon (ε) 값으로 산정하며, 피부 수분량이 높을수록 이미지 결과물의 명도가 증가 하여 파란색 부분이 백색에 가깝게 변화되어 나타난다. 동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 왼쪽 전완하부를 측정하였으며, 이에 대한 분석은 Epsilon E100 전용 분석프로그램인 Epsilon E100 Software V3를 이용하여 피부 수분의 변화를 분석하였다. 시험물질 사용 전과 비교하여 측정값이 증가할수록 보습이 개선되었음을 의미한다. 기기측정은 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 시점에서 이루어졌다. Epsilon E100을 이용하여 왼쪽 전완하부의 보습 개선도를 분석한 결과, 피부 수분이 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 54.58%가 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교하여 2주 사용 후 통계적으로 유의한 결과를 나타내었는 바(p<.001) 시험물질이 보습 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다. (도 18)

본 시험에서는 피시험자의 시험물질 사용 전후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 관한 5문항과 10 ㎝ Visual Analogue Scale (VAS, 0=전혀 없다, 10=매우 심하다)을 이용하여 시험물 질 사용 전후의 가려움증으로 인한 심리상태 3문항을 실시하였다.

피시험자의 시험물질 사용 전과 2주 사용 후의 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태에 대 해 설문조사한 결과, 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.50에서 2주 사용 후 0.95로, 가려움 빈도는 시험물질 사용 전 3.30에서 2주 사용 후 0.40으로, 수면시 가려움 정도는 시험물질 사 용 전 2.90에서 2주 사용 후 0.45로, 가려움이 가장 심할 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 3.35에서 2주 사용 후 0.80으로, 가려움이 가장 적을 때의 가려움 정도는 시험물질 사용 전 1.90에서 2주 사용 후 0.50으로 각각 감소됨을 나타내었다. 또한 시험물질 사용 전과 비교 하여 2주 사용 후 통계적으로 유의한 결과를 나타내었는 바(p<.001) 시험물질이 가려움증으로 인한 행동 및 습관상태 개선에 도움을 주는 것으로 판단된다 (표 19).

[표 19]

보습 지속력 평가

본 시험에서는 시험물질의 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력 평가를 위하여 Epsilon E100 을 적용하였다. 동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 양쪽 전완상부(4.0×4.0 ㎠)를 시험물질 도포부위와 무도포부위로 나눈 뒤, 각각의 동일한 지점을 측정하였다. Epsilon E100은 센서에 접촉된 피부 표면의 수분을 Epsilon (ε) 값으로 산정하며, 피부 수분량이 높을수록 이미지 결과물의 명도가 증가하여 파란색 부분이 백색에 가깝게 변화되어 나타난다. 동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 양쪽 전완상부를 측정하였으며, 이에 대한 분석은 Epsilon E100 전용 분석프로그램인 Epsilon E100 Software V3를 이용하여 피부 수분의 변화를 분석하였다. 시험물질 무도포부위 와 비교하여 도포부위의 측정값 변화가 유의하게(p<.05) 증가할수록 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력이 있음을 의미한다. 기기측정은 시험물질 사용 전과 1회 사용 직후, 사용 24시간 후, 사용 48시간 후의 시점에서 이루어졌다. Epsilon E100을 이용하여 양쪽 전완상부의 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력 개선도를 분석한 결과, 피부 수분이 시험물질 사용 전과 비교하여 도포부위에서 1회 사용 직후 291.63%, 사용 24시간 후 136.76%, 사용 48시간 후 60.14% 유의하게(p〈.001) 증가, 무도포부위에서 1회 사 용 직후 6.41%, 사용 24시간 후 25.51%, 사용 48시간 후 15.87% 증가되는 변화를 나타내었다. 또한 시험물질 무도포부위의 1회 사용 직후, 사용 24시간 후, 사용 48시간 후 Δ피부 수분과 비교하여 도포부위의 1회 사용 직후, 사용 24시간 후, 사용 48시간 후 Δ피부 수분이 통계적으로 유의하게 확인도었는 바(p〈.001) 시험물질이 (무도포군 대비) 48시간 보습 지속력에 도움을 주는 것으로 판단된다 (도 19, 표 20)

[표 20]

통계분석 방법

본 시험의 통계처리는 SPSS 17.0 for Windows 프로그램을 이용하여 분석하였다. 피시험자의 건조에 의한 가려움증 완화 설문지 분석을 위하여 Wilcoxon signed-rank test 분석을 실시하였으며, 일반적 설문지 분석은 평균, 표준편차, 빈도, 백분율을 실시하였다. 또한 다양한 바디 피부 개선도에 대한 기기측정 결과의 유의한 변화 여부를 분석하기 위하여 paired t-test와 Mann-Whitney U test, Repeated measures ANOVA 분석을 실시하였다.

<제조예>

이하, 본 발명에 따른 상기 생물전환산물 유효성분으로 함유하는 화장품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

1. 모이스처 로션의 제조

[표 21]

2. 소프트너의 제조

[표 22]

3. 수딩 크림

[표 23]

4. 미스트

[표 24]

5. 모이스처라이저

[표 25]

Claims

천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 치마버섯 담자균류균사를 5 ~ 15 %(v/v)로 접종 및 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물로서,
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하고,
상기 생물전환산물은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 천문동 및 대두배아는 분말 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 담자균류균사는 액상배지에 배양된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 담자균류균사는 정치용 액상 배지에서 5 ~ 7일간 배양 후, 1~3일간 진탕배양되어 수득된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 배양은 25 ~ 35 ℃에서 3 ~ 5일간 진탕배양하는 방법으로 수행된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 생물전환산물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 치마버섯 담자균류 균사를 5 ~ 15 %(v/v)로 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 아토피 증상 개선용 화장료 조성물로서,
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하고,
상기 생물전환산물은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 치마버섯 담자균류 균사를 5 ~ 15 %(v/v)로 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물로서,
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하고,
상기 생물전환산물은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
천문동 및 대두배아를 포함하는 배양배지에 치마버섯 담자균류 균사를 5 ~ 15 %(v/v)로 접종 후 배양하여 수득한 생물전환산물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치유용 화장료 조성물로서,
상기 배양배지는 글루코스 65 ~ 75 중량부, 천문동 72 ~ 82 중량부, 대두배아 0.5 ~ 5 중량부, 질산나트륨 15 ~ 25 중량부, 인산칼륨 10 ~ 20 중량부 및 황산마그네슘 1 ~ 7 중량부를 포함하고,
상기 생물전환산물은 베타글루칸, 아미노산 및 플라보노이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.