KR102283756B1

KR102283756B1 - 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102283756B1
Application number: KR1020190103445A
Authority: KR
Inventors: 하헌용
Original assignee: 하헌용
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2021-07-30
Also published as: KR20210023352A

Abstract

본 발명의 일실시예는 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. 식이섬유 가수분해효소는 식물의 세포벽을 용해하기 때문에 식물세포 내의 유효성분인 2차 대사산물을 외부로 유출시키기 위한 조건을 만들 수 있는데, 이 때 동물세포에 대한 독성이나 세포 대사에 대한 영향이 있을 수 있다. 본 발명에서는 전분 분해효소와 식이섬유 가수분해효소를 복합적으로 처리하여 세포독성을 현저히 감소시키며 동시에 보습과 관련하여 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITON COMPRISING HEDYOTIS DIFFUSA EXTRACT TREATED WITH COMPLEX EXZYME}

본 발명은 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물에 관한 것이다.

피부는 외부에서부터 순서대로 표피, 진피 및 피하지방 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 인체를 외부 환경으로부터의 물리적 또는 화학적인 자극으로부터 보호해 주는 기능을 한다. 특히, 피부는 인체가 갖고 있는 약 65~70%의 수분, 즉 인체에 필요한 각종 생리 활성 물질을 운반하며 피부가 부드럽고 촉촉한 상태를 유지할 수 있도록 도와주는 수분이 체외로 증발되는 것을 조절해 주는 중요한 역할을 한다. 또한 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층 및 기저층의 순서로 구분되는데, 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 각질세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다(J. Invest. Dermatol. 80(Suppl.), 44~49, 1983). 표피의 각질층은 약 10~20%의 수분을 함유하며 인체의 최외각에 존재함으로써 체외로부터의 수분 증발을 억제하는 한편 외부로부터의 물질 과잉 침투를 차단한다. 이들 각질층 표면은 피지선에서 나온 피지와 땀샘에서 나온 땀으로 만들어진 얇은 천연 보호막이 감싸져 있어서 수분의 증발을 예방한다. 부연 설명하자면, 물을 머금고 있는 스폰지(각질층)를 물이 통과하지 않는 비닐 랩(천연 보호막)으로 감싸고 있는 형태로 생각하면 된다. 이러한 각질층을 구성하고 있는 세포에는 수용성 성분인 고농도의 자연보습인자(Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하여 피부가 유연성을 나타내도록 작용함은 물론 적절한 수분을 유지할 수 있도록 돕는데, 예를 들면 아미노산과 같은 물질은 수용성일 뿐만 아니라 효과적으로 수분과 결합하며 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다(J. Invest. Dermatol. 54, 24-31, 1970). 그러나 환경의 변화 혹은 생활 패턴의 변화에 따른 냉/난방의 인위적인 온도 조절, 사회 생활에서 발생되는 각종 스트레스와 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 연령 증가에 따른 자연적인 피부 노화 등의 여러 가지 원인으로 인하여 각질층의 수분이 감소하여 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 윤기를 잃어 칙칙하게 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다.

종래에는 이를 위해 보습제로서 수분을 흡수하는 성질이 있는 휴멕턴트(humectant) 또는 수분 증발을 방지하는 폐쇄 보습제(Occlusive Moisturizer)를 사용하여 결국 각질층에서의 수분 보유를 증가시키게 하는 방식이 가장 널리 사용되는 방법이다. 상기 휴멕턴트는 거의 대부분이 폴리올류로서, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜 등의 물질이 있다. 그러나 이들은 피부에 도포시 폴리올의 고유 점성과 물성으로 인하여 끈적임이 심하거나 눅진한 느낌이 드는 단점이 있다. 또한, 폐쇄 보습제로는 세라마이드 등의 지질 성분이나 필수지방산 및 지질 복합체 등이 사용되었으나(J. Invest. Dermatol. (5), 731-740, 1994), 유화 제형에서 유화 계면막의 구조를 교란하여 안정도를 저해하는 난점이 있고 투명한 젤 상의 제품을 제조하는 데에는 부적합한 단점이 있다. 최근까지 많은 연구가 진행되고 있는 라멜라 액정을 함유한 제형들은 피부 각질 구조와 유사한 장점으로 수분 보습력이 우수한 것으로 알려져 있으나, 원료들의 특정 조성에서만 가능하여 보편적으로 사용하기에는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 피부 각질층에서 히알루론산 분비를 촉진시켜 수분 흡수량을 높게 유지할 수 있는 물질을 찾고자 연구한 결과, 천연에 존재하는 백화사설초에 복합효소 처리한 물질이 우수한 피부 보습 효과를 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 백화사설초 추출물을 제공하는 단계; 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소를 제공하는 단계; 및 상기 백화사설초 추출물에 상기 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 “백화사설초 (Herba Hedyotidis Diffusae)”는 백운풀(Hedyotis Diffusa Willd) 지상부의 생약명을 지칭한다. 백운풀은 쌍떡잎식물 용담목 꼭두서니과(Rubiaceae)의 한해살이 풀로서 산지의 습지에 자생한다. 잎은 선형이고 잎자루는 없으며, 엽저와 탁엽은 서로 이어져 있으며, 탁엽의 정단은 4개로 갈라지며, 숙존하고 화관은 4개로 갈라지며, 수술은 4개이다. 열매는 납작한 구형이다.

백화사설초는 무독하며 약성은 찬편이고, 맛은 쓰고 달다. 전통적으로 청열해독(淸熱解毒), 이뇨소종(利尿消腫), 활혈지통(活血止痛)의 효능이 알려져 있다. 백화사설초에 함유된 성분으로는 베툴린(Betulin), 베툴릭산(Betulinic acid), 우루솔릭산(Ursolic acid), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 스티그마스테롤(stigmasterol), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 배타-글리세레티닉산(β-glycyrretinic acid), 펜타-쿠마릭산(p-coumaric acid), 글루코사이드(glucoside), 헨트리아콘테인(hentriacontane) 등이 있으며, 항암활성, 항염증 효과, 및 항바이러스 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

본원의 일 실험예에 따르면, 백화사설초는 피부에 적용되어 보습효과를 나타낼 수 있다. 구체적으로, 피부의 각질세포가 히알루론산을 생합성하도록 촉진하여 장기간 유지될 수 있는 보습 작용을 유도낸다. 상기 백화사설초 추출물은 식이섬유 가수분해효소 및 전분 분해효소를 포함하는 복합효소 처리에 의해 보습효과가 현저히 상승될 수 있다.

본원의 피부 보습용 화장료 조성물은 백화사설초의 추출물을 복합효소 처리하여 제공된다. 상기 백화사설초 추출물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 예를 들면, 백화사설초를 자연건조하고 잘게 분쇄한 분쇄물 건조중량에 대해 추출 용매로서 물, C_1-6알코올, 아세톤, 1,3-부틸렌글리콜, 노말프로판올, 이소프로판올, 노말부탄올 등의 극성용매와 이것들의 혼합용매를 가하여 침적 추출한다. 본원에서 제한되지 않는 일 실시예에 따르면 70% 에탄올 수용매가 사용되었다. 추출 용매는 백화사설초 분말 1g 당 5 내지 20L만큼 첨가될 수 있다. 상기 추출은 1 내지 5회 반복할 수 있으며, 본원의 일 실시예에 따르면 3회 반복 추출하였다. 상기 수득한 백화사설초 추출물은 추가적으로 여과, 감압농축, 동결건조, 또는 이들의 조합으로 처리된 것일 수 있다. 여과는 3 내지 7㎛의 mesh여과지로 여과한 것일 수 있다. 감압 농축은 감압농축기를 이용하여 30 내지 100 시간 농축하는 것일 수 있다. 동결건조는 5 내지 10일간 동결건조된 것일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 “전분 분해효소”는 전분을 분해하는 효소를 통칭하며, 아밀라아제가 이에 해당한다. 아밀라아제는 α-아밀라아제(amylase), β-아밀라아제, 이소아밀라아제 및 글루코아밀라아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 본원의 일 구현예에 따르면, 상기 전분 분해효소는α-아밀라아제일 수 있다. 본원의 일 실험예에 따르면, 전분 분해효소에 의해 세포내 함유물 중 다당류가 분해되어 배당체 성분의 유효성분이 다량 얻어질 수 있다. 또한, 전분 분해효소가 처리된 식물성 추출물은 독성이 감소되고 생체 적합성이 향상될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 “식이섬유 가수분해효소”는 셀룰로오스 등의 식이섬유를 가수분해하는 효소로서, 식물의 세포벽에 부착된 펙틴 물질을 분해할 수 있는 효소이다. 셀룰라아제(Cellulase), 헤미셀룰라아제(Hemicellulase) 및 펙티나아제(Pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상이 포함될 수 있다. 본원의 일 구현예에 따르면, 식이섬유 분해효소는 셀룰라아제일 수 있다.　 셀룰라아제는 셀룰로오스의 β4 글리코시드 결합을 가수분해하여 셀로비오스를 형성한다. 처음에는 크게 분해하는 셀룰라아제가 작용하여 어느 정도 셀룰로스의 분자를 짧게 하면, 다른 셀룰라아제 또는 아밀라아제가 작용하여 올리고당(糖)이나 글루코스를 생기게 하는 것과 같이 서로 협력하여 작용한다. 식이섬유 가수분해효소는 식물의 세포벽을 용해하기 때문에 식물세포 내의 2차 대사산물을 외부로 유출시키기 위한 조건을 만들 수 있다. 다만, 동물세포에 대한 독성이나 세포 대사에 대한 영향이 있을 수 있는데, 아밀라아제를 복합적으로 처리할 경우 세포독성을 현저히 감소시키며 동시에 보습과 관련하여 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 “복합효소”는 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 모두 포함하는 효소로서, 추가적으로 다른 효소를 더 포함하는 것일 수 있다. 복합효소는 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 1:9 내지 9:1의 중량비로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 3:7 내지 7:3의 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 본원에서 제한되지 않는 일 실시예에 따르면, 5:5의 중량비로 포함되었다. 식이섬유 가수분해 효소의 비율이 이보다 높을 경우 세포 독성을 나타낼 수 있으며, 식이섬유 가수분해 효소의 비율이 이보다 낮을 경우 높은 보습 효과를 발휘하도록 개선시키지 못한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 복합효소는 백화사설초 추출물 100 중량부당 0.4 내지 4 중량부만큼 처리될 수 있다. 구체적으로, 백화사설초 추출물 100 중량부당 0.5 내지 3 중량부만큼 처리되는 것일 수 있다. 복합효소가 이보다 많이 처리될 경우 세포독성을 나타낼 수 있으며, 이보다 적게 포함될 경우 백화사설초 추출물의 보습효과를 크게 개선시키지 못하며 이보다 많이 포함될 경우 유효성분이 변질되거나 세포독성을 나타낼 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 복합효소의 처리는 35 내지 39℃에서 수행되는 것일 수 있다. 상기온도의 범위에서 벗어날 경우 화장료 조성물이 높은 보습효과를 발휘하도록 개선되지 못한다. 또한, 상기 복합효소의 처리는 1 내지 3시간 수행되는 것일 수 있다. 상기 시간보다 오래 처리될 경우 화장료 조성물에서 유효성분이 변질되거나 다른 불필요한 성분이 포함될 수 있고, 상기 범위보다 짧게 처리될 경우 화장료 조성물이 높은 보습 효과를 발휘하도록 개선되지 못한다.

본원에서 백화사설초 추출물은 복합효소 처리에 따라 우수한 보습효과를 나타내므로, 이를 포함하는 화장료 조성물은 피부 보습용도로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 “보습용”이란 각질층의 수분 보유를 증가시키는 용도를 의미한다. 본원의 일 구현예에 따르면, 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물은 각질세포가 히알루론산(HA)을 생성하도록 유도할 수 있다. 본원의 일 실험예에 따르면, 본원의 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물이 ATRA(all-trans-retinoic acid)와 비교하여 유사한 수준으로 히알루론 생성능을 가짐을 알 수 있었다. 또한, 본원의 일 구현예에 따르면, 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물은 각질세포가 HAS2 유전자 발현을 촉진하도록 유도할 수 있다.

본원의 복합효소가 처리된 피부 보습용 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이, 팩 또는 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

백화사설초 추출물은 전체 화장료 조성물 중량 대비 0.001 내지 10 중량%만큼 포함될 수 있다.

본 발명에 의한 피부 보습용 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유 성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분 야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 백화사설초 추출물을 제공하는 단계; 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소를 제공하는 단계; 및 상기 백화사설초 추출물에 상기 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 피부 보습용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.

백화사설초 추출물을 제공하는 단계에 있어, 전술한 바와 같이, 백화사설초의 추출물은 백화사설초의 분쇄물을 추출용매에 침적 추출하여 수득할 수 있다. 여기에 여과, 감압농축, 동결건조, 또는 이들의 조합이 추가적으로 수행되는 것일 수 있다.

전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소를 제공하는 단게에 있어, 복합효소는 앞에서 정의한 바와 같다.

상기 백화사설초 추출물에 상기 복합효소를 처리하는 단계에 있어, 전술한 바와 같이, 상기 복합효소를 상기 백화사설초 추출물에 처리하고 특정 조건에 일정시간만큼 유지하는 것일 수 있다.

상기 수득한 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물은 추가로 감압농축, 동결건조, 또는 이들의 조합 등의 처리가 수행될 수 있으며, 여기에 화장료 제형으로 제제화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 전분 분해효소 및 식이섬유 가수분해효소를 포함하는 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 유효성분으로 하여, 우수한 보습 효과를 나타낸다. 특히, 식이섬유 가수분해효소는 식물의 세포벽을 용해하기 때문에 식물세포 내의 유효성분인 2차 대사산물을 외부로 유출시키기 위한 조건을 만들 수 있는데, 이 때 동물세포에 대한 독성이나 세포 대사에 대한 영향이 있을 수 있다. 본 발명에서는 전분 분해효소를 복합적으로 처리하여 세포독성을 현저히 감소시키며 동시에 보습과 관련하여 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물은 피부에 적용되어 각질세포에서 히알루론산의 생합성을 촉진하므로 지속적이고 부작용이 적은 보습 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 백화사설초의 사진이다.
도 2는 백화사설초 추출물이 각질세포에 첨가되었을 때 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 3은 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물이 각질세포에 첨가되었을 때 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 4내지 7은 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물의 처리 후 15분, 30분, 45분, 및 60분 경과시 히알루론산(HA) 생성량을 나타낸 도이다.
도 8은 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물의 HAS2 유전자 발현량을 나타낸 도이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

제조예 1. 백화사설초 추출물의 제조

백화사설초(Hedyotis diffusa Willd.)는 중국 안휘성 중약재시장에서 구입하였으며, 시료는 서원대학교 공동실험실에 보관하여 사용하였다.

백화사설초를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화 하였다. 이후 백화사설초 분말 100g을 70% 에탄올 용매 1L에 첨가하였고, 25 ℃ 및 1기압 조건에서 12 시간 유지하여 추출하였다. 이후 5μm mesh의 여과지를 이용하여 여과하였다. 상기 추출과정을 3회의 걸쳐 반복하였으며, 추출용액 전체를 혼합하여 사용하였다.

상기 과정을 통하여 얻어진 추출물을 감압 농축기를 이용하여 72시간 농축한 이후에 7일간 동결건조하여 실험에 사용하였다. 원물 중량 대비 얻어진 동결건조물의 중량의 최종 수율은 14.2%로 확인되었다.

제조예 2. 효소 A 및 C를 처리한 백화사설초 추출물의 제조

효소 A는 α-아밀라아제(amylase)로 SIGMA로부터 입수하였으며, 효소 C는 셀률라아제(cellulase)로 역시 SIGMA 로부터 입수하였다.

제조예 1에 따라 제조한 백화사설초 추출물의 동결건조물에 효소 A 단독처리, 효소 C 단독처리, 및 효소 A 및 C 병용처리하였다. 효소 A단독처리한 실시예를 백화A, 효소C 단독처리한 실시예를 백화C, 효소 A 및 C 병용처리한 실시예를 백화AC로 명명하였다.

구체적으로, 하기 표 1에 기재한 바와 같이, 백화사설초의 농도별 시료에 대하여 효소 A, 효소 C, 및 효소 A와 C혼합물을 각각 1unit(약 1.68 μg) 만큼 희석하여 처리한 뒤 밀봉하여2시간 동안 인큐베이터(37℃)에서 반응시켜 시료로 사용하였다.

	백화 A	백화C	백화AC
백화사설초의 동결건조물	50, 100, 200μg	50, 100, 200μg	50, 100, 200μg
효소 처리량	1.68μg	1.68μg	각각 0.84μg 및 0.84μg
온도	37 ℃(인큐베이터 조건)	37 ℃	37 ℃

실험예1. 안전성 평가(MTT assay)

- 세포배양 및 시험방법

각질세포 (HaCat cell)를 2 x 10⁴/㎖ 농도로 96 웰(well) 플레이트에 시딩하였다. 24시간 후에 무혈청DMEM배지로 교체해준 후에 각 시료를 처리해주었다. 24시간 동안 배양한 후 배지를 걷어내고 20㎕의 3-(4,5-디메틸-2-치아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드 (MTT, 5 ㎎/㎖)을 넣어주고 CO₂ 배양기에서 2시간 배양하였다. 백화사설초 추출물을 처리하지 않은 대조군 배지, 시료가 첨가된 실험군 배지 100 ㎕의 DMSO로 결정을 용해시킨 후에 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 대조군과 비교하여 %로 표시하였으며, 세포에 처리한 샘플에 포함된 DMSO는 최종 농도 0.1%에 맞추었다.

- 실험 결과

제조예 1에서 수득한 백화사설초 추출물이 첨가된 각질세포 실험군, 시료가 첨가되지 않은 각질세포 대조군, 및 10% DMSO의 570nm흡광도를 측정한 결과를 그래프로 도 2에 나타내었다. 백화사설초 추출물은 유의한 독성을 나타내지 않아 인체에 비교적 안전한 물질임을 확인하였다.

제조예 2에서 수득한 효소가 표 1의 함량으로 처리된 백화사설초 추출물이 첨가된 각질세포 실험군, 시료가 첨가되지 않은 각질세포 대조군, 및 10% DMSO의 570nm흡광도를 측정한 결과를 그래프로 도 3에 나타내었다. 효소 C를 단독으로 처리한 경우에 일부 세포생존율이 저하되는 현상(대조군 대비 약65%)이 나타났으나, 효소 A와 C를 1:1의 비율로 사용한 경우에는 세포생존율에 뚜렷한 영향(대조군 대비 약 80%)이 없는 것으로 확인되었다.

실험예2. 보습효능 평가(Hyaluronic acid ELISA assay)

- 세포배양 및 시험방법

각질세포(HaCat cell)를 2 x 10⁵/㎖ 농도로 6 웰-플레이트에 시딩 하였다. 24시간 후에 무혈청 DMEM배지로 2번 세척해준 후에, 무혈청DMEM배지를 새로 교체하고 시료를 처리하였다. DMSO는 0.1%로 맞추었다. 15분 후에 350 ㎕의 배지를 걷어내었고, 다시 15분 후에 동량을 걷어내었으며, 다시 15분 후에 1차례 더 동량을 걷어내었다. 15,000 x g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 걷어내어 ELISA를 수행할 때까지 -20℃에서 보관하였다. ELISA는 HA-ELISA kit (echelon)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. ATRA(all-trans-retinoic acid) 1 μM을 양성대조군으로 사용하였다.

- 실험 결과

제조예 1에서 수득한 백화사설초 추출물과 제조예 2에서 수득한 효소가 처리된 백화사설초 추출물이 첨가된 각질세포에서 HA의 생성량을 확인하기 위해 ELISA kit를 사용하였다. 24시간 동안 시료를 처리한 뒤 HA ELISA kit를 이용하여, 시료 처리 이후 15분, 30분, 45분, 및 60분 후의 별 시험군에서 HA의 생성량을 측정한 결과를 각각 도 4내지 7에 나타내었다. 그 결과, 효소 C가 단독으로 처리된 백화사설초 추출물이 첨가된 실험군 및 효소 A 및 C가 병용 처리된 백화사설초 추출물이 첨가된 군에서, 양성대조군인 RA 처리 군보다 우수하게 HA의 생성량을 나타내었다. 효소 A 및 효소 C가 병용 처리된 백화사설초 추출물은 효소 C가 단독 처리된 백화사설초 추출물에 비해 효소 C가 절반만큼 처리되었음에도 불구하고 효소 C가 단독 처리된 백화사설초 추출물과 동일한 수준으로 보습 효과를 가짐을 알 수 있었다.

실험예3. HAS2 유전자 발현 확인

- 실험 방법

백화사설초 추출물이 각질세포에서 HAS2 유전자의 발현이 촉진되는지 확인하고자 하였다. 각질세포에 이미 HAS2 유전자 발현을 유도한다고 알려진 ATRA(all-trans-retinoic acid) 0.1 μM또는 1 μM을 처리한 후 RT-PCR를 수행하였으며, 기존에 보고된 HAS2 프라이머를 사용하였다. HAS2 및 GAPDH의 PCR 수행을 위한 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

Gene	Direction	Sequence (5' → 3')	Size (bp)
HAS2	Forward	GCT ACC AGT TTA TCC AAA CG (서열번호 1)	393
HAS2	Reverse	GTG ACT CAT CTG TCT CAC CG (서열번호 2)	393
GAPDH	Forward	ATT GTT GCC ATC AAT GAC CC (서열번호 3)	546
GAPDH	Reverse	AGT AGA GGC AGG GAT GAT GT (서열번호 4)	546

2 μg의 RNA로 만든 cDNA 1 μL을 대상으로 94℃에서 15분, 35 사이클: 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 60초, 72℃에서 10 분의 조건으로 수행하였다. 젤 상에 여타 다른 밴드는 육안으로 확인하지 못하였으며, 393 bp의 HAS2 와 546 bp의 GAPDH 밴드를 마커와 비교 확인할 수 있었다. ATRA 1 μM 처리한 경우 0.1 μM 처리한 경우보다 밴드가 좀 더 진하게 나타났다. 최종 PCR 조건은 2 μg RNA 대상으로 만든 cDNA 3 μL에 동일 온도조건에 사이클 수는 32회로 정하였다.

- 실험 결과

상기 확립된 조건으로 백화사설초 추출물 50, 100, 200 μg/mL을 처리된 각질세포에 대해RT-PCR을 수행하여 유전자 발현 효과를 확인한 결과, HAS2 유전자의 발현이 확인되었다. 해당 결과를 도 8에 기재하였다. 농도의존적인 유전자 발현을 확인하였으며, 비교적 낮은 농도에서도 HAS2 유전자가 발현되는 것으로 확인되었다. 즉, 인체 각질세포에 대한 보습 효능이 세포 내부로부터 기인하는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HA, HUN YONG <120> COSMETIC COMPOSITON COMPRISING HEDYOTIS DIFFUSA EXTRACT TREATED WITH COMPLEX EXZYME <130> P20190263KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS2 Forward Primer <400> 1 gctaccagtt tatccaaacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAS2 Reverse Primer <400> 2 gtgactcatc tgtctcaccg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 3 attgttgcca tcaatgaccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 4 agtagaggca gggatgatgt 20

Claims

α-아밀라아제 및 셀룰라아제를 포함하는 복합효소가 처리된 백화사설초 추출물을 포함하고, 상기 백화사설초 추출물은 물과 에탄올의 혼합 용매로 추출되고, 상기 백화사설초 추출물 100 중량부에 대하여 상기 복합효소가 1.68 중량부 처리되는 것인, 히알루론산을 증가시키는 피부 보습용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 복합효소는 α-아밀라아제 및 셀룰라아제를 1:9 내지 9:1의 중량비로 포함하는 것인, 히알루론산을 증가시키는 피부 보습용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 백화사설초 추출물은 전체 화장료 조성물 중량 대비 0.001 내지 10 중량% 함유하는 것인, 히알루론산을 증가시키는 피부 보습용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 히알루론산을 증가시키는 피부 보습용 화장료 조성물은 HAS2 유전자 발현을 증가시키는 것인, 히알루론산을 증가시키는 피부 보습용 화장료 조성물.
백화사설초를 물과 에탄올의 혼합 용매로 추출하여 백화사설초 추출물을 얻는 단계;
상기 백화사설초 추출물 100 중량부에 대하여 α-아밀라아제 및 셀룰라아제를 포함하는 복합효소를 1.68 중량부 제공하는 단계; 및
상기 백화사설초 추출물에 상기 복합효소를 처리하는 단계를 포함하는, 제1항의 히알루론산을 증가시키는 피부 보습용 화장료 조성물의 제조방법.