JPS63233921A - 抗腫瘍活性物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は熱変性を受けていない植物種実、又は植物種実
加工物を原料とし、該原料中の蛋白性物質を抽出精製し
て得られる抗腫瘍活性物質及びその製造に関連する産業
分野において利用される。

（従来の技術） 従来、抗腫瘍活性物質を製造する方法として、種々の細
胞、微生物の生産する抗腫瘍活性物質を精製する方法、
穀類に関してはその表層部を加圧加熱処理した処理物よ
り抗腫瘍活性物質を採取する方法（特開昭５３−１３９
７１号）、又はハリ１二シダの種子より熱水抽出する方
法（特開昭５４−１５４５０８号）が知られている。

またリゾプス・オリーゼ−Ｍ２４株を用いて穀類を発酵
させた後、発酵液より抗Ｂ瘍物質を採取する方法（特公
昭６１−４１５５１号）が知られていた。

従来、食酢製造時の残渣は飼料にされていた。

（発明が解決しようとする問題点） 前記従来の技術で細胞を使う場合、大ｍ＠養が困難であ
り、培地も非常に高価である。また、微生物由来のもの
に関しては、安全性の面より高度に精製する必要がある
。また、穀類より抽出する方法に関しては、物質が非蛋
白系の多糖類であり、抽出に際して、加圧加熱処理に多
大のエネルギーを要したり、菌株を純粋に培養する必要
があり、産業上の利用性に欠けるものである。また、ハ
リ工〔シダの種子より抽出する方法は、熱水抽出であり
、天然有効成分が変性破壊されている可能性がある。

（問題点を解決する為の手段） 然るに特許請求の範囲第１項記載の発明は、熱変性を受
けていない植物種実、又は植物種実の加工物から蛋白性
物質を精製したので、比較的少量で抗腫瘍活性が大きい
。前記における蛋白性物質とは、蛋白質および蛋白質を
含む物質をいう。

また特許請求の範囲第３項の発明は、熱変性を受けてい
ない植物種実、あるいは熱変性を受けていない植物種実
加工物を原料とし、該原料を必要とあらば粉砕し、１〜
１０倍岱の水性溶媒を加え、必要に応じてアルコール、
酢酸を０．１〜１０％添加し防腐性をもたせ、エンド型
プロテアーゼを主体として、グルコアミラーゼ、ペクチ
ナーゼ等を含有する酵素剤を、原料に対し０．０１〜５
％添加し、温度３℃〜５０℃で１〜１５日間抽出を行う
か、もしくは前記原料に１〜１０倍聞の水性溶媒を加え
、蛋白成分の抽出を行った後に、エンド型プロテアーゼ
を主体とした酵素剤を前記原料に対し、０．０１％〜５
％添加し、温度３℃〜５０℃で１〜１０日間作用を行わ
しめ、総窒素に対するアミノ態窒素の比率（Ａｌｌｉｎ
ＯａＣｉｄ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ１以下Ａ、Ｅと略す
）が１０％〜６０％に達した時点で遠心分離、又はろ過
により固形分を除き、上澄液又はろ液にｒＩａＦｉアン
モニウムを１００％飽和になるＪ：うに添加し、沈澱し
た両分を遠心分頬して集めこれを蒸留水に？８Ｍし、透
析ぐ脱塩１り凍結乾燥することにより、抗腫瘍話性物費
を１！することができる。また、上記固形分を除いた上
ＫＪ液、ろ液さらに硫酸アンモニウム沈澱より必公とあ
らばイオン交換、ゲルろ過等の公知の方法により精製す
ることができる。尚、本発明にいう蛋白ｖ１物質とは蛋
白質又は蛋白質を含む物質のことである。

前記におけるアミノ態窒素の比率を１０％〜６０％とし
たが、１０％以下および６０％以上μＪ（に効率が悪い
ことが認められ、１０％より増加するにつれて効率がよ
くなり、６０％に近＋８　すれば徐々に効率が悲くなる
ことが認められた。

イン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）における抗腫瘍活性
は、以下のように検討した。正常細胞としてＢａ１ｂ／
ｃ３Ｔ３細胞（マウス胚線維芽細胞）を、腫瘍ａｌｌ＋
泡として、前記正常細胞を５Ｖ４ｏウイルスで形ｆｔ１
転換したｍＫｓＡ・４ＡＣ１１Ｍ胞を用いた。培養５日
目の細胞を１０％牛脂児血清含右ＭＥＭ培地に懸濁し、
１×１０５個になるようにシャーレ（内ｔＹ　６　ｃｒ
ａ　）に播種し、さらに同培地に溶解し、ろ過減菌した
試料１ｉを添加して培地を合計４ｄとする。３７℃、５
％ＣＯ２存在下で培養し、５日目にギムザ染色し、細胞
密度計（オリンパス製）により対照群（培地のみ添加）
に対する生育率を測定した。

結果を第１表に示す。

第１表より、本発明物質は腫瘍細胞の増殖は顕著に抑制
するが、正常細胞に対しては毒性がないことが明らかで
ある。

次いでイン　ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）における抗腫瘍
活性を以下のように検討した。ＩＣＲ系マウス（雌性、
８３！ｌ令、体重２８ｇ±１９）を用い、１群を６匹と
し、ザルコーｖ　（Ｓａｒｃｏｍａ）−１８０を２×１
０５個腹腔内に移植し、当日より連続して５日間、Ｐ　
Ｂ　Ｓ　（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓａｌ
　１ｎｅ）に懸濁した試料を腹腔的投与し、６００日目
マウスの生存数及び延命率（ＩＬｓ）より抗腫瘍活性を
検討した。対照はＰＢＳのみを投与したものである。こ
の結果を第２表に示す。

第２表 ＭＳＤ：平均延命日数（死亡例についての値）ＩＬＳ：
延命率（死亡例についての値）生存数：１群６匹中６０
日以上生存しているマウス数 Ｃ：対照群のＭＳＤ Ｔ二治療群のＭＳＤ　　　　′ 第２表より、本発明物質はイン　ビボ（ｉｎｖｉｖ０）
においても顕著な抗腫瘍活性を有することが明らかであ
る。

次に澱粉質を除去した後、蛋白性物質を抽出する特許請
求の範囲第６項記載の発明について説明する。

本発明は、熱変性を受けていない植物種実より機械的方
法、酵素的方法、又は生物的方法の単独もしくは組合せ
で澱粉質を除去した後、水性溶媒もしくは、水性溶媒に
酵素を添加して蛋白成分を抽出し、該蛋白成分を含む抽
出液より蛋白性物質を精製することを特徴としたもので
ある。

前記における機械的方法とは、粉砕および篩別など穀類
の外殻を機械的に破壊して澱粉質を除去する方法であり
、ＷＩＪ索的方法とは、酵素類の単独又は複合使用によ
って澱粉質を除去する方法である。また生物的方法とは
、例えば糸状菌類を用いて澱粉質を除去する方法である
。前記三つの方法は、穀類の性質に適応するように単独
、又は組み合わせて用いることにより澱粉質を効率よく
除去することができる。実際適用に際しては、例えば熱
処理していない穀類を水に浸漬し、湿潤状態で粉砕し篩
別により説教粉物を得るか、該原料を粉砕後、１〜１０
倍ｆＭの水、原料に対し０．０１％〜５％のグルコアミ
ラーゼを主体とする酵素剤、さらに効率的に説教粉を行
い、かつ雑菌汚染を防ぐために酵母を添加し、２０℃〜
３５℃にて、２〜６日間アルコール発酵を行わしめ、８
０％〜９９％の澱粉が除去された後、発酵液を遠心分離
又はろ過し、説教粉物を得る。該説教粉物に対し、０．
１〜２０倍量の水性溶媒、もしくは０．１〜２０倍量の
水性溶媒に０．０１％〜５％のエンド型プロテアーゼを
主体°とする酵素剤を添加し、３℃〜５０℃で１〜１５
日間蛋白成分を抽出する。

その後遠心分離で固形分を除去し、抽出液に硫酸アンモ
ニウムを１００％飽和になるように添加し、沈澱する両
分を透析により脱塩後、凍結乾燥することにより、抗腫
瘍活性物質を得ることができる。

以下、前記発明による生成物（実施例６〜９）について
説明する。

イン　ビトロ（ｉｎ　ＶｉｔｒＯ）における抗腫瘍活性
は、前記と同様に検討した。結果を第３表に示す。

第３表 第３表より、本発明物質は腫瘍細胞の増殖を顕著に抑制
するが、正常細胞に対しては毒性がないことが明らかと
なった。

次いでイン　ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）における抗腫瘍
活性を前記と同様に検討した。結果を第４表に示す。

第４表 第４表より本発明物質は、イン　ビボ（ｉｎｖｉｖＯ）
においても顕著な抗腫瘍活性を有することが明らかであ
る。

特許請求の範囲第１１項に記載した発明は、熱変性を受
けていない植物種実、即ち加熱処理等によって種実中の
澱粉のα化、蛋白質の変性、その他諸成分の熱分解を受
けていない植物種実を原料とし、これを粉砕後、２〜７
倍Ｗの水を加えて原料１ｇ当たり酵素活性でグルコアミ
ラーゼ２〜２０単位、プロテアーゼ１〜１０単位、α−
アミラーゼ５〜５０単位、ペクチナーゼ０．１〜０．５
単位、セルラーゼ０．０１〜０．１単位、リバー−ゼ１
〜６０単位を含有するように酵素を添加し、同時に市販
又は自家培養酵母を加えて種実中の澱粉糖化、諸成分の
溶出及びアルコール発酵を２０℃〜３５℃で２日〜７日
間行う。次いで培養液に酢酸菌を接種し２０℃〜３５℃
にて、１日〜１４日間発酵を行わしめ、発酵終了侵、濾
過又は遠心分離により固形分を除去し、濾液又は上澄液
をケイソウ土濾過、メンプラン濾過によって不溶成分及
び菌体を除いた清澄液に硫酸アンモニウムを添加し、５
０〜１００％飽和度の両分を分取して得られた沈澱物を
蒸留水にて溶解し、透析後、凍結乾燥するか、もしくは
清澄液を分子ｆｆ１５０００のものを阻止する膜で限外
濾過を行い、膜上残留画分を凍結乾燥することにより抗
腫瘍活性物質を得ることができる。

本発明で用いる各酵素の活性測定及び力価算出は次のよ
うにして行った。

・グルコアミラーゼ ０．５％澱粉溶液に酵素を作用させ生成する還元糖をフ
ェーリング試液と加熱し、定石的に亜酸化銅を沈澱させ
、過剰の銅を硫Ｍ酸性及びヨウ化カリウム存在下におい
てチオ硫酸ナトリウムで滴定する。

力　　　価 ｐＨ４，５，３０℃±１℃の条件下で３０分間に１１０
１ｒｒのブドウ糖を生成する酵素力を１単位とする。

・プロテアーゼ １．５％ミルクカゼイン溶液に酵素を作用させ酵素作用
によってトリクロル酢酸可溶となった区分についてアル
カリ性フォーリン試液にて発色させ６６０　ｎｍにおけ
る吸光度を測定する。

力　　　価 ｐＨ４，５，３０℃±１℃の条件下で６０分間にチロシ
ン１＃Ｉ！Ｆに相当するアミノ酸を生成する酵素力を１
単位とする。

・αアミラーゼ ０．５％澱粉溶液に酵素を作用させ、酵素作用により澱
粉のヨード呈色度（６６０ｎｍで測定）が減少する度合
を比色定ｍする。

力　　　価 ｐＨ４，５，３０℃±１℃の条件下で１分間にヨード呈
色度を１％減少させる酵素力を１単位とする。

・ペクチナーゼ ０．５％ペクチン溶液に酵素を作用させ粘度の低下を粘
度計で測定する。

力　　　価 ｐＨ４，５，３０℃±１℃の条件下で１分間に粘度を５
０％低下させる酵素力を１単位とする。

・セルラーげ ０．６２５％ＣＭＣ−Ｎａ溶液に酵素を作用させ、生成
する還元糖をグルコアミラーゼの場合と同様の方法で定
量する。

力　　　価 ｐＨ４，５，３０℃±１℃の条件下で３０分間に１０＃
１ｇのブドウ糖を生成する酵素力を１単位とする。

・リパーゼ ２０％オリーブ油乳液に酵素を作用させ生成する脂肪酸
を水酸化ナトリウムで滴定する。

力　　　価 １）Ｈ４，５，３０℃±１℃の条件下で１分間に１μｓ
ｏｆの脂肪酸を生成する酵素力を１単位とする。

次に実施例１０〜１３により得た本発明有効物質の成分
分析値を第５表に示す。

第５表より本発明物質は、蛋白性のものであることがわ
かる。なお分析方法は以下の方法に基づいて行った。

タンパク質　ローリ−法 （Ｃ，Ｄ、　５ｔａｕｒｆｅｒ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　６９．　６４６．１９
７５）糖　　　　　フェノール硫酸法 （Ｍ、　Ｄｕｂｏｉｓ　、　Ｋ、　Ａ、　Ｇ１１ｌｅｓ
　。

Ｊ、　　　Ｋ、　　　Ｈａｍｉｌｔｏｎ　　、　　　Ｐ
、　　　Ａ、　　　Ｒ−ｅｂｅｒｓ　、　ａｎｄ　Ｆ、
　Ｓｍ１ｔｈ、　Ａｎａ−１Ｖｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ
Ｓｔｒｙ２８．３５０゜イン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ）における抗Ｍ瘍活性は以下のように検討した。腫瘍
細胞としては、Ｂａ１ｂ／ｃ３Ｔ３　　（マウス胚線維
芽細胞）を５Ｖ４ｏウイルスで形質転換したｍＫｓＡ・
４ＡＣ細胞を用いた。１試料８枚のシャーレ（内径６０
Ｉ）を用意し、培養５日目の細胞を１０％牛脂児血清含
有ＭＥＭ培地に懸濁し、ｌＸ１０６個になるように各シ
ャーレに播種し、次いで同培地に溶解した試料１−を添
加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で５日間培養し、細胞
数をカウントした。対照としては、培地のみを添加した
ものを用いた。結果を第６表に示す。

第６表 Ｃ：対照群の細胞数 Ｔ：試料添加群の１ｉｆＩ胞数 ※　ハトムギを原料として、原料中の澱粉を公知の蒸煮
法により液化、糖化を行った後、本発明と同様の方法に
て硫酸アンモニウムの分画沈澱を行い５０〜１００％飽
和度で沈澱するものを透析後、凍結乾燥したものである
。

原料１　Ｋ’Ｊより４．１ｇの白色粉末を得た。

第６表より本発明物質は顕著に腫瘍細胞の増殖を抑制す
ることが明らかである。。また製造工程中で熱処理を行
うことにより、その活性は失われる。次いでイン　ビボ
（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）における抗腫瘍活性の検討を前記
と同様に行った。結果を第７表に示す。

第７表 ※　第６表の熱処理と同じ試料 前記第７表より本発明物質はイン　ピボ（ｉｎｖｉｖｏ
　）においても顕著な抗腫瘍活性を有することが明らか
である。

次いで実施例１８〜２０によって得られた抗腫瘍活性に
ついて上記と同様に検討した。

第８表に試験結果をまとめて示す。

第８表 第８表の結果より本発明より得た物質は非常に高い抗腫
瘍活性を有すること、特に１０Ｉｒｔｇ／マウス投与群
に関しては、完治するという結果が得られ、本発明より
得た物質は画期的な制癌剤になるものと考えられる。

次に特許請求の範囲第１１項記載の発明に関する実施例
１４〜１７は、植物種実を原料とし、粉砕後、２〜２０
倍量の水を加え、原料に対し０゜０１％〜２％のグルコ
アミラーゼ、必要に応じて０．０１％〜２％のα−アミ
ラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼを添
加する。またグルコアミラーゼによるデンプンの溶出効
率を良くするとともに雑菌汚染を防ぐために酵母を添加
してアルコール発酵させる。ついで１５℃〜６０℃の温
度で４日〜２０日間溶出を行ない、濾過又は遠心分離に
より固形分を除去し、ろ液又は上澄液に硫酸アンモニウ
ムを添加し、５０％〜１００％飽和度の沈澱物を蒸溜水
にて溶解し透析後、凍結乾燥するか、もしくは分画分子
ｆｆ１１０．０００の膜を用いた限外ろ過により脱塩、
濃縮し凍結乾燥することにより抗１ｔ！！瘍活性物質を
得ることができる。さらに必要とあらばイオン交換、ゲ
ルろ過等の公知の方法により精製することができる。

前記における植物種実とは、例えばハトムギ、玄米、ト
ウモロコシなどが考えられる。

以下、本発明による生成物を詳細に説明する。

まず成分分析値を第９表に示す。

第９表 蛋白質、糖はそれぞれローリ−法、フェノール硫酸法に
て測定した。

第９表より、本発明物質は、蛋白性物質であることがわ
かる。

イン　ビトロ（ｉｎ　ＶｉｔｒＯ）における抗腫瘍活性
は前記と同様に検討した。結果を第１０表に示す。

第１０表 第１０表より本発明物質は顕著に腫瘍細胞の増殖を抑制
するが、正常細胞に対しては毒性が少ないことが明らか
である。

次いでイン　ビボ（ｉｎ　ＶｉＶＯ）における抗腫瘍活
性を前記と同様に検討した。結果を第１１表に示す。

第１１表 第１１表より本発明物質は、イン　ビボ（ｉｎ　ｖｉＶ
Ｏ）においても顕著な抗腫瘍活性を有することか明らか
である。

また本発明で使用する微生物の酵母及び酢酸菌は、我国
で古来から清酒・食酢の醸造に用いられてきたものであ
り、その発酵産物の安全性は歴史的に証明されている。

また、これらの主要発酵産物であるアルコール又は酢酸
は殺菌性を有するため発酵管理が細胞培養と比較すると
非常に容易であり、諸設備も簡単なもので充分である。

（発明の作用） 本発明の蛋白性物質は、抗腫瘍活性を有し、制癌作用が
認められた。また本発明の方法によれば、植物種実、又
は植物種実の加工物から容易に蛋白性物質を抽出するこ
とができる。

次に本発明の実施例について説明する。

（実施例１） ハトムギ１　Ｋｇを粉砕し、２．５１の水、１２５−の
エタノール、エンド型の市販プロテアーゼ剤２ｇ及び市
販ペクチナーゼ剤２ｇを加え、３０℃にて６日間抽出し
、Ａ、Ｅ値が３６％になった時点で、４０００ｘｇ、５
分間遠心分離し、固形分を除去し、上澄液をケイソウ土
ろ過、メンプラン（０，４５［）ろ過を行ない、清澄液
に硫酸アンモニウムを添加し、１００％飽和で沈澱する
両分を蒸留水に溶解し、透析後凍結乾燥し、黄色粉末の
抗腫瘍活性物質１．１ｇを得た。

（実施例２） ハトムギを原料として無蒸煮アルコール発酵を行った残
渣Ｉ　Ｋｇに（水分６０％）５１の水、酢酸２００１ｒ
ｄ１１エンド型の市販プロテアーゼ剤２ｇを加え、３５
℃にて５日間抽出を行った。Ａ、Ｅ値が３７％になった
時点で、ろ過により固形分を除去し、ろ液をメンプラン
（０，４５７７ＪＩ）ろ過し、清澄液に硫酸アンモニウ
ムを加え、１００％飽和で沈澱する両分を蒸留水に溶解
し、透析後凍結乾燥し、褐色粉末の抗腫瘍活性物質０．
９ｇを得た。

（実施例３） ハトムギ１　Ｋｇを粉砕後、３１のリン酸緩衝液（５０
ｍＭ、ｐＨ７，０）　、エタノール１５０雇を加え、３
０℃で２日間抽出を行なう。ろ過により固形分を除去し
、ろ液にエンド型の市販プロテアーゼ剤２９、ペクチナ
ーゼ剤１ｇを添加し、４０℃にて２日間作用させる。Ａ
、Ｅ値が３８％になった時点で、メンプラン（０，４５
ｍ）ろ過を行ない、ろ液に硫酸アンモニウムを加え、１
００％飽和にて沈澱する両分を蒸留水に溶解し、透析後
凍結乾燥し、黄色粉末の抗腫瘍活性物質１．２ｇを得た
。

（実施例４） トウモロコシ１　Ｋｇを粉砕し、２．５１の水、１２５
ｄのエタノール、エンド型の市販プロテアーゼ剤２ｇ、
ペクチナーゼ剤２ｇを加え、３０℃で５日間抽出し、Ａ
、Ｅ値が４３％に達した時点で、４０００Ｘ９．５分間
遠心分離し、固形分を除去し、上澄液をケイソウ土ろ過
、メンプラン（０゜４５ｍ）ろ過を行ない、清澄液に硫
酸アンモニウムを添加し、１００％飽和で沈澱する画分
を蒸留水に溶解し、透析後凍結乾燥することにより淡黄
色粉末の抗腫瘍活性物質０．９ｇを得た。

（実施例５） 玄米１　Ｋｇを粉砕し、２．５１の水、１２５ｄのエタ
ノール、エンド型の市販プロテアーゼ剤２ｇ、ペクチナ
ーぜ剤２ｇを加え、３０℃にて５日間抽出し、Ａ、Ｅ値
が３１％に達した時点で、４００ｏｘｇ、５分間遠心分
離し、固形分を除去し、上澄液をケイソウ土ろ過、メン
プラン（０，４５ｎ）ろ過を行ない、清澄液に硫酸アン
モニウムを添加し、１００％飽和で沈澱する両分を蒸留
水に溶解し、透析後凍結乾燥することにより、淡黄色粉
末の抗腫瘍活性物質０．５ｇを得た。

（実施例６） ハトムギＩ　Ｋ’Ｊを粉砕し、水２．７１、市販グルコ
アミラーゼ剤２ｇ及び市販パン酵母３ｇを加え、３０℃
で４日間アルコール発酵を行った。発酵液を５０００Ｘ
ｇ、５分間遠心分離し、ｆＢ；２澱粉物を得たく沈澱）
。さらに該説教粉物にリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７
，０）　５１を添加し、４℃で２日間攪拌、抽出を行っ
た。５０００Ｘり、５分間遠心分離し、固形分を除き、
抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、１００％飽和で沈
澱する両分を蒸溜水に溶解し、透析後、凍結乾燥し、黄
褐色粉末の抗１１！瘍活性物質１．２９を得た。

（実施例７） ハトムギ１　Ｋｇを水洗後、水５１に１日浸漬し、水切
後、水２１を加え、５分間湿潤状態で粉砕する。次いで
粉砕物を１００メツシユの篩にかけ、残存物を説教粉物
とし、該説教粉物に水３１、酢１１２０ｍ及び市販プロ
テアーゼ剤１ｇ、ペクチナーゼ剤１ｇを加え、３０’Ｃ
で７日間抽出を行った。５０００ｘｇ、５分間遠心分離
し、固形分を除去し、抽出液に硫酸アンモニウムを添加
し、１００％飽和で沈澱する画分を蒸溜水に溶解し、透
析後、凍結乾燥し、、黄褐色粉末の抗腫瘍活性物質０．
９ｇを得た。

（実施例８） トウモロコシＩ　Ｋｇを粉砕し、水２．７１、市販グル
コアミラーゼ剤２ｇ及び市販パン酵母３びを加え、３０
℃で４日間アルコール発酵を行った。

発酵液を５０００Ｘｇ、５分間遠心分離し、説教粉物を
得た（沈澱）。さらに該説教粉物に水５１、酢ＦＩｉ２
００ｒｄ１及び市販プロテアーゼ剤１ｇ、ペクチナーゼ
剤０．５ｇを加え、３０℃で６日間抽出を行った。５０
００ｘｇ、５分間遠心分離し固形分を除去し、抽出液に
硫酸アンモニウムを添加し、１００％飽和で沈澱する画
分を蒸溜水に溶解し、透析後、凍結乾燥し、淡黄色粉末
の抗腫瘍活性物質０．８９を得た。

（実施例９） 玄米１に３を粉砕し、水２．７１、市販グルコアミラー
ゼ剤２ｇ及び市販パン酵母３ｇを加え、３０℃で４日間
アルコール発酵を行った。発酵液を５０００）ｌ、５分
間遠心分離し、説教粉物を得た（沈澱）。該説教粉物に
水５１、酢１！Ｉ！２００Ｉｄ及び市販プロテアーゼ剤
１ｇ、ペクチナーゼ剤０゜５ｇを加え、３０℃で１０日
間抽出を行った。５０００ｘｇ、５分間遠心分離し固形
分を除去し、抽出液に１ａ酸アンモニウムを添加し、１
００％飽和で沈澱する両分を蒸溜水に溶解し、透析後、
凍結乾燥し、淡黄色粉末の抗腫瘍活性物質０．７１７を
得た。

（実施例１０） ハトムギＩ　Ｋｙを粉砕し、２．７１の水を加え市販の
グルコアミラーゼ剤２ｇ、プロテアーゼ剤１３及び市販
パン酵母３ｇを加え、２８℃〜３０℃で４日間発酵を行
った。次いで酢酸菌を接種し、２８℃〜３０℃で６日間
発酵させ、発酵終了後、培養液を４０００）ｌ、１０分
間遠心分離し、固形分を除去し、上澄液をメンプラン濾
過を行った後、硫酸アンモニウムを添加し、５０％〜１
００％飽和度の両分を分取して得られた沈澱物を蒸留水
に溶解し、透析後、凍結乾燥し、白色粉末の抗腫瘍活性
物質７．３ｇを得た。

（実施例１１） ハトムギＩ　Ｋｇを粉砕し、３．０１の水を加え、市販
のグルコアミラーゼ剤２ｇ、ペクチナーゼ剤０．５！？
及び予め培養し捕集した生酵母３ｇを加え、２８℃〜３
０℃で６日間発酵を行った。次いで酢酸菌を接種し、１
０日間発酵し、発酵終了後、濾過して固形分を除き、濾
液を分子ｆｆ１５０００のものを阻止する膜で限外濾過
行い膜上残留画分を凍結乾燥することにより、淡黄色粉
末の抗１１ｍ瘍活性物質１５．３９を得た。

（実施例１２） 玄米１　Ｋ’Ｊを粉砕後、２．７１の水を加え市販のグ
ルコアミラーゼ剤２ｇ、セルラーゼ剤１ｇ及び市販のパ
ン酵母３ｇを加え２８℃〜３０℃で５日間発酵を行った
。次いで酢酸菌を接種し、２８℃〜３２℃にて６日間発
酵を行い終了後、培養液を４０００）ｌ、１０分間遠心
分離し、固形分を除去し、上澄液をメンプラン濾過を行
った。濾液に硫酸アンモニウムを添加し、５０％〜１０
０％飽和度の両分を分取して得られた沈澱物を蒸溜水に
溶解し、透析後、凍結乾燥し、淡黄色粉末の抗腫瘍活性
物質３．９ｇを得た。

（実施例１３） トウモロコシＩ　ＫＷを粉砕後、２．７１の水を加え、
市販のグルコアミラーゼ剤２ｇ及び市販のパン酵母３ｇ
を加え、２８℃〜３０℃で４日間発酵を行った。次いで
酢酸菌を接種し、２８℃〜３２℃にて１０日間発酵を行
い発酵終了後、培養液を４０００Ｘ９．１０分間遠心分
離し、固形分を除去し、上澄液をメンプラン濾過し、濾
液に硫酸アンモニウムを添加し、５０％〜１００％飽和
度の画分を分取して得られた沈澱物を蒸留水に溶解し、
透析後°、凍結乾燥し、淡黄色粉末の抗腫瘍活性物質４
．８ｇを得た。

（実施例１４） ハトムギＩ　Ｋ’ｌを粉砕し、３ｊ！の水を加え、市販
のグルコアミラーゼ剤２ｇ、プロテアーゼ剤１ｇ及び市
販パン酵母３ｇを加え、２８〜３０℃にて１２日間溶出
を行なった。溶出液を４０００Ｘｇ、５分間遠心分離し
、固形分を除去し、上澄液をケイソウ土ろ過、メンプラ
ン（０，４５１ろ過を行ない清澄液に硫酸アンモニウム
を添加し、５０〜１００％飽和度の沈澱物を蒸溜水に溶
解し、透析後、凍結乾燥し、黄色粉末の抗腫瘍活性物質
１゜８９を得た。

（実施例１５） ハトムギ１にグを粉砕し、２，７１の水を加え、市販の
グルコアミラーゼ剤２ｇ、プロテアーゼ剤１ｇ、ペクチ
ナーゼ剤０．５ｇ及び予め培養し捕集した生Ｗ９８１３
　ｇを加え、３０〜３２℃で１４日間溶出を行ない、溶
出液をろ過し、固形分を除去後、分画分子ｆｆ１１０．
０００の膜を用い限外ろ過を行って１０倍に濃縮脱塩す
る。１１縮液を凍結乾燥し淡黄色粉末の抗腫瘍活性物質
４．５ｇを得た。

（実施例１６） 玄米Ｉ　Ｋｙを粉砕後、３１の水を加え市販のグルコア
ミラーゼ剤２ｇ、プロテアーゼ剤１ｇ、セルラーゼ剤０
．５ｇ及び市販パン酵母３ｇを加え、２８〜３０℃にて
１４日間溶出を行ない溶出液を４０００Ｘグ、５分間遠
心分離し、固形分を除去し、上澄液をケイソウ土ろ過を
行った。ろ過に硫酸アンモニウムを添加し、５０〜１０
０％飽和度の沈澱物を蒸溜水に溶解し、透析後、凍結乾
燥し、淡黄色粉末の抗腫瘍活性物質１．２ｇを得た。

（実施例１７） トウモロコシＩ　Ｋｌを粉砕後、２．７１の水を加え市
販のグルコアミラーゼ剤２ｇ、プロテアーゼ剤２ｇ及び
市販乾燥パン酵母１ｇを加え、２８〜３０℃にて１４日
間溶出を行ない、溶出液をケイソウ土ろ過し、ろ過に（
ｉｌ［アンモニウムを添加し、５０〜１００％飽和度の
沈澱物を蒸溜水に溶解し、透析後、凍結乾燥し、淡黄色
粉末の抗腫瘍活性物質１．３ｇを得た。

（実施例１８） ハトムギＩ　Ｋｇを粉砕し、２．７１の水を加え、市販
のグルコアミラーゼ剤２９、プロテアーゼ剤１ｇ、リパ
ーゼ剤１ｇ及び市販のパン酵母３ｇを加えて２８℃〜３
０℃で４日間発酵を行った。

次いで培養液に酢Ｍ菌を接種し、２８℃〜３２℃にて７
日問静置発酵を行った。発酵終了後、培養液を４０００
ｘｇ、１０分間遠心分離し、固形分を分離し、その上澄
液をメンプランろ過を行って除菌後、減圧下で濃縮し、
濃縮液にエタノールを加え、エタノール濃度２０％〜８
０％の間に生成する沈澱物を適量の水で溶解１！凍結乾
燥し、淡灰色の粉末１５．２ｇを得た。

（実施例１９） 玄米Ｉ　Ｋｇを粉砕後、３．Ｏｌの水を加え、市販のグ
ルコアミラーゼ剤１ｇ、α−アミラーゼ剤０゜５グ、プ
ロテアーゼ剤１ｇ、セルラーゼ剤０．５９及び予め培養
し、固液分離した生酵母３ｇを加え、２８℃〜３０℃で
６日間発酵を行った。次いで酢酸菌を接種し２８℃〜３
０℃にて３日間通気撹拌発酵を行った。培養液を限外濾
過により濃縮後、濃縮液にエタノールを添加し、エタノ
ール濃度２０％〜８０％の間に生成する沈澱を、退団の
水で溶解し、凍結乾燥することにより淡黄色粉末の抗腫
瘍活性物質１６．９ｇを得た。

（実施例２０） トウモロコシ１　Ｋｙを粉砕後、２．５１の水を加え、
市販のグルコアミラーゼ剤１ｇ、プロテアーゼ剤０．５
９、ペクチナーゼ剤１ｇ及び市販のパン酵母３ｇを加え
、２８℃〜３０℃で５日間発酵を行った。次いで酢Ｗ！
菌を接種し、２８℃〜３０℃にて６日問静置発醇を行っ
た。培缶液を４０００Ｘｇ、１０分間遠心分離すること
により、固形分を分離し、上澄液をメンプランろ過を行
って除菌し、減圧上濃縮後、濃縮液にエタノールを加え
エタノール濃度２０％〜８０％の間に生成する沈澱を適
量の水で溶解し、凍結乾燥することにより、淡黄色粉末
の族ｌｆｆ１ｍ活性物質５．３ｇを得た。

（発明の効果） 本発明の蛋白性物質は、腫瘍ｍｔｒｉａに特異的に増殖
抑制効果を示し、正常細胞に対しては毒性が少ないので
、実用性においてきわめて優れている。

また本発明の製造法によれば、植物種実中の天然成分に
ダメージを与えず容易に抽出できるので、０１作用が少
なく、活性の高い抗腫瘍活性物質が大同生産し得るため
、廉価に供給できるという効果がある。また酵素として
エンド型のプロテアーゼを使用した場合には、−ｍ大き
な効果が認められる。また原料から先づ澱粉を除去し、
然る後に蛋白性物質を抽出することにより、製造効率を
一層向上することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　熱変性を受けていない植物種実、又は植物種実の加
   工物から抽出した蛋白性物質を精製して得た抗腫瘍活性
   物質 ２　蛋白性物質は、蛋白質又は蛋白質を含む物質の単独
   又は混合物とした特許請求の範囲第１項記載の抗腫瘍活
   性物質 ３　熱変性を受けていない植物種実、又は植物種実の加
   工物を原料とし、これに水性溶媒を加えて蛋白成分を抽
   出した後に、酵素を作用させるか、又は前記原料に酵素
   を作用せしめて、蛋白成分を抽出し、該抽出液から蛋白
   性物質を精製することを特徴とする抗腫瘍活性物質の製
   造法 ４　酵素はエンド型プロテアーゼ又はグルコアミラーゼ
   を主体とした特許請求の範囲第３項記載の抗腫瘍活性物
   質の製造法 ５　蛋白性物質の精製は、酵素作用させた抽出液又は酵
   素抽出液中の総窒素に対するアミノ態窒素の比率が１０
   ％〜６０％に達した後行うことにした特許請求の範囲第
   ４項記載の抗腫瘍活性物質の製造法 ６　熱変性を受けていない植物種実より機械的方法、酵
   素的方法、又は生物的方法の単独もしくは組合せで澱粉
   質を除去した後、水性溶媒もしくは、水性溶媒と酵素を
   添加して蛋白成分を抽出し、該蛋白成分を含む抽出液よ
   り蛋白性物質を精製することを特徴とした抗腫瘍活性物
   質の製造法 ７　機械的方法は植物種実を水に浸漬した後、粉砕およ
   び篩別することとした特許請求の範囲第６項記載の抗腫
   瘍活性物質の製造法 ８　酵素的方法は、植物種実にグルコアミラーゼを主体
   とする酵素を添加することとした特許請求の範囲第６項
   記載の抗腫瘍活性物質の製造法 ９　酵素は、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチ
   ナーゼを主体とした特許請求の範囲第６項記載の抗腫瘍
   活性物質の製造法 １０　生物的方法は、糸状菌類又は酵母を添加し、発酵
   させることとした特許請求の範囲第６項記載の抗腫瘍活
   性物質の製造法 １１　熱変性を受けていない植物種実を発酵可能の状態
   にした原料へ酵素単独、又は酵素と酵母の両方を加えて
   種実成分の溶出、又は同時にアルコール発酵せしめるか
   、もしくはさらに酢酸菌を接種して発酵せしめ、これら
   により得た発酵液を濾過し、前記濾液中に認められる蛋
   白性物質を精製することを特徴とした抗腫瘍活性物質の
   製造法 １２　酵素は、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、α−
   アミラーゼ及びペクチナーゼを主体とした特許請求の範
   囲第１１項記載の抗腫瘍活性物質の製造法 １３　熱変性を受けていない植物種実を粉砕後、２．０
   〜７．０倍量の水を加え、グルコアミラーゼを主体とす
   る酵素及び酵母を添加し、２５℃〜３０℃にて３日〜６
   日間アルコール発酵を行い、発酵液を濾過又は遠心分離
   し、分離液と、残渣を得る前記分離液は酢酸発酵させて
   食酢を製造し、該残渣を原料とし、水性溶媒もしくは、
   水性溶媒とエンド型プロテアーゼを主体とする酵素を加
   えて蛋白成分を抽出し、該抽出液から蛋白性物質を精製
   することによる食酢製造時の残渣からの抗腫瘍活性物質
   の製造法