JPH0139759B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は生理活性含セレン蛋白多糖体SEPSの
製造法に関し、詳しくはインターフエロン誘発
能、抗ウイルス作用、血小板凝集阻害作用、免疫
増強作用、宿主防御作用、血中トリグリセライド
減少作用、精神安定作用などの生理活性を有する
含セレン蛋白多糖体SEPSの製造法に関する。 セレンは動物にとつて一般的に有害な元素であ
るとされてきたが、最近では哺乳類、鳥類、数種
の細菌などにとつて微量必須元素であるとされる
ようになつた。例えば動物のグルタチオンパーオ
キシダーゼやある種の微生物のグリシンレダクタ
ーゼ、フオルメイトデヒドロゲナーゼの必須成分
であることが明らかになつている。従つて、セレ
ンが欠乏した場合には様々な疾患、例えば各種の
癌、痛風、高血圧、心臓病などが生ずることが報
告されている。また、最近では癌に対するセレン
の防御効果が注目されている。 以上に述べた研究に用いられたセレン化合物は
すべてセレン酸、亜セレン酸及びその塩あるいは
二酸化セレンのような無機セレン化合物または化
学的に合成された低分子の有機セレン化合物であ
り、いずれも毒性の強い物質であつた。 ところで本発明者らは、微生物が各種元素を菌
体内に取り込み、効率よく蓄積する能力があるこ
とに早くから着目して、微生物による各種元素の
取り込み及び取り込まれた各種元素の形態、その
生理作用について研究してきた。 これら一連の研究のなかでセレンは概して微生
物に対しては毒性が強く、その生育を阻害しやす
い元素であるが、微生物の種類、培養条件等を適
当に選べば、セレン化合物の存在下で培養された
微生物は効率よくセレンを吸収し、生体成分と有
機的に結合した状態で菌体内に蓄積することを見
い出した。 このようにして微生物菌体内に蓄積され有機化
したセレンの生理作用について鋭意研究した結
果、特にサツカロミセス属酵母菌体の含セレン高
分子画分物質にインターフエロン誘発能、抗ウイ
ルス作用、血小板凝集阻害作用、免疫増強作用、
宿主防御作用、血中トリグリセライド減少作用、
精神安定作用などの強い生理作用があることを見
い出した。なお、セレンを含有しない培地で培養
した酵母菌体から得た高分子画分を用いた場合や
無機セレン化合物（二酸化セレン、亜セレン酸ナ
トリウム）を用いた場合には、含セレン高分子画
分でみられた強い生理作用は認められなかつた。 本発明はこのような知見にもとづいて完成され
たものであり、サツカロミセス属酵母菌体に蓄積
され、有機化された各種の強い生理活性をもつ含
セレン蛋白多糖体SEPSを抽出、採取することよ
りなる生理活性含セレン蛋白多糖体SEPSの製造
法を提供するものである。 本発明に使用する酵母はサツカロミセス属に属
し、セレン化合物を含む培地で生育し、酵母菌体
中にセレンを取込むことができるものであればよ
く、例えばビール酵母（Saccharomyces
uvarum IAM−4778）、清酒酵母、ワイン酵母、
パン酵母（S.cerevisiae KyokaiNo.７）、しよう油
酵母（S.rouxii AHU−3014）、デンプン資化性
酵母（S.diastaticus IFO−1046）などを挙げる
ことができる。 また、これらの酵母を培養する培地に添加する
セレン化合物としては適当な水溶性があり、かつ
対象酵母の生育を著しく阻害しないものであれば
よく、例えば二酸化セレン、セレン酸、亜セレン
酸などの無機セレン化合物や低分子の有機セレン
化合物などがある。また、これらの酵母を培養す
る培地へのセレン化合物の添加量は、通常は１〜
100ppm、好ましくは10〜50ppmである。培養条
件、例えば温度、時間等については各酵母につい
て一般に知られている条件を適用すればよく、セ
レン化合物を培地に加えたことにより特別に配慮
しなければならない条件はない。 このようにしてセレンを含む培地で旺盛に生育
した酵母は、その菌体内にセレンを取り込み、有
機化して多重に蓄積していることを確認した。菌
体内に蓄積されたセレンの確認は、培養終了後、
培養液を遠沈して菌体を集め、0.01規定の塩酸及
び苛性ソーダでそれぞれ洗浄したのち、さらに十
分に洗浄して乾燥した菌体を超音波またはフレン
チプレス等で処理して破砕した後、固液分離して
得た液体部分について２，３−ジアミノナフタレ
ンによる螢光光度法により測定することによつて
行なつた。 含セレン蛋白多糖体SEPSの抽出には各種の方
法が適用でき、例えば菌体懸濁液を超音波やフレ
ンチプレス等に処理して菌体を破砕したり、自己
消化や酵素処理等により菌体成分を溶出させた
後、遠心分離等により上澄液を得る。次いでその
上澄液を流水中で透析し、透析内液を濃縮した
後、Sepharose CL−6B（カラム３×60cm）でゲ
ル濾過を行なう。分画パターンは第１図の通りで
あり、溶出区分を集め、凍結乾燥し淡褐色の含
セレン蛋白多糖体SEPSを得る。このSEPSの分
子量はSephadex CL−6Bの分画パターン及び
Sephadex Ｇ−25でボイドボリユームに溶出して
くることなどから1000以上であると判定される。
なお、このSEPSのセレン含量は150ppmであり、
高分子成分と結合して存在する。 以上のようにして抽出、採取された含セレン蛋
白多糖体SEPSの物理化学的性質は次の通りであ
る。 (1) 外観 淡褐色無定形粉末 (2) 一般的性状 分子量10000以上で糖及び蛋白質からなる。 (3) 元素分析 炭素、水素、酸素、窒素、リン及びSe等灰
分を含む。 Ｃ 45.4±3.2 Ｈ 6.6±1.5 Ｎ 3.9±1.1 Ｏ 42.4±3.0 灰 分 2.2±0.8 (4) 融点 微量融点測定装置（柳本製作所）で測定する
と210℃付近で褐変し、徐々に収縮して220〜
230℃近辺で黒変するが明瞭な融点あるいは分
解点を示さない。 (5) 紫外線吸収分析 酸性、中性、アルカリ性の各緩衝液中で特異
的な吸収を示さない。（第２図） (6) 赤外線吸収分析 本物質を含むKBr錠について測定した赤外
線吸収スペクトルは第３図に示す如くである。 (7) 溶解性 本物質は水に易溶であり、ジメチルスルホキ
サイドには僅かに溶け、メタノール、エタノー
ル、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、エチルエー
テル、ピリジン等多くの有機溶媒には殆んど溶
けない。 (8) 呈色反応 本物質の水溶液を用いて種々の呈色反応を試
験した結果は下の通りである。 １ フエノール硫酸法 陽性（糖類） ２ オルシン塩酸反応 陽性（糖類） ３ α−ナフトール反応（Molish）
陽性（糖類） ４ エルソン−モルガン反応 陽性（アミノ類） ５ ローリーフオリン法 陽性（ペプチド結合） ６ ランドスミス法 陽性（ペプチド結合） 以上の結果からSEPSはSeを含有する蛋白多糖
体であることが明らかである。 更にSEPSが示す各種の生理活性は下記の通り
である。 (1) インターフエロン誘発能 本物質についてマウスＬ細胞とウシ水泡性口
炎ウイルス（VSV）を用いた系でインターフ
エロン誘発能を測定した。 すなわち、ICR系６週齢のメスのマウスに
SEPSを静脈注射、腹腔内注射の各方法により
投与し、経時的に頚静脈より採血し、遠心分離
により血清を得た後、その血清中のインターフ
エロン力価をマウスＬ細胞とVSVを用いた系
によつてプラーク半減法により測定した。対照
群のウイルスが示すプラーク数の50％へプラー
ク数が減少した試料の希釈倍率をその試料のイ
ンターフエロン力価とする。単位はPRD₅₀（50
％plaque reducing dose）で表示する。 インターフエロン活性の強さは使用したサツ
カロミセス属酵母の種類、SEPSの投与量等に
よつて異なるが、ビール酵母
（Saccharomyces uvarum）より抽出した
SEPSを20mg／Kg腹腔内投与した場合は投与24
時間後のマウス血清中のインターフエロン力価
は1250単位／mlであつた。 (2) 抗ウイルス作用 インターフエロン誘発能と同様に、マウス細
胞とウシ水泡性口炎ウイルス（VSV）を用い
た系でSEPSの抗ウイルス作用の程度を測定し
た。 すなわち、プラスチツクシヤーレにマウスＬ
細胞を底面全面に単層を形成するまで培養した
後、古い培養液を除いてVSVを感染させる。
この際のウイルス接種量は細胞層上で100個ほ
どのプラークを形成する程度とする。約１時間
吸着させた後、SEPSを含む溶液を添加して２
時間処理し、次いで寒天を含む培養液を重層
し、37℃の炭酸ガスインキユベーター中で２日
間培養する。２日後にニユートラルレツドで染
色した後、プラーク数を算定し、前項と同様に
プラーク数を50％減少させる試料の希釈倍率を
抗ウイルス作用の力価とする。 ビール酵母（S.uvarum）より得たSEPSの
場合、50mg処理で抗ウイルス作用の力価は
120PRD₅₀であつた。 (3) 血小板凝集阻止作用 ヒト及びラツト血小板のADPによる凝集が
SEPSをADPと同時に添加することにより阻害
される。 ヒト血小板の分離法は次の通りである。ヒト
上腕正中静脈より1/10量の3.8％クエン酸ナト
リウム溶液を用いて採血し、静かに混和した後
1400r.p.m.で５分間遠心して血漿を分離する。
下層はさらに3000r.p.m.で５分間遠心して乏血
小板血漿を得る。先に分離した血漿は乏血小板
血漿で適宜希釈し、血小板数が３〜４×10⁵／
mm³になるように調製し、これを多血小板血漿
として実験に用いる。ラツト血小板の分離法も
ヒトの場合とほぼ同様である。 SEPSを0.9％NaCl溶液に溶解して0.1M溶液
とし、その50μをADPの２×10^-4M溶液の0.9
％NaCl溶液50μと混和し、25℃で１時間放置
する。次いで、その混合液50μをヒト及びラ
ツト血小板血漿（浮遊液）450μに添加し、
1000r.p.m.で撹拌下経時的に反応液50μを取
り出し、速やかに1.8％ホルマリン溶液450μ
を加えて反応を停止する。次いで、位相差顕微
鏡（×400）で凝集状態を観察する。 その結果、SEPSは明らかにADPによる血小
板凝集を阻害することがわかつた。 (4) 免疫増強作用 SEPSの担癌宿主の細胞性免疫能に及ぼす影
響をハプテン型抗原塩化ピクリルによるマウス
の遅延型皮膚反応を指標にして検討した。 ザルコーマ180腹水型腫瘍細胞10⁶個を一群10
匹のICR系雌性マウス６週齢の腹腔内へ注入
し、３日後にマウス腹部を剃毛し、塩化ピクリ
ル７％エタノール溶液を綿棒で均一に塗布して
感作する。試験群のマウスには、SEPSを生理
食塩水に溶かして500mg／Kgの投与量でガン細
胞注入後１、２、４、５、６、７、８及び９日
目にマウス用金属製胃ゾンデで強制的に経口投
与する。10日目にマウスの両耳の厚さダイヤル
シツクネスゲージで測定した後、塩化ピクリル
１％オリーブ油溶液を両耳の表裏に塗布する。
その24時間後に両耳の厚さを測定する。右左の
耳の厚さの増加の平均値を10^-4cm単位で表わ
し、正常マウスの値を100％として、それに対
する相対値で試験群の遅延型皮膚反応の強さを
表わす。 その結果、ビール酵母（S.uvarum）より抽
出した含セレン蛋白多糖体SEPSを用いた場
合、正常マウス対照群の耳厚の増加を100％と
すると、担癌マウス対照群は37℃であり、正常
なマウス含セレン蛋白多糖体SEPS投与群は96
％、担癌マウス含セレン蛋白多糖体SEPS投与
群は66％となつた。以上のことから含セレン蛋
白多糖体SEPSは正常マウスに対してはほとん
ど影響を与えないが担癌マウスに対しては低下
した免疫能を回復させる作用を有することが判
明した。 (5) 宿主防御作用 ICR6週齢メスのマウスに100％致死量の大腸
菌を感染させ、含セレン高分子物質を100mg／
Kg腹腔内投与した場合、投与48時間後の生存率
を調べた。 その結果、ビール酵母（S.uvarum）の
SEPS投与群は生存率60％となり、明らかに含
セレン蛋白多糖体SEPSはマウスの大腸菌致死
量感染に対して宿主防御作用を示すことがわか
つた。 (6) 血中トリグリセライド減少作用 トライトンを血中へ注入したマウスにSEPS
を200mg／Kgの投与量で20時間の間隔で２回経
口投与し、１回目の投与43時間後に血清中のト
リグリセライド量を測定した。 トリグリセライドの測定には、リポプロテイ
ンリパーゼ（LPL）、グリセロキナーゼ
（GK）、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ
（GPO）及びペルオキシダーゼ（POD）などの
酵素によるGK−GPO比色法を用いた。 まず、試験管に血清及び標準値用グリセロー
ル水溶液（トリオレイン３mg／ml）を20μと
り、酵素溶液3.0mlを加え混和後37℃で15分間
加温する。その後、60分以内に試薬ブランクを
対照として545nｍの波長で吸光度を測定し、
検量線によりトリグリセライド値を集める。 その結果、SEPS投与マウスではトリグリセ
ライド20％減少し、SEPSには明らかに血中ト
リグリセライド減少作用があることが判明し
た。 (7) 精神安定作用 アポモルフインによつて誘起されるマウスの
よじ登り行動（climbing behavior）の阻害の
程度をアポモルフインを投与後30分間次の基準
で判定した。SEPS25mg／Kgをアポモルフイン
投与の30分前に腹腔内投与する。 （最高基準点……マウス３匹×２＝６点） ４肢ともケージ底面にある……０点 両前肢で壁につかまつている……１点 ４肢とも壁の上にある……２点 アポモルフイン処理対照マウスの点数に対し
て50％以上減少させるものをよじ登り行動を阻
害するものとする。 その結果、SEPS投与マウスでは60％の減少
が観察され、精神安定作用があることが判明し
た。 以上(1)〜(7)の生理活性ではビール酵母
（Saccharomyces uvarum IAM−4778）より得
たSEPSの活性についてのみ述べたが、他のサツ
カロミセス属酵母より得たSEPS生理活性は表１
の通りである。なお、これらの酵母から同様にし
て得たSEPSは前記同様の物理化学的性質を有す
ることを確認した。

【表】 次に本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例 １ 二酸化セレン10ppmを含む糖濃度約５％の麦芽
汁500mlを３容ヘソ付きフラスコに入れ、120℃
で10分間殺菌した後、ビール酵母（S.uvarum
IAM−4778）を３白金耳植え、30℃で２目日間
ロータリー振盪培養を行なつた。 培養終了後、培養液を遠沈して菌体を集めて水
洗したのち、0.01規定の塩酸及び苛性ソーダで洗
浄した。再び水洗して菌体に付着している夾雑物
を除去し湿菌体５ｇを得た。 この湿菌体を100mlの水に分散し、フレンチプ
レスで菌体を破砕し、次いで遠沈して上澄液を流
水に対して一昼夜透析したのち透析内液を濃縮し
た。次いで、Sepharose CL−6B（カラム３×60
cm）でゲル濾過を行ない糖に富む溶出区分（第１
図、区分）を集め、凍結乾燥してSEPS300mg
を得た。この粉末標品中のセレン含量は150ppm
であつた。生理活性は表１のＡに示す通りであつ
た。 実施例 ２ 亜セレン酸20ppmを含む糖濃度約５％の麦芽汁
を実施例１と同様に処理し、これに清酒酵母（S.
cerevisiae Kyokai No.７）を植え、以下実施例
１と同様に培養し、菌体回収を行ない湿菌体5.5
ｇを得た。 この湿菌体を実施例１と同様に処理して菌体破
砕上澄液90mlを得た。この溶液を減圧下で10mlま
で濃縮し、Sephadex Ｇ−25（カラム2.5×50cm）
でゲル濾過を行ないボイドボリユームに溶出する
区分を集める。次に、この区分を濃縮して
Sepharose CL−6B（カラム３×60cm）でゲル濾
過を行ない、実施例１と同様の溶出区分を集め、
凍結乾燥してSEPS250mgを得た。この粉末標品
中のセレン含量は120ppmであつた。生理活性は
表１のＢに示す通りであつた。 実施例 ３ 二酸化セレン10ppmを含む醤油麹汁培地に醤油
酵母（S.rouxii AHU−3014）を植え、実施例１
と同様に培養し、菌体回収を行ない湿菌体4.5ｇ
を得た。 この湿菌体を実施例１と同様に処理して菌体破
砕上澄液90mlを得た。この上澄液を流水に対して
一昼夜透析したのち透析内液を濃縮した。次い
で、Sepharose CL−6B（カラム３×60cm）でゲ
ル濾過を行ない実施例１と同様の溶出区分を集め
凍結乾燥したSEPS230mgを得た。この粉末標品
中のセレン含量は100ppmであつた。また、生理
活性は表１のＣに示す通りであつた。 実施例 ４ 二酸化セレン10ppmを含む糖濃度約５％の麦芽
汁を実施例１と同様に処理して、これに、デンプ
ン資化性酵母（S.diastaticus IFO−1046）を植
え、実施例１と同様に培養し、菌体回収を行ない
湿菌体6.3ｇを得た。 この湿菌体を実施例１と同様に処理して菌体破
砕上澄液100mlを得た。この上澄液を流水に対し
て一昼夜透析したのち透析内液を濃縮した。次い
で、Sephadex Ｇ−25（カラム2.5×50cm）でゲル
濾過を行ないボイドボリユームに溶出する区分を
集める。次に、この区分を濃縮後、Sepharose
CL−6B（カラム３×60cm）でゲル濾過を行ない
実施例１と同様の溶出区分を集め、凍結乾燥して
SEPS200mgを得た。この粉末標品中のセレン含
量は150ppmであつた。生理活性は表１のＤに示
す通りであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はビール酵母の菌体破砕上澄液を透析し
た後、濃縮してSepharose CL−6B（カラム３×
60cm）でゲル濾過を行なつた場合の溶出パターン
である。第２図はビール酵母から得たSEPSの紫
外線吸収スペクトルであり、第３図は赤外線吸収
スペクトルである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ セレン化合物を含む培地で培養して得たセレ
   ン含有サツカロミセス属酵母菌体から分子量
   10000以上の生理活性含セレン蛋白多糖体SEPS
   を抽出、採取することを特徴とする生理活性含セ
   レン蛋白多糖体SEPSの製造法。