FR2542745A1

FR2542745A1 - Polysaccharide, sa preparation et son application en therapeutique

Info

Publication number: FR2542745A1
Application number: FR8404223A
Authority: FR
Inventors: Suguru Takeo; Hisao Kado; Nobuhiro Watanabe; Kiichi Uchida; Yoshitada Mori
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1983-03-18
Filing date: 1984-03-19
Publication date: 1984-09-21
Also published as: GB2139240B; DE3409029A1; DE3409029C2; GB2139240A; JPS59170017A; JPH0372085B2; US4764507A; FR2542745B1; GB8407083D0

Abstract

ON OBTIENT UNE SUBSTANCE RDP DE POLYSACCHARIDE SOLUBLE DANS L'EAU ET INSOLUBLE DANS LES SOLVANTS ORGANIQUES USUELS, IDENTIFIABLE PAR DES REACTIONS CALORIMETRIQUES ET DES SPECTRES D'ABSORPTION UV, IR OU RMNC, A PARTIR DE SON DE RIZ, PAR EXTRACTION. CETTE SUBSTANCE PRESENTE DES ACTIVITES BIOLOGIQUES, ET EST UTILE COMME AGENT ANTI-TUMORAL, AGENT IMMUNOMODULATEUR ET AGENT DE DEFENSE D'UN HOTE CONTRE DES MALADIES INFECTIEUSES.

Description

La présente invention concerne une nouvelle substance de polysaccharide

(dénommée ci-après RDP), et un agent anti- tumoral, un agent immunomodulateur et un agent de défense d'un hôte contre des maladies infectieuses, contenant ladite 5 substance comme composant actif. Comme on le sait dans l'art antérieur, les polysac- charides s'obtiennent à partir de diverses sources, par exem- ple, les basidiomycètes (demande de brevet japonais No 94012/1978), les bactéries (demande de brevet japonais N O 10 76896/1979), les moisissures (brevet japonais publié No 59097/1978), les algues (demande de brevet japonais No 28923/1977) et les graines (demande de brevet japonais N O 139713/1978). On sait également que ces polysaccharides sont doués 15 d'une activité anti-tumorale Cependant, diverses difficul- tés, comme par exemple de faibles rendements, une complexité du procédé de production, la toxicité, etc , se renc ontrent dans l'utilisation de ces polysaccharides comme agent antitumoral. 20 On a constaté, selon la présente invention, qu'on pouvait obtenir une nouvelle substance RDP du type polysac- charide à partir de son de riz, et que la substance RDP du type polysaccharide était efficace en tant qu'agent anti-tu- moral, agent immunomodulateur et agent de défense d'un hôte 25 contre des maladies infectieuses. La présente invention concerne ( 1) une nouvelle substance RDP du type polysaccharide ( 2) un procédé de production de la substance RDP du type polysaccharide de ( 1), qui consiste 30 à traiter le son de riz avec de l'eau chaude pour extraire la substance RDP du type polysaccharide dans l'eau, à ajouter un solvant organique polaire ou un agent de relargage à l'eau contenant la substance extraite afin de former des précipités contenant ladite substance RDP du type 35 polysaccharide,

2 à isoler les précipités, et à soumettre les précipités à un traitement de dé- protéination ; ( 3) un agent anti-tumoral contenant la substance RDP 5 du type polysaccharide de ( 1) comme ingrédient actif ; ( 4) un agent immunomodulateur contenant la substance RDP du type polysaccharide comme ingrédient actif ; et ( 5) un agent de défense d'un hôte contre une maladie infectieuse, contenant la substance RDP du type polysaccharide comme ingrédient actif. Sur les dessins : la Fig 1 est un spectre d'absorption des ultra- violets de la substance RDP du type polysaccharide produite par le procédé de la présente invention ; 15 la Fig 2 est un spectre d'absorption des rayons infrarouges de ladite substance-RDP du type polysaccharide et 13 la Fig 3 est un spectre RMN C de ladite substance RDP du type polysaccharide. 20 La présente invention concerne une nouvelle substan- ce RDP du type polysaccharide, un procédé de production de ladite substance, et un agent anti-tumoral, un agent immunomodulateur, et un agent de défense d'un hôte contre des ma- ladies infectieuses, contenant ladite substance comme ingré- 25 dient actif. La substance RDP du type polysaccharide de la présen- te invention est obtenue à partir de son de riz par extrac- tion et purification Ce son de riz est un sous-produit for- mé dans la production de riz glacé à partir de riz non glacé 30 et n'est pas limité par la variété du riz non glacé, la zo- ne de production, le degré de glaçage, etc Avant l'extrac- tion et la purification de la substance RDP du type polysac- charide à partir du son de riz, il est avantageux de laver complètement le son de riz afin d'éliminer le riz pulvérisé 35 (ou broyé) et autres impuretés Ces sons de riz qui ont déjà

3 été utilisés dans d'autres applications, comme par exemple comme son de riz dégraissé, qui est un résidu de l'extrac- tion d'huile de son de riz à partir de son de riz, peuvent être utilisés dans la présente invention. 5 La substance RDP du type polysaccharide de la présen- te invention est produite par addition de solvants organi- ques ou d'agents de relargage à un extrait obtenu par trai- tement à l'eau chaude de son de riz pour obtenir des préci- pités et, si on le désire, dissolution des précipités obte- 10 nus dans l'eau afin de les purifier. On fait passer le son de riz dans un séparateur, par exemple un tamis, pour éliminer les impuretés et on le lave à l'eau, si nécessaire, après pulvérisation Il est avantageux d'éliminer une fraction soluble dans les lipides en 15 utilisant des solvants organiques, par exemple l'acétate d'éthyle, le tétrachlorure de carbone, le chloroforme, l'é- ther, le n-hexane, le benzène, l'éther de pétrole-, l'acéto- ne, etc. Le traitement du son de riz à l'eau chaude est effec- 20 tué en introduisant le son de riz et l'eau distillée ou purifiée en une proportion d'environ 5 à 10 fois celle du son de riz dans un récipient ou un récipient sous pression, par exemple un réservoir en acier inoxydable, un réservoir émail- lé, un réservoir en verre, un dispositif'd'extraction tubu- 25 laire à système d'écoulement, etc , avec ou sans agitation, sdus pression de O à 1,5 M Pa, de préférence entre O et 0,5 M Pa et à une température comprise entre 70 OC et 200 OC, de préférence entre 100 OC et 150 OC pendant 10 minutes à 24 heures, de préférence 0,5 à 5 heures En pratique, il con- 30 vient d'effectuer le traitement à l'eau chaude à une pres- sion de O à 0,3 M Pa et à une température de 100 O C à 140 O C pendant 1 à 5 heures. L'extrait obtenu par le traitement à l'eau chaude est soumis à des opérations telles qu'une filtration, une 35 centrifugation, etc , pour séparer les matières solides et, si nécessaire, il est ensuite concentré jusqu'à un volume approprié par application, par exemple, d'une concentration

4 à une pression réduite, une ultrafiltration, etc , à une seule de ces opérations ou à une combinaison de ces opéra- tions. En recueillant les précipités formés par l'addition 5 d'un solvant organique polaire hydrosoluble ou d'un agent de relargage à l'extrait, on obtient une substance RDP de polysaccharide brute. Les solvants organiques polaires que l'on peut utili- ser dans cette opération comprennent le méthanol, l'éthanol, 10 le propanol, l'acétone, etc La quantité de solvant organique polaire que l'on utilise est déterminée en tenant compte de la quantité de la substance désirée contenue dans l'ex- trait, etc Par exemple, dans le cas de l'éthanol, on peut l'ajouter en sorte que la concentration en éthanol soit de 15 30 à 50 Z en volume Les précipités formés sont de préféren- ce lavés avec le solvant organique, comme décrit ci-dessus, par exemple l'éthanol, etc. Les agents de relargage que l'on peut utiliser dans l'opération ci-dessus comprennent le chlorure de sodium, 20 le sulfate d'ammonium et le chlorure de potassium L'agent de relargage est généralement ajouté jusqu'à ce que le de- gré de saturation atteigne 0,5 à 1, de manière à former des précipités. La déprotéination et la purification de la substance 25 RDP de polysaccharide peuvent être effectuées soit avant l'addition du solvant organique ou de l'agent de relargage à l'extrait, soit après la formation de précipités par l'addition du solvant organique ou de l'agent de relargage puis dissolution des précipités dans -l'eau. 30 Pour le traitement de purification et de déprotéina- tion, on peut avoir recours à divers modes opératoires co-nnus Par exemple, on ajoute une enzyme amylolytique et/ou une enzyme protéolytique à une solution contenant la subs- tance RDP de polysaccharide pour transformer les impuretés 35 qui s'y trouvent, par exemple de l'amidon, des protéines,

5 etc , en composés de bas poids moléculaire Ces composés de bas poids moléculaire sont éliminés à l'étape suivante de purification Comme enzymes de ce type, on peut avoir-recours à 5 une enzyme amylolytique, par exemple ct-amylase, iso-amyla- se, pullulanase, etc , une enzyme protéolytique, par exem- ple papaine, pepsine, trypsine, pronase, etc , et, si nécessaire, à d'autres enzymes Dans ce traitement enzymati- que, il est préférable que l'enzyme soit ajoutée à un rap- 10 port de 1/100 à 1/5000 par rapport au substrat, et que ce traitement soit effectué pendant 0,5 à 24 heures, de préfé- rence 1 à 15 heures. En outre, on peut faire appel aux procédés suivants de purification et de déprotéination : un procédé dans le- 15 quel un acide inorganique ou organique tel que l'acide acétique cristallisable, l'acide sulfurique, l'acide chlorhy- drique, l'acide tannique, l'acide trichloracétique, etc , est ajouté à une solution aqueuse contenant la substance RDP de polysaccharide décrite ci-dessus en une proportion 20 d'environ 0,1 à 10 % en poids, de préférence d'environ 3 à 5 Z en poids Lorsque des précipités se forment, on les élimine par des opérations telles qu'une filtration, une centrifugation, etc , puis les acides restants, les ions inorganiques et les fractions de bas poids moléculaire sont 25 dialysés pendant 1 à 3 jours contre de l'eau courante ou de l'eau distillée en utilisant une membrane semi-perméable, par exemple une membrane en cellophane, une membrane en col- lodion, etc ; un procédé d'échange d'ions dans lequel un é- changeur de cations ou d'anions, par exemple "Dowex", "Am- 30 berlite", "Duolite", "Diaion", etc , est utilisé ; un pro- cédé d'ultrafiltration dans lequel on utilise une membrane ayant un poids moléculaire fractionné de 1 000 à 100 000 ; une filtration sur gel ; une centrifugation ; un traitement par du carbone actif ; une concentration et une combinaison 35 de ces opérations En outre, la substance RDP peut être hy-

6 drolysée en utilisant des acides et/ou certains enzymes jusqu'à des poids moléculaires de 1 000 000 à 10 000 en conservant les activités biologiques Une grande quantité de protéines peut être éliminée de la substance RDP de po- 5 lysaccharides par les procédés décrits ci-dessus Cependant, une petite quantité de protéine qui est liée chimiquement à la substance RDP de polysaccharide ne peut être éliminée complètement Dans ce cas, il est possible d'éliminer com- plètement ces protéines de la substance RDP de polysaccha- 10 ride par un procédé tel que celui de Sevag. Ces procédés de purification peuvent être appliqués séparément ou en combinaison entre eux, et ces combinaisons et l'ordre dans lequel elles sont appliquées ne sont pas soumis à limitations. 15 Par lyophilisation ou séchage par atomisation d'une solution aqueuse contenant la substance RDP de polysac- charide de haut poids moléculaire qui a été purifiée par les procédés décrits ci-dessus, on peut obtenir une subs- tance RDP blanche sous forme de poudre. 20 La substance RDP-de polysaccharide ainsi obtenue a les propriétés physiques et chimiques suivantes : Cette substance ne passe pas à travers une membrane de dialyse et est insoluble dans les acides organiques ou les solvants organiques, par exemple l'acide acétique cris- 25 tallisable, les alcools tels que méthanol, éthanol, propa- nol, butanol, etc , l'acétone, l'hexane, le benzène, l'acé- tate d'éthyle, le diméthylsulfoxyde, la ligroine, le tétra- chlorure de carbone, le chloroforme, et les éthers, mais el- le est soluble dans l'eau. 30 Une solution aqueuse à 1 % de la présente substance est neutre. La présente substance n'a pas de point de fusion et elle vire au brun à 220 OC et au noir à 280 OC (carbonisa- tion) ; l'analyse élémentaire révèle que la présente subs- 35 tance obtenue dans l'Exemple 1 comme décrit ci-après com-

7 prend 38,10 % de carbone, 6,27 Z d'hydrogène, 50,73 % d'oxygène et 4,90 % de cendres. Une solution aqueuse à 1 % de la présente substance est positive dans les réactions colorées suivantes : la 5 réaction phénol-acide sulfurique, la réaction anthrone-aci- de sulfurique, la réaction carbazole-acide sulfurique, la réaction tryptophane-acide sulfurique, la réaction cystéine- acide sulfurique, la réaction chromotrope-acide sulfurique et la réaction de Molish, et elle est négative dans les 10 réactions colorées suivantes : la réaction du biuret, la réaction à la ninhydrine, la réaction de Lowry-Folin, la réaction de Elson-Morgan, et la réaction amidon-iode. La rotation spécifique de la présente substance ob- 20 tenue dans l'Exemple 1 décrit ci-après est lal = + 142 à D 15 i 145 o (H 20). Il a été confirmé que le composant cendres contient Si, P, K, Na, Ca, Mg, etc , et sur la base du fait que la substance RDP est éluée dans un volume de vides avec filtra- tion sur gel en utilisant le "Sepharose" CL-6 B (produit par 20 Pharmacia Chemicals AB), on suppose que-les éléments ci-des- sus n'existent pas indépendamment en tant qu'élément ou composé de cet élément dans la substance RDP, mais qu'ils existent à l'état lié au squelette de la substance RDP. La liqueur surnageante obtenue par un procédé consis- 25 tant à hydrolyser la substance RDP avec de l'acide sulfuri- que 1 N à 100 C pendant 3 heures, puis à ajouter du carbo- nate de baryum jusqu'a neutralisation, est positive dans les réactions colorées suivantes : réaction de Molish, réaction à l'anthrone, réaction tryptophane-acide sulfuri- 30 que, réaction cystéine-acide sulfurique ; réaction chromo- trope-acide sulfurique, etc , et elle est négative dans les réactions colorées suivantes ; réaction du biuret, réaction à la ninhydrine, réaction de Lowry-Folin, etc. Dans l'hydrolysat ci-dessus, le glucose est toujours 35 décelé par une analyse par chromatographie en couche mince.

8 Par développement avec les quatre solvants indiqués ci-après dans l'analyse par chromatographie en couche mince des pro- duits obtenus par hydrolyse complete de la substance RDP avec l'acide formique et l'acide sulfurique, on ne peut dé- 5 celer aucune tache excepté celle identifiée comme étant du glucose. ( 1) acetate d'éthyle:méthanol:acide acétique:eau ( 65:15:10:10) ( 2) acétate d'éthyle:isopropanol:eau ( 65:23:12) 10 ( 3) isopropanol:pyridine:eau:acide acétique ( 8:8:4:1) ( 4) n-butanol:pyridine:eau ( 6:4:3). Ainsi, on peut conclure que la présente substance RDP est un polysaccharide consistant essentiellement en glucose comme seul composant sucre. 15 La présente substance RDP présente le spectre d'ab- -sorption des ultraviolets comme indiqué sur la figure 1, le spectre d'absorption des rayons infrarouges représenté sur la figure 2, et le spectre RMN 13 C représenté sur la figure 3 D'après le spectre d'absorption des rayons infrarouges 20 et la rotation spécifique, on suppose que la liaison a exis- te dans la substance RDP. Sur la base des résultats sus-décrits, on suppose que la substance RDP de la présente invention est un polysac- charide contenant du glucose comme seul composant sucre. 25 En outre, lors de l'oxydation par du periodate, la présente substance RDP consomme 1,7 mole de periodate de sodium et libère 0,85 mole d'acide formique par reste de glucose; Le processus de dégradation de Smith de cette subs- tance donne la glycérine décelée par analyse chromatographi- 30 que sur papier L'analyse par méthylation de cette substan- ce révèle la présence de 2, 3,4-tri-0-méthyl-D-glucose ainsi que d'une petite quantité de tétraméthyl et de diméthyl- glucose. Sur la base des résultats décrits ci-dessus, on sup- 35 pose que la substance RDP de la présente invention est un

9 polysaccharide qui présente une liaison a-1,6-glucoside com- me chaîne principale En outre, l'analyse RMN 13 C de la présente substance RDP révèle la présence de restes de glu- cose à liaison en a-1,6, une beaucoup plus petite quantité 5 de restes de glucose à liaison en a -1,4. On a mis en évidence que la substance RDP de polysac- charide de la présente invention est douée de diverses ac- tivités biologiques telles qu'une activité anti-tumorale, immunomodulatrice, et de défense d'un hôte contre des mala- 10 dies infectieuses Les procédés et les résultats d'essais portant sur ces activités biologiques de la substance RDP de polysaccharide obtenue dans l'Exemple 1 seront décrits en détail. ( 1) Activités anti-tumorales 15 (a) Effet d'une administration intrapèritonéale de substance RDP sur une tumeur syngénique Meth-A On transplante des cellules tumorales (lx 105 cellu- les/souris) par voie intrapéritonéale à 50 souris femelles âgées de 6 semaines de race BALB/C-CRJ (poids moyen 20 gram- 20 mes), ces cellules s'étant développées pendant une semaine par voie intrapéritonéale chez une souris de la même souche. Ces souris sont divisées en quatre groupes ; un groupe de 20 souris servant de groupe témoin et trois groupes de 10 souris chacun servant de groupes d'essai Pendant 5 jours 25 consécutifs en partant du jour suivant la transplantation des cellules tumorales, on administre par voie intrapérito- néale la substance RDP dissoute dans une solution saline à la dose de 10, 30 ou 100 milligrammes par kilogramme (mg/kg) pour les groupes d'essai Pour lé groupe témoin, d'autre 30 part, on n'administre qu'une solution saline de la même ma- nière On mesure le temps de survie (en jours) et on calcu- le la prolongation de vie à l'aide de l'équation suivante :

10 Temps moyen de survie (jours) pour le groupe d'essai Prolongation de la x 100 5 vie (%) Temps moyen de survie (jours) pour le groupe témoin (b) Effet de l'administration orale de la substance RDP sur une tumeur syngénique Meth-A On transplante sur 50 souris femelles àgées de 6 semaines de souche BALB/C-CRJ (poids moyen, 20 g) des cellu- 10 les tumorales ( 1 x 104 cellules/souris) par voie sous-cutanée dans la région axillaire, qui-se sont développées pendant une semaine par voie intrapéritonéale chez une souris de la même souche Ces souris sont divisées en quatre groupes ; un groupe de 20 souris sert de groupe témoin et trois grou- 15 pes de 10 souris chacun représentent les groupes d'essai. Pendant 10 jours-consécutifs en partant du jour suivant la transplantation des cellules tumorales, on administre orale- ment la substance RDP dissoute dans une solution saline à la dose de 10, 30 ou 100 mg/kg pour les groupes d'essai Pour 20 le groupe témoin, par contre, on administre uniquement une solution saline de la même manière Trente-cinq jours après la transplantation des cellules tumorales, on sacrifie les souris et on excise la tumeur développée et la pèse. Le rapport d'inhibition est calculé d'après l'équation 25 suivante Poids moyen de la tumeur Rapor pour le groupe d'essai d'inhibition (%) -1_ X 100 dih i Poids moyen de la tumeur 30 \,pour le groupe témoin L'activité anti-tumorale de la substance RDP telle que déterminée par les procédés décrits ci-dessus (a) et (b) est indiquée sur le Tableau I.

111 TABLEAU I Administration Administration intrapéritonéale(a) orale (b) Echantillon Dose Temps moyen Prolongation Poids moyen Rapport (mg/kg) de survie de la vie de la d'inhi- (jours) (%) tumeur bition (g) () Témoin (solution saline) 21,0 9,30 - Substance 10 27,3 130 5,12 45 RDP 30 > 42,0 > 200 3,72 60 100 35,7 170 4,65 50 .~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ On voit, d'après les résultats du Tableau I, que la subs- tance RDP présente une forte activité anti-tumorale avec la dose optimale d'environ 30 mg/kg, aussi bien dans le cas de l'administration intrapéritonéale que de l'administra- tion orale. 20 De plus, il a été confirmé que la substance RDP est également efficace contre le carcinome du poumon de Lewis, le mélanome B-16, le sarcome 180 et le carcinome ascitique de Ehrlich, avec une plage de doses de 10 à 100 mg/kg par administration intrapéritonéale ou orale avec, pour résul- 25 tat, un rapport d'inhibition de la tumeur de 30 à 70 % En outre, la substance RDP n'est pas toxique comme décrit ciaprès Ainsi, la substance RDP est supposée trouver une ap- plication en tant qu'agent anti-tumoral très efficace. ( 2) Activités immunomodulatrices 30 (a) Epreuve d'élimination du carbone (CCT) Ce test est utilisé pour examiner, parmi les actions immunomodulatrices, l'effet de la substance RDP sur l'amé- lioration de l'activité phagocytaire du macrophage. La substance EDP dissoute dans une solution saline 35 est administrée par voie intrapéritonéale à un groupe d'es- 5 10 IE

12 sai de six souris femelles âgées de 4 semaines de souche ICR-CRJ (poids moyen, 20 g) pendant 2 jours Par ailleurs, seule une solution saline est administrée au groupe té- moin de la même manière Le troisième jour, on injecte 5 dans la veine caudale 0,25 ml d'une solution de carbone (préparée en diluant un encre noire -Fount India fabriquée par Perikan Co avec une solution saline jusqu'à 5 fois). Immédiatement après l'injection et également 10 minutes après, on recueille 0,025 ml de sang du plexus veineux 10 du rétro-orbite de la souris, on le met en suspension dans 3,5 ml d'une solution de carbonate de sodium 0,01 M et on mesure l'absorbance (OD 650) à 650 nm pour déterminer la vitesse de diminution de la concentration du carbone dans le sang Cette vitesse est indiquée par un indice phagocy- 15 taire (image d'Arneth), tel que défini par l'équation sui- vante log C 1 log C 2 Indice phagocytaire = _ T 2 T 1 20 o C 1 est une absorbance (<D 650) à l'instant T 1 et C 2 est celle à l'instant T 2. En ce qui concerne les souris porteuses d'une tumeur, des cellules de sarcome 180 sont transplantées dans le muscle de la patte arrière des souris (lx O 7 cellules/ 25 souris) 7 jours avant le début de l'administration de la substance RDP et, ensuite, les souris sont mises à l'épreu- ve de la même manière que ci-dessus Les résultats sont récapitulés sur le Tableau II. 30

13 TABLEAU Il EchantillonDose Souris normales Souris portant une tumeur (mg/kg) Indice phago Valeur Indice phago Valeur cytaire relative cytaire relative (Z) (Z) Témoin 42,8 x 10 100 101 x 10 100 (Sol ution saline) Substance 10 53,7 125 110 109 RDP 30 94,2 220 150 149 10 100 86,5 202 130 129 On peut voir d'après les résultats présentés au Ta- bleau II que, aussi bien dans le cas des souris normales 15 que pour celles portant une tumeur, l'administration de la substance RDP en une proportion de 10 à 100 mg/kg, en par- ticulier de 30 mg/kg favorise la fonction du système réticuloendothélial des souris et intensifie fortement l'acti- vité phagocytaire du macrophage. 20 (b) Essai portant sur les cellules formatrices de plaques d'hémolyse (PFC) Ce procédé est utilisé pour examiner parmi les actions immunomodulatrices l'effet de la substance RDP pour amé- liorer l'aptitude de production d'anticorps due à l'activation des cellules B de l'hôte. La substance RDP dissoute dans une solution saline est administrée par voie intrapéritonéale à un groupe d'essai de six souris femelles âgées de 4 semaines ICR-CRJ (poids moyen, 20 g) pendant 3 jours consécutifs Pour le groupe 30 témoin, on n'administre qu'une solution saline de la même manière Le quatrième jour et également le onzième jour, on injecte des hématies de mouton dans la veine caudale ( 4 x 108 cellules/souris) pour sensibiliser les souris Quatre jours après l'injection, on détermine l'aptitude des cellu- F.

14 les de rate de souris à la formation de plaques par le procédé de Cunningham Les résultats figurent au Tableau III. TABLEAU III Echantillon Dose Sensibilisation du Sensibilisation du (mg/kg) 4 ème jour llème jour Nombre de Valeur Nombre de Valeur plaques relative plaques relative par rate (%) par rate (%) Témoin 2,7 xl O 100 2,4 x 104 100 (solution saline) Substance 10 4,1 150 6,0 250 RDP 30 7,0 260 8,6 360 100 6,3 233 8,1 337 On peut voir d'après les résultats du Tableau III que l'administration de la substance RDP à la dose de 10 à 100 mg/kg améliore fortement l'aptitude à la production d'anticorps. 20 (c) Réaction d'hypersensibilité du type retardé (DHR) Ce procédé est utilisé pour examiner parmi les actions d'immunomodulation l'effet de la substance RDP pour amé- liorer l'action de l'immunité à médiation cellulaire due à l'activation des cellules T de l'hôte. 25 La substance RDP dissoute dans une solution saline est administrée oralement à un groupe d'essai de six sou- ris ICR-CRJ âgées de 8 semaines (femelles ; poids moyen 27 g) pendant 8 jours consécutifs Par ailleurs, pour-le groupe témoin, on n'administre qu'une solution saline de 30 la même manière Le quatrième jour suivant l'administra- tion, on applique une solution dans l'éthanol à 5 % de chlorure de picryle sur la région abdominale qui a été ra- sée pour obtenir une sensibilisation primaire Le onzième 5 1 O 15

15 jour, on applique une solution d'huile d'olive à 1 Z de chlorure de picryle sur le ctté avant et le côté arrière de chaque oreille de la souris pour obtenir une sensibili- sation secondaire Au bout de 24 heures, on mesure l'aug- 5 mentation de l'épaisseur de l'oreille, c'est-à-dire qu'on mesure la différence d'épaisseur avant application et après application D'autre part, dans le cas des souris porteu- ses de tumeur, on transplante le sarcome 180 par voie in- trapéritoneale (lx 105 cellules/souris) avant l'adminis- 10 tration de la substance RDF, puis on répète les opérations ci-dessus. Les résultats sont récapitulés sur le Tableau IV, TABLEAU IV 15 Echantillon Dose Souris normales Souris porteuses de tuneur Augnentation de Valeur Augnentation de Valeur 1 'épaisseur de relative l 'épaisseur de relative 1 'oreille (nm) (%) l'oreille (nm) (%) 20 Témoin xl O_ 2 (solution 3,39 x 1100 094 x 1 O-2 100 saline) Substance30 8,30 245 2,40 255 RDP 100 8,14 240 2,35 250 500 5,86 173 2,08 221 25 On peut voir d'après les résultats représentés sur le Tableau IV que la substance RDP administrée orale- ment à une dose de 30 à 500 mg/kg améliore fortement l'im- munité à médiation cellulaire dans le cas de souris norma- les aussi bien que dans celui des souris porteuses de tu- 30 meur. D'après les résultats des essais sus-décrits (a), (b) et (c), on peut voir que la substance RDP améliore for- tement diverses activités immunitaires ayant des mécanismes différents L'agent immunomodulateur peut être utilisé dans

16 les cas o la fonction immunitaire s'effondre ou dans le cas o la fonction de reconnaissance de l'anticorps étran- ger est mauvaise. Ainsi, la substance RDP est susceptible de trou- 5 ver des applications, par exemple comme agent thérapeuti- que ou comme agent thérapeutique adjuvant ou comme agent inhibiteur ou agent pour l'accélération de la récupération après une intervention pour le traitement de maladies infectieuses et de tumeurs malignes. 10 En plus de l'aptitude à la récupération ou l'activation immunitaire sus-décrite, l'agent immunomodulateur peut parfois être utilisé pour normaliser la réaction im- munitaire anormalement stimulée ; par exemple, on peut l'appliquer dans le cas de maladies auto-immunitaires tel- 15 les que les rhumatismes, les maladies du collagène, et les allergies. ( 3) Activité de défense d'un hôte. Il est bien connu que les activités de défense d'hôtes du corps vivant contre les maladies infectieuses 20 bactériennes sont basées sur les principes suivants : l'un est appelé l'immunité humorale dépendant de la production d'anticorps contre les bactéries envahisseuses et un autre est appelé l'immunité à médiation cellulaire dans lequel le macrophage et la cellule T luttent contre les bactéries 25 envahisseuses En général, le corps vivant présente des activités de défense suffisantes contre l'invasion de tel- les bactéries étrangères Cependant, il est bien connu que dans le cas de la présence de-tumeur, en particulier au dernier stade du cancer, ces activités s'effondrent grave- 30 ment ; et qu'en conséquence, de sérieux ravages sont pro- voqués même par les bactéries non pathogènes vivant géné- ralement dans l'hôte. Afin de déterminer si la substance RDP améliore les activités de défense de l'hôte contre des maladies infectieuses dues à ces bactéries, on examine l'activité

17 inhibitrice de la substance RDP contre l'infection par Escherichia coli, un microorganisme infectieux du type à l'encontre duquel on déclare que l'immunité humorale pourrait agir et contre l'infection par Listeriamonocyto- 5 genes, à l'encontre duquel on déclare que l'immunité à médiation cellulaire pourrait agir. Des souris ICR-CRJ âgées de 7 semaines (femelles,_ poids moyen : 26 g) sont divisées en quatre groupes de 20 souris chacun La substance RDP dissoute dans une so- 10 lution saline est injectée par voie sous-cutanée dans le dos des souris à une dose de 10, 30 ou 100 mg/kg, 3 jours et un jour avant l'infection Pour le groupe témoin, on n'injecte qu'une solution saline de la même manière. Ensuite, dans le cas de E coli, on introduit 15 2 x 107 cellules/souris par voie sous-cutanée dans le dos, et dans le cas de L monocytogenes, on introduit par voie intrapéritonéale 2 xl O 7 cellules/souris Au bout d'une se- maine, on compare le nombre des sur-vivants L'effet pro- tecteur est calculé d'après l'équation suivante 20 Nombre de survivants Nombre de survivants dans le groupe dans le groupe Effet d'essai témoin protecteur25 (%) Nombre de souris dans un groupe x 100 Les résultats sont récapitulés au Tableau V. TABLEAU V Bactéries Echantillon Dose (mg/kg) Temps d'administration avant l'infection Un jour avant 3 jours avant Nombre de Effet pro Nombre de Effet pro- survivants tecteur survivants tecteur (Z) (Z) T êm, oi, O ` O s Ol utl on saline) E col i SB-001 10 16 80 17 85 Substance 30 18 90 19 95 RDP 100 20 100 20 100 Témoin O (solution saline) L.mono SB-010 10 8 40 8 40 Substance 30 12 60 12 60 RDP 100 10 50 10 50 Co r> 'n -t,

19 On peut voir d'après les résultats du Tableau V que l'administration de la substance RDP à une dose de 10 à 100 mg/kg avant l'infection produit de très grandes ac- tivités de défense des hôtes à l'encontre de l'infection 5 par E coli et également des activités significatives à l'encontre de l'infection par L monocytogenes. Compte tenu du fait que la substance RDP n'est pas toxique, elle peut constituer un agent de défense d'hôtes très intéressant à utiliser contre des maladies infectieu- 10 ses. La toxicité aiguë de la substance RDP sera étudiée ci-après plus en détail. Dix rats SD-CRJ âgés de 5 semaines (mâles, poids 120-150 g) sont utilisés respectivement dans le groupe té- 15 moin et le groupe d'essai La substance RDP est adminis- trée en une seule fois à la dose physiquement maximale de 15 g/kg dans le groupe d'essai, et on n'administre qu'une solution saline dans le groupe témoin Aucun rat ne meurt. L'augmentation de poids dans le groupe d'essai est égale à 20 celle du groupe témoin En outre, on n'observe pas d'ano- malie aussi bien dans l'aspect qu'à la nécroscopie On con- sidère ainsi que la dose léthale moyenne DL 50 de cette substance est supérieure à 15 g/kg et que la substance ne présente pas de toxicité aiguë. 25 Selon la présente invention, la substance RDP de polysaccharide présentant une activité anti-tumorale, immunomodulatrice et de défense des hôtes supérieure contre des maladies infectieuses comme décrit ci-dessus peut être produite en une grande quantité, comme montré dans les 30 Exemples décrits ci-après, par une combinaison de processus relativement aisés Ainsi, la présente invention est d'un grand intérêt pratique dans le domaine d'une production industrielle d'un polysaccharide à partir de son de riz en étant douée d'excellentes activités biologiques. 35 En outre, étant donné qu'on a observé que la subs-

20 tance RDP de la présente invention était douée d'une ap- titude à induire la production ou les effets de l'inter- féron, on peut s'attendre à ce qu'elle exerce un effet de prévention ou de traitement de maladies à virus telles que 5 l'herpès et la grippe. Etant donné que la substance RDP peut être admi- nistrée aussi bien par voie orale que par une autre voie, on peut s'attendre à ce qu'elle constitue un agent anti- tumoral, immunomodulateur, de prévention ou de traitement 10 de maladies infectieuses très intéressant à utiliser. Dans la forme pratique du médicament, la substance RDP peut être produite seule ou en association avec des adjuvants (par exemple, eau, solution saline, polyéthylèneglycol, glycérogélatine, amidon, dextrine, lactose, etc ) 15 sous la forme, par exemple, d'un produit pharmaceutique liquide, d'une pastille, d'un comprimé, d'une poudre, d'un suppositoire, etc. L'invention sera décrite en détail en référence aux exemples suivants. 20 EXEMPLE 1 On ajoute 125 litres d'eau du robinet à 25 kg de son de riz du commerce ayant été séparé de morceaux de riz, etc par passage au tamis Le mélange est extrait à 120 O C pendant 1 heure et à 100 OC pendant 5 heures sous 25 agitation constante. Ensuite, on filtre le mélange, on concentre le filtrat sous pression réduite jusqu'à 40 litres On ajuste le filtrat ainsi concentré à p H 6,7 avec de l'hydroxyde de sodium, puis on ajoute 500 mg d'une a-amylase (produite 30 par Nagase Sangyo Co , Ltd ) et on effectue un traitement enzymatique à 70 OC pendant 1 heure Après le traitement enzymatique, l'enzyme est inactivée par chauffage à 100 OC, et les matières insolubles sont enlevées par centrifugation. De l'éthanol est ajouté jusqu'à une concentration finale de 35 30 % (en volume) On sépare le précipité formé On dissout

21 ce précipité de nouveau dans l'eau pour éliminer les matiè- res insolubles On lyophilise la partie soluble et on ob- tient 508 g d'une poudre jaune clair On dissout de nou- veau 4 g de ladite poudre dans de l'eau ayant subi un é- 5 change d'ions, et on élimine les matières insolubles par centrifugation On soumet la partie soluble à une filtration sur gel de Sepharose CL-6 B (produit par Pharmacia Che- micals AB), et on recueille les fractions éluées dans le volume de vides et les lyophilise pour obtenir 1 g d'une 10 poudre blanche On dissout encore cette poudre blanche dans 100 ml d'eau ayant subi un échange ionique et on la place dans une ampoule à brome en même temps que 20 ml de chloro- forme et 4 ml de n-butanol On secoue le mélange pendant 60 minutes, puis on le centrifuge à faible vitesse, après 15 quoi il se forme une phase blanche de protéines dénaturées entre une phase aqueuse et une phase chloroformique On retire la phase aqueuse de l'ampoule à brome On ajoute un mélange chloroforme/n-butanol dans le même rapport que ci-dessus, et on secoue le mélange résultant On répète 20 cette opération environ 30 fois jusqu'à ce que la phase blanche de protéine dénaturée n'apparaisse plus On lyo- philise la phase aqueuse pour obtenir 800 mg d'une poudre- blanche déprotéinée. EXEMPLE 2 25 On dégraisse du son de riz du commerce ( 25 kg) en le chauffant au reflux avec 100 litres-d'hexane, puis on le sèche On traite ensuite le son de riz dégraissé de la même manière que dans ' Exemple 1 pour obtenir 450 g d'une poudre jaune clair On traite 4 9 de ladite poudre de la 30 même manière que dans l'Exemple 1 pour obtenir 750 mg d'une poudre blanche. EXEMPLE 3 On mélange 3 kg de son de riz dégraissé du commer- ce avec 20 litres d'eau, puis on extrait le mélange à 120 OC 35 pendant 2 heures sous agitation constante On concentre le

22 mélange sous pression réduite pour obtenir 5 litres d'une solution concentrée On ajoute ensuite à la solution 0,3 g d'une a-amylase et on maintient la température du mélange à 60 OC pendant 5 heures On chauffe ensuite le mélange à 5 100 O C et on le soumet à une centrifugation pour obtenir 4,9 litres d'une liqueur surnageante On ajoute de l'étha- nol à la concentration finale de 40 % (en volume) On sé- pare le précipité formé et on le lyophilise pour obtenir 88 9 d'une poudre brun-jaune clair. 10 On traite 4 g de cette poudre de la même manière que dans l'Exemple 1 pour obtenir 720 mg d'une poudre blanche.

23 que dans l'Exemple 1 pour obtenir 402 g d'une poudre blanche. EXEMPLE 5 On soumet 1 litre d'une liqueur surnageante obte- nue par dialyse et centrifugation dans l'Exemple 1 à une 5 chromatographie utilisant CM Sepharose, un gel d'échange de cations et DEAE Sepharose, un gel d'échange d'anions. Les fractions non adsorbées sont recueillies et concentrées à 1 litre On procède ensuite à une déprotéination et à une lyophilisation de la même manière que dans l'Exemple 1 pour 10 obtenir 358 g d'une poudre blanche. EXEMPLE 6 On ajoute 10 g de carbone activé à 1 litre d'une liqueur surnageante obtenue par dialyse et centrifugation dans l'Exemple 1 Au bout de 30 minutes, on centrifuge le 15 mélange On soumet la liqueur surnageante au même traite- ment de déprotéination et de lyophilisation que dans 1 ' exem Dle 4 pour obtenir 365 g d'une poudre 'blanche. EXEMPLE 7 On soumet une portion de 20 ml de la liqueur sur- 20 nageante obtenue par dialyse et centrifugation dans 1 ' exemple 4 à une filtration sur gel en utilisant Sepharose CL-6 B et on recueille des fractions de volumes de vides pour compléter à 100 ml On soumet ce liquide au même trai- tement de déprotéination et de lyophilisation que dans 1 ' 25 exemple 1 pour obtenir 70 g d'une poudre blanche. EXEMPLE 8 On dissout de nouveau le précipité obtenu par précipitation à l'éthanol après traitement de 1 ' a -amylase de l'Exemple 1 dans 10 litres d'eau On soumet la solution 30 à une ultrafiltration pour éliminer la partie de poids molé- culaire inférieur à 80 000 et également pour concentrer à 3 litres Le précipité formé est séparé par centrifugation en donnant 2,8 litres d'une liqueur surnageante Cette li- queur surnageante est soumise au même traitement de déprotéination et de lyophilisation que dans l'Exemple 1 pour

24 obtenir 400 g d'une poudre blanche. EXEMPLE 9 On ajoute de l'acétone à la solution soumise au traitement par 1 l a-amylase puis à l'inactivation de l'en- 5 zyme à 100 'C pendant une heure dans l'Exemple 1 jusqu'à la concentration finale de 40 Z (en volume) On dissout le précipité formé dans 10 litres d'eau On applique ensuite le même processus, comprenant le traitement d'ultrafiltra- tion que dans l'Exemple 8 pour obtenir 412 g d'une poudre 10 blanche. EXEMPLE 10 On ajoute du sulfate d'ammonium à la solution soumise au traitement de 1 ' a-amylase suivi de l'inactiva- tion de l'enzyme à 100 'C pendant 1 heure dans l'Exemple 15 jusqu'au degré de saturation de 70 % pour obtenir un re- largage Le précipité formé est recueilli par centrifuga- tion, dissous dans 3 litres d'eau et dialysé contre de l'eau courante pendant 2 jours On ajoute de l'acide trichloracétique à ladite solution jusqu'à une concentration 20 de 7 % Le précipité formé est séparé par centrifugation. La liqueur surnageante est dialysée de nouveau contre de l'eau courante-pendant 2 jours Le dialysat ainsi obtenu est lyophilisé en donnant 503 9 d'une poudre jaune clair. On dissout 4 9 de la poudre dans de l'eau ayant subi un é- 25 change d'ions et les fait passer à travers une colonne de Sepharose CL-6 B On recueille des fractions de volume de vides et les lyophilise pour obtenir 1,5 g d'une poudre blanche. EXEMPLE Il 30 On refroidit à 40 'C la solution soumise au trai- tement de 1 ' a-amylase de l'Exemple, et on ajoute ensuite 600 mg d'une protéinase (Pronase E, produit par Kaken Kaga- ku Co , Ltd ) et on laisse réagir pendant 24 heures On chauffe le mélange réactionnel à 100 OC pendant 1 heure 35 pour inactiver l'enzyme Les matières insolubles sont en-

25 levées pour centrifugation On ajoute de l'éthanol à la liqueur surnageante jusqu'à la-concentration finale de 30 % (en volume) On recueille par centrifugation le pré- cipité formé puis on le dissout dans 10 litres d'eau On 5 applique ensuite le même processus comprenant le traite- ment utilisant une ultrafiltration que dans l'Exemple 8 pour obtenir 413 g d'une poudre blanche. EXEMPLE 12 On ajoute à 3 litres de la liqueur surnageante 10 obtenue par traitement par ultrafiltration de l'Exemple 8, un mélange de chloroforme et de n-butanol dans le même rapport que dans l'Exemple 1 pour effectuer un traitement de déprotéination On sèche par atomisation une portion hydrosoluble pour obtenir 420 g d'une poudre blanche. 15 EXEMPLE 13 On ajoute de l'éthanol à la portion hydrosoluble obtenue par application du traitement de déprotéination de l'Exemple 12 jusqu'à une concentration finale de 40 % (en volume) On recueille par centrifugation le précipité 20 formé, on le lave et le déshydrate trois fois avec de l'é- thanol, puis on le sèche sous vide pour obtenir 405 g d'u- ne poudre blanche. EXEMPLE 14 On ajoute à 2 g d'une poudre blanche obtenue 25 dans l'Exemple 5, 100 ml d'un mélange à 2 % d'acide sul- furique et d'acide formique, et on maintient le tout pen- dant 4 heures à 60 C pour l'hydrolyser On neutralise la solution par addition de bicarbonate de baryum et on la centrifuge pour obtenir une liqueur surnageante. 30 On applique un demi-volume de la liqueur surna- geante sur Sepharose CL-2 B et on recueille la fraction F 1 (poids moléculaire : supérieur à 20 000 000) en éluant dans le volume de vides et la fraction F 2 (poids moléculai- re : environ 1 000 000) On applique un autre demi-volume 35 de la liqueur surnageante sur Sephadex G-200 (produit par

26 Pharmacia Chemicals AB), et on recueille la fraction F 3 (poids moléculaire : environ 100 000) et la fraction F 4 (poids moléculaire : environ 10 000) On obtient par lyo- philisation de chaque solution des poudres blanches, F 1, 5 412 mg ; F 2 : 248 mg ; F 3 : 295 mg ; et F 4 : 263 mg. Les activités biologiques de chaque fraction sont mises à l'épreuve en utilisant le procédé décrit ci-des- sus Les 4 fractions présentent toutes des activités aus- si fortes que la substance ARP avant hydrolyse Les ré- 10 sultats sont récapitulés en détail ci-après : ( 1) Activités antitumorales Les activités à l'encontre d'une tumeur syngénique, Meth-A, par l'administration orale sont indiquées sur le Tableau VI. 15 TARI :Al I VT 20 25 | nu XL nu v a Fraction Dose Poids moyen de Rapport (mg/kg) la tumeur (g) d'inhibition (%) Témoin 8,60 - (Solution saline) F 1 30 4,90 43 F 2 " 5,16 40 F 3 " 5,33 38 F 4 " 5,30 38 ( 2) Activités immunomodulatrices (a) Epreuve d'élimination du carbone (CCT) - Les activités en utilisant des souris porteuses 30 de tumeurs sont indiquées sur le Tableau VII.

27 TABLEAU VII Fraction Dose Indice Valeur (mg/kg) phagocytaire relative (Z) Témoin x 10-3 100 (Solution saline) F 1 30 153 138 F 2 " 155 140 F 3 " 158 142 F 4 150 135 (b) Essai portant sur des cellules formatrices de plaques d'hémolyse (PFC) Les activités en utilisant des souris normales sensibilisées au 4 ème jour par des hématies de mouton sont indiquées sur le Tableau VIII. TABLEAU VIII Fraction Dose Nombre de plaques Valeur (mg/kg) par rate relative (%) Témoi N x 104 Témoin _ 2,6 x O 100 (Solution saline) F 1 30 6,0 231 F 2 " 5,5 212 F 3 " 5,2 200 F 4 " 5,0 192 (c) Réaction d'hypersensibilité du type retardé (DHR) Les activités en utilisant des souris porteuses de tumeurs sont indiquées sur le tableau IX. 5 10 15 20 25 30

28 TABLEAU IX Fraction Dose Augmentation de Valeur (mg/kg) l'épaisseur de relative (%) l'oreille (mm) Témoin -0,90 x 102 100 (Solution saline) F 1 30 2,07 230 F 2 " 2,21 245 F 3 " 1,89 210 F 4 " 1,80 200 ( 3) Activités de défense d'un hôte contre des maladies in- fectieuses. Les activités administrées par voie sous-cuta- née un jour après l'infection sont indiquées sur le Ta- bleau X. TABLEAU X Fraction Dose E coli*l L mono * 2 (mg/kg) Nombre de Effet pro Nombre de Effet pro- survivants tecteur (%) survivants protecteur(%) Témoin O (Solution saline) F 1 30 20 100 12 60 F 2 " 18 90 10 50 F 3 " 17 85 10 50 F 4 " 17 85 9 45 : Escherichia coli SB-001 : Listeria monocytogenes SB-010 E coli * 1 * 2 L mono. 5 10 15 20 25 30

Claims

EXEMPLE 4 On fait passer 20 kg de son de riz du commerce à 15 travers un tamis à mailles de 0,59 mm pour éliminer les impuretés telles que des morceaux de riz, puis on le lave avec 100 litres d'eau ayant subi un échange ionique On ajoute ensuite 50 litres d'eau distillée au son de riz lavé ci-dessus, et on extrait le mélange à 710 OC pendant 3 heu- 20 res sous agitation constante On filtre le mélange On con- centre le filtrat sous pression réduite et le centrifuge, pour obtenir ainsi 10 litres d'une liqueur surnageante. On y ajoute ensuite 250 mg d'une a-amylase et on maintient une température de 65 OC pendant 24 heures On chauffe le 25 mélange à 100 OC On ajoute ensuite de l'éthanol à la con- centration finale de 30 Z (en volume) On sépare le préci- pité formé On dissout ce précipité de nouveau dans 3 li- tres d'eau, on enlève les matières insolubles, on concentre encore jusqu'à 1 litre et on centrifuge pour obtenir une 30 liqueur surnageante On dialyse cette liqueur surnageante pendant 2 jours à l'eau courante et on centrifuge pour ob- tenir 1 litre d'une liqueur surnageante On ajoute un mé- lange de 200 ml de chloroforme et 40 ml de n-butanol à 1 li- tre de cette liqueur surnageante On procède ensuite à une 35 déprotéination et à une lyophilisation de la même manière R E V E N D I C A T I O N S

1 Substance RDP de polysaccharide, caractérisée en ce cue:( 1) elle présente les propriétés suivantes : elle ne traverse pas une membrane de dialyse ; elle est insolu- 5 ble dans l'alcool, l'acétone, l'hexane, le benzène, l'acé- tate d'éthyle, le diméthylsulfoxyde, la ligroine, le tétra- chlorure de carbone, le chloroforme et l'éther, et est so- luble dans l'eau; une solution aqueuse à 1 % est neutre ; elle contient des substances minérales en une proportion 10 ne dépassant pas 5 % ; elle réagit positivement dans les réactions suivantes : la réaction de Molish, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction tryptophane-acide sulfurique , la réaction cysteine-acide sulfurique, la réac- tion chromotrope-acide sulfurique, la réaction phénol-acide 15 sulfurique, et la réaction carbazole-acide sulfurique ; et négativement dans la réaction du biuret, la réaction à la ninhydrine, la réaction de Lowry-Folin, la réaction de El- son-Morgan et la réaction amidon-iode ; elle présente un spectre d'absorption des ultra-violets tel qu'indiqué sur 20 la figure 1, un spectre d'absorption des rayons infrarou- ges tel qu'indiqué sur la figure 2 et un spectre RMN 13 C tel qu'indiqué sur la figure 3 ; ( 2) elle contient du glucose comme seul composant sucre et une liaison a -1,6-glucoside dans la chaine principale, et 25 contient en outre une liaison a l,4-glucoside.

2 Procéde de production d'une substance RDP de polysaccharide, ladite substance,( 1) ayant les propriétés suivantes : elle ne traverse pas une membrane de dialyse ; elle est insoluble dans l'alcool, l'acétone, l'hexane, le 30 benzène, l'acétate d'éthyle, le diméthylsulfoxyde, la ligroine, le tétrachlorure de carbone, le chloroforme et l'é- ther, et elle est soluble dans l'eau ; une solution aqueuse à 1 % est neutre ; elle contient des substances minérales en une proportion ne dépassant pas 5 % ; elle réagit positi- 35 vement dans les réactions suivantes : la réaction de Molish, la réaction anthrone-acide sulfurique, la réaction tryptophane-acide sulfurique, la réaction cystéine-acide sul- furique, la réaction chromotrope-acide sulfurique, la réac- 5 tion phénol-sulfurique et la réaction carbazole-acide sul- furique, et négativement à la réaction du biuret, la réac- tion à la ninhydrine, la réaction de Lowry-Folin, la réac , tion de Elson-Morgan, et la réaction amidon-iode ; elle présente un spectre d'absorption des ultra- 10 violets tel que représenté sur la figure 1, un spectre d'absorption des rayons infrarouges tel que représenté sur la figure 2 et un spectre RMN 13 C tel que représenté sur la figure 3 ; ( 2) contenant du glucose comme seul constituant sucre et 15 une liaison a-1,6-glucosi'de dans la chaîne principale et en outre contient une liaison a-1,4-glucoside ; caractérisé en ce qu'il consiste à traiter du son de riz avec de l'eau chaude pour extraire ladite substance RDP de polysaccharide dans l'eau, à ajouter un solvant orga- 20 nique polaire ou un agent de relargage à l'eau contenant la substance extraite pour former des précipités contenant ladite substance RDP de polysaccharide, à isoler les pré- cipités, et à les soumettre à un traitement de déprotéi- nation. .CLMF: 3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le solvant organique polaire est un solvant choisi entre le méthanol, l'éthanol, le propanol et l'acétone.

4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé- en ce que l'agent de relargage est un composé choisi dans 30 le groupe comprenant le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium et le chlorure de potassium.

5 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le traitement de déprotéination est un traitement choisi dans le groupe comprenant un traitement enzymatique, 35 un traitement à l'acide et la méthode de Sevag.

6 Procéde selon l'une quelconque des revendica- tions 2, 3, 4 et 5, caractérisé en ce qu'on procède en outre à un traitement de purification par dialyse en uti- lisant une membrane de dialyse, à un traitement d'échange 5 d'ions au moyen d'une résine d'échange de cations ou d'anions, à une ultrafiltration en utilisant une membrane d'ultrafiltration et à une filtration sur gel, ces opéra- tions étant effectuées seules ou en combinaisons entre elles.

7 Agent anti-tumoral caractérisé en ce qu'il 10 consiste essentiellement en une substance RDP de polysac- charide ou son véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite substance RDP de polysaccharide>(l) ayant les pro- priétés suivantes elle ne traverse pas une membrane de dialyse ; elle est insoluble dans l'alcool, l'acétone, 15 l'hexane, le benzène, l'acétate d'ethyle, le diméthylsul- foxyde, la ligro Yne, le tétrachlorure de carbone, le chlo- roforme et l'éther, et elle est soluble dans 1 l'eau ; une solution aqueuse à 1 Z est neutre ; elle contient des substances minérales en une proportion ne dépassant pas 20 5 Z ; elle réagit positivement dans les réactions suivan- tes : réaction de Molisch, réaction anthrone-acide sulfu- rique, réaction tryptophane-acide sulfurique, réaction cysteine-acide sulfurique, réaction chromotrope-acide sul- furique, réaction phénol-acide sulfurique, et réaction carbazole-acide sulfurique ; et négativement dans la réaction du biuret, la réaction à la ninhydrine, la réaction de Lowry-Folin, la réaction de Elson-Morgan et la réaction amidon-iode ; elle présente un spectre d'absorption des ul- traviolets tel que représente sur la figure 1 ; un spectre 30 d'absorption des rayons infrarouges tel que représenté 13 sur la figure 2 et un spectre RMN C tel que représenté sur la figure 3 ; ( 2) elle contient du glucose comme seul composant sucre et contient une liaison a-l,6-glucoside dans la chaîne princi- 35 pale et contient en outre une liaison a-l,4-glucoside.

8 Agent immunomodulateur, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement en une substance RDP de polysac- charide ou son véhicule pharmaceutiquement acceptable, la- dite substance RDP de polysaccharide,( 1) ayant les proprié- 5 tés suivantes : elle ne traverse pas une membrane de dia- lyse ; elle est insoluble dans l'alcool, l'acétone, l'hexa- ne, le benzène, l'acétate d'éthyle, le diméthylsulfoxyde, la ligro Tne, le tétrachlorure de carbone, le chloroforme, et l'éther, et est soluble dans l'eau ; une solution aqueu- 10 se à 1 Z est neutre ; elle contient des substances minéra- les en une proportion ne dépassant pas 5 % ; elle réagit positivement dans les réactions suivantes : réaction de Molisch, réaction anthrone-acide sulfurique, réaction tryp- tophane-acide sulfurique, réaction cystéine-acide sulfuri- 15 que, réaction chromotrope-acide sulfurique, réaction phé- nol-acide sulfurique et réaction carbazole-acide sulfurique ; et négativement dans la réaction du biuret, la réaction à la ninhydrine, la réaction de Lowry-Folin, la réaction de El- son-Morgan et la réaction amidon-iode ; elle présente un 20 spectre d'absorption des ultraviolets tel que représenté sur la figure 1, un spectre d'absorption des rayons infra- rouges tel que representé sur la figure 2, un spectre RMN 13 C tel que représenté sur la figure 3 ; ( 2) contenant du glucose comme seul composant sucre et une 25 liaison a-l,6-glucoside dans la chaîne principale et con- tient en outre une liaison a-l,4-glucoside.

9 Agent de défense d'un hôte contre des maladies infectieuses, caractérisé en ce qu'il consiste essentiel- lement en une substance RDP de polysaccharide ou son vehi- 30 cule pharmaceutiquement acceptable, ladite substance RDP de polysaccharide,(l) ayant les propriétés suivantes : elle ne traverse pas une membrane de dialyse ; elle est insolu- ble dans l'alcool, l'acétone, l'hexane, le benzène, l'acé- tate d'éthyle, le diméthyl-sulfoxyde, la ligroi Tne, le té- 35 trachlorure de carbone, le chloroforme, et l'éther, et est soluble dans l'eau ; une solution aqueuse à 1 % est neutre elle contient des substances minérales en une proportion ne dépassant pas 5 % ; elle réagit positivement dans les réactions suivantes : réaction de Molisch, réaction anthro- 5 ne-acide sulfurique, réaction tryptophane-acide sulfurique, réaction cysteine-acide sulfurique, réaction chromotrope- acide sulfurique , réaction phénol-acide sulfurique, et réaction carbazole-acide sulfurique ; et négativement dans la réaction du biuret, la réaction à la ninhydrine, la 10 réaction de Lowry-Folin, la réaction de Elson-Morgan et la réaction amidon-iode ; elle présente le spectre d'absorp- tion des ultraviolets tel que représenté sur la figure 1, le spectre d'absorption tel que représenté sur la figure 2, et le spectre RMN 13 C tel que représenté sur la figure 3 ; 15 ( 2) contenant du glucose comme seul composant sucre, et une liaison a-l,6-glucoside dans la chaîne principale et contient en outre une liaison a-l,4-glucoside.