JPS5936965B2 - タンパク質ｒｂｆ−ｐｍ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシスチン含量の少い新規なタンパク質に関し、
更に詳しくは米の表皮部を出発物としてある種の操作を
加えることにより得られる生理活性物質として有用な新
規タンパク質に関する。

米ぬかを溶媒抽出することで生理活性をもつ物質ＲＢＡ
が得られることが知られている（特開昭５０−７７５１
８号公報参照）。この物質ＲＢＡはシステイン１５〜２
０モル％、グリシン２３〜２６モル％を含む植物性蛋白
でｐＨ７〜１０の等電点をもつことが知られており、例
えば米ぬかを食塩水で抽出することにより得られる。一
方、穀粒などの種子の表層部から抗腫瘍活性物質が採取
できることは特開昭５３−１３９７１３号公報により公
知である。

この公報記載の発明では原料を加圧加熱処理してから熱
水抽出し、又は熱水可溶部を除去した後アルカリ水溶液
で抽出をおこなつている。実施例によれば米ぬかを原料
とするアルカリ抽出液は中和、濃縮後１．５倍量のエタ
ノールを加え、分離された沈澱はアルカリに再溶解、エ
タノール不溶分除去ののち、上澄液の透析で精製し、ア
セトン、メタノール不溶性の白色粉末としている。かか
る公報記載の発明で得られた活性物質は非蛋白系の高分
子物質で、高級脂肪酸乃至その近縁物質であると推測さ
れている。本発明者はこの発明をふまえて更に検討を加
え、米ぬかを原料とする塩基性水溶液抽出液を先行技術
と異なる方法で処理することにより、先行技術のものと
は性質の異なる抗腫瘍活性物質ＲＢＦ−Ｐを得、既に特
許出願した（特願昭５４−１０４６８３）。本発明者は
、さらにこのＲＢＦ−Ｐの活性成分を探究した結果、活
性成分の１つとして新物質を見出し本発明に到つた。即
ち本発明はシスチン含量０．１％未満、窒素含量１２％
以上１５％未満でｐＨ３以上６未満の範囲に等電点をも
ち、希食塩水及び希酸に不溶、希アルカリに可溶なタン
パク質ＲＢＦ−ＰＭを提供するものである。タンパク質
の溶解度にもとづく分類法に従えば米の蛋白質はアルブ
ミン、グロブミン、プロラミン及びグルテリンの４種に
大別される。

普通米の赤ぬ力沖の含量としてそれぞれ３．８７％、３
．７４％、０．５８％及び２．３９％というような値が
知られている（堀越、森田：米の蛋白質、植物酵素蛋白
質研究法Ｐ４５１、共立出版昭５１）。アルブミンは純
水に可溶であり、グロブリンは純水に不溶であるが、い
ずれも希塩類溶液に可溶である。

プロラミンとグルテリンは、希塩類溶液に不溶な点で上
記２種と異なり共に希酸、希アルカリ可溶性であり純ア
ルコールには溶けないがプロラミンは６０〜９０％アル
コールに溶解する。グルテリンとプロラミンは共にグル
タミン酸とプロリンが多いが、プロラミンは特にプロリ
ン含量が高い。米に含まれるグルテリンのアミノ酸組成
の例は前記堀越氏らの文献に示されているがグルタミン
酸が特に多くついでアスパラギン酸、アルギニンが多い
。

シスチンは１〜２％含まれている。他の例として脱脂ぬ
かをアルカリ抽出し酸を加えて、沈澱させた米ぬかタン
パク標品のアミノ酸組成が知られている（満田他、栄養
と食糧２３，８２）。この場合も特に多いアミン酸はグ
ルタミン酸で、シスチン含量は約２％である。本発明の
タンパク質ＲＢＦ−ＰＭは純水、希塩類溶液、アルコー
ル（１００％、７０％）のいずれにも不溶であり、希ア
ルカリに可溶であるから溶解性からするとグルテリンに
近いが希酸は不溶である点で異なる。

アミノ酸組成としては、シスチンが極度に少くきわめて
特異である。またしばしば少量の糖を含む。また先に挙
げた米ぬかから抽出される生理活性タンパク質のＲＢＡ
とは溶解性（食塩水など）、アミノ酸組成（シスチン含
量など）が著るしく異なる。

次に本発明のタンパク質の製法の詳細を説明する。

タンパク質ＲＢＦ−ＰＭを含むＲＢＦ−Ｐは、米の表皮
部から塩基を用いて抽出した水溶液を有機溶媒と混和し
不溶分除去後、酸で沈澱させることにより得られる。

米の表皮部は通常玄米から白米を得た残りの米ぬかとし
て得られるが、玄米など表皮部のついたま＼の米自体や
米ぬか油を抽出した残渣のｆ）！き他の有用成分取得の
目的に使用されたあとの米ぬかであつても使用可能であ
る。

米はもちとうるち、ジヤポニカ種とインデイカ種などに
分れ、更に多数の品種に分れるが特に種類は問わない。
本発明は入手の最も容易なジヤポニカ種うるち米のぬか
を主として使用した。米ぬかは熱水可溶部中にも抗腫瘍
活性物質を含むが（特開昭５３−１３９７１３号公報参
照）、本発明に係るＲＢＦ−Ｐは熱水不溶部中から得ら
れるので、通常まず加熱水で処理して熱水可溶分（主と
して澱粉などの多糖類）を除去する。

熱水可溶分除去は米ぬかを５〜２０倍量（重量）の熱水
と共に蒸煮する方法でおこなうことができる。特開昭５
３−１３９７１３号公報で示された加圧加熱処理をこの
工程で併用することもできる。熱水可溶分を除去した米
ぬかは例えば１〜１０（重量）％カセイソーダ水溶液の
如き塩基性水溶液で抽出される。炭酸ソーダ、カセイカ
リ、アンモニアなど他の塩基の水溶液を用いることもで
きる。水酸化カルシウムは不溶性の不純物をつくるので
好ましくない。塩基の量はカセイソーダの場合米ぬかに
対して０．１倍量（重量）程度を用いれば足りる。塩基
性水溶液の濃度、抽出温度、時間はＲＢＦ−Ｐの得量や
活性に影響がある。

５％カセイソーダ水溶液を用い５０℃で抽出するとき、
抽出時間５時間程度ではＲＢＦ−Ｐの得量は多いが活性
が十分でない。

１０時間とか２０時間とかの抽出時間では活性のすぐれ
たＲＢＦ−Ｐが得られる。

しかし、５０℃で３０時間以上になると収量、活性共に
激減する。活性のすぐれたＲＢＦ−Ｐを得るには抽出温
度に応じて適当な抽出時間があり、例えば３０℃では１
００時間程度の長時間がよい。１０℃未満とか、９０℃
以上というような極端な温度は活性のよいＲＢＦ−Ｐを
得るのに適していない。

塩基濃度についても、極端でない１〜１０％がよい。米
の表皮部から塩基を用いて抽出した水溶液から抗腫瘍活
性物質を得る手段として先行技術では中和にはじまり、
濃縮、エタノール添加、遠心分離、再溶解、再エタノー
ル添加を経て結局は透析により精製していた（特開昭５
３−１３９７１３号公報実施例１）。これに対して本発
明では抽出液に塩基性の状態のまま有機溶媒を混和して
不溶分を除去し、しかるのち酸を加えて沈澱させるきわ
めて簡単な方法で別の活性物質ＲＢＦ−Ｐが得られる。

塩基による抽出液にまずエタノール、メタノール、アセ
トン等の水と混合できる有機溶媒を加えると不溶分が沈
澱してくる。

この沈澱は有害な成分であり例えばエタノール濃度を４
０ｑ１）容量以上とすることで十分に沈澱できる。この
沈澱は遠心分離あるいは淵過により除去することができ
る。塩基による抽出水溶液と混和する有機溶媒は水と相
溶し混和するものであればよいが、酸性のものは塩基を
中和してしまうので不都合である。タンパク質の分画に
普通に用いられるエタノールやアセトンを用いることが
できるが、その他メタノール、ｎ−プロパノール、イソ
プロパノールのような低級アルコール類、エチレングリ
コール、プロピレングリコール、グリセリンのような多
価アルコール類、エトキシエタノール、ブトキシエタノ
ールなどのグリコールエーテル類が一般に使用できる。
また、ジオキサン、テトラヒドロフラン、メチルエチル
ケトンなどのエーテルやケトンも水混和性である限り用
いることができる。普通は上記のような含酸素有機溶媒
を用いるが場合によつてはアセトニトリルの如きその他
の水混和性溶媒を用いてもよい。有機溶媒の使用量は溶
媒の種類によつても異なるが水溶液に対して通常一容以
上が好ましい。

例えばエタノールの場合混和後のエタノール濃度４０％
にすれば塩基による抽出水溶液中にとけていた有害な多
糖類を沈澱して除くことができ、方エタノール濃度力塙
すぎて６００！）以上になると後で酸性にした時、ＲＢ
Ｆ−Ｐの沈澱が妨げられる。しかし、メタノールの場合
は水溶液に対して４〜５倍という多量を用いてもよい結
果が得られる。なお本明細書で用いている％は原則とし
て重量％であるが、有機溶媒濃度に限り容量％である。
このように有害成分を除去したアルカリ水性有機溶媒に
対し塩酸、リン酸、酢酸などの酸を加え中和し沈澱を得
る。これがＲＢＦ−Ｐである。得られた沈澱は加熱減圧
乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの方法により乾燥物とな
る。水性有機溶媒溶液の中和による沈澱の収得は１段で
もよいが２段階に実施すれば更に精製度が上る。

この場合第１段階は水性エタノール濃度を１０〜４０％
例えば３０（ｆｌ）というように低くとつてＰＨ５〜６
まで中和することにより活性物質の損失を少くおさえ、
得られた沈澱をアルカリに再溶解して第２段階では５０
％というような高目の濃度になるようにエタノールを加
え、不溶分を除去した後再び酸でＰＨを調節して沈澱を
得る。ＰＨを７にしたときに溶液中の固形分の２２％が
沈澱として得られるにすぎないがＰＨ６にすると７４％
、ＰＨ５で７４％、ＰＨ４で５９％、ＰＨ３で３６％と
変り、脂肪酸のように酸性にすれば沈澱するといつたも
のでなくタンパク質の等電点沈澱のように沈澱に適した
ＰＨが限られていることがわかる。上記の例かられかる
ようにＰＨ３〜７特にＰＨ４〜６の範囲に調節するよう
に中和することが望ましい。このようにして得られたＲ
ＢＦ−Ｐはマウスの腹水癌及び固形癌に対して抑制効果
をもち、またマイトマイシン−Ｃなどの他の抗腫瘍性剤
との併用効果も認められた。本発明のタンパク質ＲＢＦ
−ＰＭはこのようなＲＢＦ−Ｐの抗腫瘍活性成分のひと
つとして新たに見出されたものでシスチン含量の極度に
少いタンパク質であり、ＲＢＦ−Ｐの極性有機溶媒不溶
分として得られた。

極性有機溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパ
ノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコー
ル類、アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノ
ンなどのケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエス
テル類、エチルエーテル、イソプロピルエーテル、テト
ラヒドロフランなどのエーテル類などが用いられる。

ＲＢＦ−Ｐの中に少量の脂肪酸塩が含まれる場合メタノ
ールを用いれば脂肪酸塩も溶解してＲＢＦ−ＰＭから除
かれる。他の溶媒、例えばエチルエーテルを用いると脂
肪酸塩を溶かさないためＲＢＦ−ＰＭは少量の脂肪酸塩
を含んだ形で得られる。極性有機溶媒可溶分として除か
れる部分は高級脂肪酸などのヘキサン可溶分と、ヘキサ
ン不溶分ＲＢＦ−Ｈとを含みマウス腹水癌に対して阻止
効果がぁる（特願昭５４−１０４６８３号明細書参照）
。

極性有機溶媒としてメタノールを使用する場合、例えば
ＲＢＦ−ＰｌＯ９に対し、１１のメタノールを加え攪拌
してメタノール可溶分を溶解せしめたのち不溶部を済取
乾燥すると約３９のＲＢＦ−ＰＭが得られる。

このようにして得られたタンパク質ＲＢＦ−ＰＭは一般
的に次のような性質をもつている。

ローり一法蛋白呈色反応：牛血清アルブミン換算で９０
％以上Ｇ１えば第１表の＃２０は９３（Ｉ））フエノー
ル硫酸糖呈色反応：グルコース換算で８％以下紫外部吸
収スペクトル：２８０ｎｍ付近に弱い吸収を示す（第１
図）赤外部吸収スペクトル：３３００，１６４０，１５
３０（１−JモV１−１付近に顕著な吸収を示す（第２図
）融点：３００℃まで明確な融点は示さない元素分析：
いくつかの例を第１表に示す。

窒素含量は一般にや＼少なめの１２−１５％、特に１２
−１４％の範囲にある。等電点：標準的な等電点電気泳
動分析法ではスポツトが移動せず、溶液の紫外吸光度が
極小を示すＰＨは３〜６の範囲にある０１えば第１表の
＃２０は３．５〜５）。

アミノ酸分析 ６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し塩酸を蒸発さ
せたのち、０．０１Ｎカセイソーダを加えて４時間室温
で置き、更に０．１Ｎ塩酸で酸性化し、イオン交換クロ
マトグラフイ一、ニンヒドリン発色法で分析した。

システインがあればアルカリ処理の間にシスチンに変化
するのでシスチンとして分析される。本明細書でいうシ
スチン含量はこのような分析法によつたものなので、タ
ンパク質中に存在したときにシステインの形をとつてい
たものをも含んでいる。本発明のタンパク質のアミノ酸
組成の範囲をいくつかの分析例と共に第１表に示す。液
体クロマトグラフイ一 溶出クロマトグラムの一例を第３図に示す。

充填剤 トヨパール（東洋曹達 登録商標）ＨＷ６Ｏ（
親水性ビニルモノマーの重合によ る全多孔性の球状ゲル） 溶出液 ０．０１２５Ｎカセイソーダ、溶出流量３６〜
３７ｍ１／ｈ標品の溶出時間と比較した結果、第３図の
ＲＢＦ−ＰＭは分子量３万−５万及び７万−１２万に主
な分布をもつ。

溶解性 試料１Ｗ９と溶媒１ｍ１を室温で混合した後肉眼で判定
する。

完溶するものに○，ほとんど溶ける様子のないものは×
，一部溶解するものは△で示す。Ｘ純水、０．８５％食
塩水、メタノール、エタノール、７０％エタノール、ア
セトン、メチルエチルケトン、エチルエーテル、イソプ
ロピルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、７Ｍ−尿素
水溶液、リン酸緩衝液（ＰＨ４．７〜７）。

クエン酸緩衝液（ＰＨ３．３〜７）、酢酸緩衝液（ＰＨ
３．７〜８．１）、塩酸（０．１Ｎ，６Ｎ）、０．１Ｍ
酢酸水溶液△ ３Ｍ塩酸グアニジン水溶液 ０６Ｍ塩酸グアニジン水溶液 カセイソーダ水溶液（０．０１２５Ｎ） ０，０１２５Ｎ アルカリ性アルコール水溶液（５”ｏ重量％）ラウリル
硫酸ナトリウム水溶液（０．１％）ドデシルベンゼンス
ルホン酸ソーダ水溶液（０．１（ｆ）） 氷酢酸 トリフルオロ酢酸 オレイン酸ソーダ水溶液（５％） 蛋白質のアミノ酸組成に関しては多くの事実が知られて
おり例えば水島、赤堀編集、蛋白質化学、第２巻、１２
７〜１４９頁（共立出版、昭２９年）には数多くの蛋白
質及び食品についてアミノ酸組成の分析表が挙げられて
いる。

周知のようにシスチンは蛋白質においてその三次構造を
決定する上で重要な役割を果しており大部分の蛋白質で
も約１％またはそれ以上のシスチンを含むことが上記の
表からもうかがえる。上記の表の中にもシスチンを含ま
ない特殊な蛋白質が少し見い出されるがそれらの大部分
は窒素含量が多く、窒素含量１２〜１５％でシスチン含
量がＯ、１（ｆｌ）未満の蛋白質は見い出されていない
。本発明の蛋白質ＲＢＦ一ＰＭはこのように稀な化学組
成と共に溶解性及びＰＨ３以上６未満という特定の等電
点範囲により特定される。本発明の蛋白質ＲＢＦ−ＰＭ
は生理活性物質として有用である。

特に抗腫瘍活性が著しく実施例に示すようにマウス腫瘍
に対し顕著な抑制効果を示す。

以下本発明を具体的実施例につき説明する。

実施例 １庄内ササニシキ、岩手キヨニシキ、埼玉ニホ
ンバレの混合米から得られた米ぬか１６１＜９に対し水
２１６１を加え１２０℃で１時間加圧下に蒸煮した後、
４．５時間１００℃に保ち熱水可溶部を溶出せしめた。

熱済過して得られた固形分２２．４ｋｇに対し５％カセ
イソーダ水溶液４０ｋ９を混合し５０℃で１０時間攪拌
し抽出をおこなつた。抽出液６０．３ｋ９に対し水６０
．３１を加えた後、エタノール１２０．６１を加えエタ
ノール濃度を５００１）（容量比）とした。アルカリ性
エタノール不溶分を遠心分離により除去した後塩酸でＰ
Ｈ５．５に調節した。

一夜１０℃以下に放置後沈澱物を分離した後、凍結乾燥
により乾燥沈澱物ＲＢＦ−Ｐｌ．４６ｋｇを得た。ＲＢ
Ｆ−ＰｌＯ９に対しメタノール１１を加え可溶分を除去
した後、メタノール不溶部である蛋白質ＲＢＦ−ＰＭ３
．２ｇを得た（第１表の＃３５Ｂ）。得られたＲＢＦ−
ＰＭ＃３５Ｂの紫外部吸収スペクトルを第１図、赤外部
吸収スペクトルを第２図、液体クロマトグラムを第３図
に示す。第１表の＃３７は同じ品種の米ぬか１６ｋｇか
ら上記と同様にして得たＲＢＦ−Ｐｌ．５４ｋｇのメタ
ノール不溶分（得率３２．５％）である。

第１表の＃４６は福島ササニシキと埼玉ニホンバレの混
合米から得られたぬかを用い、上記と同様にして得たＲ
ＢＦ−Ｐ（収量１．３０ｋｇ／１６ｋｇぬか）のメタノ
ール不溶分（得率３０．７％）である。実施例 ２ＩＣ
Ｒマウスの腹腔内で７日間培養された腹水型ザルコーマ
１８０細胞を５週令のＩＣＲマウス雌（１群７匹）の腹
腔に５．６Ｘ１０６ケ移植し２４時間後から検体材料の
生理食塩水溶液を毎日一回５日間腹腔内に投与した。

７日目に腹水中に生育した腫瘍細胞量を沈降容積により
測定し対照群と比較して腫瘍阻止率を求めた。

実施例１で得られた蛋白質ＲＢＦ−ＰＭ＃３５Ｂは１０
０〜／Ｋｇ・日の投与量において６２（ｆ）の阻止率を
示した。

実施例 ３ ＩＣＲマウスの腹腔内で７日間培養した腹水型ザルコー
マ１８０細胞を５週令のＩＣＲマウス雌（１群５〜７匹
）の右後肢筋肉に３×１０６ケ移植し２４時間後より検
体試料の生理食塩水溶液を毎日一回１０日間腹腔内投与
した。

２８日目に腫瘍を摘出して重量をはかり対照群と比較し
て腫瘍阻止率を求めた。

′圧Ｗ！生ｊ邑＼八」ハｕノ 実施例１で得られた蛋白質ＲＢＦ−ＰＭ＃３５Ｂの結果
は次の通りであつた。

実施例 ４ コシヒカリの米ヌカ４ｋｇに水１６１を加え１２０℃で
１時間加圧下に蒸煮した後水を更に４０１加え、４．５
時間１００℃に保つて、でんぷんなどの熱水可溶部を溶
出せしめた。

熱淵過して固形分を集め、４０１）カセイソーダ水溶液
１０ｋｇと混合し、２０℃で４８時間放置して塩基水溶
液可溶部を抽出した。水５１を加えて済過して得た抽出
液に６．３２のエタノールを加えエタノール濃度３０％
とした後、塩酸で中和しＰＨ５に調節した。４℃で２４
時間静置後析出した沈澱を遠心分離で集め、２回水洗し
、湿ケーキ１．３ｋｇを得た。

これを２％カセイソーダ水溶液３．５１＜ｇに溶解し、
エタノール４．８２を加えエタノール濃度約５０％とし
た。アルカリ性エタノール不溶分が析出したので、これ
を済過して除去しＰＨ５．５に調節して中和した。一夜
放置後沈澱物を分離し、乾燥沈澱物ＲＢＦ−Ｐｌ２２９
を得た。これは、中和前の淵液中に含まれていた透析膜
不透過性固形分１６５ｇに対して７４％の取得率にあた
る。上記ＲＢＦ−ＰｌＯ９にメタノール１１を加えて可
溶分を除去しメタノール不溶分としてＲＢＦ−ＰＭ３．
７ｇを得た（第１表の＃２０）。

実施例３と同様の方法でマウス固形癌の阻止効果を調べ
たところ次の通りであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得た蛋白質ＲＢＦ−ＰＭ＃３５Ｂの
紫外部吸収スペクトル、第２図はその赤外部吸収スペク
トル、第３図はその液体クロマトグラムである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シスチン含量０．１％未満、窒素含量１２％以上１
   ５％未満でｐＨ３以上６未満の範囲の等電点をもち、希
   食塩水及び希酸に不溶、希アルカリに可溶なタンパク質
   ＲＢＦ−ＰＭ。