CN112795613B - 一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽及其应用 - Google Patents

一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽及其应用，所述降血糖多肽是以油用牡丹籽粕为原料，采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶连续酶解，结合超滤以及反相高效液相色谱进行分离获得，其主要活性成分的氨基酸序列为Tyr‑Phe‑Phe‑Met(YFFM)。并以此主要活性成分的序列为基础设计合成了两种结构类似的多肽Phe‑Phe‑Phe‑Met(FFFM)、Tyr‑Tyr‑Phe‑Met(YYFM)。以对α‑葡萄糖苷酶的抑制活性为指标，YFFM、FFFM和YYFM的IC50值分别为1.099mg/mL、0.145mg/mL和0.191mg/mL。本发明对牡丹籽粕功能食品开发及降血糖多肽的设计具有较好的应用前景和意义。

Description

一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽及其应用
技术领域
本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种来源于油用牡丹籽粕的降血糖多肽，以及基于该多肽设计合成的两种结构类似的降血糖多肽。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖症为特征的内分泌和代谢疾病，其中2型糖尿病约占全球总病例的90％。根据世界卫生组织的估计，到2030年，糖尿病将成为世界第七大死亡原因。2型糖尿病可能引起一些并发症，包括糖尿病性视网膜病变、肾脏毒性、动脉粥样硬化、糖尿病足溃疡、囊性纤维化和阿尔茨海默氏病。
目前有一些抗糖尿病药已经在临床得到应用，例如阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等，它们通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性起作用，但持续使用这些药物通常会带来不良的副作用，例如肝毒性和出现胃肠道不良的症状。现在已经有研究发现存在许多天然的抗糖尿病活性成分，如：苦瓜多肽、杏仁多糖、褐藻多酚等。与小分子药物相比，多肽类降血糖功能因子，用药剂量更小、活性更高、毒副作用更低，且代谢终产物为易吸收的氨基酸，能规避胃、肠道消化。
牡丹(Paeonia ostii)是芍药科芍药属植物，是我国著名的传统花卉，至今已有2000年的种植历史。油用牡丹是牡丹组植物中产籽出油率高于22％的种的统称，目前以凤丹和紫斑两种牡丹为主要油用栽培推广对象。牡丹主要分布在山东、河南、陕西、重庆等省市，分布范围广、适应性强，在南、北方均适宜种植。自牡丹籽油获批成为新资源食品起，油用牡丹产业发展迅速，榨油后产生大量的副产物牡丹籽粕，通常当做废弃物处理，造成了牡丹蛋白资源的浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡丹籽粕来源的活性高、毒副作用低的降血糖多肽，同时实现牡丹籽粕的资源化高附加值利用。
针对上述目的，本发明牡丹籽粕来源的降血糖多肽由下述方法制备得到：
1、牡丹籽粕脱脂
将油用牡丹籽粕粉碎后，以1g:4～6mL的料液比加入正己烷，常温搅拌浸提30～40min，沉淀15～20min后抽滤，收集残渣，连续浸提两次后，将残渣置于通风橱内自然挥发正己烷，得脱脂牡丹籽粕粉。
2、碱溶酸沉法提取牡丹蛋白
取脱脂牡丹籽粕粉，以1g:8～12mL的料液比加入蒸馏水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH至9～10，在室温下搅拌3～5h，然后离心，取上清液用1mol/L HCl水溶液将pH调节至4～5，在4℃下静置2～3h后，离心，收集沉淀，用1mol/L NaOH水溶液将其调节为中性后冻干，得到牡丹蛋白粉。
3、双酶连续酶解
将冻干的牡丹蛋白粉和蒸馏水以1g:20～30mL的料液比混合，将混合物在80～90℃下预热15～30min，用1mol/L NaOH水溶液将pH调节至8.5～10，加入蛋白粉质量3％～5％的碱性蛋白酶在50～60℃下水解2～3h，在水解过程中通过加入0.5mol/L NaOH水溶液将反应液pH始终维持在8.5～10；酶解结束后，将体系置于80～95℃水浴中以终止酶解反应；将该体系再次冷却至40～50℃后维持此温度，将pH调节至8～9，加入蛋白粉质量3％～5％的胰蛋白酶水解2～3h，在水解过程中加入0.5mol/L NaOH溶液维持pH值为8～9；酶解结束后将体系置于80～95℃水浴终止酶解反应，冷却至室温后，加入1mol/L HCl水溶液调节溶液至中性，离心，取上清液得到牡丹籽粕酶解液。
4、超滤分离多肽
将牡丹籽粕酶解液置于超滤杯中，先经10kDa的超滤膜截留，取出＜10kDa的部分再次使用1kDa的超滤膜截留，超滤过程中保持工作压力为0.1～0.2MPa，保留分子量＜1kDa部分。
5、反相高效液相色谱分离多肽
采用反相高效液相色谱对超滤后分子量＜1kDa的部分进行分离，分离条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径20～50nm、粒径5～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是三氟乙酸体积浓度为0.1％的超纯水溶液，流动相B是三氟乙酸体积浓度为0.1％的乙腈溶液，进行梯度洗脱，流动相梯度选择：0～5分钟内5％流动相B洗脱，5～35分钟内5％～60％流动相B洗脱，35～60分钟内60％～100％流动相B洗脱，检测波长为214nm，流速为1mL/min；收集40％～80％流动相B洗脱之间的最高峰肽组分，冻干得到降血糖多肽。
上述降血糖多肽中主要活性成分的氨基酸序列为Tyr-Phe-Phe-Met。
本发明同时基于上述降血糖多肽中主要活性成分的氨基酸序列设计合成了两种与其结构类似的多肽，其氨基酸序列为Phe-Phe-Phe-Met和Tyr-Tyr-Phe-Met。
本发明降血糖多肽的毒副作用低、活性高，可用于制备降血糖药物。
本发明的有益效果如下：
本发明以牡丹籽粕为原料，经正己烷或石油醚等溶剂脱脂后，采用碱溶酸沉法提取籽粕中的蛋白，再先后使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解，酶解液通过超滤分离和反相液相色谱C-18柱纯化，分段收集。将所收集的每个组分均进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定，其中降血糖活性最高的多肽段采用液质联用进行鉴定，鉴定到活性成分为YFFM，并以此为基础通过分子对接，设计并合成了两个具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型多肽FFFM和YYFM。本发明不但实现了牡丹籽粕的高附加值应用，而且提供了更多的活性更高、毒副作用更低的降血糖多肽。
附图说明
图1是<1kDa酶解产物的反相高效液相色谱图。
图2是0.5mg/mL各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
图3是多肽YFFM质谱图。
图4是YFFM对α-葡萄糖苷酶的分子对接结果图。
图5是不同浓度下FFFM的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
图6是不同浓度下YYFM的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、牡丹籽粕脱脂
将油用牡丹籽粕粉碎后，以1g:5mL的料液比加入正己烷，常温搅拌浸提40min，沉淀20min后抽滤，收集残渣，连续浸提两次后，将残渣置于通风橱内自然挥发正己烷12h以上，得脱脂牡丹籽粕粉。
2、碱溶酸沉法提取牡丹蛋白
取50g脱脂牡丹籽粕粉，以1g:10mL的料液比加入蒸馏水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH至10，在25℃下搅拌4h，然后5000r/min离心10min，取上清液用1mol/L HCl水溶液将pH调节至4.5，在4℃下静置2h后，5000r/min离心10min，收集沉淀，用1mol/L NaOH水溶液将其调节为中性后冻干，得到牡丹蛋白粉。
3、双酶连续酶解
将冻干的牡丹蛋白粉和蒸馏水以1g:25mL的料液比混合，将混合物在85℃下预热20min，用1mol/L NaOH水溶液将pH调节至9.0，加入蛋白粉质量4％的碱性蛋白酶在55℃下水解2h，在水解过程中通过加入0.5mol/L NaOH水溶液将反应液pH始终维持在9.0。酶解结束后，将体系置于90℃水浴中以终止酶解反应。将该体系再次冷却至40℃后维持此温度，将pH调节至8.0，加入蛋白粉质量4％的胰蛋白酶水解2h，在水解过程中加入0.5mol/L NaOH溶液维持pH值为8.0。酶解结束后将体系置于90℃水浴终止酶解反应，冷却至室温后，加入1mol/L HCl水溶液调节溶液至中性，8000r/min离心10min，取上清液得到牡丹籽粕酶解液。
酶解结果表明连续两次酶解的水解产物比单一酶酶解的水解产物具有更高的水解度，进一步对比发现先用碱性蛋白酶再用胰蛋白酶连续水解的方法得到的水解产物具有最高的水解度16.83％，使得牡丹蛋白得到了更好的水解。
4、超滤分离多肽
将牡丹籽粕酶解液置于超滤杯中，先经10kDa的超滤膜截留，取出＜10kDa的部分再次使用1kDa的超滤膜截留，超滤过程中保持工作压力为0.15MPa，保留不同分子量的滤液，最终得到分子量＜1kDa、1～10kDa、＞10kDa的三部分。
5、反相高效液相色谱分离多肽
采用反相高效液相色谱对超滤后分子量＜1kDa的部分进行分离，分离条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径20～50nm、粒径5～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是三氟乙酸体积浓度为0.1％的超纯水溶液，流动相B是三氟乙酸体积浓度为0.1％的乙腈溶液，进行梯度洗脱，流动相梯度选择：0～5分钟内5％流动相B洗脱，5～35分钟内5％～60％流动相B洗脱，35～60分钟内60％～100％流动相B洗脱，检测波长为214nm，流速为1mL/min；采用紫外检测器记录波长在214nm处的吸光度，得到9个峰的多肽段：S1～S9，结果如图1所示。分别测定9个多肽段对α-葡萄糖苷酶的抑制率，结果如图2显示，在样品浓度为0.5mg/mL时，S9峰具有最高的抑制活性，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为27.13±0.71％，且该组分的抑制活性高于＜1kDa部分。因此，收集40％～80％流动相B洗脱之间的最高峰肽组分S9，冻干得到降血糖多肽。
将所得降血糖多肽溶解在流动相C中，采用反相高效液相色谱-质谱联用仪进行分离鉴定，分离条件为：流动相C是甲酸体积浓度为0.1％的超纯水溶液，流动相D是甲酸体积浓度为0.1％的乙腈溶液，进行梯度洗脱，流动相梯度选择：0～1min内2％～8％流动相D洗脱，1～23min内8～30％流动相D洗脱，23～24min内30％～100％流动相D洗脱，并在流动相D100％的条件下保持8min。通过装有纳米喷雾的Q Exactive Plus系统进行数据采集，使用Xcalibur检索原始数据。对原始数据进行筛选，设置筛选条件为：置信度>90％，最大可变PTM(翻译后修饰)为3，母体质量误差公差为5.0ppm，碎片离子质量公差为0.02Da，共鉴定出6个多肽序列，分别为YFFM(Tyr-Phe-Phe-Met)、TYPLL(Thr-Tyr-Pro-Leu-Leu)、SLLPE(Ser-Leu-Leu-Pro-Glu、YSPAPL(Tyr-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu)、WLLDPM(Trp-Leu-Leu-Asp-Pro-Met)、SLLGDFM(Ser-Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Met)，其鉴定结果和对α-葡萄糖苷酶抑制活性见表1所示，其质谱图如图3所示。其中α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法为：在96孔板中加入40μL样品或阳性对照(阿卡波糖)，加入80μL 0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液(溶于0.1M pH6.8磷酸钾缓冲溶液中)，在37℃下孵育15min，再加入80μL 2.5mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液(PNPG，配制于0.1M pH 6.8磷酸钾缓冲溶液中)，体系继续在37℃环境下孵育20min，最终加入150μL 0.2M Na2CO3水溶液。使用酶标仪在405nm处测量体系吸光度，α-葡萄糖苷酶抑制活性计算方法如下：
抑制率(％)＝[1-(Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank)]×100
式中，Asample＝样品溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+PNPG溶液的吸光度；Ablank＝样品溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+磷酸钾缓冲溶液的吸光度；Acontrol＝磷酸钾缓冲溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+PNPG溶液的吸光度。
表1鉴定的降血糖多肽中6种多肽序列
Figure BDA0003007677860000051
Figure BDA0003007677860000061
由表1可见，所得降血糖多肽中对α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的活性成分是多肽序列YFFM。
采用分子对接方法研究多肽YFFM抑制α-葡萄糖苷酶机理。由图4可见，在Maestro(分子对接模拟软件)中进行分子对接，多肽YFFM与α-葡萄糖苷酶对接打分的结果是-7.775kJ/mol。N端酪氨酸分别与α-葡萄糖苷酶形成了4个氢键作用，分别是Tyr 158、Arg315、Asp 352和Glu 411残基，并且第三个苯丙氨酸与酶的Pro312残基也形成了1个氢键；酪氨酸与C端甲硫氨酸分别在Hip 280和Phe 303残基形成了π-π共轭作用。阿卡波糖作为标准药品分子对接打分结果为-8.941kJ/mol，它与α-葡萄糖苷酶形成了7个氢键作用，分别是Tyr 158、Ser 304、Asp307、Thr 310、Pro 312和Leu 313残基。通过对比阿卡波糖和YFFM与α-葡萄糖苷酶的对接结果，YFFM有很好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
基于氨基酸基团相似的碳原子基团结构，用结构相似的氨基酸置换YFFM中的某一氨基酸，用Tyr置换Phe或Phe置换Tyr，且每次只改变一个氨基酸。设计、合成并鉴定它们的活性，最终得到两个新型多肽FFFM(氨基酸序列为：Phe-Phe-Phe-Met)和YYFM(氨基酸序列为：Tyr-Tyr-Phe-Met)具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，活性如图5和图6所示，IC50值分别为0.145±0.026mg/mL和0.191±0.030mg/mL。结合分子对接验证，FFFM和YYFM与α-葡萄糖苷酶对接打分的结果分别为-9.093和-9.496kJ/mol。FFFM分别在Asp 307、Gly 309、Thr310、Pro 312和Leu 313残基上，与α-葡萄糖苷酶形成5个氢键作用；YYFM分别在Tyr 158、Ser 240、Asp 242和Asp 352残基上，与α-葡萄糖苷酶形成4个氢键作用。综上，FFFM和YYFM具有较YFFM更强的体外降血糖活性，有成为降血糖功能食品的潜力。

Claims (2)

1. 一种牡丹籽粕来源的降血糖多肽，其特征在于，所述降血糖多肽的氨基酸序列为Tyr-Phe-Phe-Met，其由下述方法制备得到：
（1）牡丹籽粕脱脂
将油用牡丹籽粕粉碎后，以1g:4～6mL的料液比加入正己烷，常温搅拌浸提30～40min，沉淀15～20min后抽滤，收集残渣，连续浸提两次后，将残渣置于通风橱内自然挥发正己烷，得脱脂牡丹籽粕粉；
（2）碱溶酸沉法提取牡丹蛋白
取脱脂牡丹籽粕粉，以1g:8～12mL的料液比加入蒸馏水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH至9～10，在室温下搅拌3～5h，然后离心，取上清液用1mol/L HCl水溶液将pH调节至4～5，在4℃下静置2～3h后，离心，收集沉淀，用1mol/L NaOH水溶液将其调节为中性后冻干，得到牡丹蛋白粉；
（3）双酶连续酶解
将冻干的牡丹蛋白粉和蒸馏水以1g:20～30mL的料液比混合，将混合物在80～90℃下预热15～30min，用1mol/L NaOH水溶液将pH调节至8.5～10，加入蛋白粉质量3%～5%的碱性蛋白酶在50～60℃下水解2～3h，在水解过程中通过加入0.5mol/L NaOH水溶液将反应液pH始终维持在8.5～10；酶解结束后，将体系置于80～95℃水浴中以终止酶解反应；将该体系再次冷却至40～50℃后维持此温度，将pH调节至8～9，加入蛋白粉质量3%～5%的胰蛋白酶水解2～3h，在水解过程中加入0.5mol/L NaOH溶液维持pH值为8～9；酶解结束后将体系置于80～95℃水浴终止酶解反应，冷却至室温后，加入1mol/L HCl水溶液调节溶液至中性，离心，取上清液得到牡丹籽粕酶解液；
（4）超滤分离多肽
将牡丹籽粕酶解液置于超滤杯中，先经10kDa的超滤膜截留，取出＜10kDa的部分再次使用1kDa的超滤膜截留，超滤过程中保持工作压力为0.1～0.2MPa，保留分子量＜1kDa部分；
（5）反相高效液相色谱分离多肽
采用反相高效液相色谱对超滤后分子量＜1kDa的部分进行分离，分离条件为：色谱柱为C18反相色谱柱，填料为孔径20～50 nm、粒径5～10 µm的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A是三氟乙酸体积浓度为0.1%的超纯水溶液，流动相B是三氟乙酸体积浓度为0.1%的乙腈溶液，进行梯度洗脱，流动相梯度选择：0～5分钟内5%流动相B洗脱，5～35分钟内5%～60%流动相B洗脱，35～60分钟内60%～100%流动相B洗脱，检测波长为214 nm，流速为1 mL/min；收集40%～80%流动相B洗脱之间的最高峰肽组分，冻干得到降血糖多肽。
2.权利要求1所述的降血糖多肽在制备降血糖药物中的应用。
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