CN116162677A - 一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法，属于食品技术领域。本发明为解决现有胶原三肽生产过程中存在的复合酶使用量大、产品中盐和游离氨基酸残留、胶原三肽的得率和纯度低的问题，提出了采用复合酶梯次酶解和超滤膜联合制备小分子鱼皮胶原蛋白肽。具体是通过中性蛋白酶和木瓜蛋白酶梯次酶解，最大程度提高胶原酶水解效率，再使用可特异性水解甘氨酸(Gly)末端的木瓜蛋白酶对300‑1000Da的寡肽进行深度水解，以提高胶原三肽的得率；采用超滤和纳滤膜组合分离技术对胶原肽进行进一步纯化，去除游离氨基酸及分子量大于700Da的肽段，以提高胶原三肽(约300Da)纯度。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法。
背景技术
近年来胶原蛋白肽在国际市场的比重迅速增加，胶原肽全世界整体年销售量已经达到25000t，已经形成了集美容、关节和骨骼保健、运动保健以及外用品等多个应用领域。胶原三肽是由胶原或明胶水解得到的含有三个氨基酸的小肽，其具有易吸收的特性。人体肠道存在肽转运体PepT 1，能特异性转运二肽和三肽。因此胶原三肽可直接被肠道吸收或者经不完全消化后再被人体吸收。另外，大量研究表明，胶原三肽具有较强的生理功能活性，如促进皮肤、骨骼修复，促进矿物元素吸收，抗氧化等。胶原三肽可作为营养补充剂或食品强化剂等，通过口服对人体机能进行调节；也可应用于化妆品，通过透皮吸收，改善皮肤水分、弹性等。
对于胶原蛋白肽，小分子肽尤其是三肽的得率和纯度是决定其功能活性的关键指标。申请号为202111305526.7的发明专利申请提出了一种皮肤修复用胶原三肽的生产方法，该方法中采用多级放射滤筒进行鱼皮除杂，然后使用复合蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶按照1：1：1进行复合酶解，获得胶原三肽，但是该方法使用复合酶一次性添加的方式进行酶解，酶使用量较大，并且未对非特异性酶解产物进行进一步分离，以去除游离氨基酸和未降解的大分子肽段，因此存在三肽纯度不高的问题。公开号为CN113698472A的发明专利申请提出了一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法以及鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，该方法使用的主要是胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解胶原，然后利用葡聚糖凝胶提纯小分子肽，但该方法中定义的小分子肽指的是分子量<700Da的六肽及更小的肽，并且选择的复合酶需要使用大量酸碱试剂调节pH值而造成产品中大量盐残留，并且葡聚糖凝胶层析柱较难工业生产使用。由此可见，亟需一种复合酶使用量低，产品得率和纯度高的胶原三肽生产方法。
发明内容
为解决现有胶原三肽生产过程中存在的复合酶使用量大、产品中盐和游离氨基酸残留、胶原三肽的得率和纯度低的问题，本发明采用梯次复合酶解和膜分离联合技术制备高纯度鱼皮胶原三肽，本方法可以有效提高胶原三肽得率和纯度，并且最大程度减少复合酶使用量、减少产品中盐和游离氨基酸残留。本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮明胶溶胀；
(2)使用中性蛋白酶对溶胀后的鱼皮明胶进行酶解，获得鱼皮明胶水解液；
(3)使用木瓜蛋白酶对步骤(2)获得的鱼皮明胶水解液进行酶解，获得鱼皮明胶水解液；
(4)利用超滤膜对步骤(3)获得的鱼皮明胶水解液进行过滤，收集流出液，以去除未充分水解的分子量>1kDa的大分子量肽段；
(5)利用第一步纳滤对步骤(4)获得的流出液进行过滤，收集流出液，以分离鱼皮胶原三肽；
(6)利用第二步纳滤对步骤(5)获得的流出液进行过滤，以去除鱼皮胶原三肽中混合的游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述溶胀是将鱼皮明胶配制成质量份数为5％-10％的溶液，并在80-100℃下加热10分钟。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述中性蛋白酶的添加量为5000-8000U/g，酶解温度为50-65℃，酶解时间为2-3h。
在本发明的一种实施方式中，其特征在于，步骤(3)所述木瓜蛋白酶的添加量为2000-3000U/g，酶解温度为50-65℃，酶解时间为1.5-2h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述超滤膜截留分子量为1-2kDa，膜浓缩倍数为4-5倍。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)所述第一步纳滤的纳滤膜截留分子量为800-1000Da，浓缩倍数为4-5倍。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)所述第二步纳滤的纳滤膜截留分子量为260Da，浓缩倍数为3-4倍，浓缩后再加入1-2倍体积的水洗出游离氨基酸和盐。
本发明还提供了一种由上述制备方法获得的鱼皮胶原三肽。
本发明的有益效果：
为解决现有胶原三肽生产过程中存在的复合酶使用量大、产品中盐和游离氨基酸残留、胶原三肽的得率和纯度低的问题，本发明提出采用复合酶梯次酶解和超滤膜联合制备小分子鱼皮胶原蛋白肽。具体的工艺优势体现在如下几方面：①通过中性蛋白酶和木瓜蛋白酶梯次酶解，先使用活性较强的中性蛋白酶水解大部分肽段，使胶原肽中胶原酶用位点充分暴露，最大程度提高胶原酶水解效率，再使用可特异性水解甘氨酸(Gly)末端的木瓜蛋白酶对300-1000Da的寡肽进行深度水解，以提高胶原三肽的得率；②采用超滤和纳滤膜组合分离技术对胶原肽进行进一步纯化，去除游离氨基酸及分子量大于700Da的肽段，以提高胶原三肽(约300Da)纯度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明描述的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的中性蛋白酶与木瓜蛋白酶均为市售蛋白酶。
本发明涉及的鱼皮胶原三肽水解率检测方法如下：
1、OPA试剂的配置(现配现用，顶多保存7天)
①0.2g OPA(邻苯二甲醛)+5mL无水乙醇，混合溶解，锡箔纸避光放置；
②4.767g四硼酸钠，0.25gSDS，0.22gDTT(二硫代苏糖醇)，加150mL去离子水溶解将①②混合定容250mL棕色容量瓶。
2、标准曲线的绘制
0.0328g L-亮氨酸定容在250mL容量瓶，配成1mmol/L亮氨酸溶液；
分别取0、2、4、6、8、10mL配置好的1mmol/L的亮氨酸标曲样，用去离子水定容至10mL，使得浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，之后吸取0.3mL，再加入3mL OPA试剂，震荡摇匀，避光反应2min，立刻使用紫外分光光度计在340nm下测OD值。
3、测量
样品预先稀释，保证浓度在0.5-1mg/mL之间；
4mL棕色离心管中加入3mL配置好的OPA试剂，再加入0.3mL待测样，震荡摇匀，避光反应2min，立刻使用紫外分光光度计在340nm下测OD值。
4、水解率结果计算
其中，X为样品的质量，单位为g；P为样品的蛋白质含量％。
本发明涉及的鱼皮胶原三肽得率的计算方法如下：
得率＝鱼皮胶原三肽质量÷水解前鱼皮胶原蛋白总质量×100％
本发明涉及的三肽纯度检测方法如下：
使用高效液相色谱法(HPLC)测定获得的三肽样品中肽分子量分布。
样品处理：将样品的pH先调至7左右，之后0.45μm滤膜过滤后放入进样小瓶。
色谱条件：凝胶色谱柱为TSKgel，流动相：30％乙腈+70％超纯水+0.07％三氟乙酸溶液，用真空泵脱气，紫外检测波长214nm；柱温为25℃，流速1mL/min，进样量为10μL。
使用不同分子量标准品确定三肽洗脱时间，用洗脱时间下的峰面积占总体出峰面积的比例表示三肽纯度。
实施例1：
(1)鱼皮明胶溶胀：将鱼皮明胶配制成质量分数为8％的溶液，并在90℃下加热10分钟，促进明胶的充分溶胀；
(2)第一步酶解：使用中性蛋白酶对溶解的鱼皮明胶进行一步酶解，酶添加量为5000U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h；
(3)第二步酶解：在中性蛋白酶酶解后，使用适量木瓜蛋白酶对鱼皮明胶水解液进行二次酶解，酶添加量为2500U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为1.5h；
(4)超滤膜过滤：将经过两步酶解的鱼皮明胶水解液进行超滤膜过滤，以去除未充分水解的分子量>1kDa的大分子量肽段，使用的膜截留分子量为2kDa，膜浓缩倍数为4倍，收集流出液；
(5)第一步纳滤膜过滤：收集的超滤流出液中主要为分子量<2kDa的寡肽，再使用纳滤膜对寡肽混合物进行进一步分离，选择截留分子量为1000Da的纳滤膜分离出三肽，浓缩倍数为4倍，三肽多分布于流出液中；
(6)第二步纳滤膜过滤：上述第一步纳滤环节收集的流出液中主要为三肽及游离氨基酸和盐，该步骤的目的是去除三肽中混合的游离氨基酸和盐。选择截留分子量为260Da的纳滤膜进行处理，浓缩倍数为4倍，再加入2倍水进一步洗出游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌：将步骤(6)中得到的浓缩液进行低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)中得到的杀菌鱼皮胶原三肽浓缩液进行冷冻干燥，获得高纯度鱼皮胶原三肽粉末。
在该实施例下，最终测得高纯度三肽得率达68.6％，其中三肽纯度达85.9％，水解率31.9％，产品粉末细腻，咸淡适中，并且无明显的苦腥味。
实施例2：
(1)鱼皮明胶溶胀：将鱼皮明胶配制成质量分数为8％的溶液，并在90℃下加热10分钟，促进明胶的充分溶胀；
(2)第一步酶解：使用中性蛋白酶对溶解的鱼皮明胶进行一步酶解，酶添加量为6000U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h；
(3)第二步酶解：在中性蛋白酶酶解后，使用适量木瓜蛋白酶对鱼皮明胶水解液进行二次酶解，酶添加量为2500U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为1.5h；
(4)超滤膜过滤：将经过两步酶解的鱼皮明胶水解液进行超滤膜过滤，以去除未充分水解的分子量>1kDa的大分子量肽段，使用的膜截留分子量为2kDa，膜浓缩倍数为4倍，收集流出液；
(5)第一步纳滤膜过滤：收集的超滤流出液中主要为分子量<2kDa的寡肽，再使用纳滤膜对寡肽混合物进行进一步分离，选择截留分子量为1000Da的纳滤膜分离出三肽，浓缩倍数为4倍，三肽多分布于流出液中；
(6)第二步纳滤膜过滤：上述第一步纳滤环节收集的流出液中主要为三肽及游离氨基酸和盐，该步骤的目的是去除三肽中混合的游离氨基酸和盐。选择截留分子量为260Da的纳滤膜进行处理，浓缩倍数为4倍，再加入2倍水进一步洗出游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌：将步骤(6)中得到的浓缩液进行低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)中得到的杀菌鱼皮胶原三肽浓缩液进行冷冻干燥，获得高纯度鱼皮胶原三肽粉末。
在该实施例下，最终测得高纯度三肽得率达69.3％，其中三肽纯度达84.8％，水解率32.5％，产品粉末细腻，咸淡适中，并且无明显的苦腥味。
实施例3：
(1)鱼皮明胶溶胀：将鱼皮明胶配制成质量分数为8％的溶液，并在90℃下加热10分钟，促进明胶的充分溶胀；
(2)第一步酶解：使用中性蛋白酶对溶解的鱼皮明胶进行一步酶解，酶添加量为8000U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h；
(3)第二步酶解：在中性蛋白酶酶解后，使用适量木瓜蛋白酶对鱼皮明胶水解液进行二次酶解，酶添加量为2500U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为1.5h；
(4)超滤膜过滤：将经过两步酶解的鱼皮明胶水解液进行超滤膜过滤，以去除未充分水解的分子量>1kDa的大分子量肽段，使用的膜截留分子量为2kDa，膜浓缩倍数为4倍，收集流出液；
(5)第一步纳滤膜过滤：收集的超滤流出液中主要为分子量<2kDa的寡肽，再使用纳滤膜对寡肽混合物进行进一步分离，选择截留分子量为1000Da的纳滤膜分离出三肽，浓缩倍数为4倍，三肽多分布于流出液中；
(6)第二步纳滤膜过滤：上述第一步纳滤环节收集的流出液中主要为三肽及游离氨基酸和盐，该步骤的目的是去除三肽中混合的游离氨基酸和盐。选择截留分子量为260Da的纳滤膜进行处理，浓缩倍数为4倍，再加入2倍水进一步洗出游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌：将步骤(6)中得到的浓缩液进行低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)中得到的杀菌鱼皮胶原三肽浓缩液进行冷冻干燥，获得高纯度鱼皮胶原三肽粉末。
在该实施例下，最终测得高纯度三肽得率达67.9％，其中三肽纯度达84.2％，水解率33.9％产品粉末细腻，咸淡适中，并且无明显的苦腥味。
实施例4：
(1)鱼皮明胶溶胀：将鱼皮明胶配制成质量分数为8％的溶液，并在90℃下加热10分钟，促进明胶的充分溶胀；
(2)第一步酶解：使用中性蛋白酶对溶解的鱼皮明胶进行一步酶解，酶添加量为4000U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h；
(3)第二步酶解：在中性蛋白酶酶解后，使用适量木瓜蛋白酶对鱼皮明胶水解液进行二次酶解，酶添加量为2500U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为1.5h；
(4)超滤膜过滤：将经过两步酶解的鱼皮明胶水解液进行超滤膜过滤，以去除未充分水解的分子量>1kDa的大分子量肽段，使用的膜截留分子量为2kDa，膜浓缩倍数为4倍，收集流出液；
(5)第一步纳滤膜过滤：收集的超滤流出液中主要为分子量<2kDa的寡肽，再使用纳滤膜对寡肽混合物进行进一步分离，选择截留分子量为1000Da的纳滤膜分离出三肽，浓缩倍数为4倍，三肽多分布于流出液中；
(6)第二步纳滤膜过滤：上述第一步纳滤环节收集的流出液中主要为三肽及游离氨基酸和盐，该步骤的目的是去除三肽中混合的游离氨基酸和盐。选择截留分子量为260Da的纳滤膜进行处理，浓缩倍数为4倍，再加入2倍水进一步洗出游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌：将步骤(6)中得到的浓缩液进行低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)中得到的杀菌鱼皮胶原三肽浓缩液进行冷冻干燥，获得高纯度鱼皮胶原三肽粉末。
在该实施例下，最终测得高纯度三肽得率达35.6％，其中三肽纯度达83.6％，水解率19.1％产品粉末细腻，咸淡适中，并且无明显的苦腥味。
实施例5：
(1)鱼皮明胶溶胀：将鱼皮明胶配制成质量分数为8％的溶液，并在90℃下加热10分钟，促进明胶的充分溶胀；
(2)第一步酶解：使用中性蛋白酶对溶解的鱼皮明胶进行一步酶解，酶添加量为9000U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h；
(3)第二步酶解：在中性蛋白酶酶解后，使用适量木瓜蛋白酶对鱼皮明胶水解液进行二次酶解，酶添加量为2500U/g，酶解温度为55℃，酶解时间为1.5h；
(4)超滤膜过滤：将经过两步酶解的鱼皮明胶水解液进行超滤膜过滤，以去除未充分水解的分子量>1kDa的大分子量肽段，使用的膜截留分子量为2kDa，膜浓缩倍数为4倍，收集流出液；
(5)第一步纳滤膜过滤：收集的超滤流出液中主要为分子量<2kDa的寡肽，再使用纳滤膜对寡肽混合物进行进一步分离，选择截留分子量为1000Da的纳滤膜分离出三肽，浓缩倍数为4倍，三肽多分布于流出液中；
(6)第二步纳滤膜过滤：上述第一步纳滤环节收集的流出液中主要为三肽及游离氨基酸和盐，该步骤的目的是去除三肽中混合的游离氨基酸和盐。选择截留分子量为260Da的纳滤膜进行处理，浓缩倍数为4倍，再加入2倍水进一步洗出游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌：将步骤(6)中得到的浓缩液进行低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥：将步骤(7)中得到的杀菌鱼皮胶原三肽浓缩液进行冷冻干燥，获得高纯度鱼皮胶原三肽粉末。
在该实施例下，最终测得高纯度三肽得率达61.5％，其中三肽纯度达78.6％，水解率34.2％产品粉末细腻，咸淡适中，并且无明显的苦腥味。
从实施例1-5获得的结果可以看出，中性蛋白酶酶添加量是影响酶解效率、肽得率的关键因素，酶添加量控制在5000-8000U/g可确保水解率保持在30％-35％，酶添加量低于该范围则会导致水解率和三肽纯度大幅度下降；酶添加量高于该范围不会进一步提高水解率，反而会导致三肽纯度下降，因为过多酶添加后，几乎达到水解极限，部分酶作用于水解小分子肽，使其分解为具有更低分子量的二肽，而在超滤-纳滤环节很难与三肽分离，因此最终三肽纯度下降。
对比例1：
改变实施例1步骤(2)第一步酶解过程使用酶的种类(增加碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶作为对比)其他条件同实施例1。酶的种类对水解率，三肽得率和三肽纯度的影响结果见表1。
表1对比例1中酶的种类对水解率，三肽得率和三肽纯度的影响结果
由表1与实施例1-5对应的结果可知，第一步酶解过程使用中性蛋白酶可提高水解率，三肽得率和三肽纯度。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶对鱼皮胶原蛋白水解率明显低于中性蛋白酶，并且碱性蛋白酶和胃蛋白水解后可能产生更多分子量接近三肽的二肽和四肽，难以与三肽完全分离，因此获得的产品中三肽纯度明显下降。
对比例2：
删除实施例1中步骤(5)，其他条件同实施案例一。对水解率，三肽得率和三肽纯度进行测定，具体结果见表2。
对比例3：
将实施例1中步骤(2)和步骤(3)改成一步酶解，同时向步骤(1)获得的鱼皮明胶溶液中加入5000U/g中性蛋白酶和2500U/g木瓜蛋白酶，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h。对水解率，三肽得率和三肽纯度进行测定，具体结果见表2。
对比例4：
将实施例1中步骤(2)和步骤(3)实施顺序进行调换，先使用2500U/g木瓜蛋白酶对鱼皮明胶溶液进行酶解，酶解温度为55℃，酶解时间为1.5h；再使用中性蛋白酶对溶解的鱼皮明胶进行二次酶解，酶添加量为5000，酶解温度为55℃，酶解时间为2.5h。对水解率，三肽得率和三肽纯度进行测定，具体结果见表2。
表2对比例2-4对应的水解率，三肽得率和三肽纯度
由表2可以看出，对比例2去除实施例1步骤(5)第一步纳滤环节，所得胶原肽产品得率提高，但所的产品中三肽纯度大幅度下降，因为其中500Da<分子量<2000Da的寡肽未能有效分离。
对比例3将实施例1步骤(2)和(3)的分步酶解调整为同时加酶一次酶解，对比例4调整实施例1中步骤(2)和(3)的顺序，结果都显示使肽得率急剧下降，因为未能充分发挥两种酶协同作用，充分说明使用中性蛋白酶充分水解鱼皮胶原后有利于胶原酶用位点暴露，最大程度提高胶原酶水解效率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)鱼皮明胶溶胀；
(2)使用中性蛋白酶对溶胀后的鱼皮明胶进行酶解，获得鱼皮明胶水解液；
(3)使用木瓜蛋白酶对步骤(2)获得的鱼皮明胶水解液进行酶解，获得鱼皮明胶水解液；
(4)利用超滤膜对步骤(3)获得的鱼皮明胶水解液进行过滤，收集流出液，以去除未充分水解的分子量>1 kDa的大分子量肽段；
(5)利用第一步纳滤对步骤(4)获得的流出液进行过滤，收集流出液，以分离鱼皮胶原三肽；
(6)利用第二步纳滤对步骤(5)获得的流出液进行过滤，以去除鱼皮胶原三肽中混合的游离氨基酸和盐；
(7)低温巴氏杀菌；
(8)冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述溶胀是将鱼皮明胶配制成质量份数为5％-10％的溶液，并在80-100℃下加热10分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述中性蛋白酶的添加量为5000-8000 U/g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述酶解的温度为50-65℃，酶解时间为2-3 h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述木瓜蛋白酶的添加量为2000-3000 U/g。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解的温度为50-65℃，酶解时间为1.5-2 h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述超滤膜截留分子量为1-2kDa，膜浓缩倍数为4-5倍。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述第一步纳滤的纳滤膜截留分子量为800-1000 Da，浓缩倍数为4-5倍。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述第二步纳滤的纳滤膜截留分子量为260 Da，浓缩倍数为3-4倍，浓缩后再加入1-2倍体积的水洗出游离氨基酸和盐。
10.一种由权利要求1-9任意一项所述制备方法获得的鱼皮胶原三肽。
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|---|---|---|---|---|
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