JP5569485B2 - 植物からのポリアミン組成物の調製方法 - Google Patents
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2.鉱酸及び/又は有機酸を含む酸溶液を添加し酸性条件下に処すことを特徴とする1のポリアミン組成物の調製方法。
3.鉱酸及び/又は有機酸が、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸、トリクロロ酢酸、過塩素酸、クエン酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸及びギ酸よりなる群から選ばれた少なくとも1種以上の酸であることを特徴とする2のポリアミン組成物の調製方法。4.酸性条件下になるように添加する酸溶液が、塩酸及び/又は過塩素酸であることを特徴とする1〜3のいずれかのポリアミン組成物の調製方法。
5.植物及び/又は植物抽出物を酸性条件下に処すと同時又は後に、ポリフェノール吸着剤を添加し、液体画分を分離することを特徴とする1〜4のいずれかのポリアミン組成物の調製方法。
6.植物及び/又は植物抽出物が、大豆種子、大豆胚芽、大豆胚、小麦種子、小麦胚芽、小麦胚、豆乳及びオカラよりなる群から選ばれた少なくとも1種以上であることを特徴とする1〜5のいずれかのポリアミン組成物の調製方法。
7.ポリアミン組成物が、1,3−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、N,N−ビス(アミノプロピル)カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン及びホモカルドヘキサミンよりなる群から選ばれた少なくとも1種以上の化合物を含むことを特徴とする1〜6のいずれかのポリアミン組成物の調製方法。
8.ポリアミン組成物が、プトレシン、カダベリン、スペルミジン及びスペルミンからなる群から選ばれた少なくとも1種以上の化合物を含むことを特徴とする1〜7のいずれかのポリアミン組成物の調製方法。
9.液体画分を分離する工程が、遠心分離及び/又は濾過分離であることを特徴とする1〜8のいずれかのポリアミン組成物の調製方法。
10.1〜9のいずれかの調製方法によって回収されたポリアミン組成物を、さらにイオン交換法、ゲル濾過法、膜分画法及び電気透析法よりなる群から選ばれた少なくとも1種以上の処理により精製することを特徴とするポリアミン組成物の調製方法。
ポリフェノール吸着剤の添加量は、好ましくは0.1〜30%(w/v)、より好ましくは0.5〜20%(w/v)、さらに好ましくは、1〜10%(w/v)である。
植物又は/及び植物抽出物として、葉、茎、根、種子、果実、胚、胚芽、豆乳、納豆、オカラなどに含まれるポリアミン含量を調べることができる。ポリアミンは遊離型ポリアミン、化合型ポリアミン、結合型ポリアミンがあり抽出方法は異なるがいずれも解析することができる(Plant Cell Physiol., 43(2), 196-206, 2002)。具体例として種子の遊離型ポリアミンの分析方法について詳細に示す。約0.1〜1.0gのダイズ種子に希釈内部標準液(1,6−hexanediamine、又は1,7−diaminoheptane、内部標準量=7.5〜48nmol)と5%過塩素酸水溶液(試料生体重1.0g当たり5〜20ml)を加え、ポリトロンミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出する。磨砕液を、4℃・35,000×gで20分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とする。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに100〜400μlの遊離型ポリアミン溶液(ポリアミン組成物,精製ポリアミン組成物)、200μlの飽和炭酸ナトリウム水溶液、200μlのダンシルクロライド/アセトン溶液(10mg/ml)を加えて軽く混和する。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、60℃のウォーターバスで1時間加温してダンシル化を行う。チューブを放冷した後、プロリン水溶液(100mg/ml)を200μl加えて混和する。アルミ箔で覆ってウォーターバスで30分間再加温する。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、600μlのトルエンを加えて激しく混和する。チューブを静置して2相に分かれた後に、上層のトルエン層を300μlマイクロチューブに分取する。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去する。チューブに200μlのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させる。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器(励起波長:365nm・発光波長:510nm)を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析する。HPLCカラムはμBondapak C18(Waters社製:027324、3.9×300mm、粒子径10μm)を使用する。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のHPLCチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出する。
100gのダイズ種子(品種‘フクユタカ’)に希釈内部標準液(1,7−diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)と480mlの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で一晩放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーでダイズ種子を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下でポリアミン組成物を抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中和して本液をポリアミン組成物とした。ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが8.2mg、スペルミジンが12.4mg、スペルミンが6.1mg含まれており、合計で26.7mgであった。さらに回収したポリアミン組成物を陽イオン交換樹脂(AG50W‐X4, 200‐400mesh, H+型, バイオラッド社製)で充填したカラムに通し、ポリアミンを樹脂に吸着させた。0.7NNaCl/0.1Mリン酸ナトリウム溶液(pH8.0)、水、1N塩酸を順次流してカラムを洗浄した。不純物を除去した後に、6N塩酸でポリアミンを溶出して30%の水酸化ナトリウムで中和して本液を精製ポリアミン粗成物とした。精製ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが6.4mg、スペルミジンが10.4mg、スペルミンが5.1mg含まれており、合計で21.9mgであった。ポリアミン組成物と精製ポリアミン組成物のHPLC分析のチャート図を図1に示した。プトレシン(検出時間:10.173分・10.175分)、カダベリン(検出時間:10.903分・10.890分)、スペルミジン(検出時間:16.050分・16.137分)、スペルミン(検出時間:20.100分・20.225分)のシャープな単一ピークがいずれの組成物においても検出された。ポリアミン以外の不純物ピークはほとんど検出されず、明らかにポリアミン組成物は高純度であり、ポリアミンが主成分であることが確認された。ポリアミン純度をHPLC分析のピーク面積から算出したところ、ポリアミン組成物は80〜86%、精製ポリアミン組成物は88〜93%であった。ポリアミン組成物が高純度である理由は、ポリフェノール吸着剤を添加し、酸条件下で抽出することで種子タンパク質などの不純物を変性及び吸着除去していることが大きく影響している。精製ポリアミン組成物は電気透析装置(アシライザーS3, アストム社製)により脱塩して濃縮した。
ダイズ種子(品種‘フクユタカ’)を吸水させて、光条件下又は暗黒条件下、26℃で2日間培養して発芽させた。光条件下又は暗黒条件下で培養した発芽ダイズの芽部分をそれぞれ約50gサンプリングした。50gのダイズ芽に希釈内部標準液(1,7−diaminoheptane、内部標準量=600nmol)、250mlの5%過塩素酸水溶液、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を8g添加し、ホモジナイザーでダイズ芽を十分に破砕した。次に室温下で30分間放置して酸性条件下でポリアミン組成物を抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中和して本液をポリアミン組成物とした。光条件下で発芽させたダイズ芽からポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンとカダベリンが26.2mg、スペルミジンが1.8mg、スペルミンが0.2mg含まれており、合計で28.2mgであった。暗黒条件下で発芽させたダイズ芽からポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンとカダベリンが17.1mg、スペルミジンが1.6mg、スペルミンが0.2mg含まれており、合計で18.9mgであった。
100gのダイズ胚芽(フォーユー社製)に希釈内部標準液(1,7−diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、500mlの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーでダイズ胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下でポリアミン組成物を抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中和して本液をポリアミン組成物とした。ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが23.5mg、スペルミジンが24.0mg、スペルミンが9.6mg含まれており、合計で57.1mgであった。さらに回収したポリアミン組成物を陽イオン交換樹脂(AG50W‐X4, 200‐400mesh, H+型, バイオラッド社製)で充填したカラムに通し、ポリアミンを樹脂に吸着させた。0.7NNaCl/0.1Mリン酸ナトリウム溶液(pH8.0)、水、1N塩酸を順次流してカラムを洗浄した。不純物を除去した後に、6N塩酸でポリアミンを溶出して30%の水酸化ナトリウムで中和して本液を精製ポリアミン粗成物とした。精製ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが20.4mg、スペルミジンが22.3mg、スペルミンが7.7mg含まれており、合計で50.4mgであった。精製ポリアミン組成物は電気透析装置(アシライザーS3, アストム社製)により脱塩して濃縮した。
100gのコムギ胚芽(培焼・ローストタイプ,日清ファルマ社製)に希釈内部標準液(1,7−diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、500mlの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ポリフェノール吸着剤であるポリクラールVT(ISP社製)を16g添加し、ブレンダーミキサーでダイズ胚芽を十分に破砕後、室温下で30分間放置して酸性条件下でポリアミン組成物を抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中和して本液をポリアミン組成物とした。ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが6.4mg、スペルミジンが23.9mg、スペルミンが14.3mg含まれており、合計で44.6mgであった。さらに回収したポリアミン組成物を陽イオン交換樹脂(AG 50W-X4, 200-400mesh, H+型, バイオラッド社製)で充填したカラムに通し、ポリアミンを樹脂に吸着させた。0.7NNaCl/0.1Mリン酸ナトリウム溶液(pH8.0)、水、1N塩酸を順次流してカラムを洗浄した。不純物を除去した後に、6N塩酸でポリアミンを溶出して30%の水酸化ナトリウムで中和して本液を精製ポリアミン粗成物とした。精製ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが5.7mg、スペルミジンが21.5mg、スペルミンが12.9mg含まれており、合計で40.1mgであった。精製ポリアミン組成物は電気透析装置(アシライザーS3,アストム社製)により脱塩して濃縮した。
100mlの豆乳(品種‘フクユタカ’)に希釈内部標準液(1,7−diaminoheptane、内部標準量=1200nmol)、100mlの5%過塩素酸水溶液を加えた。その後、ミキサーで十分に混合後、室温下で30分間放置して酸性条件下でポリアミン組成物を抽出した。混合物を4℃・27,700×gで20分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中和して本液をポリアミン組成物とした。ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが0.7mg、スペルミジンが1.9mg、スペルミンが0.7mg含まれており、合計で3.3mgであった。回収したポリアミン組成物を30%の水酸化ナトリウムで中和し、電気透析装置(アシライザーS3,アストム社製)により脱塩して濃縮した。
1kgのオカラに希釈内部標準液(1,7−diaminoheptane、内部標準量=10μmol)、5Lの5%過塩素酸水溶液を加えて室温下で1時間放置した。その後、ホモジナイザーでオカラを十分に破砕後、室温下で1時間放置して酸性条件下でポリアミン組成物を抽出した。破砕物を2℃・22,000×gで30分間遠心分離して液体画分を採取し、30%の水酸化ナトリウム溶液で中和して本液をポリアミン組成物とした。ポリアミン組成物中にはポリアミンとしてプトレシンが5.4mg、スペルミジンが17.8mg、スペルミンが6.5mg含まれており、合計で29.7mgであった。ポリアミン組成物は電気透析装置(アシライザーS3,アストム社製)により脱塩して濃縮した。
Claims (5)
- (1)大豆胚芽及び/又はこれらの抽出物を、塩酸の酸溶液を添加してpH6.0以下の酸性条件下に処す工程と、(2)(1)の工程の後に遠心分離及び/又は濾過分離により液体画分を回収する工程とを含むことを特徴とするポリアミン組成物の調製方法。
- 大豆胚芽及び/又はこれらの抽出物を酸性条件下に処すと同時又は後に、ポリフェノール吸着剤を添加し、液体画分を分離することを特徴とする請求項1に記載のポリアミン組成物の調製方法。
- ポリアミン組成物が、1,3−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、N,N−ビス(アミノプロピル)カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン及びホモカルドヘキサミンからなる群より選ばれた少なくとも1種の化合物を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のポリアミン組成物の調製方法。
- ポリアミン組成物が、プトレシン、カダベリン、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選ばれた少なくとも1種の化合物を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリアミン組成物の調製方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の調製方法によって回収されたポリアミン組成物を、さらにイオン交換法、ゲル濾過法、膜分画法及び電気透析法からなる群より選ばれた少なくとも1種の処理により精製することを特徴とするポリアミン組成物の調製方法。
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