CN112544888A - 一种富含亚精胺的纳豆提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富含亚精胺的纳豆提取物的制备方法，其特征在于，所述方法利用超临界二氧化碳流体萃取技术实现了从固态发酵的纳豆制备富含亚精胺的纳豆提取物。本方法加工过程简单，制备时间短，提取率高，萃取温度低，可有效避免热敏性成分受热降解，所得纳豆提取物中亚精胺含量为纳豆的10～15倍。该纳豆提取物中不含菌体和芽孢，也没有新鲜纳豆或纳豆冻干粉中令人不快的氨味，可以被更广泛的人群所接受。制备过程不产生废渣、废液和废气，提取渣中仍然保留了新鲜纳豆本身所含的纳豆激酶和其他营养成分，不影响进一步利用，做到了物尽其用。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种富含亚精胺的纳豆提取物的制备方法。
背景技术
亚精胺，H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2，结构式如式I所示，普遍存在于动植物以及微生物细胞中，是由腐胺（丁二胺）和腺苷甲硫氨酸生物合成的。
亚精胺是一种带正电的烷基胺类聚合阳离子，极易与带负电的DNA、RNA和脂质结合发生反应，因此参与了许多重要的生命过程，如调控细胞增殖、细胞衰老、器官发育、免疫以及癌症等生理和病理过程。研究表明，亚精胺代谢紊乱与多种疾病的发病机制有关。细胞学水平上，亚精胺能显著延长酵母、果蝇、线虫以及人外周血单个核细胞寿命及生存率。动物模型中，外援补充亚精胺可通过诱导自噬作用，改善老年小鼠左心室顺应性以及线粒体功能，改善其衰老状态以及肌肉的再生能力，提高记忆能力，降低神经变性，还能减少高脂饮食诱导肥胖小鼠动脉粥样硬化斑块中的脂质积累和坏死核心的形成，改善血压，降低心血管疾病的发病率、死亡率。除此之外，亚精胺还具有广泛的抗炎作用以及抗氧化能力，能降低与年龄相关的氧化蛋白损伤以及活性氧(ROS)的过度积累。2017年欧盟委员会法规Regulation(EU) 2017/2470将富含亚精胺的小麦胚芽提取物纳入新资源食品列表，并公布了该提取物中亚精胺的含量为0.8～2.4mg/g以及亚精胺的日摄入量为不大于6mg。2020年3月欧盟完善了新资源食品富含亚精胺的小麦胚芽提取物的规格，并在附件中对其定义、黄曲霉毒素限量、微生物标准进行了规定。奥地利The Longevity Labs公司一款亚精胺补剂spermidineLIFE®胶囊宣称可激发细胞自噬机制，延缓衰老以及包括心血管健康，骨骼、关节和软骨，免疫系统，肝功能，毛发再生等众多益处。
纳豆是由蒸煮后的大豆经接种纳豆芽孢杆菌后发酵而成的一种传统食品，是日本消费量最大的发酵食品，被认为是日本人长寿的“秘方”。相关研究表明大豆中亚精胺水平高于常见的谷物、蔬菜、水果或肉类等食品，而纳豆中亚精胺含量则明显高于大豆种子，是亚精胺重要的食物来源之一。
国内外市场上所提供的由纳豆提取的主要活性成分有纳豆激酶、维生素K2、超氧化物歧化酶(SOD)等，由纳豆提取、以亚精胺为活性成分的提取物至今未见报道。国内外市场上制备亚精胺的主要方法技术有溶剂提取法、化学合成法、酶法、微生物发酵法和基因工程技术，存在耗能高，副反应多，污染大，操作繁琐，成本偏高等不利因素。
超临界二氧化碳流体萃取技术，其原理是利用超临界二氧化碳流体粘度小、扩散系数大，对某些天然产物具有特殊溶解作用，溶质和溶剂的分离彻底且容易的特性，通过调节压力和温度而方便地改变溶剂的性质，可控制其选择性；通过适当地选择提取条件和携带剂种类，能在接近常温下进行操作，适用于热敏性成分的快速提取。该技术具有选择性强，提取率高，条件温和，生产周期短，不污染环境等优点。但是，现有技术中没有使用超临界二氧化碳流体萃取技术提取亚精胺的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种富含亚精胺的纳豆提取物的制备方法。该方法采用超临界二氧化碳流体萃取技术，所得纳豆提取物中亚精胺含量为纳豆的10～15倍。产品无令人不快的氨味，加工过程简单高效，安全无污染。
本发明提供了一种富含亚精胺的纳豆提取物的制备方法，所述方法包括采用超临界二氧化碳流体萃取技术制备富含亚精胺的纳豆提取物。
在本发明中，优选地，所述方法包括采用超临界二氧化碳流体萃取技术以固态发酵的纳豆为原料制备富含亚精胺的纳豆提取物。
本发明所使用的原料是由蒸煮后的大豆经接种纳豆芽孢杆菌后发酵而成的，属于固态发酵类型的纳豆，是一种食品，可由市场购买获得。
在本发明中，优选地，所述方法包括以下步骤：
（1）取固态发酵的纳豆进行冷冻干燥，使用微粉碎设备将冻干的纳豆粉碎，并过筛，筛子为200目筛；
（2）将粉碎后的原料粉装入萃取釜中，将携带剂加入携带剂罐，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；
（3）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，所得萃取物合并收集；
（4）所得萃取物合并，加入适量羟丙基-β-环糊精，减压干燥，即为富含亚精胺的纳豆提取物。
优选地，在步骤（1）中，所述冷冻干燥的条件为：冷冻干燥箱温度为-50℃，真空度为30Pa，搁板加热温度为30～50℃，干燥时间为20小时。
优选地，在步骤（2）中，所述携带剂为10%～70%的乙醇水溶液。
优选地，在步骤（2）中，所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min。
优选地，在步骤（3）中，所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa。
优选地，在步骤（4）中，所述加入羟丙基-β-环糊精的比例约为1:1。
优选地，在步骤（4）中，所述减压干燥的温度为65℃，真空度为10～30hPa。
本发明的有益效果包括：
1.本发明首次实现利用超临界二氧化碳流体萃取技术制备富含亚精胺的纳豆提取物，所得纳豆提取物中亚精胺含量为纳豆的10～15倍；
2.本发明的方法，操作简便，制备时间短，提取率高，萃取温度低，可有效避免热敏性成分受热降解；
3.本发明的方法，制备过程不产生废渣、废液和废气，不污染环境，使用的夹带剂是由食用酒精和纯化水配制的，对人体无害，所得纳豆提取物中乙醇残留低于100mg/kg，无甲醇残留。提取渣中仍然保留了新鲜纳豆本身所含的纳豆激酶和其他营养成分，不影响进一步利用，做到了物尽其用；
4. 本发明的方法，工艺过程简单，安全可靠，生产成本低，经济效益可观。
附图说明
图1为标准品的HPLC图谱。
图2为纳豆提取物的HPLC图谱。
图3为固态发酵纳豆的HPLC图谱。
图4为冻干后原料粉的HPLC图谱。
图5为超临界装置流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，实施例所描述的具体工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。
实施例1：使用本发明方法制备富含亚精胺的纳豆提取物
（1）取固态发酵的纳豆5kg进行冷冻干燥，使用微粉碎设备将冻干的纳豆粉碎，并过筛，筛子为200目筛；所述冷冻干燥的条件为：冷冻干燥箱温度为-50℃，真空度为30Pa，搁板加热温度为30～50℃，干燥时间为20小时，所得粉碎后的原料粉的重量为1.66kg；
（2）取粉碎后的原料粉230g装入1.0L萃取釜中，配制30%乙醇水溶液500mL加入携带剂罐中，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min；
（3）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，合并收集两釜中的精油状萃取物；所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa；
（4）所得萃取物合并称重24.73g，以70mL95%乙醇溶解并全部转移至圆底烧瓶中，加入25g羟丙基-β-环糊精，混匀并全部溶解，减压干燥，净获得纳豆提取物43.85g提取物；所述减压干燥的温度为65℃，真空度为10～30hPa。
以上实施例中提及的固态发酵的纳豆、冻干后的原料粉、纳豆提取物等样品依据国标方法食品中生物胺的测定（GB5009.208-2016）中第一法（液相色谱法）进行检测分析，具体色谱条件为：色谱柱为C18柱（4.6×250mm，5μm），柱温为35℃，流动相A为10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液），流动相B为90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01mol/L乙酸铵溶液），梯度洗脱程序见表1，进样量5μL，流速0.8ml/min，紫外检测波长为254nm。
表1 梯度洗脱程序表：
| 时间（min） | 0 | 22 | 25 | 33 | 33.01 | 45 |
| 流动相A浓度（%） | 40 | 15 | 0 | 0 | 40 | 40 |
| 流动相B浓度（%） | 60 | 85 | 100 | 100 | 60 | 60 |
标准曲线绘制：分别精确称取适量亚精胺盐酸盐标准品和4.0mg内标标准品（1，7-二氨基庚烷），置于100ml容量瓶中，分别加入0.1mol/L的盐酸溶解、定容，配置成亚精胺盐酸盐浓度分别为20.0 mg/L、60.0 mg/L、100.0mg/L、200.0mg/L的标准溶液。分别吸取1.0mL各浓度标准溶液，置于15mL离心管中，依次加入100μL氢氧化钠溶液（2mol/L）、300μL饱和碳酸氢钠溶液和1mL衍生试剂（10mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液），涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴中衍生30min取出，加入100μL浓氨水，涡旋混匀，静置30min，用乙腈定容至4mL，涡旋混匀，过0.45μm滤膜，吸取5μL按照上述方法，记录色谱峰面积，如附图1所示，亚精胺标准品的保留时间为31.72min。以标准品衍生溶液的浓度为横坐标，以标准品的峰面积与内标的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线是Y=0.07518X+0.007086，R2=0.9999，说明亚精胺盐酸盐在0.005mg/mL～0.05mg/mL范围内线性关系良好。
试样提取：准确称取待测样品1g，置于50ml离心管中，加入2mL内标标准溶液（1.0mg/mL）样品充分混匀，加入20mL5%三氯乙酸溶液，振荡提取30min，5000r/min离心10min，转移上清液至50mL容量瓶中，残渣用20mL5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用5%三氯乙酸溶液稀释至刻度，用上述衍生方法进行衍生后，吸取5μL按照上述色谱方法，记录色谱峰面积，如附图2～4所示，根据标准曲线得到待测液中亚精胺盐酸盐的浓度。
试样中亚精胺含量计算：
X=
式中：
X：试样中亚精胺的含量，单位为mg/g
c：试样溶液中亚精胺盐酸盐的浓度，单位为mg/L
V：试样溶液衍生后溶液的体积，单位为mL
f：稀释倍数
m：试样的质量，单位为g
0.57：亚精胺盐酸盐折算成亚精胺的折算系数。
由此测定，本实施例中纳豆提取物、固态发酵的纳豆、冻干后的原料粉的亚精胺含量依次为1.94mg/g、0.15mg/g、0.60mg/g，亚精胺的提取率为61.37%。
实施例2：使用本发明方法制备富含亚精胺的纳豆提取物
（1）取上面实施例中粉碎后的原料粉230g装入1.0L萃取釜中，配制25%乙醇水溶液500mL加入携带剂罐中，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min；
（2）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，合并收集两釜中的精油状萃取物；所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa；
（3）所得萃取物合并称重22.85g，以50mL95%乙醇溶解并全部转移至圆底烧瓶中，加入20g羟丙基-β-环糊精，混匀并全部溶解，减压干燥，净获得纳豆提取物40.82g提取物，亚精胺含量为2.34mg/g，亚精胺的提取率为68.89%。
实施例3：使用本发明方法制备富含亚精胺的纳豆提取物
（1）取上面实施例中粉碎后的原料粉230g装入1.0L萃取釜中，配制20%乙醇水溶液500mL加入携带剂罐中，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min；
（2）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，合并收集两釜中的精油状萃取物；所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa；
（3）所得萃取物合并称重17.44g，以50mL95%乙醇溶解并全部转移至圆底烧瓶中，加入15g羟丙基-β-环糊精，混匀并全部溶解，减压干燥，净获得纳豆提取物28.39g提取物，亚精胺含量为1.81mg/g，亚精胺的提取率为37.19%。
实施例4：使用本发明方法制备富含亚精胺的纳豆提取物
（1）取上面实施例中粉碎后的原料粉230g装入1.0L萃取釜中，配制40%乙醇水溶液500mL加入携带剂罐中，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min；
（2）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，合并收集两釜中的精油状萃取物；所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa；
（3）所得萃取物合并称重22.41g，以50mL95%乙醇溶解并全部转移至圆底烧瓶中，加入20g羟丙基-β-环糊精，混匀并全部溶解，减压干燥，净获得纳豆提取物38.15g提取物，亚精胺含量为2.13mg/g，亚精胺的提取率为58.60%。
实施例5：使用本发明方法制备富含亚精胺的纳豆提取物
（1）取上面实施例中粉碎后的原料粉230g装入1.0L萃取釜中，配制50%乙醇水溶液500mL加入携带剂罐中，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min；
（2）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，合并收集两釜中的精油状萃取物；所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa；
（3）所得萃取物合并称重18.89g，以50mL95%乙醇溶解并全部转移至圆底烧瓶中，加入20g羟丙基-β-环糊精，混匀并全部溶解，减压干燥，净获得纳豆提取物36.50g提取物，亚精胺含量为1.58mg/g，亚精胺的提取率为41.57%。
实施例6：使用本发明方法制备富含亚精胺的纳豆提取物
（1）取上面实施例中粉碎后的原料粉230g装入1.0L萃取釜中，配制70%乙醇水溶液500mL加入携带剂罐中，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min；
（2）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，合并收集两釜中的精油状萃取物；所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa；
（3）所得萃取物合并称重13.65g，以50mL95%乙醇溶解并全部转移至圆底烧瓶中，加入15g羟丙基-β-环糊精，混匀并全部溶解，减压干燥，净获得纳豆提取物24.32g提取物，亚精胺含量为1.14mg/g，亚精胺的提取率为19.97%。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (9)
1.一种富含亚精胺的纳豆提取物的制备方法，所述方法包括采用超临界二氧化碳流体萃取技术制备富含亚精胺的纳豆提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括采用超临界二氧化碳流体萃取技术以固态发酵的纳豆为原料制备富含亚精胺的纳豆提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
（1）取固态发酵的纳豆进行冷冻干燥，使用微粉碎设备将冻干的纳豆粉碎，并过筛，筛子为200目筛；
（2）将粉碎后的原料粉装入萃取釜中，将携带剂加入携带剂罐，开启超临界二氧化碳流体萃取装置，将装置内的二氧化碳加温加压，使其达到超临界流体状态，随后开启携带剂泵，以混有携带剂的超临界二氧化碳流体萃取原料粉中的亚精胺；
（3）含有萃取物和携带剂的超临界二氧化碳流体，经分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ减压解析，所得萃取物合并收集；
（4）所得萃取物合并，加入适量羟丙基-β-环糊精，减压干燥，即为富含亚精胺的纳豆提取物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤（1）中所述冷冻干燥的条件为：冷冻干燥箱温度为-50℃，真空度为30Pa，搁板加热温度为30～50℃，干燥时间为20小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（2）中所述携带剂为10%～70%的乙醇水溶液。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（2）中所述超临界二氧化碳流体萃取条件为：萃取釜温度为40℃，萃取釜压力为30MPa，萃取时间为40min，二氧化碳流速为20L/h，采用含水乙醇为携带剂，携带剂泵流速为10mL/min。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（3）中所述分离条件为：分离釜Ⅰ温度为40℃，分离釜Ⅰ压力为5.9MPa；分离釜Ⅱ温度为40℃，分离釜Ⅱ压力为5.4MPa。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（4）所述加入羟丙基-β-环糊精的比例约为1:1。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤（4）所述减压干燥的温度为65℃，真空度为10～30hPa。
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| 李云荫: "《中学植物学词典》", 30 June 2000, 辽宁教育出版社 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113466377A (zh) * | 2021-07-16 | 2021-10-01 | 广州国标检验检测有限公司 | 一种药物中氰胺类杂质的检测方法 |
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